專利名稱：使用電穿孔輔助疫苗接種和加強(qiáng)免疫來(lái)增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗以及它們的給藥。更具體地，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)
和增強(qiáng)哺乳動(dòng)物^j":阮原-試劑的免疫反應(yīng)(免疫應(yīng)答，immuneresponse )，通過向所述哺乳動(dòng)物在第 一免疫反應(yīng)組織中提供所述抗原i式劑的最4刀纟合藥(primary administration),之后向所述p甫吝'L動(dòng)物在第二身體組織中^是供至少一種加強(qiáng)給藥(助推給藥，boostadministration),其中所述最4刀和力口強(qiáng)纟合藥中的至少一種是通過電穿孑L力口以壽甫助的。
背景技術(shù)：
以下描述包括可以用于理解本發(fā)明的信息。并不表示承認(rèn)任何這樣的信息是所要求保護(hù)的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)、或相關(guān)技術(shù)，或者任何具體或含蓄參考的出版物是現(xiàn)有技術(shù)。
在接種疫苗領(lǐng)域，疫苗的給藥通常是通過利用注射器和針頭注
入到皮下或月幾內(nèi)(iM)ia織。在傳統(tǒng)才喿作中，疫苗的初始癥會(huì)藥之后是一次或多次以與第一次相同的注射方式給藥的助推注射，僅僅是
在后一時(shí)間或時(shí)間段(通常是初始給藥后的2到6周)。在某些情
況下，第二次加強(qiáng)l合藥是以第二時(shí)間間隔遞送的，該第二時(shí)間間隔經(jīng)常比第一時(shí)間間隔(即，在疫苗的最初或"初始"給藥和第一次加強(qiáng)接種疫苗之間的時(shí)間)更長(zhǎng)。在這樣的時(shí)間間隔期間，免疫系統(tǒng)通常應(yīng)答，例如通過產(chǎn)生針對(duì)該疫苗的抗原成分的抗體(所謂的
5"體液"免疫)和/或通過引發(fā)涉及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫
反應(yīng)。在抗體產(chǎn)生的環(huán)境下，抗體效-f介的水平通常約4至8周后加強(qiáng)(免疫)會(huì)達(dá)到最大效價(jià)。
對(duì)于許多疾病，加強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)于將身體保持在準(zhǔn)備好對(duì)抗感染或某些腫瘤形成的狀態(tài)來(lái)i兌是必要的。然而，在單個(gè)組織類型中的加強(qiáng)免疫不會(huì)總是提供最佳免疫反應(yīng)。許多因素影響免疫反應(yīng)的質(zhì)量，例如， 一些抗原不誘導(dǎo)強(qiáng)免疫反應(yīng)，而其他抗原可以引發(fā)誘導(dǎo)強(qiáng)免疫反應(yīng)和炎性或有時(shí)調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)。對(duì)各種抗原試劑的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的差異性在疫苗開發(fā)中是一個(gè)主要關(guān)心的問題。在出現(xiàn)生物恐怖主義和用作生物武器的病原體的高度有毒菌抹的可能性、以及由于哺乳動(dòng)物和鳥類病原體(例如，HIV， SARS， H5N1等)在相同物種中和不同物種之間的進(jìn)化和有效快速擴(kuò)展引起的可能危險(xiǎn)的情況下，本領(lǐng)域需要提供以能夠在巨大種群中以穩(wěn)定方式提供快速誘導(dǎo)強(qiáng)大、廣譜免疫反應(yīng)的方式進(jìn)行疫苗接種種群的方法。
本發(fā)明正是以這樣的方式，即通過提供用于增強(qiáng)對(duì)靶抗原的免疫反應(yīng)的方法而4,動(dòng)了疫苗4妄種4頁(yè)i或，該方法包4舌在預(yù)選組織中電穿孔輔助給予初始和加強(qiáng)(免疫)組合物。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明包括向皮膚和/或肌肉組織中給予疫苗組合物。這方面的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包4#用于^合予疫苗組合物的纟合藥方案，其中初始推注給予到一種組織類型(例如肌肉，皮膚，皮下空間，粘膜，鼻內(nèi)，或吸入到肺中)并且加強(qiáng)給藥在不同或第二組織類型中遞送。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，開始的初始推注給藥到皮膚而加強(qiáng)推注給藥到肌肉組織。