專利名稱：選擇性胰高血糖素樣肽-2(glp-2)類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like-peptide-2，GLP-2)類似物及其醫(yī)藥用途，例如在預(yù)防或治療胃和腸相關(guān)疾病以及減輕化學治療和/或放射治療的胃腸相關(guān)副作用方面的醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：
GLP-2是33個氨基酸的肽，其來自于對腸中腸內(nèi)分泌L細胞中以及腦干的特定區(qū)域中胰高血糖素原(proglucagon)的特定翻譯后加工。它與胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胃泌酸調(diào)節(jié)素和腸高血糖素(glicentin)一起應(yīng)答于養(yǎng)分攝入而共分泌。
GLP-2通過刺激隱窩中干細胞增殖和抑制絨毛凋亡來誘導(dǎo)小腸粘膜上皮的顯著生長(Drucker等Proc Natl Acad Sci U S A.1996，937911-6)。GLP-2還對結(jié)腸具有生長效應(yīng)。GLP-2還抑制胃排空和胃酸分泌(Wojdemann等J Clin Endocrinol Metab.1999，842513-7)、增強腸屏障功能(Benjamin等Gut.2000，47112-9)、通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白來刺激腸的己糖轉(zhuǎn)運(Cheeseman，.Am J Physiol.1997，R1965-71)以及提高腸的血流量(Guan等Gastroenterology.2003，125，136-47)。
GLP-2與屬于II類胰高血糖素分泌素家族的單G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合。GLP-2受體在已知應(yīng)答于GLP-2的部位(小腸、結(jié)腸和胃)中表達(Yusta等.Gastroenterology.2000，119744-55)。然而，胃腸道中GLP-2受體刺激的靶細胞仍不清楚，并且對與GLP-2受體偶聯(lián)的下游胞內(nèi)遞質(zhì)(mediator)的了解甚少。
GLP-2在小腸中已被證實的特異性并有益的效果已經(jīng)引起了人們在治療腸疾病或損傷中使用GLP-2的極大興趣(Sinclair和Drucker，Physiology2005357-65)。而且，已顯示GLP-2在多種臨床前腸損傷模型中預(yù)防或降低粘膜上皮損傷，所述模型包括化學治療誘發(fā)的腸炎、缺血-再灌注損傷、硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的結(jié)腸炎以及炎性腸病的遺傳模型(Sinclair and DruckerPhysiology 2005357-65)。
另外，GLP-2R mRNA在胃中的表達(Yusta等，2000)與GLP-2減少胃動力及胃酸分泌的觀察結(jié)果(Meier等，2006)一起提供了充足的證據(jù)證明胃直接或間接地應(yīng)答于GLP-2。
盡管如此，對于GLP-2或GLP-2類似物在特征為胃壁內(nèi)襯(gastriclining)損傷之病癥中的用途還沒有進行研究。
GLP-2以具有以下序列的33個氨基酸的肽的形式分泌H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。其迅速地被酶DPP IV在NH2端的2位丙氨酸(A)處切割，形成無活性的人GLP-2(3-33)。除了腎清除之外，GLP-2(1-33)的這種快速酶降解導(dǎo)致該肽的半衰期為約7分鐘(Tavares等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.278E134-E139，2000)。
US 5,994,500(Drucker等)描述了GLP-2拮抗劑及其對胃腸組織生長的影響。其提出了將所述拮抗劑配制成藥物用于治療增生或誘導(dǎo)發(fā)育不全。US 5,994,500通過突變例如替換和缺失來改變哺乳動物GLP-2的結(jié)構(gòu)。
US 6,184,208、US 5,789,379和US 6,184,201公開了GLP-2類似物及其醫(yī)藥用途。這些類似物全是通過人GLP-2的替換和/或缺失得到的。
DaCambra等(Biochemistry 2000，39，8888-8894)描述了GLP-2活性的結(jié)構(gòu)決定因素。這種決定因素的實例是Phe6和Thr5，所述Phe6和Thr5稱為對GLP-2受體結(jié)合和活化是至關(guān)重要的。
WO97/39031公開了GLP-2類似物[Gly2]GLP-2。其中2位的丙氨酸被甘氨酸取代，以使所述肽抵抗DPP IV切割。顯示丙氨酸的取代提高所述肽的穩(wěn)定性和效能(potency)。該專利申請描述了如何使用GLP-2類似物對抗腸上皮粘膜炎癥和破壞相關(guān)的疾病。它們包括大規(guī)模小腸切除、炎性腸病、化學療法和/或放射誘發(fā)的粘膜炎以及缺血性損傷。
WO02/066511描述了體內(nèi)半衰期延長的GLP-2類似物及其作為治療胃腸病癥如炎性腸疾病的藥物的用途。
WO 01/41779描述了h[Gly2]GLP-2用作抑制化學療法誘導(dǎo)之凋亡和促進小腸上皮細胞存活的預(yù)處理的用途。
本文引用的所有參考文獻明確地通過參考整體并入本文。
許多科學家已提出將GLP-2或GLP-2類似物用于治療多種疾病。但是，仍然需要改進的和具有小腸選擇性的GLP-2類似物。


