專利名稱：：預(yù)防性結(jié)核疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(complex)毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合!^(MrB-C廣弓胞的一種慢性感染性疾病，戶腿結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群目前包括結(jié)核分枝桿菌(M/w6ercw/a^J、牛分支桿斷MBo—、田鼠分支桿菌(M附/cro^^^瞎'卜l:^支桿菌(AfW/c麵附入根據(jù)世界衛(wèi)生組織，世界范圍內(nèi)每年記錄感染該疾病的新增病例約為8,000,000例，約3，000，000人死亡。認(rèn)為世界范圍內(nèi)現(xiàn)有皿2,000，000，000的人感染，每年產(chǎn)生新的感染數(shù)約為9千萬-l億。現(xiàn)有用于預(yù)防治療結(jié)核的疫苗是基于菌株BCG(卡介節(jié)的，其是牛分支桿菌的一種減毒變體?，F(xiàn)有技術(shù)中描述了多種基于分枝桿菌屬毒力株或無毒力株的細(xì)胞壁片段的抗結(jié)核疫苗。還描述了用于該疫苗組合物中的佐劑顯著地影響其效果。E.Ribi等,Nature1963，198,1214-1215頁描述了4頓包含無毒力BCG株的細(xì)胞壁片段和礦物油的組合物進行的免疫測定。所述片段通過在礦物油中勻漿所述菌株的培養(yǎng)物獲得。該組，比傳統(tǒng)的疫苗(BCG)更為有效。然而，在同一篇文章中提到在水中并且不存在礦物油的條件下勻1時，其不能引起倒可免疫反應(yīng)。D.P.Pal等，IndianJ.MedRes.1977，65,340~345頁，描述了用H37Rv毒力株的細(xì)鵬片段和礦物油制備的疫苗。在這種情況下，戶腿細(xì)M片段M將死細(xì)胞婦細(xì)中勻漿獲得，隨后向組合物中加入礦物油。其同樣描述了該7K相中的細(xì)胞斷段是非免疫原性的，礦物油的存，于疫苗的效力來說是必須的。GK,Khuller等，F(xiàn)oliaMicrobiol.,1992，37,407412頁，描述了用Freund不完全佐劑制備的結(jié)核分枝桿菌H37Ra無毒力,胞壁的不同片段的，效果，其同樣包括了礦物油。RM.Agger等,Scand.J.Immunol"2002，56，443氺7頁，描述了包含H37Rv毒力株的細(xì)胞壁片段的疫苗，當(dāng)其包含陽離子表面活性劑二甲基雙十八銨溴化物作為佐劑時是有效的。其同樣描述了在鼠模型觀啶中，使用不含有戶艦佐劑的勻漿的結(jié)核分枝桿菌并不會產(chǎn)對結(jié)核的抗性水平。I.M.OrmeVaccine,2006，24,2-19頁(其為關(guān)于抗結(jié)核新疫苗的近期綜述文章)，描述了常規(guī)的BCG疫苗在if[^人結(jié)核中基本上是無效的。在同一篇文章中還說明，對接受不同類型疫苗(蛋白亞單位疫苗、DNA疫苗、病毒組合疫苗、重組株疫節(jié)的若干個候選行了領(lǐng)l賦，并且預(yù)期了新的發(fā)展。因此，需要一種預(yù)防性疫苗來預(yù)防由結(jié)核分枝桿菌弓胞的感染，其比基于減毒BCG株的當(dāng)前疫苗更為有效。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是包含MTB"C毒力胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療由結(jié)核分枝桿菌弓l起的感染的藥物中的用途。發(fā)明詳述專利申請ES2231037-A1公開了一種制備包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合ll(Mra-C)毒力株的細(xì)胞壁片段的免疫治療劑的方法。