在一種可替換的實(shí)施方式中，初始推注可給藥到肌肉而一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)給藥可遞送到皮膚組織中。另一方面，本發(fā)明涉及電穿孔(EP)在遞送通過兩次或更多次 給藥(每一次間隔多于一天)的疫苗組合物中的應(yīng)用。電穿孔可通 過任何恰當(dāng)?shù)倪m于將物質(zhì)遞送到特定類型組織中的細(xì)月包內(nèi)的電穿 孔裝置來(lái)^是供。例如，對(duì)于將一種物質(zhì)給藥到皮膚組織細(xì)胞，電穿 孔裝置可包括具有利用非侵入性電極經(jīng)皮或經(jīng)粘膜地進(jìn)行電穿孔 的能力的任何裝置，或者可替換地，具有針狀電極的裝置，該針狀 電才及可利用直4妻插入到要電穿孔的組織，如皮膚(皮內(nèi)或皮下)、 粘月莫或月幾肉中的電才及來(lái)電穿孔該組織。
本發(fā)明的另 一個(gè)方面涉及給予患者疫苗的電穿孔輔助方法，相 比于在沒有電穿孔的相同的免疫原量和質(zhì)量情況下預(yù)期觀察到的 或者在單獨(dú)一種組織類型中給藥之后預(yù)期觀察到的免疫反應(yīng)，引起 增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及疫苗的電穿孔輔助給藥，其中該疫 苗由以減活或滅活細(xì)菌或病毒形式的^t原、蛋白質(zhì)、多月太或肽構(gòu)成； 或者可替4奐地，核酸(或多個(gè)核酸物種)的電穿孔輔助鄉(xiāng)會(huì)藥，其中 該核酸編碼一種或多種抗原，并且尤其是在給予身體組織并由這樣 的組織中的細(xì)胞攝取之后能夠指導(dǎo)所編碼抗原的表達(dá)的核酸。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于更快、更強(qiáng)并且具有引發(fā)體液 和/或細(xì)胞(.即T細(xì)胞)免疫反應(yīng)的能力的免疫反應(yīng)。
這些和其他方面以及實(shí)施方式通過參考以下附圖、詳細(xì)描述以 及所附權(quán)利要求將顯而易見。


圖l是曲線圖，示出了在兔的所選組織中利用編碼人類IgG的 DNA質(zhì)粒進(jìn)行注射和EP之后所得到的兔抗-人類IgG抗體效價(jià)。 誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖2A和2B是曲線圖，示出了在Balb/c小鼠的不同同齡組中 對(duì)乙型肝炎表面抗原的抗體產(chǎn)生的結(jié)果。如圖所示，在皮膚中的初 始接種與6天后在肌肉中結(jié)合電穿孔的后續(xù)加強(qiáng)提供了增強(qiáng)的效價(jià) 水平。
圖3A和3B是曲線圖，示出了對(duì)Balb/c小鼠的不同同齡組的 乙型肝炎表面抗原的抗體產(chǎn)生的結(jié)果。如圖所示，這些結(jié)果證實(shí)了 在圖2A和2B中獲得的那些結(jié)果。特別地，甚至在初始4妻種之后 20天聯(lián)合電穿孔在肌肉中的加強(qiáng)(接種)供了增強(qiáng)的抗體效價(jià)。
具體實(shí)施例方式
及其他疾病狀態(tài)(例如癌癥)的疫苗的方法，該疫苗組合物通過一 革殳時(shí)間的兩次或多次給予。然而，該所述的本發(fā)明目前的方法基于 以下創(chuàng)造性認(rèn)識(shí)初始推注遞送到第 一組織例如皮膚組織，接著加 強(qiáng)(助推，boosting)到第二、不同組織例如月幾肉組織，同時(shí)采用 電穿孔以直4妄將所述疫苗組合物遞送到所述組織中的至少 一個(gè)并 且優(yōu)選每一個(gè)的細(xì)胞內(nèi)，在哺乳動(dòng)物中才是供了增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。事 實(shí)上，在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，起初的或初始給藥包括將用于治療 特定疾病或病癥的抗原試劑用電穿孔輔助遞送至皮力夫組織，而一個(gè) 或多個(gè)后續(xù)"加強(qiáng)"給藥遞送至已^皮同時(shí)電穿孔(即，在遞送抗原 (或編碼抗原的核酸以增強(qiáng)抗原的吸收)(或核酸)之前、同時(shí)或 之后4皮電穿孑L)的月幾肉組織。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，初始是選擇
8性i也通過同時(shí)EP和初始4,注主會(huì)予月幾肉以及在皮月夫組織中的后續(xù)力口 強(qiáng)而實(shí)施的。
在EP輔助疫苗遞送的情況下，疫苗可以-使用包4舌各種類型電