發(fā)明內(nèi)容
一般而言，本發(fā)明涉及GLP-2類似物其與野生型GLP-2相比包含一個或多個替換，并可具有小腸相對于結(jié)腸的選擇性提高、體內(nèi)生物活性提高和/或化學穩(wěn)定性提高(例如體外穩(wěn)定性測定中所評估的)的特性。更具體地，優(yōu)選的本發(fā)明GLP-2類似物包含野生型GLP-2序列中8、11、12、13、16、17、18、20、21、24和/或28位中一個或多個位置上的非保守性替換，其任選還具有野生型GLP-2序列中2位(如引言中所述的)以及3、5、7和10位中一個或多個位置上的其他保守性或非保守性替換和/或31至33位上一個或多個相應(yīng)氨基酸的替換或缺失，并任選地還具有N端或C端穩(wěn)定肽序列的添加。另外，本發(fā)明的GLP-2類似物可包含對應(yīng)于9、14和15位的一個或多個氨基酸的保守性替換。除了提供可具有提高的化學穩(wěn)定性和/或生物活性的GLP-2類似物之外，本發(fā)明還涉及提供與結(jié)腸相比在小腸中具有偏好性腸生長促進活性(反之亦然)的化合物，特別是通過包含對野生型GLP-2中Asn11和/或Asn16和/或Arg20和/或Asn24和/或Gln28位中的一個或多個位置進行修飾來實現(xiàn)。
因此，在一個方面中，本發(fā)明提供了通式I代表的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物 R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2· 其中 R1是氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；⒓柞；?、苯甲?；蛉阴；?； X2是Gly、Ala或Sar； X3是Glu或Asp； X5是Ser或Thr； X6是Phe或Pro或保守性替換； X7是Ser或Thr； X8是Asp或Ser或保守性替換； X9是Glu或Asp或保守性替換； X10是Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸； X11是Y1； X12是Thr或Lys或保守性替換； X13是Ile、Glu或Gln或保守性替換； X14是Leu、Met或Nle或保守性替換； X15是Asp或Glu或保守性替換； X16是Y2； X17是Leu或Glu或保守性替換； X18是Ala或Aib或非保守性替換； X19是Ala或Thr或保守性替換； X20是Y3； X21是Asp或Ile或保守性替換； X24是Y4； X28是Y5； X31是Pro、Ile或缺失； X32是Thr或缺失； X33是Asp，Asn或缺失； R2是NH2或OH； 其中 Z1和Z2獨立地不存在或者是選自以下的1-10個氨基酸單元的肽序列Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn；通過HPP＝∑hpiX11+hpiX16+hpiX20+hpiX24+hpiX28算出的式I中X11、X16、X20、X24、X28殘基的親水性圖(hydrophaticityprofile，HPP)≥-10 其中 Y1、Y2、Y4和Y5可各自選自Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe；并且 Y3可選自Asn、Asp、Glu、Gln、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe； 前提條件是，當X20是Arg時，則X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括如上所述的胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)類似物，其中HPP≥-4。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括如上所述的胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)類似物，其中HPP≥0。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了由通式II代表的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物 R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 其中 R1是氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙?；? X2是Gly、Ala或Sar； X3是Glu或Asp； X5是Ser或Thr； X6是Phe或Pro； X7是Ser或Thr； X8是Asp或Ser； X9是Glu或Asp； X10是Met、Leu、Nle或氧化性穩(wěn)定的Met取代氨基酸； X11是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val； X12是Thr或Lys； X13是Ile、Glu或Gln； X14是Leu、Met或Nle； X15是Asp或Glu； X16是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val； X17是Leu或Glu； X18是Ala或Aib； X19是Ala或Thr； X20是Asn、Arg、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr或Val； X21是Asp或Ile； X24是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val； X28是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val； X31是Pro、Ile或缺失； X32是Thr或缺失； X33是Asp、Asn或缺失； R2是NH2或OH； 其中 Z1和Z2獨立地不存在或者是選自以下的1-10個氨基酸單元的肽序列Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn； 前提條件是，當X20是Arg時，則X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括如上所述的GLP-2類似物，其中 X11是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val X16是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val X20是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val X24是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val X28是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括如上所述的GLP-2類似物，其中 X11是Ala、Ile、Leu、Phe或Val； X16是Ala、Ile、Leu、Phe或Val X20是Ala、Ile、Leu、Phe或Val X24是Ala、Ile、Leu、Phe或Val X28是Ala、Ile、Leu、Phe或Val。
在又一個實施方案中，本發(fā)明包括如上所述的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物與野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，并且具有在體內(nèi)導(dǎo)致腸質(zhì)量增加的生物活性。
在又一個實施方案中，本發(fā)明包括如下所述的GLP-2類似物，其具有X11、X16、X20、X24和/或X28位上的多于一個替換(即相對于上文給出的野生型序列具有多于一個替換)和/或一個或多個所述替換與X3、X5、X7和/或X10位上的一個或多個替換相組合。
在又一個實施方案中，本發(fā)明包括X10的替換是Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸(例如Met(O)或Met(O)2)的GLP-2類似物。因此，作為上述替換的補充或替代，所述GLP-2類似物可在X10位上具有Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸(例如Met(O)或Met(O)2)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，所述GLP-2類似物與具有本申請背景技術(shù)部分中所示序列的野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地，至少63％的序列同一性，更優(yōu)選至少66％的序列同一性，再優(yōu)選至少69％的序列同一性。
就GLP-2多肽序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為候選序列中與野生型GLP-2序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，所述定義在以下步驟后得出比對序列和必要時引入缺口以實現(xiàn)最高序列同一性百分比，并且不將任何保守性替換認為是序列同一性的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)例如使用公眾可用的軟件如BLAST、BLAST2或Align軟件進行序列比對，比對程序參閱Altschul等(Methods in Enzymology，266460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)或Pearson等(Genomics，46，24，36，1997)和http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html。
使用這些程序及其默認設(shè)置測定本文使用的以及根據(jù)本發(fā)明的序列同一性百分比。更一般地，技術(shù)人員能夠容易地確定用于測定比對的適當參數(shù)，包括在所比較序列的全長上實現(xiàn)最佳比對所需的任何算法。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，如上所述的GLP-2類似物包含X3、X5、X7、X11、X16、X20、X24、X28、X31、X32和/或X33位上的多于一個替換(即相對于上文所述野生型序列的多于一個替換)。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，如上文所述的GLP-2類似物包含選自X11、X16、X20、X24、X28是Ile、Ala、Leu、Phe或Val的一個或多個替換；X31、X32和X33位的氨基酸殘基任選是缺失的；或者是其可藥用鹽或衍生物。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，如上所述的GLP-2類似物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位中一個或多個位置上的替換(即相對于上文所述野生型序列的替換)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如上所述的GLP-2類似物公開于本文表1或表2中，或是其可藥用鹽或衍生物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述GLP-2類似物定義為通式III或者其可藥用鹽或衍生物 R1-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2； 其中 R1是氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲?；?、苯甲?；蛉阴；? X8是Asp或Ser，優(yōu)選Asp； X11是Ser、Ala、Glu、Lys或Asn； X15是Glu或Asp，優(yōu)選Glu； X16是Ser、Ala或Glu； X20是Ser、Ala或Glu； X24是Ser、Ala或Glu；和 X28是Ser、Ala、Gln或Glu。
本發(fā)明的目的化合物(式I)描述于下表中，其中所述化合物可在N端如式III中針對R1所述被修飾，并且包括其可藥用鹽或衍生物 本發(fā)明的另一些化合物在下文表1中顯示。
本發(fā)明提供了相對于結(jié)腸而言在小腸中具有偏好性生長促進活性的化合物。具體地，本文所述實驗顯示，在施用給試驗動物時，野生型GLP-2中X11和/或X16和/或Asn20和/或X24和/或X28位的某些替換提供了與結(jié)腸質(zhì)量增加相比小腸重量的偏好性增加。這些發(fā)現(xiàn)意味著，所舉例的化合物可用于治療這樣的病癥其中小腸中生長促進作用提高而結(jié)腸中的效應(yīng)較低是有利的，或者用于治療小腸損壞而結(jié)腸完整的病癥。
因此，優(yōu)選導(dǎo)致小腸生長的化合物通常包含野生型GLP-2中11、16、20、24和/或X28位的一個或多個替換(即相對于上文所述的野生型序列)。這些化合物可選擇性地導(dǎo)致小腸(而不是結(jié)腸)生長。因此，它們可用于影響或涉及小腸的病況。
優(yōu)選地，這些小腸選擇性化合物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位中多于一個位置上的替換(即相對于上文所述的野生型序列)。因此，所述小腸選擇性化合物可包含以下多于一個替換，其中X11是Ser，X16是Ala，X20、X24是Ala，X28是Ala，X31是Ile，X32是Thr且X33是Asp。X31、X32和X33位的氨基酸殘基可任選地缺失。
在小腸選擇性化合物中，X11、X16、X20、X24和X28可獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可各自獨立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可獨立地是Ala、Ser。
應(yīng)了解，落在這些一般性標準之外的其它殘基組合也可提供小腸選擇性。
優(yōu)選的X11、X16、X20、X24和X28位殘基組合包括Ser/Ser/Ser/Ser/Ser；Ala/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ala/Ala/Ser，Ser/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ser/Ser/Ser/Ser；Ala/Ala/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ser/Ala/Ala；Ser/Ala/Ala/Ala/Ala；Ser/Ala/Arg/Ala/Ala；Ala/Ser/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ala/Ala/Ala。
偏好性刺激小腸上皮生長的示例化合物包括ZP2264，ZP2268，ZP2242，ZP2272，ZP2411，ZP2380，ZP2384，ZP2398，ZP2417，ZP2423，ZP2385，ZP2399，ZP2418，ZP2381，ZP2420和ZP2397。
本發(fā)明還擴展至與結(jié)腸相比具有胃偏好性生長促進活性的化合物。因此，它們可用于影響胃或涉及胃的病癥。
優(yōu)選地，這些胃選擇性化合物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位上的多于一個替換(即相對于上文所述野生型序列)。X31、X32和X33位的氨基酸殘基可以任選是缺失的。
例如，在胃選擇性化合物中， X11可以是Leu、Phe或Lys， X16可以是Leu、Phe或Lys， X20可以是Ala或Ser， X24可以是Ala、Ser或Lys， X28可以是Ala、Ser或Lys。
例如，X11和X16可獨立地是Leu或Phe，X24和X28可獨立地是Lys或Ser，X20可以是Ser。
例如，X11和X16可以獨立地是Leu或Phe，X20、X24和X28可以是Ser。
應(yīng)了解，落在這些一般性標準之外的其它殘基組合也可提供胃選擇性。
優(yōu)選的X11、X16、X20、X24和X28位的殘基組合包括Lvs/Lvs/Lvs/Lvs/Lvs；Phe/Phe/Ser/Ser/Ser；Leu/Leu/Ala/Ala/Ala和Leu/Leu/Ser/Ser/Ser。
偏好性刺激胃上皮生長的示例化合物包括ZP2400、ZP2412、ZP2396、ZP2395、ZP2394和ZP2401。
優(yōu)選地，所述GLP-2類似物在下文實施例7中所述的至少一個降解測試中維持相對于初始純度而言至少為70％的實測純度。另外的或者作為替代的，它可在HCl 0.1M溶液中12天后維持相對于初始純度而言至少為60％的實測純度。另外的或者作為替代的，它可在NH4HCO30.1M溶液中6天后維持相對于初始純度而言至少為70％的實測純度。
本發(fā)明的另一個方面涉及如上所述至少具有1nM的EC50并因此被定義為GLP-2激動劑的GLP-2類似物。如實施例9中所述分析本發(fā)明化合物。在圖5中，給出ZP2264的EC50作為GLP-2激動劑的示例。
在另一個方面中，本發(fā)明提供組合物，其包含與載體混合的如本文所定義GLP-2類似物或者其鹽或衍生物。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述組合物是可藥用組合物，所述載體是可藥用載體。所述GLP-2肽類似物可以是GLP-2類似物的可藥用酸加成鹽。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及如本文所定義的GLP-2類似物作為藥物組合物的用途，其被配制為適于通過注射或輸注施用的液體，或者配制為導(dǎo)致所述GLP-2類似物緩慢釋放。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于治療的如本文所定義GLP-2類似物或其鹽。
本發(fā)明還提供了如上所述的GLP-2類似物在制備用于治療和/或預(yù)防胃和腸相關(guān)疾病的藥物中的用途。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及GLP-2或者其鹽或衍生物在制備用于治療和/或預(yù)防胃腸相關(guān)疾病的藥物中的用途，例如治療患有腸功能受損的新生兒、骨質(zhì)疏松和DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介導(dǎo)的病癥。例如，所述胃腸相關(guān)疾病包括潰瘍、佐-埃綜合征(zollinger-ellisonsyndrome)、胃炎、消化疾病、吸收障礙綜合征、短腸綜合征(short-gutsyndrome)、盲管綜合征、炎性腸病(克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)、腹型斯?jié)姳R腹瀉(celiac sprue)(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉(tropical sprue)、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、與腹瀉相關(guān)的腸易激綜合征、小腸損傷和短腸綜合征(short bowelsyndrome)。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及如上所述GLP-2類似物的用途，其中所述胃腸相關(guān)疾病是放射性腸炎、感染性或感染后腸炎或者由于有毒試劑或其它化學治療劑造成的小腸損傷。
本發(fā)明還提供了如本文所定義的GLP-2類似物在制備用于治療和/或預(yù)防化學治療或放射治療副作用的藥物上的用途。
所述化學治療或放射治療的副作用有腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐或者化學治療導(dǎo)致的腸上皮結(jié)構(gòu)性和功能性損傷。
本發(fā)明還提供了如本文所定義的GLP-2類似物在制備用于治療新生兒、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介導(dǎo)疾病的藥物上的用途。
因此，本發(fā)明還提供治療藥盒，其包含癌癥化學治療藥物和本發(fā)明的GLP-2類似物，其中每一種均任選地與可藥用載體組合。所述兩種治療劑可以分開包裝(例如在分開的瓶中)以分別施用，或可以在同一組合物中提供。因此本發(fā)明還提供包含與可藥用載體組合的癌癥化學療法藥物和本發(fā)明GLP-2類似物的藥物組合物。
對于患有胃腸粘膜瘤形成或胃腸粘膜瘤形成風險提高的患者，可能期望選擇化合物以降低或消除已降低之副作用(例如刺激或加重胃腸粘膜瘤形成)的風險。例如，選擇用于治療患有結(jié)腸瘤形成(良性或惡性)或有發(fā)生結(jié)腸瘤形成風險的患者的化合物時，選擇對小腸的選擇性高于結(jié)腸的化合物比非選擇性化合物或?qū)Y(jié)腸的選擇性高于小腸的化合物可能更合適。
在其它一些方面中，本發(fā)明提供GLP-2類似物用于制備治療和/或預(yù)防營養(yǎng)不良(例如衰竭綜合征(wasting syndrome)惡病質(zhì)和厭食癥之類的病癥)的藥物的用途。
在又一個方面中，本發(fā)明提供了包含編碼如本文所定義GLP-2類似物之核酸序列的核酸分子。
在其他方面中，本發(fā)明提供包含任選地與指導(dǎo)其表達的序列組合的上述核酸序列的表達載體，以及用所述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。優(yōu)選地，所述宿主細胞能夠表達并分泌GLP-2類似物。在另一方面中，本發(fā)明提供生產(chǎn)GLP-2類似物的方法，所述方法包括在適于表達所述GLP-2類似物的條件下培養(yǎng)宿主細胞以及純化由此制備的GLP-2類似物。
本發(fā)明還提供用于治療的本發(fā)明核酸、本發(fā)明表達載體或者能夠表達并分泌本發(fā)明GLP-2類似物的宿主細胞。應(yīng)當理解，所述核酸、表達載體和宿主細胞可用于治療任何可用GLP-2類似物本身進行治療的本文所述病癥。因此提到包含本發(fā)明GLP-2類似物的治療組合物或施用本發(fā)明的GLP-2類似物時，應(yīng)解釋為包括施用本發(fā)明的核酸、表達載體或宿主細胞，除非其上下文中另有說明。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的核酸分子、表達載體或宿主細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防胃腸相關(guān)疾病，或者用于治療和/或預(yù)防化學治療或放射治療的副作用，或者用于治療新生兒、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介導(dǎo)的疾病。
在又一個方面中，本發(fā)明提供了在有此需要的患者中通過施用有效量的本發(fā)明核酸、表達載體或宿主細胞來治療胃腸相關(guān)疾病的方法。胃腸相關(guān)疾病的實例在上文給出。
在又一個方面，本發(fā)明提供了在有此需要的患者中治療或預(yù)防化學治療或放射治療之副作用的方法，所述方法包括施用有效量的本發(fā)明的核酸、表達載體或宿主細胞。
在另一方面中，本發(fā)明提供治療和/或預(yù)防有此需要的患者中營養(yǎng)不良(例如衰竭綜合征惡病質(zhì)和厭食癥之類的病癥)的方法，所述方法包括施用有效量的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物或者本發(fā)明的核酸、表達載體或宿主細胞。
下文通過舉例而非限制性的參考附圖進一步詳細說明本發(fā)明的實施方案。



圖1.與載體對照相比，施用參照化合物、[Gly2]GLP-2和化合物ZP2264、ZP2266-ZP2268(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后相對小腸質(zhì)量的改變。以載體動物為100％來顯示相對小腸質(zhì)量。＊P＜0.05，與載體相比；$P＜0.05，與[Gly2]GLP-2處理相比。
圖2.與載體對照相比，施用參照化合物、[Gly2]GLP-2和化合物ZP2242、ZP2269和ZP2272(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后相對小腸質(zhì)量的改變。以載體動物為100％來顯示相對小腸質(zhì)量。＊P＜0.05，與載體相比；$P＜0.05，與[Gly2]GLP-2處理相比。
圖3、與[Gly2]GLP-2處理的動物相比，施用化合物ZP2264、ZP2266-ZP2268(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后的小腸/結(jié)腸質(zhì)量比的改變。以載體動物為100％來顯示相對小腸(small intestinal，SI)質(zhì)量。$P＜0.05，與[Gly2]GLP-2處理相比。
圖4.與[Gly2]GLP-2處理的動物相比，施用化合物ZP2242、ZP2269、ZP2272和ZP2271(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后的小腸/結(jié)腸質(zhì)量比的改變。以[Gly2]GLP-2處理的動物為100％來顯示相對小腸(SI)質(zhì)量。
圖5.體外篩選ZP2264對BHK-21細胞中重組表達的GLP-2受體的激動作用。ZP2264的IC 50是3.55E-12，完全在激動劑的定義范圍內(nèi)。
圖6.對小腸有選擇性的ZP化合物的小腸/結(jié)腸敏感性指數(shù) 圖7.對胃有選擇性的ZP化合物的胃/結(jié)腸敏感性指數(shù) 圖8.非選擇性ZP化合物的小腸/結(jié)腸敏感性指數(shù) 發(fā)明詳述 定義 除非另有具體說明，為上文陳述中使用的具體術(shù)語提供了下述定義。
在說明書和權(quán)利要求書全篇中，使用天然氨基酸的常規(guī)單字母代碼和三字母代碼以及其它α-氨基酸例如肌氨酸(Sar)、正亮氨酸(Nle)和α-氨基異丁酸(Aib)的普遍公認的三字母代碼。本發(fā)明的肽中所有氨基酸殘基優(yōu)選為L-構(gòu)型，然而，也可以存在D-構(gòu)型的氨基酸。
本文所使用的“保守性替換”表示天然人GLP-2肽序列某些位置上的氨基酸殘基被改變?yōu)閷儆谌缦卤硭x的同一組(I、II、III、IV、V、1、2、3)的氨基酸殘基。