其同樣公開了含有該治療劑的組合物以及其用于與其他藥物聯(lián)用治療結(jié)核的治療應(yīng)用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了戶腿免疫治療劑在審恪預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途。因此，本發(fā)明的目的在于包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合^(MTB-C)毒力糊鵬片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，其中戶脫治療劑艦包含下述步驟的方法獲得-培養(yǎng)MTB"C毒力株等于或大于3周，隨后-在非離子表面活性劑的雜下勻魏胞歸物。戶，毒力株可以是MTB"C的樹可毒力株。本領(lǐng)域研究人員最常用的毒力fe—被稱為H"Rv，其可以在國家標(biāo)準(zhǔn)菌^(NationalCollectionofTypeCulture)(NCTC)，倫敦，英國免費獲#(皿號NC007416)o戶;M毒力株可以在本領(lǐng)域公知的培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，例如Mddlebraok7H10或7H11瓊月旨，Sauton培養(yǎng)基或Proskauer-Beck線基。在等于或大于3周的期間JW毒力株，包含3周至4周。培養(yǎng)的，維持在34"38。C之間。一旦培養(yǎng)結(jié)束，采用諸如專利申請ES2231037-A1中描述的技術(shù)分離細(xì)胞?；罴?xì)胞的勻漿在非離面活性劑存在下，,在中性pH(例如在pH6-8之間)緩沖介質(zhì)中進行，例如由PBS緩沖銜磷離緩沖銜麟。可以通M聲處理的方法進行勻漿，或Mii約lmm直徑的小爽例如zm化誠二氧化鋯/二氧化硅珠)和機械勻槳器的方法進行。可采用的機械勻漿器例如為BioSpecBeadBeate漲型。通過該勻漿方法裂解MTB-C⑧細(xì)胞，獲得細(xì)胞壁小片段。該勻漿方法中4頓的非離子表面活性劑tt^自縫酚乙氧掛七物、山梨聚糖酯乙氧基化物及其混合物。更雌的，所述非離子表面活性劑選自雜酚乙tt化物。更雌的，艦包含7-8摩爾的環(huán)氧乙烷成分的辛基酚乙氧^f七物，該表面活性劑可以TritonX-l14⑧的名稱在市場上找到。在勻漿步驟中，所述非離子表面活性齊啲含量雌占勻漿物總重量的1%-10%M，更雌在3%-6%重量之間。艦常規(guī)處理分離含有細(xì)^段的勻漿物，并棄去非片段飾胞和可溶的成分。例如可應(yīng)用如專利申請ES2231037-A1中描述的在不同速度下的離心和緩沖溶液的洗滌。所職化步驟后，獲得含有細(xì)胞壁片段的沉淀物。將戶腿沉淀物分散于PBS緩沖液中，進行常規(guī)處理保證在片段化和純化步驟后還可能保持活性的MTB-C細(xì)胞的完全失活。所述的處理可以是化學(xué)方法，例如用甲醛處理，或物理方法，例如ilii高壓滅菌或巴斯德滅菌處理的施?？梢詢龈蓽缁钐幚砗笤赑BS緩沖液中的細(xì)M片段的分散齊似利于存儲。最后戶腿分散劑可分輕小瓶中，在-15至-25'C之間凍干，真SS為0.1-0.5mbar。凍干步驟后獲得的小瓶含有包含MTB-C細(xì)片段的免疫治療劑，其通常儲存在很低的鵬下，例如-7(TC。如前所述，本發(fā)明的目的是包含MIB-C毒力片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，艮P，在制滅結(jié)核疫苗中的用途。該預(yù)防性治療結(jié)核的藥物包含基于細(xì)胞壁片段的免疫治療劑以及任選的可藥用稀釋劑、佐劑和/^W劑。臓藥物可以是磷酸緩沖忠K、7jC溶液、乳劑劍旨質(zhì)體的形式。該藥物雌為脂質(zhì)體的形式?？刹捎贸Ｒ?guī)輔助脂質(zhì)和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的獄，例如在專利申請ES2231037-A1中公開的另卩些，來形^B^脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體通常包括帶中性和/或陰性凈電荷的磷脂，以及甾醇類。