極的電穿孔裝置而被遞送至組織。例如，對(duì)于皮膚組織(如角質(zhì)層、 表皮組織和皮下組織)的電穿孔，電穿孔裝置可采用非侵入性電極
^口美國(guó)專利No. 6,009,345、 5,968,006禾口 6,972,013中戶斤4苗述的曲;^ 電才及(meander electrode)和環(huán)形電才及。另夕卜，也可采用如在PCT 申請(qǐng)WO02/072781中描述的非侵入性點(diǎn)電極，以及如在美國(guó)專利 號(hào)5，439，440中描述的卡鉗電極。在一個(gè)相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施方式中， 疫苗可以通過局部施加至皮膚表面而遞送，以1更采用電穿孔脈沖或 脈沖序列以攜帶抗原通過角質(zhì)層的表面并通過"經(jīng)皮電穿孔，，而進(jìn) 入到較深的皮力夫組織，而在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，疫苗使用針頭和 注射器、無(wú)針頭快速注射裝置如Biojector、皮膚貼遞送系統(tǒng)(skin patch delivery system )或^f壬^f可其^f也合適方式，同時(shí)4吏用4壬4可合適電 極結(jié)構(gòu)例如曲流電極、環(huán)形電極或點(diǎn)電極，聯(lián)合向該皮膚組織提供 電穿孔脈沖或脈沖序列而給藥到皮膚組織(例如表皮或皮下)內(nèi)。
皮膚組織中的疫苗接種也可使用侵入性電極如針狀電極、微電 極或通過從快速注射裝置噴射的導(dǎo)電流體射流形成的電極來(lái)實(shí)施。 在一些這樣的實(shí)施方式中，針狀電極也可包括可用于將抗原物質(zhì)遞
送到身體組織內(nèi)的空心針。對(duì)于皮膚給藥，疫苗組合物可^皮例如皮 下地，如通過單獨(dú)的皮下注射器針頭、噴射注射器、或者通過電極 本身注入到皮膚組織內(nèi)，接著利用 一個(gè)或多個(gè)電穿孔脈沖來(lái)脈沖這 些電極。
關(guān)于疫苗組合物給藥至肌肉組織，通常針頭型電才及(可選地能 夠遞送疫苗)與通過^f"頭和注射器或噴射注射而將疫苗遞送至^L肉 同時(shí)(經(jīng)常是在其后)進(jìn)行脈沖。針頭電4及，包括在上述專利中描述的或在美國(guó)專利No. 5，273，525、 6，110，161、 6,261,281、 6，958，060、 PCT申請(qǐng)WO01/85202以及 WO2007/095140中的任何一個(gè)所描述的那些電極，將其全部以其各 自的整體并入本文供參考。
如將理解的，本發(fā)明才是供用于由于初始疫苗接種到第 一 組織 (例如皮月夫組織)中4妄著在第二組織(例如月幾肉組織)中一次或多 次加強(qiáng)導(dǎo)致的增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。事實(shí)上，在涉及多次加強(qiáng)給藥的實(shí) 施方式中，第二或后續(xù)加強(qiáng)可以鄉(xiāng)合藥至仍不同于鄉(xiāng)會(huì)予第一次加強(qiáng)纟合 藥的其他組織類型。不希望受特定理論束縛，認(rèn)為增強(qiáng)的免疫反應(yīng) 至少部分地是通過包括皮膚組織中的初始免疫和肌肉中的加強(qiáng)免 疫的方法引起的，因?yàn)閷⒁呙缃臃N到皮膚中提供相對(duì)較高濃度的樹 突細(xì)胞(其能夠影響所遞送的抗原試劑的免疫加工)，而肌肉內(nèi)的 加強(qiáng)免疫4是供該抗原在月幾肉隔室中的相對(duì)4交長(zhǎng)期存在，佳:得該抗原 在提供細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞中被加工。因此，編碼一種或多種肽或多肽 :阮原物種的 一種或多種核酸物種的遞送增強(qiáng)該肽或多肽4元原的長(zhǎng) 期表達(dá)，從而允許所表達(dá)的抗原相對(duì)較長(zhǎng)期暴露于免疫系統(tǒng)的細(xì)月包 和體液臂(humoral arm )。
在本發(fā)明的又 一 個(gè)實(shí)施方式中，給藥的方法包括將加強(qiáng)接種與 初始4妄種的時(shí)間間隔開'l"合當(dāng)?shù)奶靆:。當(dāng)然，在初始和加強(qiáng)4妾種之間 (以及考慮或需要在兩個(gè)或更多個(gè)加強(qiáng)給藥的后續(xù)加強(qiáng)接種之間) 的特定時(shí)間間隔可易于確定，并且將取決于這樣的因素，如待引發(fā) 的期望的免疫反應(yīng)、遞送的抗原、初始和加強(qiáng)組合物要遞送到其中 的組織類型、遞送的組合物的類型(例如在每一種情況下為包含肽 的組合物，在每一種情況下為編碼抗原的核酸、在一種情況(例如 初始)下為肽和在另一情況(例如加強(qiáng))下為編碼肽的核酸)，是 否聯(lián)合初始免疫、加強(qiáng)免疫、或初始和加強(qiáng)免疫使用了 EP、給予該組合物的患者的年齡和癥狀等。如附圖l所示出的，相比于將在