本文所使用的“非保守性”替換意為天然人GLP-2序列中氨基酸殘基的任何其它替換，例如用非蛋白質(zhì)氨基酸(Sar、Nle、Aib)進行替換或者用不屬于同一組的氨基酸進行替換。
為了描述所得的α螺旋一側(cè)的親水性圖，我們選擇了Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.(1982)157，105-132所述的各個氨基酸的親水性指數(shù)(Hydropathy index，hpix)。在本發(fā)明中，通過氨基酸位置X11-X16-X20-X24-X28對目的螺旋進行大致描述。
使用Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.(1982)157，105-132所述的親水性指數(shù)HPI來描述各個氨基酸的親水性指數(shù)(HPI)。
各個氨基酸的HPI值為 氨基酸 hpi指數(shù) I4,5 V4,2 L3,8 F2,8 C2,5 M1,9 A1,8 G-0,4 T-0,7 W-0,9 S-0,8 Y-1,3 P-1,6 H-3,2 E-3,5 Q-3,5 D-3,5 N-3,5 K-3,9 R-4,5 根據(jù)HPP＝∑hpiX11+hpiX16+hpiX20+hpiX24+hpiX28來計算式I中X11、X16、X20、X24、X28殘基所得的親水性圖(HPP) HPP≥-10 HPP≥-4 HPP≥0 Y1、Y2、Y4和Y5可各自選自Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe。Y3可選自Asn、Asp、Glu、Gln、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe。
對于小腸選擇性化合物，在HPP≥-10、-4或0的總體標準內(nèi)，可以期望11和16位的HPI應(yīng)獨立地為-0.8≤HPI≤3.8，例如-0.8≤HPI≤2.8，如HPI＝1.8。
對于20、24和28位，可以期望HPI應(yīng)獨立地為-0.8≤HPI20、24、28≤1.8，例如-0.8≤HPI20、24、28≤1.8，如HPI20、24、28＝-0.8。
因此，X11、X16、X20、X24和X28位中每個位置上的殘基可獨立地為Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以各自獨立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可以是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如X11和X16可以是Ala，以及X20、X24和X28可以是Ala、Ser、Gly或Thr。
X11、X16、X20、X24和X28位的優(yōu)選組合可包括Ala/Ala/Ala/Ser/Ser、Ala/Ala/Ser/Ser/Ser、Ala/Ala/Thr/Ser/Ser和Ala/Ala/Gly/Ser/Ser。
對于胃選擇性化合物，在HPP≥-10、-4或0的總體標準內(nèi)，可能期望11和16位的HPI應(yīng)獨立地為-3.9≤HPI11、16≤3.8，例如HPI11、16可以是2.8≤HPI11、16≤3.8，或者HPI11、16可以是-3.9。
對于20、24和28位，可能期望HPI應(yīng)獨立地為-3.9≤HPI20、24、28≤1.8，例如HPI20、24、28可以是-0.8≤HPI20、24、28≤1.8，或HPI20、24、28可以是-3.9。
因此，X11位的殘基可以是Leu、Phe或Lys。
X16位的殘基可以是Leu、Ser、Phe、Lys或Thr。
X20位的殘基可以是Ala、Ser、Leu、Gly或Thr。
X24位的殘基可以是Ala、Ser、Lys、Glu、Gly或Thr。
X28位的殘基可以是Ala、Ser、Lys、Gln、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以獨立地是Leu或Phe，X24和X28可以獨立地是Ala或Ser。
本發(fā)明優(yōu)選的化合物具有至少一種GLP-2生物活性，特別是導(dǎo)致腸或胃生長。這可以如實施例中所述在體內(nèi)測定中進行評估，其中在用GLP-2類似物處理或接觸測試動物之后測定腸或其部分的質(zhì)量。
如上文所述，與天然GLP-2相比較，本發(fā)明的GLP-2類似物具有一個或多個氨基酸替換、缺失、倒位或添加。這一定義還包括同義術(shù)語GLP-2模擬物和/或GLP-2激動劑。此外，本發(fā)明的類似物還可具有一個或多個其氨基酸側(cè)基、α-碳原子、末端氨基、或末端羧酸基的化學修飾。化學修飾包括但不限于添加化學部分、形成新鍵以及去除化學部分。氨基酸側(cè)基修飾包括但不限于賴氨酸ε-氨基的?；?，精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化以及谷氨酸或天冬氨酸的脫酰胺作用。末端氨基修飾包括但不限于去氨基(des-amino)、N-低級烷基、N-二低級烷基以及N-?；揎棥Ｄ┒唆然揎棸ǖ幌抻邗０贰⒌图壨榛０?、二烷基酰胺以及低級烷基酯修飾。本文優(yōu)選的低級烷基為C1-C4烷基。此外，可通過肽化學普通技術(shù)人員公知的保護基保護一個或多個側(cè)基或端基。氨基酸的α-碳可被單甲基化或二甲基化。
在其存在時，氧化穩(wěn)定的Met-取代氨基酸指選自以下的氨基酸Met(O)(甲硫氨酸亞砜)、Met(O)2(甲硫氨酸砜)、Val、Ile、Asn、Glx(Glu或Gln)、Tyr、Phe、Trp，優(yōu)選為Leu、Nle、Ala、Ser和Gly。
應(yīng)當理解，本發(fā)明的肽還可以以鹽或其它衍生物的形式提供。鹽包括可藥用鹽例如酸加成鹽和堿鹽。酸加成鹽的實例包括鹽酸鹽、檸檬酸鹽和乙酸鹽。堿鹽的實例包括陽離子選自以下的鹽堿金屬例如鈉和鉀、堿土金屬例如鈣以及銨離子+N(R3)3(R4)(其中R3和R4獨立地表示任意取代的C1-6烷基、任意取代的C2-6烯基、任意取代的芳基或任意取代的雜芳基)?？伤幱名}的其它實例描述于“Remington′sPharmaceutical Sciences”第17版.Alfonso R.Gennaro(編輯)，MarkPublishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985和更新的版本以及theEncyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
本發(fā)明GLP-2類似物的其它衍生物包括與金屬離子如Mn2+和Zn2+的配位絡(luò)合物、酯如體內(nèi)可水解的酯、游離酸或堿、水合物、前藥或脂質(zhì)。可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在化合物中存在的羥基或羧酸基之間以及適當?shù)聂人峄虼挤磻?yīng)配偶體之間形成酯。作為前藥的化合物衍生物可在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化成母體化合物之一。一般地，化合物的至少一種生物活性將在化合物前藥形式中降低，并且可通過前藥轉(zhuǎn)化被活化，以釋放該化合物或其代謝物。前藥的實例包括使用保護基，所述保護基可原位除去以釋放活性化合物，或者可在體內(nèi)抑制藥物的清除。
在其存在時，Z1和Z2各自獨立地代表3至20個或4至20個氨基酸殘基的肽序列，例如在4至15個氨基酸殘基范圍內(nèi)、更優(yōu)選在4至10個氨基酸殘基范圍內(nèi)，尤其是在4至7個氨基酸殘基范圍內(nèi)，例如4、5、6或7個氨基酸殘基，比如6個氨基酸殘基。肽序列Z中每個氨基酸殘基可獨立地選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Orn。優(yōu)選地，所述氨基酸殘基選自Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Orn和Met以及落入WO01/04156中所定義式I范圍內(nèi)的氨基酸，例如Dbu(2，4-二氨基丁酸)或Dpr(2，3-二氨基丙酸)，更優(yōu)選選自Glu、Lys和Met，尤其是Lys。上述氨基酸可為D-或L-構(gòu)型，但優(yōu)選上述氨基酸為L-構(gòu)型。特別優(yōu)選的序列Z是4個、5個或6個連續(xù)賴氨酸殘基、特別是6個連續(xù)賴氨酸殘基的序列。示例性序列Z示于WO 01/04156。
在某些實施方案中不存在Z1。在這種情況下，可以存在或不存在Z2。
將具有EC50至少為1nM的GLP-2類似物定義為GLP-2激動劑。
本發(fā)明包括在下文實驗部分進一步描述的下列肽。
本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物包括化合物ZP2264、ZP2267、ZP2268和ZP2270。
穩(wěn)定性研究 技術(shù)人員能設(shè)計適當方法(例如定量法)用于檢測GLP-2類似物的降解產(chǎn)物，例如基于下面描述的方法。降解可以以氧化、水解和脫酰胺作用的形式發(fā)生，這取決于任何給定的GLP-2類似物中氨基酸的特性和位置以及條件例如pH、溶液和溫度。當在應(yīng)激條件(即可能引起降解的條件)下孵育化合物并且隨后分析化合物中剩余完整肽的含量時，可根據(jù)化學穩(wěn)定性對化合物進行分級。此外，得到的對應(yīng)激條件下所得主要降解產(chǎn)物的了解對于任何后來分析方法的開發(fā)都是很重要的。
檢測GLP類似物的定量測定 技術(shù)人員還能夠設(shè)計方法(例如定量法)用于檢測復(fù)雜環(huán)境或溶液(例如血漿、尿、組織勻漿、細胞勻漿、唾液等)中的GLP類似物，以研究施用于哺乳動物之后GLP類似物的吸收、分布、代謝和排泄，或者作為體外細胞體系功能研究的一部分。
在一個實施方案中，定量測定可基于針對GLP類似物或其片段的抗體。從免疫動物中得到的抗體可用于定量分析。在一個實施例中，可利用固定在多孔板中的與所述分子中一部分具有親和力的第一抗體制備直接夾心ELISA。然后將樣品施加至孔中，GLP類似物被第一抗體捕獲。然后所捕獲的GLP類似物被與GLP類似物另一部分具有親和力的第二抗體識別?？捎妹?辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)或放射性同位素標記所述第二抗體。然后可通過加入比色底物或直接計數(shù)輻射或通過閃爍來檢測所捕獲的GLP類似物的量?；蛘?，通過加入與第二抗體具有親和力的標記抗體來間接檢測所捕獲的GLP類似物的量?？捎珊幸阎縂LP類似物的外標曲線得到的應(yīng)答來估計樣品中的濃度?；蛘?，所述抗體可用于制備直接競爭性免疫測定，其中將對GLP類似物具有特異性的抗體固定在多孔板上，并將樣品與預(yù)定固定濃度的標記GLP類似物一起在孔中孵育。所述標記可以是酶、熒光團、放射性同位素或生物素，并使用以下方法檢測，例如對所述酶具有特異性的底物(例如比色、熒光或化學發(fā)光)、閃爍或者與酶連接的抗生物素蛋白，隨后進行上述檢測?？赏ㄟ^適當?shù)姆椒z測已結(jié)合的標記GLP類似物的量，并可由得自上述外標曲線的應(yīng)答來得出樣品中GLP類似物的濃度。
在另一個實施方案中，定量測定可基于液相層析-串聯(lián)質(zhì)譜法。在這樣的設(shè)置中，根據(jù)與惰性氣體(He或Ar)碰撞引起的母體化合物斷裂來監(jiān)測對待研究GLP類似物具有特異性的片段的應(yīng)答。斷裂之前通過反相層析分離樣品組分，或直接將樣品注入質(zhì)譜儀中。適當時可對樣品進行預(yù)處理(即加入蛋白酶抑制劑、蛋白質(zhì)沉淀、固相萃取、免疫-親和萃取等)。由上述外標曲線所得應(yīng)答得出樣品中存在的GLP類似物濃度，這可以是在使用與待研究的GLP類似物相似的內(nèi)標校正應(yīng)答之后。
產(chǎn)生特異性抗體 可在哺乳動物中誘導(dǎo)并從血清中純化針對GLP類似物或其片段的特異性抗體。GLP類似物或片段可直接與佐劑一起用于免疫兔、小鼠或其它哺乳動物，或者GLP類似物或其片段可與載體分子(即匙孔槭血藍蛋白、卵清蛋白、白蛋白等)化學連接，并與佐劑一起注射?？稍谘娱L的時間中以2至4周的間隔重復(fù)所述注射，以提高抗體的親和力和選擇性。可直接從血清獲得多克隆抗體。為了得到單克隆抗體，應(yīng)將分離自免疫動物(優(yōu)選小鼠)的B細胞與腫瘤細胞融合，以形成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。利用固定的GLP類似物或其肽隨后用標記的抗-抗體檢測來篩選和選擇適當?shù)目寺『涂贵w?；蛘?，所述篩選和選擇可基于固定抗體隨后用標記的GLP類似物或其片段檢測。在所有情況下，所述標記均可以是放射性同位素、酶、熒光團或生物素，并使用以下方法檢測，例如對所述酶具有特異性的底物(例如比色、熒光或化學發(fā)光)、閃爍或者抗生物素蛋白與酶連接，隨后進行上述檢測。
合成GLP-2類似物 優(yōu)選通過固相或液相肽合成手段合成本發(fā)明的類似物。在該上下文中，參照WO98/11125和Fields，GB等，2002，“Principles and practice ofsolid-phase peptide synthesis”.InSynthetic Peptides(2nd Edition)以及本文的實施例。
因此，可用多種方式合成GLP-2類似物，例如包括以下步驟的方法 (a)通過固相或液相肽合成手段合成肽并回收這樣得到的合成肽；或 (b)當所述肽由天然氨基酸組成時，在宿主細胞中表達編碼所述肽的核酸構(gòu)建體，并從所述宿主細胞培養(yǎng)物中回收表達產(chǎn)物；或 (c)當所述肽由天然氨基酸組成時，實現(xiàn)編碼所述肽的核酸構(gòu)建體的無細胞體外表達，并回收所述表達產(chǎn)物；或 (a)、(b)和(c)方法的組合以得到所述肽的片段，隨后連接所述片段以得到所述肽，并回收所述肽。
因此，對于本發(fā)明的一些類似物，使用基因工程技術(shù)可能是有利的。這可能是當肽足夠大(或作為融合構(gòu)建體產(chǎn)生)和當肽僅包含可由活生物RNA翻譯的天然存在氨基酸的情況。
就重組基因技術(shù)而言，編碼本發(fā)明肽的核酸片段是重要的化學產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的另一方面提供包含編碼本發(fā)明GLP-2類似物的核酸序列的核酸分子，其中所述肽優(yōu)選由天然氨基酸構(gòu)成。本發(fā)明的核酸片段為DNA或RNA片段。
本發(fā)明的核酸片段通常插入適當?shù)妮d體中，以形成攜帶本發(fā)明核酸片段的克隆載體或表達載體；這種新載體也是本發(fā)明的一部分。涉及構(gòu)建本發(fā)明這些載體的細節(jié)將在下文轉(zhuǎn)化細胞和微生物的上下文中討論。取決于應(yīng)用的目的和類型，所述載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微染色體或病毒的形式，但僅在某些細胞中瞬時表達的裸DNA也是重要的載體。本發(fā)明優(yōu)選的克隆載體和表達載體(質(zhì)粒載體)能自主復(fù)制，從而能夠為了用于隨后克隆的高水平表達或高水平復(fù)制而實現(xiàn)高拷貝數(shù)。
本發(fā)明載體的一般概況包括在5’→3’方向有效連接的下述特征用于驅(qū)動本發(fā)明核酸片段表達的啟動子，任選的編碼允許分泌(分泌至胞外相或適當時分泌至周質(zhì)中)的前導(dǎo)肽或多種目的(如組合分泌、純化標記和酶修飾以校正肽或?qū)⒍嚯钠握系侥ぶ?的前導(dǎo)肽的核酸序列、編碼本發(fā)明肽的核酸片段以及任選的編碼終止子的核酸序列。當用表達載體在生產(chǎn)株或細胞系中操作時，為了轉(zhuǎn)化細胞的遺傳穩(wěn)定性，優(yōu)選所述載體在引入宿主細胞時整合進宿主細胞基因組中。
使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞以產(chǎn)生經(jīng)修飾的本發(fā)明肽。這樣的轉(zhuǎn)化細胞也是本發(fā)明的一部分，可以是用于擴增本發(fā)明核酸片段和載體或用于重組產(chǎn)生本發(fā)明肽的培養(yǎng)細胞或細胞系。
本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細胞是微生物例如細菌(如埃希氏菌屬(Escherichia)(如大腸桿菌)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌屬(Salmonella)或分枝桿菌屬(Mycobacterium)(優(yōu)選非致病性的，如牛分枝桿菌(M.bovis)BCG)的物種)、酵母(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和原生動物?；蛘?，所述轉(zhuǎn)化細胞來自多細胞生物，即可以是真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。來自人的細胞也是有意義的，參照下文對細胞系和載體的討論。為了克隆和/或最優(yōu)化表達的目的，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)化細胞能復(fù)制本發(fā)明核酸片段。本發(fā)明的實施方案優(yōu)選使用表達所述核酸片段的細胞；它們可用于小規(guī)?；虼笠?guī)模制備本發(fā)明的肽。