所4頓的糊旨可以是，例如磷脂醐旦堿、磷脂,氨酸和磷脂鵬醇。戶m脂質(zhì)體的主要成分通常為磷脂miM堿，其可以合成m天然來源分離。常用的商業(yè)產(chǎn)品^u^衍生的卵磷脂，其為包括磷脂翻旦堿在內(nèi)的a^的磷脂混合物。用于制備脂質(zhì)體的甾醇類可以是膽固醇和膽鹽。戶腿脂質(zhì)體im^大豆衍生的卵磷脂和膽酸鈉的混合物形成。劍旨質(zhì)體任選的含有改善其穩(wěn)定性的添加劑，例如維生素E，其作為脂質(zhì)抗氧化劑起作用。獲得柳旨質(zhì)體通常具有這樣的大小分布99.9%小于1。所述脂質(zhì)體可進行凍干，以獲得凍干脂質(zhì)體形式的免疫治療劑。該藥物可以作為單劑或多劑的形式以一定的時間間隔重復(fù)施用，優(yōu)選的兩次給藥間隔2-5周，優(yōu)選間隔34周。該藥物可以經(jīng)粘膜給藥，例如，經(jīng)眼、鼻內(nèi)、口腔、胃、腸道、陰it^t粘膜，或胃腸外給藥，例如經(jīng)皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜S;WM內(nèi)。優(yōu)選胃腸外給藥。合適的劑量于^個參數(shù)，包括給藥的方法和所治療的，，但的劑量是1pg至1000pg之間，更優(yōu)選為25-700昭，更優(yōu)選為50-200呢。戶，包含MTB-C毒力胞壁片段的藥物可與其它結(jié)核的預(yù)防'|苗1^施用，例如在S.H.E.Kaufinann^NatureRev.Immunol.2006，6，699-704中蹈lj的那些，例如諸如BCG疫苗、亞單位疫苗或重組BCG疫苗。戶，疫苗的組合可同時施用，或間隔一定的時間分開接種兩次完成。接種之間的時間甚至可以皿數(shù)年。在分開接種的情況下，皿首先施用抗結(jié)核的預(yù)防性疫苗，而隨后施用作為首次接種疫苗再剌激(增強瀏的包含MTB-C毒力糊SK)t段的藥物。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，施用戶;M包含基于廳-c毒力鄉(xiāng)!Wt段的免疫治療齊啲藥物會,誘導(dǎo)TM型干擾素Y產(chǎn)生針對結(jié)核分枝桿菌特異餓原的應(yīng)答。戶;f^C原包括Ag85B和Ag85A，其為Ag85復(fù)合物的--部分，該復(fù)合物由在細(xì)生物合成中起決定性作用的低肝量蛋白家族《賊并且在細(xì)菌培養(yǎng)對數(shù)期大M^生。已觀察到傳統(tǒng)的BCG疫苗不產(chǎn)生針對復(fù)合物Ag85抗原的免疫做應(yīng)答，其可能代表了較低的，能力。同樣發(fā)現(xiàn)接種戶艦免疫治療劑后用毒力株H37Rv感染的小,市中的存活菌數(shù)目低于對照小鼠組中的存活菌數(shù)目，并且戶皿數(shù)目與接種常規(guī)BCG疫苗的小鼠中的情況相當(dāng)。以下實施例用于向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本發(fā)明特定實施方案的詳細(xì)解釋。實施例1免疫治療劑作為針對結(jié)核分枝桿菌引起感染的預(yù)防性疫苗的效果。本例中使用的免疫治療劑按照專利申請ES2231037-Al中實施例2描述的方法制備。所述基于MTB-C毒力株細(xì)鵬片段的免疫治療齊啲媒在6-8周齡且賺定病原體的C57BL/6型睢性小鼠中進行測定。小鼠被分成3組，每組12只，按下述接種方案進行1)無接種(對照組)，2)在微的第3周和第6周皮下接種兩劑的專利申請ES2231037-A1實施例2中獲得的285Mg免疫治療劑，3)在1^第0周時皮下接種2><106形,位的BCG丹麥菌銜Statens血清研究所，丹麥)。