初始和力。強(qiáng)之間的時(shí)間間隔開 一個(gè)足夠期間以允"i午免疫系統(tǒng)可以 對(duì)皮膚中的最初接種起反應(yīng)來(lái)說(shuō)，同時(shí)對(duì)皮膚和肌肉給藥效果要差 一些。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，疫苗初始推注的給藥與加強(qiáng)推注在 時(shí)間上間隔開一天到大約4-7周。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中， 一刀始和加強(qiáng)4,注之間的時(shí)間間隔可以為一天至7、 14、 20、 30、 35、 40、 45、 50和54天。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，該時(shí)間間隔可以 為2天、6天或20天。當(dāng)給予多次加強(qiáng)給藥時(shí)，后續(xù)加強(qiáng)免疫之間 的時(shí)間間隔可以相同或不同。 一些優(yōu)選的加強(qiáng)免疫之間的間隔包括 l周，2-4周，1-3個(gè)月，4、 5、 6、 8和10個(gè)月，以及l(fā)、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 15和20年。
如已經(jīng)描述的，本發(fā)明的疫苗可以包4舌，除了其^f也物質(zhì)以外， 編碼一種或多種抗原肽、蛋白質(zhì)或多肽(其表達(dá)通過啟動(dòng)子，優(yōu)選 可誘導(dǎo)性的或組織特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)或控制)的基因基疫苗。在一 些優(yōu)選的這種實(shí)施方式中，以預(yù)定時(shí)間間隔推注遞送至皮膚和肌肉 組織分別用于最初免疫和加強(qiáng)免疫。然而，本發(fā)明還設(shè)想了同時(shí)給 予初始和加強(qiáng)接種，其中初始的推注給藥優(yōu)選到皮膚中而加強(qiáng)接種 4皮遞送到月幾肉內(nèi)。在這類的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，遞送至月幾肉 的疫苗組合物包括在誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(其可通過暴露于誘導(dǎo)劑或與誘 導(dǎo)劑可操作相關(guān)聯(lián)而被誘導(dǎo))調(diào)節(jié)下編碼抗原的核酸。因此，在一 個(gè)所選時(shí)間，例如在同時(shí)的初始和加強(qiáng)免疫之后的1至14天之間， 由遞送至肌肉組織的核酸編碼的基因的表達(dá)可^皮"i秀導(dǎo)以表達(dá)感興 趣的抗原，并誘導(dǎo)或增強(qiáng)對(duì)該特定抗原的免疫應(yīng)答。在其他可替換
表達(dá)核酸，而加強(qiáng)組合物可以包括包含抗原本身的肽或多肽。即， 在這樣的一個(gè)實(shí)施方式中， 一種或多種疫苗組合物(其是用于初始 或加強(qiáng)的組合物)可以包括不同形式的相同抗原；例如，組合物之 一可以包括單個(gè)抗原肽、蛋白、或多肽物種，而組合物的另一個(gè)可以包含能夠指導(dǎo)該相同抗原肽、蛋白或多肽物種的表達(dá)的核酸。更 進(jìn)一步i也，初始和/或加強(qiáng)組合物可包含4壬4可合適的基因遞送載體
(例如，DNA或RNA病毒，病毒基因組，"凈果露"DNA載體，質(zhì) 粒或不打算整合到將其引入的細(xì)胞的基因組中的其他遺傳元件，用 于整合(通過同源性重組、隨機(jī)插入或其他方式)的載體或其部分， 肽，蛋白質(zhì)或多肽物種，和/或設(shè)計(jì)用于任何特定指征(其中期望免 疫反應(yīng))的有才幾分子混合物。
現(xiàn)在轉(zhuǎn)到本發(fā)明的特定代表性、非限制性實(shí)施例，描述了涉及 纟會(huì)予皮月夫組織疫苗組合物隨后在月幾肉中加強(qiáng)(在兩種情況下都使用 電穿孔)的實(shí)驗(yàn)，以提供增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
實(shí)施例1
白色新西蘭兔的三個(gè)同齡組(n=4)用編碼完全人類IgG蛋白 的DNA 4妻種。該4妾種對(duì)于同齡組1 -3給藥如下
1 )第0天寸又月幾肉注射；
2)第0天皮膚接種；第7天月幾肉注射，每一種情況利用 電穿孔；