通過轉(zhuǎn)化細胞生產(chǎn)本發(fā)明的肽時，雖然遠非必要，但將表達產(chǎn)物運出至培養(yǎng)基或攜帶到轉(zhuǎn)化細胞表面是方便的。
已經(jīng)鑒定了有效的生產(chǎn)細胞時，優(yōu)選基于所述生產(chǎn)細胞建立攜帶本發(fā)明載體和表達編碼所述肽的核酸片段的穩(wěn)定細胞系。優(yōu)選地，這種穩(wěn)定細胞系分泌或攜帶本發(fā)明的肽，從而便于純化。
一般而言，將含有復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體(來源于與宿主細胞相容的物種)與宿主一起使用。所述載體通常帶有復(fù)制位點以及能在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，一般使用來源于大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322(但是存在許多其它可用的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(參閱如Bolivar等，1977)。pBR322質(zhì)粒含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因而提供鑒定轉(zhuǎn)化細胞的簡單手段。pBR質(zhì)?；蚱渌⑸镔|(zhì)粒或噬菌體必須還包含啟動子或經(jīng)修飾以包含啟動子，其可被原核微生物用于表達。
在原核重組DNA構(gòu)建中最普遍使用的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，1978；ltakura等，1977；Goeddel等，1979)以及色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，1979；EP 0036776A)。盡管這些是最常用的，但也已發(fā)現(xiàn)并使用了其它微生物啟動子，其核苷酸序列的細節(jié)已公開，使得技術(shù)人員能將其與質(zhì)粒載體功能性連接(Siebwenlist等，1980)。
除了原核生物以外，還可使用真核微生物例如酵母培養(yǎng)物，而且這時所述啟動子也應(yīng)能夠啟動表達。在真核微生物中，釀酒酵母或普通面包酵母是最常用的，盡管許多其它菌株也可普遍獲得的。例如，對于酵母屬中的表達，質(zhì)粒YRp7是常用的(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。該質(zhì)粒已含有為不能生長在色氨酸中的酵母突變株(如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977))提供選擇標記的trp1基因。然后，作為酵母宿主細胞基因組特征的trp1損傷的存在提供了用于通過在無色氨酸情況下培養(yǎng)來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。
酵母載體中適當?shù)膯有蛄邪?-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)的啟動子，例如烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶以及葡糖激酶的啟動子。在構(gòu)建適當?shù)谋磉_質(zhì)粒時，還將與這些基因相關(guān)的終止序列還被連接到表達載體中待表達序列的3’處，以提供mRNA多聚腺苷酸化和終止。
具有轉(zhuǎn)錄由生長條件控制的額外優(yōu)點的其它啟動子為乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶和上述甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。含有酵母兼容性啟動子、復(fù)制起點和終止序列的任何質(zhì)粒載體都是適用的。
除了微生物以外，來源于多細胞生物的細胞培養(yǎng)物也可用作宿主。原則上任何這樣的細胞培養(yǎng)物都是可使用的，不管來自脊椎動物或無脊椎動物培養(yǎng)物。然而，脊椎動物細胞是最有意義的，近年來，在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中擴增脊椎動物已經(jīng)成為常規(guī)方案(Tissue Culture，1973)。這種可用的宿主細胞系的實例為VERO和HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系以及W138、BHK、COS-7293、草地貪夜蛾(spodoptera frugiperda，SF)細胞(完整的表達系統(tǒng)可購自i.a.Protein Sciences，1000ResearchParkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和Invitrogen)、Invitrogen(PO Box2312，9704 CH Groningen，The Netherlands)提供的黑腹果蠅(D.melanogaster)細胞系S2以及MDCK細胞系。
這些細胞的表達載體通常包括(如果需要)復(fù)制起點、位于待表達基因之前的啟動子以及任何必需的核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點以及轉(zhuǎn)錄終止子序列。
對于哺乳動物中的應(yīng)用，表達載體的控制功能通常由病毒物質(zhì)提供。例如，常用的啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2，最常用的是猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動子是特別有用的，因為它們都容易以同時包括SV40病毒復(fù)制起點的片段的形式從病毒中得到(Fiers等，1978)。還可以使用更小或更大的SV40片段，只要其包括從Hind III位點至病毒復(fù)制起點中BglI位點的約250bp序列。此外，還可以(并且通常希望)利用正常情況下與目的基因序列相關(guān)的啟動子或控制序列，只要這樣的控制序列與宿主細胞系統(tǒng)相容。
復(fù)制起點可通過構(gòu)建載體提供以包含外源起點來提供，例如可來自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者可以由宿主細胞染色體復(fù)制機制提供。如果所述載體整合進宿主細胞染色體中，后者通常是足夠的。
為了在重組生產(chǎn)方法中得到滿意的產(chǎn)量，通過將肽與可用作親和標記(為了易于純化)的融合配偶體和/或通過具有多個肽重復(fù)來將所述類似物制備為融合蛋白可能是有利的。這些方法需要存在適當?shù)碾拿盖懈钗稽c，但是技術(shù)人員會知道如何加工其背后的基因構(gòu)建體。
重組制備后，可通過本領(lǐng)域普遍公知的方法純化本發(fā)明的肽，包括多步層析(離子交換、大小排阻以及親和層析技術(shù))。
或者，可在無細胞體系中體外制備由天然存在的氨基酸組成的肽。這在肽可能對推定的宿主細胞有毒性的情況下特別有利。因此，本發(fā)明還考慮使用無細胞體外翻譯/表達以制備本發(fā)明的肽。在這種情況下，參照來自例如Ambion Inc.，2130 Woodward，Austin，TX 78744-1832，USA的市售體外翻譯試劑盒、材料和技術(shù)文件。
最后，當然可以組合可用方法，從而制備如半合成類似物。在這樣的設(shè)置中，使用至少2個分開的步驟或方法制備肽片段，隨后連接所述片段以得到最終的肽產(chǎn)物。
藥物組合物和施用 本發(fā)明的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物可配制成用于保存或施用的藥物組合物，并且其在可藥用載體中包含治療有效量的本發(fā)明GLP-2肽或者其鹽或衍生物。
本發(fā)明化合物的治療有效量取決于給藥途徑、受治哺乳動物的類型以及所考慮的具體哺乳動物的身體特征。這些因素及其與確定該量之間的關(guān)系是醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的?？烧{(diào)整該量和施用方法以達到最佳效力，從而將肽遞送到大腸，但是將取決于醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的因素例如體重、飲食、同時用藥(concurrent medication)和其它因素。
本發(fā)明中提供藥物組合物，其中所述GLP-2類似物或其鹽以有效治療或預(yù)防胃腸相關(guān)病癥的量存在。
利用有機和無機堿可形成具有酸性部分的本發(fā)明化合物的可藥用鹽。與堿形成的適當鹽包括金屬鹽比如堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀或鎂鹽；銨鹽和有機胺鹽，比如與嗎啉、硫代嗎啉、哌啶、吡咯烷、單-、二-或三低級烷基胺(如乙基-叔丁基-、二乙基-、二異丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基丙基-胺)或單-、二-或三羥基低級烷基胺(例如單-、二-或三乙醇胺)形成的鹽。還可以形成內(nèi)鹽。相似地，當本發(fā)明的化合物包含堿性部分時，可利用有機和無機酸形成鹽。例如，可由下述酸形成鹽醋酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來酸、丙二酸、苦杏仁酸、蘋果酸、鄰苯二甲酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲基磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸和樟腦磺酸以及其它公知的可藥用酸。還可利用氨基酸例如賴氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸形成氨基酸加成鹽。
對醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見地，本發(fā)明的肽或藥物組合物的“治療有效量”將根據(jù)年齡、體重和受治哺乳動物的物種、使用的具體化合物、具體的給藥方式以及所期望效果和治療適應(yīng)證進行變化。由于這些因素與確定該量的關(guān)系是醫(yī)藥領(lǐng)域熟知的，因此確定治療有效的劑量水平、實現(xiàn)預(yù)防和/或治療本文描述的腸和胃相關(guān)疾病的期望結(jié)果所需的量以及本文公開的其它醫(yī)學適應(yīng)證將在技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
本文使用的“治療有效量”是降低給定病癥或病理的癥狀、優(yōu)選使患有所述病癥或病理的個體的生理反應(yīng)正?；牧俊？梢允褂帽绢I(lǐng)域的常規(guī)方法確定癥狀的降低或生理反應(yīng)的正?；?，并且可根據(jù)給定的病癥或病理而改變。在一個方面中，一種或多種GLP-2類似物或含有一種或多種GLP-2類似物的藥物組合物的治療有效量是這樣的量其將可檢測的生理參數(shù)恢復(fù)到與未患所述病癥或病狀的個體中所述參數(shù)基本相同的值(優(yōu)選在所述值的+30％以內(nèi)，更優(yōu)選在+20％以內(nèi)，并且還更優(yōu)選在10％以內(nèi))。
在本發(fā)明的一個實施方案中，開始以較低的劑量水平施用本發(fā)明的化合物或藥物組合物，提高劑量水平直至實現(xiàn)預(yù)防/治療相關(guān)醫(yī)療適應(yīng)證例如腸和胃相關(guān)疾病的期望效果。這將定義為治療有效量。對于單獨的或作為藥物組合物一部分的本發(fā)明的肽，這樣的劑量可以在約0.01mg/kg體重至100mg/kg體重之間，比如在約0.01mg/kg體重至10mg/kg體重之間，例如在10至100μg/kg體重之間。
對于治療用途，將選定的GLP-2類似物與可藥用并且適于通過選定的給藥途徑遞送所述肽的載體配制在一起。就本發(fā)明目的而言，外周腸胃外途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下以及腹膜內(nèi)給藥途徑。用于本發(fā)明的某些化合物還可適用于通過口服、直腸、鼻腔或下呼吸道途徑給藥。這些是所謂的非胃腸外(non-parenteral)途徑。本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物以及可藥用載體。適當?shù)目伤幱幂d體是常規(guī)地與基于肽的藥物一起使用的載體，比如稀釋劑、賦形劑等。用于治療用途的可藥用載體是藥學領(lǐng)域熟知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編輯1985)。例如，可以使用弱酸性或生理pH的無菌鹽水和磷酸緩沖液。pH緩沖劑可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氫銨、二乙醇胺、組氨酸(是優(yōu)選的緩沖劑)、精氨酸、賴氨酸、或乙酸鹽或其混合物。優(yōu)選的緩沖范圍是pH 4至8、pH 6.5至8，更優(yōu)選pH 7至7.5。所述藥物組合物中可包含防腐劑，例如對甲酚、間甲酚和鄰甲酚、對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸鈉、苯甲酸、苯甲酸芐酯、山梨酸、丙酸、對羥基苯甲酸酯。所述藥物組合物中可包含防止氧化、脫酰胺、異構(gòu)化、消旋化、環(huán)化、肽水解的穩(wěn)定劑，例如抗壞血酸、甲硫氨酸、色氨酸、EDTA、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。所述藥物組合物中可包含防止聚集、纖維化和沉淀的穩(wěn)定劑，比如十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇、羧甲基纖維素、環(huán)糊精。所述藥物組合物中可包含增溶或防止聚集的有機改性劑，比如乙醇、乙酸或乙酸酯及其鹽。所述藥物組合物中可包含等滲劑比如鹽例如氯化鈉或最優(yōu)選的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物。
所述藥物組合物中可包含去污劑比如吐溫20、吐溫80、SDS、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127。所述藥物組合物中可包含染料甚至是芳香劑。在另一個實施方案中，提供GLP-2肽類似物的可藥用酸加成鹽?？梢允褂弥鷳覄?。
所述藥物組合物中可包含有機改性劑比如乙醇、叔丁醇、2-丙醇、乙醇、甘油、聚乙二醇，用來冷凍凍干的產(chǎn)品。所述藥物組合物中可包含填充劑和等滲劑比如鹽例如氯化鈉，碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸或賦形劑半胱氨酸、卵磷脂或人血清白蛋白或其混合物用于冷凍干燥。
本發(fā)明的藥物組合物可以配制成以下形式并使用用于口腔給藥的片劑、膠囊劑或酏劑；用于直腸給藥的栓劑；用于注射給藥的優(yōu)選的無菌溶液或無菌粉劑或懸液等等?？烧{(diào)整給藥量和方法以實現(xiàn)最佳效力，但是將取決于這樣的因素比如體重、飲食、并行的藥物處理和其它因素，這是醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)當認識到的。
當進行胃腸外給藥時，比如靜脈內(nèi)和皮下，例如以每日為基礎(chǔ)，注射用藥物組合物可制備成水溶液或懸液的常規(guī)形式；適用在臨用前重構(gòu)或在注射前懸于液體中的凍干固體形式，或作為乳劑。
用于重構(gòu)凍干產(chǎn)品的稀釋劑可以是上述列表中的適當緩沖劑、水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸；或添加洗滌劑比如Tween 20、Tween 80、泊洛沙姆例如Pluronic F-68或Pluronic F-127、聚乙二醇和或添加防腐劑比如對甲酚、間甲酚和鄰甲酚、對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸鈉、苯甲酸、苯甲酸芐酯、山梨酸、丙酸、對羥基苯甲酸酯和或添加有機改性劑比如乙醇、乙酸、檸檬酸、乳酸或其鹽的注射用水。
此外，如果需要，所述注射用藥物組合物可包含少量非毒性輔助物質(zhì)，比如濕潤劑或pH緩沖劑?？墒褂迷鰪娢盏闹苿?例如脂質(zhì)體、洗滌劑和有機酸)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將所述化合物配制成用于輸注給藥，例如在用作全胃腸外營養(yǎng)治療的患者(例如新生兒，或患有惡病質(zhì)或厭食癥的患者)的液體營養(yǎng)補充劑時，或用于注射給藥，例如皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)，并且相應(yīng)地以無菌和無熱原形式的水溶液使用，并任選地緩沖至生理上可接受的pH，例如弱酸性或生理pH。用于肌內(nèi)給藥的制劑可基于植物油溶液或懸液，例如芥花籽油、玉米油或大豆油。這些基于油的制劑可利用抗氧化劑進行穩(wěn)定，例如BHA(丁化羥基苯甲醚)和BHT(丁化羥基甲苯)。
因此，本發(fā)明的肽化合物可在載體如蒸餾水或鹽水、磷酸緩沖液、5％葡萄糖溶液或油中施用。如果需要，可通過摻入增溶劑例如去污劑和乳化劑提高GLP-2類似物的溶解度。