使用在Praskauer-Beck培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期的結(jié)核分枝桿菌的毒力株(H37RvPasteur)感染，將其以lml的等分存儲在-7(TC下備用。在試驗的第9周將小鼠置于Mddlebrook氣霧劑感染儀中用所述毒力株的氣霧劑感染，其在小鼠肺中微了約10-50存活菌的接種物。在動物被氣霧劑感染后3周(微的第12周)后，聊市勻漿的系列稀釋液在Middlebrook7H11瓊脂中于37'C下培養(yǎng)4周，測定肺中的存活菌數(shù)。肺在lml雙蒸7乂存在下勻漿。表I的結(jié)果,御市中鑒定的每，^^形成單位(CFU)的對數(shù)表I小鼠組疫苗Log10CFU/ml1無(對照組)6,42±0242月旨質(zhì)體包裹的免疫治療劑5.72±0.303BCG5.71±0.58未接種小鼠組和接種組結(jié)^L間的差異是統(tǒng)計學(xué)顯著性的?？梢杂^察到，在接種脂質(zhì)體包裹的免疫治療劑的小鼠組中，檢測至啲肺部存活菌劍氐于未接種小鼠中的情況，與接種常規(guī)BCG疫苗的小鼠中的數(shù)目基料目同。因此，接種基于MTB-C毒力鄉(xiāng)胞斷段的免疫治療劑實現(xiàn)了對由結(jié)核分枝桿菌弓I起的感染的保護作用。實施例2免疫治療劑產(chǎn)生針對結(jié)核分枝桿菌引起感染的特異性Thl應(yīng)答的有效性本實施例中^ffi的免疫治療劑按照專利申請ES2231037-Al中實施例2描述的方法制備。所述基于MTB"C毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑的有效性在6-8周齡且，定病原體的C57BL/6型雌性小鼠中進行體外i微測定。小鼠被分成4只一組，按下述接種方^S行1)在試驗的第3周和第6周皮下接種鹽水(對照組)，2)在試驗的第3周和第6周皮下接種兩齊摶利申請ES2231037-A1實施例2中獲得的285Mg免疫治療劑，3)在微第0周時皮下接種2xl()6離形鵬位的BCG丹麥菌銜Statens血清研究所，艘)，在微的第3和第6周接種舫乂。4)在試驗第3周時皮下接種2xl06菌落形成單位的結(jié)核分枝桿菌的毒力株(H37RvPasteur)，在微的第6周接種lbJC。小鼠在第7周處死，取其脾臟，浸泡在含有5mlL-谷氨i^-RPMl(Gibco)的試管中。試管保留在冰中直至微結(jié)束。機械裂解脾臟，用直徑70拜的尼龍篩過濾懸浮液，隨后在300g下離心10併巾。沉淀物用15mlTris和氯化銨的雙蒸水溶液重構(gòu)，對細(xì)Kffi豫解。8射中后用20mlL-谷氨Sfcfl安-RPM1洗滌，在300g下離心10分鐘。將獲得的沉淀再懸浮于5mlL-谷氨St^-RPMl中，懸細(xì)直徑70拜的尼龍篩過濾。用Neubauerchamber計數(shù)細(xì)胞。將來自小鼠脾臟的細(xì)胞以lxl()5細(xì)胸孔的比例接種于培養(yǎng)皿中，用200m1由補充有滅活的胎牛血清、艦西林、鶴素、丙酮,和2-巰基乙醇的L谷胺E^-RPMI纟賊的完全培養(yǎng)與CCM)或200Ml補充結(jié)核分枝桿菌，(10ng/ml的抗原PPDXstatens血清研究所，iW)和5ng/ml的ESAT-6、Ag85A和Ag85B(LionexDiagnosticsandTTier^euticsGmbH,德意志聯(lián)邦共和國)的完全培養(yǎng)萄CCM)蹄。這些細(xì)胞在37。C下于5^的c02氣氛中孵育。％小時后，培養(yǎng)皿在300g下離心10頒，麟它們每一個的上清液。冷凍上清液，^EB^狀態(tài)保留至少24小時后，用雙夾心ELISA技術(shù)采用對鼠干擾素y特異性的單克隆抗^iaclone)分析干擾素Y成分。表n顯示了以1og,op^ml表示的平均千擾素Y濃度，M每一組小鼠中針對結(jié)核分枝桿菌抗原而被誘導(dǎo)。