3 )第0天皮膚和肌肉都接種。
電穿孔使用具有能夠在月幾肉組織中注射和電穿孔的兩個(gè)相同 注射/電極的Elgen 1000 (Inovio AS， Oslo, Norway )裝置以及具有 用于皮月夫電穿孔的卡鉑電4及(9mmx9mm)的BTX ECM 820來(lái)實(shí) 施。對(duì)于皮膚和月幾肉的鄉(xiāng)會(huì)藥，在皮內(nèi)或月幾內(nèi)注射疫苗溶液后分別施 加電場(chǎng)。對(duì)于皮力夫，4妄種包括"使用28G針頭以在兔背部皮力夫中注射 30 (ag/30 pi的編碼IgG的DNA溶液。對(duì)于肌肉，接種包括在兔四 頭月幾中4吏用200 pi DNA/針-400 pl/注射部位或者20 |ag/400 jal hlgG 的月幾肉S主射(i.m.)。
12電穿孔條件
月幾肉250 mA, 20ms， 2月永沖，100 ms間隔(10 Hz ), 2曙4十陣 列，21G針頭，兩個(gè)針頭電極之間2mm距離，200 pl/針，1 cm總 插入深度，0.7cm注射深度；
皮膚100V/mm, 10ms， 5月永沖，ls間隔，30 iul/吾lM立。
如圖1所示，相對(duì)于單獨(dú)在月幾肉中或者4又作為初始4妄種在皮月夫 和肌肉中實(shí)施的接種，當(dāng)初始和加強(qiáng)接種分別在皮膚和肌肉中實(shí)施 時(shí)，針對(duì)兔中的人類IgG的抗體效價(jià)驚人地且顯著地更高。因此， 這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，抗原試劑在時(shí)間上間隔開地給予到不同組織能夠增 強(qiáng)對(duì)這樣的抗原試劑的免疫反應(yīng)。這樣的方法提供更快和更多地出 現(xiàn)^"對(duì)所述試劑的循環(huán)抗體。
實(shí)施例2
在這個(gè)實(shí)施例中，使用(BALB/c)小鼠免疫模型，表明了在 皮膚中的初始免疫和在第二組織如肌肉中的加強(qiáng)免疫并結(jié)合電穿 孔的附加優(yōu)點(diǎn)的驚人優(yōu)勢(shì)，其中如通過ELISA 4企測(cè)的研究了抗原特 異'!"生4元-IgGl和4元-IgG2a 4元體的歲:U介。這里4元畫IgGl和^t-IgG2a才元 體的使用提供了這樣的證實(shí)，即依照本發(fā)明的免疫方案增強(qiáng)了與炎 性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)的反應(yīng)(也稱為TH1反應(yīng))以及與調(diào)節(jié)性體 液免疫相關(guān)的反應(yīng)(也稱為TH2反應(yīng))。
在一個(gè)第一實(shí)驗(yàn)中，Balb/c小鼠的5個(gè)同齡組(n=7)在小鼠 四頭肌的皮膚(表皮)或肌肉組織中用30昭/30|^1的編碼乙型肝炎 表面抗原(g畫Wiz畫HBsAg ) (Aldevron LLC, Fargo, ND， USA)的質(zhì) 粒DNA (pDNA)接種，接著電穿孔。在肌肉中使用Elgen 1000裝置(Inovio Biomedical Corp, San Diego )而在皮月夫中寸吏用BTX ECM 820實(shí)施電穿3L。
對(duì)于肌肉處理，電穿孔使用50V且在250 mA的電流限值，5 個(gè)脈沖，20ms月永沖長(zhǎng)度，100ms間隔來(lái)實(shí)施。對(duì)于皮膚(表皮) 組織，電穿孔^f吏用卡鉑電極實(shí)施，其參數(shù)為3個(gè)脈沖，10 ms脈 沖長(zhǎng)度，150 V/mm,月永沖之間為1 s的間隔。
第1同齡組^又在第0天在皮月夫(皮內(nèi))組織接受初始接種(S0)。
第2同齡組在第0天在月幾肉中4妄受初始4妄種(M0)。
第3同齡組在第0天在皮膚(皮內(nèi))和月幾肉中4妾受初始4妄種 (S0M0 )。
第4同齡組在第0天在皮月夫(皮內(nèi))中4妾受初始4妄種然后在第 2天在月幾肉中進(jìn)4亍加強(qiáng)(S0M2)。
第5同齡組在第0天在皮膚(皮內(nèi))中接受初始接種然后在第 6天在月幾肉中進(jìn)4亍加強(qiáng)(S0M6)。
血清抗-HB特異性免疫反應(yīng)通過ELISA進(jìn)行4企測(cè)。(A)幾何 平均抗-HB IgGl抗體終點(diǎn)效j介(士標(biāo)準(zhǔn)誤差)在不同時(shí)間點(diǎn)(在第 一次免疫之后的第14、 21、 28和42天)進(jìn)4亍確定。注意到在第42 天的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，*p<0.05。 (B)幾何平均抗-HBIgG2a終點(diǎn) 效價(jià)(土標(biāo)準(zhǔn)誤差)在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行確定。也注意到在第42天的 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，*p<0.05。