為了用作注射劑，可向水性載體或賦形劑中補充明膠，用于在注射部位處或附近駐留GLP-2類似物使得GLP-2類似物向期望作用部位緩慢釋放。替代的凝膠劑比如透明質(zhì)酸也可用作駐留劑(depot agents)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，使得終濃度為0.5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至100mM； b.甘露醇，使得最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100mM至230mM；和 c.乙酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當量的治療化合物以達到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。
將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整至目標重量，無菌過濾并以適當?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體制品或凍干制品進一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，使得終濃度為0.5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至100mM的L-組氨酸； b.L-精氨酸，使得最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，使得最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當量的治療化合物以達到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。
將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整至目標重量，無菌過濾并以適當?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體制品或凍干制品進一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，使得終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至100mM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸； b.L-精氨酸，使得最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，使得最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當量的治療化合物以達到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。
將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整至目標重量，無菌過濾并以適當?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體制品或凍干制品進一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，使得終濃度為0.5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至100mM的L-組氨酸； b.L-精氨酸，使得最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，使得最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當量的治療化合物以達到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。
將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整至目標重量，無菌過濾并以適當?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體制品或凍干制品進一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的L-組氨酸，使得終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至100mM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸； b.L-精氨酸，使得最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM； c.甘露醇，使得最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM；和 d.醋酸，使得使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0.05至100mM，最優(yōu)選0.5至50mM。
添加適當量的治療化合物以達到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。
將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整至目標重量，無菌過濾并以適當?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體制品或凍干制品進一步處理所述制劑。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，所述制劑包含 a.溶解在水中的N-乙酸鹽，使得終濃度最高為200mM，優(yōu)選0.5至100mM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸； b.甘露醇，使得最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM。
添加適當量的治療化合物以達到濃度為1至100mg/mL，優(yōu)選5至50mg/mL，最優(yōu)選10至30mg/mL。
將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6.5至7.5，最優(yōu)選6.7至7.3。將所得的溶液調(diào)整至目標重量，無菌過濾并以適當?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體制品或凍干制品進一步處理所述制劑。
還可將本發(fā)明的GLP-2類似物配制成緩慢釋放的植入裝置，用于延長和持續(xù)施用GLP-2肽類似物。這樣的持續(xù)釋放制劑可以是位于身體表面的貼片形式。持續(xù)釋放制劑的實例包括生物相容性聚合物的復(fù)合材料，比如聚(乳酸)、乳酸-羥基乙酸共聚物、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、唾液酸、硅酸鹽、膠原、脂質(zhì)體等。當希望提供高局部濃度的本發(fā)明GLP-2類似物時，所述持續(xù)釋放制劑是特別有意義的。
可以以含有腸營養(yǎng)(intestinotrophic)量的肽的無菌-填充小瓶或安瓿形式、以單位劑量或多劑量的量應(yīng)用GLP-2類似物。所述小瓶或安瓿可含有GLP-2類似物和理想的載體，作為可立即施用的制劑?；蛘撸鲂∑炕虬碴晨珊羞m于在適當載體(如無菌水或磷酸緩沖鹽水)中重建的形式(如凍干形式)的GLP-2肽。
作為注射制劑的替代方案，所述GLP-2類似物可配制成用于通過其它途徑給藥?？筛鶕?jù)標準藥物實踐配制口服劑型比如片劑、膠囊劑等。根據(jù)本發(fā)明，施用GLP-2類似物以治療將受益于小腸組織生長的個體。
可通過加入增強劑例如殼聚糖或去污劑例如吐溫20、吐溫80、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127、Brij 35、Brij 72、cremophorEL來配制鼻用劑型。
本發(fā)明的肽化合物可單獨使用，或者與具有抗炎效應(yīng)的化合物組合使用。不限于理論地，設(shè)想這樣的組合治療可增強本發(fā)明肽類似物的有益治療效果。
當然，最適于患者治療的治療劑量和方案將根據(jù)待治療的疾病或病癥以及患者的體重和其它參數(shù)而變化。不希望限于任何特定理論地，預(yù)計μg/kg范圍內(nèi)的劑量以及更短或更長的治療時間或頻率可產(chǎn)生治療上有用的結(jié)果，比如尤其是小腸質(zhì)量的統(tǒng)計學顯著性增加。在一些情況下，治療方案可包括施用維持劑量，所述劑量適于預(yù)防初始治療停止后出現(xiàn)的組織退回治療前狀態(tài)。可根據(jù)本發(fā)明得到的結(jié)果指導(dǎo)最適于人類應(yīng)用的劑量大小和給藥方案，并可在正確設(shè)計的臨床試驗中進行證實。
可通過常規(guī)手段確定有效劑量和治療方案，從實驗動物中的低劑量開始，然后提高劑量同時監(jiān)測效果，并系統(tǒng)性地變化給藥方案。在對給定的對象確定最佳劑量時，臨床醫(yī)生可考慮許多因素。這樣的考慮因素是技術(shù)人員公知的。
在一個實施方案中，本發(fā)明GLP-2肽的人劑量可以從約10μg/kg體重/天至約10mg/kg/天，優(yōu)選約50μg/kg/天至約5mg/kg/天，并且最優(yōu)選約100μg/kg/天至約1mg/kg/天。
醫(yī)學狀況 通過施用有效量的本文所述的GLP-2類似物或其鹽，本發(fā)明的肽可用作預(yù)防或治療患有胃腸(包括食管的上消化道)病癥的個體的藥物。所述胃腸相關(guān)病癥包括任何病因的潰瘍(例如消化性潰瘍、佐-埃綜合征、藥物誘發(fā)的潰瘍、與感染或其它病原體有關(guān)的潰瘍)、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉以及化學治療和/或放射治療誘發(fā)的粘膜炎和腹瀉。
對于患有胃腸粘膜瘤形成或胃腸粘膜瘤形成風險提高的患者，可能期望選擇化合物以降低或消除已降低之副作用(例如刺激或加重胃腸粘膜瘤形成)的風險。例如，選擇用于治療患有結(jié)腸瘤形成(良性或惡性)或有發(fā)生結(jié)腸瘤形成風險的患者的化合物時，選擇對小腸的選擇性高于結(jié)腸的化合物比非選擇性化合物或?qū)Y(jié)腸的選擇性高于小腸的化合物可能更合適。
如上文一般所述，將受益于小腸質(zhì)量提高以及隨后發(fā)生和/或維持正常小腸粘膜結(jié)構(gòu)和功能的個體是采用本發(fā)明GLP-2類似物治療的候選者?？捎肎LP-2類似物治療的具體病癥包括多種形式的斯?jié)姳R腹瀉，包括腹型斯?jié)姳R腹瀉，其由熱對α-麥醇溶蛋白的毒性反應(yīng)引起，并且可能是麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病的結(jié)果，以小腸絨毛的顯著喪失為特征；熱帶型斯?jié)姳R腹瀉，由感染引起，以絨毛的部分扁平為特征；丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉，通常在患有普通變異型免疫缺乏或低丙種球蛋白血癥的患者中觀察到，以絨毛高度顯著降低為特征。GLP-2類似物治療的治療效力可通過檢查絨毛形態(tài)的腸活檢、營養(yǎng)吸收的生物化學評估、小腸通透性的非侵入性測定、患者的體重增加、或這些病癥相關(guān)癥狀的改善來監(jiān)測。
本發(fā)明的GLP-2類似物可用作預(yù)防或治療胃相關(guān)疾病的藥劑，所述疾病包括任何病因的潰瘍(例如消化性潰瘍、佐-埃綜合征、藥物誘發(fā)的潰瘍、與感染或其它病原體相關(guān)的潰瘍)。
可用本發(fā)明GLP-2類似物治療或可用GLP-2類似物預(yù)防的其它病癥包括上述放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎以及由于癌癥化學治療劑或毒劑引起的小腸損傷。
所述GLP-2類似物還可用于治療營養(yǎng)不良，例如惡病質(zhì)和厭食癥。
本發(fā)明的具體實施方案涉及使用本發(fā)明的肽預(yù)防和/或治療腸損傷和功能障礙。由于增殖迅速，小腸粘膜干細胞對化學療法的細胞毒效應(yīng)特別敏感(Keefe等，Gut 2000；47632-7)。施用本發(fā)明的GLP-2肽激動劑可增強腸隱窩的營養(yǎng)效應(yīng)并且迅速提供新細胞以取代化學療法后損傷的腸上皮。施用本發(fā)明肽實現(xiàn)的最終目標是降低進行化學療法治療患者中相關(guān)胃腸損傷的發(fā)病率，同時增加對更具攻擊性的化學治療、放射治療以及放化學治療組合療法的耐受?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明對正在進行或準備進行放射治療的患者提供并行的預(yù)防或治療性處理。
抗癌化學療法后的胃腸粘膜炎是一旦出現(xiàn)就基本上不能治療的日益嚴重的問題，盡管其能逐漸緩和。利用常用的細胞抑制癌癥藥物5-氟尿嘧啶和伊立替康進行的研究證明，使用這些藥物的有效化學療法主要影響小腸的結(jié)構(gòu)完整性和功能，而結(jié)腸的敏感性較低，并且主要應(yīng)答為粘液形成的增加(Gibson等，J Gastroenterol Hepatol.18(9)1095-1100，2003；Tamaki等，J lnt Med Res.31(1)6-16，2003)。
本發(fā)明的新GLP-2類似物可用于預(yù)防和/或治療胃腸損傷和化學治療劑的副作用。這種可能很重要的治療應(yīng)用可適用于目前使用的化學治療劑，例如但不限于5-氟尿嘧啶、六甲蜜胺、博來霉素、白消安、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、門冬酰胺酶(Crisantaspase)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體多柔比星、亞葉酸、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、美司鈉、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、Pemetrexed、噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鳥嘌呤/硫代鳥嘌呤、托泊替康、曲奧舒凡、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、博來霉素、白消安、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、門冬酰胺酶、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟達拉濱、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體多柔比星、亞葉酸、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、Pemetrexed、噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鳥嘌呤/硫代鳥嘌呤、托泊替康、曲奧舒凡、長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱。
設(shè)想可通過施用有效量的GLP-2類似物或其鹽將本發(fā)明的肽用于治療新生兒的方法中。通過利用本發(fā)明的肽激動劑可克服由于缺少腸發(fā)育造成的喂養(yǎng)新生兒的相關(guān)并發(fā)癥。
在本發(fā)明的另外一個實施方案中，描述了通過向有此需要的患者施用有效量的GLP-2類似物或其鹽來治療DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法。這樣的疾病包括DPP-IV酶過表達的病癥。
在一個實施方案中，可如上所述將藥物組合物配制成引起所述GLP-2類似物或者其鹽或衍生物的緩慢釋放。
設(shè)想可通過施用有效量的GLP-2類似物或其鹽將本發(fā)明的肽用于治療新生兒的方法中。通過利用本發(fā)明的肽激動劑可克服由于缺少腸發(fā)育造成的喂養(yǎng)新生兒的相關(guān)并發(fā)癥。
在本發(fā)明的另外一個實施方案中，描述了通過向有此需要的患者施用有效量的GLP-2類似物或其鹽來治療DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法。這樣的疾病包括DPP-IV酶過表達的病癥。
實施例 提供下述實施例用于說明本發(fā)明的優(yōu)選方面，而不意在限制本發(fā)明的范圍。
一般性肽合成 儀器和合成策略 在裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中分批合成肽，使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作為N-α-氨基保護基和適當?shù)耐ㄓ脗?cè)鏈功能性保護基。
溶劑 將溶劑DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedel de-