表n<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(1)組2和組3之間的統(tǒng)計學(xué)顯著差異(2)組2和組4之間的統(tǒng)計學(xué)顯著差異(3)組3和組4之間的統(tǒng)計學(xué)顯著差異表n的結(jié)果顯示，細(xì)基于結(jié)核分枝桿菌毒力胸胞壁片段的脂質(zhì)體爐的免疫治療劑接種2次會^誘導(dǎo)產(chǎn)生針對結(jié)核分枝桿菌特異'鵬原的干擾素Y。這表示其誘導(dǎo)了Thl型保護'腿答。特別的，由接種針對抗原PPD、Ag85B和Ag85A的脂質(zhì)體爐的免疫治療劑的小鼠組誘導(dǎo)的應(yīng)答與接種結(jié)核分枝桿菌H37RV毒力株的小鼠組的應(yīng)答之間沒有顯著差異。戶腿應(yīng)答比接種BCG菌銜常規(guī)疫節(jié)的小鼠組反應(yīng)更好，因為后者僅誘導(dǎo)針對PPD而不針對Ag85B和Ag85A的應(yīng)答。只有接種戶皿毒力株的小鼠組能誘導(dǎo)針)m原ESAr-6的應(yīng)答。因此，基于結(jié)核分枝桿菌毒力胸鵬片段的免疫治療劑能誘導(dǎo)針對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的Thl型^^'腿答，表明其可有效用于預(yù)防由結(jié)核分枝桿菌弓胞的感染。權(quán)利要求1、包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，其中所述治療劑通過包含以下步驟的方法獲得一培養(yǎng)所述MTB-C毒力株等于或大于3周的時間，以及隨后一在非離子表面活性劑的存在下勻漿該細(xì)胞培養(yǎng)物。2、權(quán)利要求1的用途，其特征在于培養(yǎng)時間在34周之間。3、權(quán)利要求1或2的用途，辦征在于臓非離子表面活性劑選自'^S酚乙竊化物、山梨聚糖酯乙氧,物及其混合物。4、權(quán)利要求3的用途，辦征在于戶腿非離豫面活性劑選自雜酚乙氧靴物。5、權(quán)利要求4的用途，賺征在于戶腿非離子表面活性劑選自含有7-8摩爾環(huán)氧乙烷成分的酚乙氧,物。6、權(quán)利要求1-5任一戶;M的用途，，征在^3槳在中性pH值的緩沖介質(zhì)中進行。7、權(quán)利要求1-6任一戶脫的用途，其特征在于戶雄方法進一步包括下列步驟—i!31離心分離未片段化的細(xì)胞和溶解的成分，—對細(xì)鵬片段級鄉(xiāng)行化學(xué)或物理處理，滅活最終含有的最終毒力胸胞，以及一Mil凍干的方^B喿獲得的免疫治療劑。8、權(quán)利要求l-7任一戶腿的用途，其特征在于戶腿藥物為脂質(zhì)體的形式。9、權(quán)利要求1-8任一戶腐的用途，其特征在于以單劑或多齊啲形用戶腿藥物。10、權(quán)利要求9的用途，^T征在于以雙劑的形式施用戶艦藥物。11、權(quán)利要求10的用途，其特征在于戶腿的雙劑以2-5周的間隔絲施用。12、權(quán)利要求1-11任一戶腿的用途,嫌征在于與其它抗結(jié)核的預(yù)防性疫苗齢施用艦藥物。13、權(quán)利要求12的用途，其特征在于戶腿疫苗在時間上分開的兩次接種中齢施用。14、權(quán)利要求13的用途，其特征在于首先鵬抗結(jié)核的預(yù)防性疫苗，隨后施用包含MTB-C毒力胞壁片段的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)毒力株細(xì)胞壁片段的免疫治療劑在制備預(yù)防性治療結(jié)核的藥物中的用途，其中所述試劑通過包含以下步驟的方法獲得培養(yǎng)所述MTB-C毒力株等于或大于3周，以及隨后在非離子表面活性劑的存在下勻漿該細(xì)胞培養(yǎng)物。文檔編號A61K39/04GK101600455SQ200780040568公開日2009年12月9日申請日期2007年10月17日優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日發(fā)明者I·阿馬特列拉,P·J·卡多納伊格萊西亞斯申請人:阿爾西維爾法爾瑪公司