以上方案的結(jié)果在圖2A和2B中示出。如清楚示出的，這種 接種疫苗方案提供了針對(duì)疾病靶抗原例如乙型肝炎抗原的增強(qiáng)效 價(jià)。治療方案增強(qiáng)了體液反應(yīng)以及細(xì)胞反應(yīng)。例如，圖2A示出了 抗-HB IgGl抗體硝基(體液的)，而圖2B示出了抗-HB IgG2a的免 疫反應(yīng)(纟田月包的)。令人驚異地，與包括使用電穿孔的在皮膚中的初始以及之后在月幾肉中的加強(qiáng)的4妄種方案相比，相同時(shí)間在兩個(gè)不 同組織中、或者可^辦4奐i也-f又在一種組織類型或者另 一組織類型例如 皮膚和肌肉、或者皮膚或肌肉中的接種會(huì)使效價(jià)更低。還令人驚異 的是，在初始和加強(qiáng)4妾種之間小到兩天的時(shí)間間隔的情況下，見察到 增強(qiáng)的效果。
其他數(shù)據(jù)表明，在第二組織如肌肉中的加強(qiáng)可從第 一次接種時(shí) 延遲，這里，至多20天，并且仍然對(duì)包括在皮膚(表皮)組織中 的初始和在月幾肉組織中的加強(qiáng)(二者均通過電穿孔)的免疫方案表
現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫效果。特別地，Balb/c小鼠的5個(gè)同齡組(每個(gè)同 齡組n=7 )在該小鼠四頭肌的皮膚(表皮)或肌肉組織中用30昭/30|^1 的質(zhì)粒g-Wiz-HBsAg ( Aldevron LLC, Fargo， ND ) 4妄種，4妻著進(jìn)4亍 電穿孔。對(duì)于肌肉治療，電穿孔使用Elgen 1000兩個(gè)相同的注射器 (Inovio Biomedical Corp， San Diego )實(shí)施，其中脈沖參教:i殳定為 50V和在250 mA的電流才及限，5個(gè)月永沖，20 ms月永沖長(zhǎng)度，月永沖之 間為100ms間隔。對(duì)于皮膚/表皮組織治療，電穿孔使用卡鉑電極 來(lái)實(shí)施，并且月永沖參凄t包括3個(gè)脈沖，10ms脈沖長(zhǎng)度，150V/mm, ls間隔。
第1同齡組在第0天在皮膚(皮內(nèi))組織接受接種(S0)。
第2同齡組在第0天在皮膚(皮內(nèi))中接受接種，然后在第20 天在皮月夫中再次進(jìn)4亍加強(qiáng)(S0S20)。
第3同齡組在第0天在肌肉中接受接種，然后在第20天在肌 肉中再次進(jìn)4亍加強(qiáng)(M0M20)。
第4同齡組在第0天在皮膚(皮內(nèi))中接受接種，然后在第20 天在肌肉中進(jìn)行加強(qiáng)(S0M20)。
第5同齡組在第0天在肌肉中接受接種并在第20天在皮膚(皮 內(nèi))中進(jìn)4亍力口強(qiáng)(M0S20)。來(lái)自這個(gè)實(shí)-驗(yàn)的結(jié)果示于圖3A和3B。特別地，血清抗-HB特 異性免疫反應(yīng)通過ELISA檢測(cè)。在圖3A中，幾何平均抗-HBIgGl 抗體(體液反應(yīng))終點(diǎn)效價(jià)(±標(biāo)準(zhǔn)誤差)在第一次疫苗接種后第 28天和第42天出現(xiàn)。示出的在第42天的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異為 *p<0.05。在圖3B中，示出了幾何平均抗-HB IgG2a反應(yīng)(細(xì)胞的)， 終點(diǎn)效<介±標(biāo)準(zhǔn)誤差。注意到在第42天的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異 (*p<0.05)。 #4居這些結(jié)果，4艮明顯，在一種組織類型中利用疫苗 初始免疫一個(gè)患者并在第二組織類型中進(jìn)行加強(qiáng)免疫有明顯的優(yōu) 點(diǎn)。在一個(gè)特別伊C^選的方面，在皮3夫/表皮組織中經(jīng)由電穿孔的初始 免疫以及在月幾肉中經(jīng)由電穿孔的加強(qiáng)免疫中實(shí)i見了一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。而 且，在第一次<接種之后，在時(shí)間上延遲至少2天，優(yōu)選6和/或7 天，并且可替換地優(yōu)選在7天之后如在第20天，進(jìn)4亍加強(qiáng)免疫可 以看到一定的好處。