Germany)通過填充強陽離子交換樹脂(Lewatit S 100MB/H strong acid，Bayer AGLeverkusen，Germany)的柱進行純化，并在使用前加入3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)分析其中的游離胺，如果存在游離胺，則產(chǎn)生黃色(Dhbt-O-陰離子)。不經(jīng)純化直接使用溶劑DCM(二氯甲烷，分析級，Riedel de-

Germany)。不經(jīng)純化直接使用乙腈(HPLC-級，Lab-Scan，Dublin Ireland)。
氨基酸 以適當?shù)膫?cè)鏈保護形式從Advanced ChemTech(ACT)購得Fmoc保護的氨基酸。
偶聯(lián)試劑 偶聯(lián)試劑二異丙基碳二亞胺(DIC)購自Riedel de-

Germany。
固體支持物 在TentaGel S樹脂0.22-0.31mmol/g上合成肽，在優(yōu)選C端酰胺化肽的情況下使用TentaGel S-Ram、TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere，Germany)，而當優(yōu)選C端游離羧酸時使用TentaGel SPHB，TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmoc。
催化劑和其它試劑 二異丙基乙胺(DIEA)購自Aldrich，Germany，哌啶和吡啶來自Riedel-de

Frankfurt，Germany。乙二硫醇購自Riedel-de

Frankfurt，Germany。3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)、1-羥基苯并三唑(HOBt)(HOAt)得自Fluka，Switzerland。乙酸酐得自Fluka。
偶聯(lián)方案 在DMF中通過DIC法由適當?shù)腘-a-保護的氨基酸和HObt或HOAt將氨基酸偶聯(lián)為原位合成的HObt或HOAt酯。在80℃進行茚三酮測試檢查?；饔?，以防止測試期間Fmoc去保護(Larsen，B.D.andHolm，A.，Int.J.Peptide Protein Res.43，1994，1-9)。
N-α-氨基保護基(Fmoc)的去保護 按以下進行Fmoc基的去保護利用DMF中的20％哌啶進行處理(1×5和1×10分鐘)，隨后用DMF沖洗(5×15ml，每次5分鐘)直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測到黃色為止。
HOBt-酯的偶聯(lián) 將3份N-α-氨基保護的氨基酸與3份HObt和3份DIC一起溶解在DMF中，然后加入樹脂中。
用酸從樹脂中切割肽 利用95％三氟乙酸(TFA，Riedel-de

Frankfurt，Germany)-水(體積/體積)或95％TFA和5％乙二硫醇(體積/體積)在室溫下處理2小時從樹脂中切割肽。用95％TFA-水洗滌過濾的樹脂，減壓蒸發(fā)濾液和洗液。用醚沖洗殘留物并在醋酸-水中凍干。通過高效液相層析(HPLC)分析粗冷凍產(chǎn)物并通過質(zhì)譜(MS)進行鑒定。
在Tenta Gel樹脂(PEG-PS)上進行分批肽合成 將TentaGel樹脂(1g，0.23-0.24mmol/g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。所述樹脂在DMF(15ml)中膨脹，并用DMF中的20％哌啶處理，以除去接頭TentaGel S RAM上或樹脂TentaGel SRAM-Lys(Boc)Fmoc的第一個氨基酸上的初始Fmoc基團。排干樹脂并用DMF洗滌直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測到黃色為止。如上述將根據(jù)該序列的氨基酸偶聯(lián)為預(yù)先形成的Fmoc-保護的HObt酯(3份)。除非另外指出，繼續(xù)偶聯(lián)2小時。排干樹脂并用DMF(5×15ml，每次5分鐘)洗滌以除去過量的試劑。通過上述茚三酮測試檢查所有的?；饔谩Ｍ瓿珊铣珊?，用DMF(3×15ml，每次5分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)洗滌肽-樹脂，并真空干燥。如上所述從樹脂中切割肽并如下所述分析和純化粗肽產(chǎn)物。
HPLC條件 用HP 1100四元泵、HP 1100自動進樣器、HP 1100柱恒溫器和HP 1100多波長檢測器組成的Hewlett Packard HP 1100HPLC系統(tǒng)進行梯度HPLC分析。使用用于LC的Hewlett Packard Chemstation軟件(A.06.01版)進行儀器控制和數(shù)據(jù)采集。使用以下的柱和HPLC緩沖系統(tǒng) 柱VYDAC 238TP5415，C-18，5mm，

150×4.6mm。
緩沖液AMQV中0.1％的TFA；B0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度0-1.5分鐘.0％B 1.5-25分鐘50％B 25-30分鐘100％B 30-35分鐘100％B 35-40分鐘0％B 流速1ml/分鐘，柱箱溫度40℃，UV檢測I＝215nm。
粗肽的HPLC純化 通過PerSeptive Biosystems VISION工作站純化粗肽產(chǎn)物，VISION 3.0軟件用于儀器控制和數(shù)據(jù)采集。使用下述柱和HPLC緩沖系統(tǒng) 柱Kromasil KR