本文所4皮露和要求保護(hù)的所有組合物以及方法可々艮據(jù)本4皮露 內(nèi)容無(wú)需過度實(shí)-驗(yàn)而完成和實(shí)施。雖然本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng) 依照優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)， 明顯的是，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對(duì)于本文所描 述的組合物和方法，以及所述方法的步駛《或步-驟的順序可以有各種 變化。更具體地，所描述的實(shí)施方式在所有方面僅認(rèn)為是舉例說(shuō)明 性的而不是限制性的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有類似替 代和修改認(rèn)為是在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
本說(shuō)明書中提到的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物指示本發(fā)明所 述領(lǐng)域的普通沖支術(shù)人員的水平。所有專利、專利申請(qǐng)和出版物(包
括其所要求的優(yōu)先權(quán)或另一種權(quán)益的那些)在本文中通過引用將其 如同每一個(gè)單個(gè)出版物具體和單個(gè)地指定通過引用并入的相同程
度并入到本文中。本文中舉例說(shuō)明性地描述的本發(fā)明合適地可以在沒有本文中 沒有具體4皮露的任何元件的情況下實(shí)施。因此，例如，在本文的每 一種情況下，術(shù)語(yǔ)"包括"、"基本還是由...組成"以及"由...組成" 中任一個(gè)可以用其他兩個(gè)術(shù)語(yǔ)代替。已經(jīng)采用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)用作描 述的術(shù)語(yǔ)而不用于限制，并且并不意圖^f吏用這樣的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)暗示 排除在其整體或其部分總所示和所述的特征的任何等同物，但是應(yīng) 當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在所要求的本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種修改。因此，
行了披露，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行本文披露的構(gòu)思的修改和 變形，并且這樣的修改和變形認(rèn)為是在由所附權(quán)利要求所限定的本 發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明涉及可專利的過程和方法。才艮據(jù)本發(fā)明的"可專利"過 程或方法，如同任何可專利機(jī)器、制造的制品、物質(zhì)的組合物一樣，
如，對(duì)于新穎性、創(chuàng)造性等，如果后續(xù)審查表明，所附權(quán)利要求中 的一個(gè)或多個(gè)涵蓋否定新穎性、創(chuàng)造性等的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式， 則通過限定限制至"可專利"實(shí)施方式的權(quán)利要求，特別排除不可 專利的實(shí)施方式。而且，本發(fā)明所附權(quán)利要求應(yīng)解釋為提供最寬的 合理范圍，以及保持它們的有效性。此外，如果對(duì)于可專利性的一 個(gè)或多個(gè)法定要求被修改或者如果對(duì)于評(píng)價(jià)對(duì)于可專利性的特定 法定要求從該申請(qǐng)?zhí)峤粫r(shí)是否滿足的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生變化，或者所附權(quán)利 要求中的 一個(gè)或多個(gè)的有效性在授予專利時(shí)被質(zhì)疑，則權(quán)利要求應(yīng) 以在該情況下(1 )保持它們的有效性和(2)提供最寬的合理解釋 的方式進(jìn)行解釋。
1權(quán)利要求
1. 一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中的免疫反應(yīng)的方法，包括在第一時(shí)間向所述哺乳動(dòng)物在第一組織遞送部位給予疫苗組合物的第一推注，接著在第二時(shí)間向所述哺乳動(dòng)物在第二組織遞送部位給予所述疫苗組合物的加強(qiáng)推注，所述加強(qiáng)遞送在所述第一時(shí)間之后的2到10天給予所述哺乳動(dòng)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一推注和加強(qiáng)推注 的所述給予包括在給予所述第一推注和/或加強(qiáng)推注的給予之 前、同時(shí)或之后的至少一個(gè)電穿3L電力永沖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人類。
4. 4艮據(jù)^l利要求2所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是動(dòng)物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述疫苗組合物包含多肽 抗原。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述疫苗組合物包含編碼 4元原的核酸，所述4元原在所述哺乳動(dòng)物中能夠,人所述核酸凈皮表 達(dá)。
7. 才艮據(jù)4又利要求1所述的方法，其中，所述第一組織遞送部位包 4#選自由皮月夫、表皮和皮下組織組成的組中的組織。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第二組織遞送部位包 括選自由肌肉、橫紋肌和平滑肌組成的組中的組織。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述向第一組織部位給予 組合物與所述向第二組織部位給予組合物在時(shí)間上間隔2天 到30天。
10. —種4吏哺乳動(dòng)物免疫的方法，包4舌向所述哺乳動(dòng)物在第一時(shí)間 在所述哺乳動(dòng)物的第一組織纟會(huì)予部4立遞送疫苗組合物的至少 一個(gè)第一4#注，*接著向所述哺乳動(dòng)物在第二時(shí)間在所述哺乳動(dòng) 物上的第二組織給予部位遞送加強(qiáng)疫苗組合物的至少 一 個(gè)推 注。
11. 4艮據(jù)片又利要求10所述的方法，其中，所述第一4,注和加強(qiáng)推注的所述給藥包括在所述第一推注和加強(qiáng)推注的給藥之前、同 時(shí)或之后的至少一個(gè)電穿孔電脈沖。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人類。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是動(dòng)物。
14. 才艮據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述疫苗組合物包含多 肽抗原。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述疫苗組合物包含編 碼抗原的核酸，所述抗原在所述哺乳動(dòng)物中能夠/人所述核酸表 達(dá)。
16. 4艮據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述第一組織給予部位 包括選自由皮膚、表皮和皮下組織組成的組中的組織。
17. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述第二組織給予部位 包括選自由肌肉、橫紋肌和平滑肌組成的組中的組織。
18. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述向所述第一組織部 位給予組合物與所述向所述第二組織部位給予組合物在時(shí)間 上間隔3天到4周。
全文摘要
本發(fā)明披露了增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法。這樣的方法涉及向不同組織給予疫苗組合物以引發(fā)增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。該增強(qiáng)的免疫反應(yīng)由在兩個(gè)分開的患者組織中接種疫苗以及給予加強(qiáng)的途徑所產(chǎn)生，例如，通過首先向皮膚內(nèi)給予初始免疫，隨后向肌肉中給予加強(qiáng)免疫。在每一種情況(初始和加強(qiáng)免疫)下，該疫苗組合物的給予優(yōu)選使用同時(shí)電穿孔輔助遞送抗原試劑來(lái)實(shí)施。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101522211SQ200780037742
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者伊麗莎白·托倫·謝爾勒, 戴爾特墨·拉布塞, 峰 林, 雅各布·馬蒂森, 魯內(nèi)·謝肯 申請(qǐng)人:基因特倫尼克斯公司