10mm C-8，250×50.8mm。
緩沖體系緩沖液AMQV中0.1％的TFA；B0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度0-37分鐘.0-40％B 流速35ml/分鐘，UV檢測I＝215nm和280nm。
質(zhì)譜 將肽溶解在超梯度甲醇(Labscan，Dublin，Ireland)、milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)和甲酸(Merck，Damstadt，Germany)(50∶50∶0.1v/v/v)中得到1至10mg/ml的濃度。利用準確度為+/-0.1m/z的LCT質(zhì)譜儀(Micromass，Manchester，UK)通過ESI-TOF-MS以正極性方式分析肽溶液(20ml)。
一般性合成方案 在所有合成中，將干燥的TentaGel-S-Ram樹脂(1g，0.22-0.31mmol/g)置于裝有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。所述樹脂在DMF(15ml)中膨脹，并用含有20％哌啶的DMF處理以保證樹脂上非質(zhì)子化氨基的存在。排干樹脂并用DMF洗滌，直到向排出的DMF中加Dhbt-OH后不能檢測到黃色為止。如上述將根據(jù)該序列的氨基酸偶聯(lián)為預(yù)先形成的Fmoc-保護的HObt酯(3份)。除非另外指出，繼續(xù)偶聯(lián)2小時。排干樹脂并用DMF(5×15ml，每次5分鐘)洗滌以除去過量的試劑。在80℃進行茚三酮測試檢查所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5分鐘)、DCM(3×15ml，每次1分鐘)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分鐘)洗滌肽-樹脂，并真空干燥。如上所述從樹脂中切割肽并凍干。利用上述制備性HPLC純化后，收集肽產(chǎn)物并通過ES-MS確定肽的身份。該方案用于合成下文進一步示例的所有肽。
合成的化合物 利用上述技術(shù)，使用上述方法合成化合物1809至1861以及參照化合物1559(H-[Gly2]hGLP-2-OH)(表1)。
表1合成的化合物

實施例1.合成化合物2264 在TentaGel S RAM上合成 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
將干燥的TentaGel S RAM(0.2mmol/g，1g)置于帶有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯管中，如“TentaGel樹脂上的批量肽合成”所述進行處理，直至完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如前所述檢查?；饔?。在完成合成和脫去N端Fmoc保護基團之后，如上所述將肽從樹脂上切割下來。在如上所述使用制備型HPLC純化之后，收集到413mg肽產(chǎn)物，純度大于93％，通過MS確認肽的身份(測量值M3488.13，計算值M 3487.79)。
實施例2.合成化合物2268 在TentaGel S RAM上合成 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
將干燥的TentaGel S RAM(0.2mmol/g，1g)置于帶有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯管中，如“TentaGel樹脂上的批量肽合成”所述進行處理，直至完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如前所述檢查?；饔?。在完成合成和脫去N端Fmoc保護基團之后，如上所述將肽從樹脂上切割下來。在如上所述使用制備型HPLC純化之后，收集到132mg肽產(chǎn)物，純度大于91％，通過MS確認肽的身份(測量值M3535.88，計算值M 3535.77)。
實施例3.合成化合物2264(Lys6) 在TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc上合成 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys NH2。
將干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于帶有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯管中，如“TentaGEl樹脂上的批量肽合成”所述進行處理，直至完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如前所述檢查酰化作用。在完成合成和脫去N端Fmoc保護基團之后，如上所述將肽從樹脂上切割下來。在如上所述使用制備型HPLC純化之后，收集肽產(chǎn)物，純度大于90％，通過MS確認肽的身份(測量值M 4256.40，計算值M 4256.36)。
實施例4.合成化合物2268(Lys6) 在TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc上合成 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys NH2。
將干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于帶有用于過濾的聚丙烯濾器的聚乙烯管中，如“TentaGel樹脂上的批量肽合成”所述進行處理，直至完成N端組氨酸的偶聯(lián)。所有偶聯(lián)均持續(xù)過夜。如前所述檢查酰化作用。在完成合成和脫去N端Fmoc保護基團之后，如上所述將肽從樹脂上切割下來。在如上所述使用制備型HPLC純化之后，收集肽產(chǎn)物，純度大于90％，通過MS確認肽的身份(測量值M 4304.10，計算值M 4304.34)。
實施例5.合成化合物2264A(乙酸鹽) 從三氟乙酸鹽進行反離子交換得到化合物2264的乙酸鹽。
由于純化合成肽粗產(chǎn)物所用的HPLC緩沖液中存在三氟乙酸鹽(0.1％v/v)，所以純化的化合物2264合成肽產(chǎn)物以三氟乙酸鹽的形式分離。
為了用乙酸鹽交換反離子三氟乙酸鹽，將所述肽的溶液通過裝填有帶乙酸根的強堿性離子交換樹脂的柱(Dowex 1×8)。化合物2264T溶于水中。將所述溶液通過含有帶乙酸根的強堿性離子交換樹脂(Dowex 1×8；載荷量1.33meq/ml樹脂)的柱。然后，用水清洗所述樹脂，收集洗脫液并凍干得到純度大于90％的乙酸鹽。
實施例6.合成化合物2264C(鹽酸鹽) 從三氟乙酸鹽(Tfa)進行反離子交換得到化合物2264的鹽酸鹽(Cl-)。
將化合物2264T溶解于0.1M的鹽酸中，凍干所得溶液。將剩余物溶于水中，再次凍干得到純度大于90％的鹽酸鹽。
另一些選擇性GLP-2類似物化合物在表2中列出。



實施例7.相對化學穩(wěn)定性測試 將表3中所列出的化合物溶于0.1M HCl中至名義濃度為0.5mM。將所述樣品在黑暗中在40℃下孵育7天，然后稀釋至0.2mg/ml的名義濃度，通過RP-HPLC分析以回收主峰，并通過LC-MS分析通過質(zhì)量來確認主峰的身份。
化合物以0.2mg/ml的名義濃度在Phenomenex Gemini C18柱，3μm，

3×150mm上通過RP-HPLC和LC-MS進行分析，流動相為MQW和MeCN中的0.1％TFA，在39分鐘中從25％逐步至48％MeCN。流速為0.400mL/分鐘。柱箱溫度為50℃，自動加樣器溫度為4℃，在220nm處進行UV檢測。
表3中列出了回收純度的結(jié)果。
表3ZP化合物的回收純度 ＊在分析型RP-HPLC的清洗相中洗脫。實施例7中顯示的重復(fù)數(shù)據(jù)使用了改進的分析型RP-HPLC方法。
通過此分析方法，在清洗相的后期洗脫了4種化合物(ZP2264、ZP2267、ZP2268和ZP2272)，通過如下所述的改進方法使用這四種化合物進行重復(fù)實驗。
實施例8.相對化學穩(wěn)定性檢驗 將表4中所列出的化合物溶于0.1M HCl中至名義濃度為0.25mM。將所述樣品在黑暗中在40℃下孵育2天，然后稀釋至0.2mg/ml的名義濃度，通過RP-HPLC分析以回收主峰。
化合物以0.25mg/ml的名義濃度在Phenomenex Gemini C18柱，3μm，

3×150mm上通過RP-HPLC和LC-MS進行分析，流動相為MQW和MeCN中的0.1％TFA，在39分鐘中從25％逐步至80％MeCN。流速為0.400mL/分鐘。柱箱溫度為50℃，自動加樣器溫度為4℃，在220nm處進行UV檢測。
表4中列出了回收純度的結(jié)果。
表4ZP化合物回收的純度 實施例9、體外篩選對BHK-21細胞中重組表達的GLP-2受體有激動作用的GLP-2類似物＊) 使用瞬時轉(zhuǎn)染了GLP-2受體和CRE-螢光素酶報告基因構(gòu)建體的BHK21細胞進行篩選。使用從10fM至10nM的7個濃度以及每個濃度三個重復(fù)點來測定劑量應(yīng)答曲線和EC50值。在所有測試板上均使用對照肽。
＊)在匈牙利布達佩斯通過AMRI進行所述測試。
材料和方法 所使用的材料和細胞 Nunc或Greiner組織培養(yǎng)瓶 Nunc或Greiner 10cm TC培養(yǎng)皿(Nunc 172931) 用于分板的Nunc或Greiner 96孔板(Nunc 167008) BHK-21(C13)細胞 白色96孔板(PerkinElmer 6005680) 用于稀釋的深孔板(Nunc 278752) Glasgow MEM(Sigma G5154) 無酚紅DMEM(Invitrogen/Gibco 31053-028) 胎牛血清(FCS，Invitrogen/Gibco Zealand batch) 非必需氨基酸(100×)(Invitrogen/Gibco 11140-035) 200mM谷氨酰胺(100×)(Invitrogen/Gibco 25030-024) 青霉素/鏈霉素(100×)(Invitrogen/Gibco 15140-122) 丙酮酸鈉(100×)(Invitrogen/Gibco 11360-039) D-PBS(Invitrogen/Gibco 14190-094) 1×胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen/Gibco 25300-054) Opti-MEM(Invitrogen/Gibco 31985-047) Lipofectamine 2000(Invitrogen 11668-027) CRE-luc載體(Zealand batch) hGLP2R載體(Zealand batch) DMEM中的10％(w/v)無菌BSA(Sigma 05488) DMEM中的10mM(200×)IBMX(Sigma I5879) LucLite試劑盒(Perkin Elmer 6016911) Topseal-A(Perkin Elmer 6005185) 培養(yǎng)基和緩沖液 用于BHK-21(C13)細胞的生長培養(yǎng)基 Glasgow MEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+10％FCS+1％NEAA+1％ 青霉素/鏈霉素+1mM丙酮酸鈉(1∶100). 用于BHK-21(C13)細胞的無抗生素轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基 Glasgow MEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+1％NEAA+1mM丙酮酸鈉(1∶100) 用于BHK-21(C13)細胞的轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基 Glasgow MEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+0.2％FCS+1％NEAA+1％青霉素/鏈霉素+1mM丙酮酸鈉(1∶100) 包被液D-PBS+1％BSA 肽溶解緩沖液 D-PBS+0.1％BSA 刺激緩沖液 無酚紅DMEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+50μM IBMX+0.3％BSA在經(jīng)轉(zhuǎn)染的BHK21(C13)細胞中篩選肽的方案 將BHK-21細胞接種于10厘米TC-培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至70-80％匯合。接著，將培養(yǎng)基換成無血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。將DNA(7.5微克hGLP-2受體載體和7.5微克CRE-螢光素酶載體)和Lipofectamine 2000稀釋于OptiMEM中，將其合并然后在20-30分鐘后添加至細胞中。在培養(yǎng)箱中在37℃5％CO2下孵育細胞4小時，胰酶消化，以35000個細胞/孔重新接種到96孔板。將細胞在完全培養(yǎng)基中孵育過夜以使轉(zhuǎn)基因表達。所有用于制備稀釋GLP-2類似物溶液的平板均用磷酸鹽緩沖液中1％的BSA預(yù)包被2小時并干燥過夜。將GLP-2類似物溶于PBS/0.1％BSA中至250μM，分別在兩個步驟中用含有磷酸二酯酶抑制劑和0.3％BSA的無酚紅無血清培養(yǎng)基(刺激緩沖液)稀釋至10μM和100nM，之后，在相同的刺激緩沖液中連續(xù)稀釋GLP-2類似物，產(chǎn)生10nM至10fM的濃度。僅使用刺激緩沖液作為基線活性的對照。這些溶液預(yù)先加溫至37℃30分鐘。用預(yù)溫(37℃)的刺激緩沖液洗滌細胞，然后與100微升預(yù)溫的肽稀釋液和對照在37℃5％CO2下孵育5小時。在孵育臨結(jié)束前制備LucLite酶底物/裂解緩沖液。每孔加入100微升LucLite底物，在合適的計數(shù)器(例如Wallac Victorll)中對發(fā)光進行計數(shù)。通過用4參數(shù)Logistic方程進行擬合而從原始數(shù)據(jù)中得到EC50值(Microcal Origin5.0或GraphPad 4)。
在表5中列出結(jié)果 表5在表達GLP-2受體的BHK21細胞中篩選GLP-2類似物 ZP ID 226322642266 226722682269 227022722242 pEC50 10.84 11.59.253 10.87 11.21 10.0410.231 1.2712,41 SEM0.1929 0.2419 0.2272 0.3139 0.2239 0.09546 0.1449 0.1668 0,1971 結(jié)論結(jié)果清楚地顯示，所有測試的化合物都是GLP-2激動劑。
實施例10.體內(nèi)測試，在雄性C57BL小鼠中測定對腸生長的刺激 在C57BL小鼠中測定本發(fā)明化合物(ZP2264、ZP2266、ZP2267、ZP2268、ZP2242、ZP2269、ZP2270、ZP2272和ZP2242)選擇性刺激小腸質(zhì)量(與結(jié)腸質(zhì)量相比)的能力。連續(xù)三天每天一次對各個組(n＝6-10)小鼠皮下給予800nmol/kg的每種化合物。出于比較的目的，對其它組動物以相同給藥方案給予等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2(ZP1559)或載體(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)。在最后一次給予化合物后24小時，將小鼠處死，將小腸(從幽門到盲腸)和結(jié)腸(盲腸以下的腸)排空并稱重。
為了校正體重(body weight，BW)的微小差異，將小腸(smallintestine，SI)和結(jié)腸的器官重表示為相對于BW的值。非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2已被報道為刺激幽門、胃、小腸和結(jié)腸的胃腸生長，為了評價化合物所誘導(dǎo)生長模式的差異，按照如下計算化合物X的小腸-結(jié)腸敏感性指數(shù) (SI/結(jié)腸)X/(SI/結(jié)腸)[Gly2]GLP-2％ 具有大于或等于1.10的小腸-結(jié)腸敏感性的化合物被認為對小腸具有相對選擇性。


結(jié)果 基于所述肽選擇性增加小腸質(zhì)量(與結(jié)腸質(zhì)量相比)的能力來確定本發(fā)明測試化合物的作用。在圖1和2中，顯示了施用參照化合物[Gly2]GLP-2和ZP2264、ZP2266、ZP2267、ZP2268、ZP2242、ZP2269和ZP2272后與載體對照相比的小腸相對質(zhì)量。在圖3和4中，顯示了與參照化合物[Gly2]GLP-2相比，所述測試化合物對小腸質(zhì)量與結(jié)腸質(zhì)量之比值的影響。將給予[Gly2]GLP-2的動物中小腸質(zhì)量與結(jié)腸質(zhì)量之比值標準化為100％。基于計算出相對于參照化合物[Gly2]GLP-2的小腸-結(jié)腸敏感性指數(shù)，將具有小腸選擇性的測試化合物顯示于表6。將給予[Gly2]GLP-2的動物中的小腸-結(jié)腸敏感性指數(shù)標準化為1。相對于參照化合物[Gly2]GLP-2，所述測試化合物對小腸和結(jié)腸質(zhì)量的影響在表7中顯示。將給予[Gly2]GLP-2的動物中小腸質(zhì)量和結(jié)腸質(zhì)量標準化為100％。
實施例11.體內(nèi)測試，在雄性C57BL小鼠中測定對腸生長的刺激 在雄性C57BL小鼠中測定了另一些化合物選擇性刺激小腸質(zhì)量(相對于結(jié)腸質(zhì)量)的能力。使用與實施例10中相似的方案，只是每天施用200nmol/kg每種化合物。連續(xù)三天每天一次對各個組(n＝6-10)小鼠皮下給予200nmol/kg的每種化合物。對其它組動物以相同給藥方案給予等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2(參照化合物)或載體(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，陰性對照)。在最后一次給予化合物后24小時，將小鼠處死，將胃、小腸和結(jié)腸排空并稱重。
如圖6所示，本發(fā)明的化合物ZP2380、ZP2381、ZP2384、ZP2385、ZP2397、ZP2398、ZP2399、ZP2411、ZP2417、ZP2418、ZP2420、ZP2423具有選擇性增加小腸質(zhì)量(相對于結(jié)腸質(zhì)量)的能力。
實施例12.體內(nèi)測試，在雄性C57BL小鼠中測定對腸生長的刺激 基于所述肽相對于載體對照選擇性增加胃質(zhì)量的能力來測定本發(fā)明測試化合物的作用。在雄性C57BL小鼠中測定本發(fā)明化合物(ZP2395、ZP2396、ZP2400、ZP2412、ZP2394和ZP2401)選擇性刺激胃質(zhì)量(相對于結(jié)腸質(zhì)量)的能力。連續(xù)三天每天一次對各個組(n＝6-10)小鼠皮下給予200nmol/kg的每種化合物。出于比較的目的，對其它組動物以相同給藥方案給予等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2或載體(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)。在最后一次給予化合物后24小時，將小鼠處死，將胃和小腸(從幽門到回盲腸)排空并稱重。為了校正體重(BW)的微小差異，將胃的器官重表示為相對于BW的值。圖7中顯示，化合物ZP2395、ZP2396、ZP2400、ZP2412、ZP2414、ZP2416、ZP2394和ZP2401具有選擇性增加胃質(zhì)量(相對于結(jié)腸質(zhì)量)的能力。
尚未報道過參照化合物[Gly2]GLP-2刺激胃質(zhì)量，而許多所述ZP化合物增加胃質(zhì)量(相對于體重)(圖7)。為評價與[Gly2]GLP-2相比，ZP化合物對胃誘導(dǎo)的差異生長模式，按照如下計算化合物X的胃-結(jié)腸敏感性指數(shù) (胃/結(jié)腸)X/胃/(結(jié)腸)[Gly2]GLP-2％ 具有大于或等于1.05的胃/結(jié)腸敏感性的化合物被認為對胃具有相對選擇性。
化合物ZP2267、ZP2386、ZP2404、ZP2413、ZP1415、ZP2402、ZP2403、ZP2382、ZP2266、ZP2378、ZP2414、ZP2416、ZP2424、ZP2379、ZP2269對小腸、結(jié)腸或胃沒有選擇性(圖8)。
圖8顯示了實施例10至12所得數(shù)據(jù)的總結(jié) 圖8數(shù)據(jù)總結(jié)
＊NT未測試 GLP-2受體特異性 底物顯示對給定受體具有特異性的機制涉及所述底物與所述受體之間基于氫鍵、疏水作用、靜電相互作用等的多種相互作用。
在我們的構(gòu)效關(guān)系研究中，看來GLP-2序列的11、16、20、24和28位殘基與GLP-2受體的識別和結(jié)合密切相關(guān)。因此，這些特定位置的氨基酸譜的改變將GLP-2類似物分為三個不同的組別小腸特異性、胃特異性和非特異性肽。
發(fā)現(xiàn)GLP-2類似物的受體特異性取決于11、16、20、24和28位氨基酸的疏水性和氫鍵結(jié)合勢。
實施例13.HPI對小腸特異性的影響 在表9中顯示了根據(jù)SI/結(jié)腸敏感性指數(shù)具有小腸特異性之GLP-2肽的HPI數(shù)據(jù)。
表9小腸特異性GLP-2類似物-親水性圖(hydrophaticity profile，HPP)
數(shù)據(jù)顯示，小腸特異性GLP-2類似物中11、16、20、24和28位中各個位置的HPI區(qū)間應(yīng)該獨立地為11位和16位至少為-0.8≤HPI≤3.8，或者優(yōu)選為-0.8≤HPI≤2.8或更優(yōu)選為HPI＝1.8。
對20、24和28位來說，HPI區(qū)間應(yīng)獨立地為-0.8≤HPI20、2428≤1.8，或者優(yōu)選為-0.8≤HPI20≤1.8或更優(yōu)選為HPI24和28＝-0.8。
根據(jù)HPI區(qū)間，小腸選擇性肽的可能的氨基酸替換模式在表10中顯示。
表10小腸特異性GLP-2類似物親水性圖(HPP)
因此，X11、X16、X20、X24和X28各自可獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。特別地，X11和X16各自可獨立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可以獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
實施例14.HPI對胃特異性的影響 在表11中，顯示了根據(jù)胃/SI-敏感性指數(shù)具有胃特異性之GLP-2肽的HPI數(shù)據(jù)。
表11胃特異性GLP-2類似物親水性圖(HPP)
數(shù)據(jù)顯示，胃特異性GLP-2類似物中11、16、20、24和28位中各個位置的HPI區(qū)間應(yīng)獨立地為11位和16位至少為-3.9≤HPI11、16≤3.8，或者優(yōu)選為2.8≤HPI11、16≤3.8或HPI11、16＝-3.9。
對于20、24和28位，HPI應(yīng)獨立地是-3.9≤HPI20、24、28≤1.8，或者優(yōu)選為-0.8≤HPI20、24、28≤1.8或HPI20、24、28＝-3.9。
根據(jù)HPI區(qū)間，可能的氨基酸替換模式在表12中顯示。
表12可能的氨基酸替換模式
因此，對于胃特異性化合物 X11可以是Leu、Phe或Lys。
X16可以是Leu、Phe或Lys。
X20可以是Ala或Ser。
X24可以是Ala、Ser或Lys。
X28可以是Ala、Ser或Lys。
作為舉例，X11和X16可獨立地是Leu或Phe，以及X20、X24和X28可以是Ser。
氫鍵結(jié)合勢(hydrogen bonding potential，HBP)對受體特異性的影響 如之前所述，還發(fā)現(xiàn)GLP-2類似物的受體特異性由上述11、16、20、24和28位的氫鍵結(jié)合勢決定。
W.D.Stein“The movement of molecules across cell membranes”，Academic Press N.Y.1967，65-125頁引入并定義了各個氨基酸的氫鍵結(jié)合勢(HBP)，并且提供了給定氨基酸側(cè)鏈形成氫鍵的能力。
各個氨基酸的HBP在表13中給出 表13各個氨基酸的HBP
實施例15.氫鍵結(jié)合勢(HBP)對胃特異性的影響 胃特異性類似物的實例在表14中顯示。
表14胃特異性GLP-2肽類似物
根據(jù)此表，胃特異性GLP-2類似物11、16、20、24和28位中各個位置的HBP區(qū)間應(yīng)獨立地為對所有位置來說至少為0≤HBP11、16、20、24、28≤2。根據(jù)HBP區(qū)間，可能的氨基酸替換模式在表15中顯示。
表15、可能的氨基酸替換模式
優(yōu)選的胃特異性類似物是如下的GLP-2類似物其HBP區(qū)間對于11和16位為HBP11、16＝0，20、24和28位獨立地為0≤HBP20、24、28≤2。
一些胃特異性GLP-2類似物如下 X11可以是Leu、Phe或Lys。
X16可以是Leu、Phe或Lys。
X20可以是Ala或Ser。
X24可以是Ala、Ser或Lys。
X28可以是Ala、Ser或Lys。
例如，X11和X16可以獨立地是Leu或Phe，X24和X28可以獨立地是Lys或Ser，X20可以是Ser。
例如，X11和X16可以獨立地是Leu或Phe，X20、X24和X28可以是Ser。
實施例16、氫鍵結(jié)合勢(HBP)對小腸特異性的影響 還發(fā)現(xiàn)小腸特異性GLP-2類似物由參數(shù)例如上述11、16、20、24和28位的氫鍵結(jié)合勢決定。各個氨基酸的HBP在表16中給出。
表16、氫鍵結(jié)合勢(HBP)對小腸特異性的影響
根據(jù)此表，小腸特異性GLP-2類似物的11、16、20、24和28位中各個位置的HBP區(qū)間應(yīng)獨立地為對所有位置來說至少為0≤HBP11、16、20、24、28≤2。
優(yōu)選的類似物具有如下HBP區(qū)間對11和16位為HBP11、16＝0，20、24和28位獨立地具有0≤HBP20、24、28≤2的HBP區(qū)間。
顯示小腸特異性的更優(yōu)選GLP-2類似物是具有如下HBP區(qū)間的肽對11和16位來說為HBP11、16＝0，HBP20＝0-2，HBP24、28＝2。
由此，一些替換模式顯示于表17中。
表17、小腸特異性肽
因此，在小腸選擇性化合物中，X11、X16、X20、X24和X28可各自獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。例如，X11和X16可獨立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可以獨立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
盡管已經(jīng)結(jié)合上述示例性實施方案描述了本發(fā)明，但是在給出這一公開內(nèi)容后，許多等價的改良和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，認為所提出的本發(fā)明示例性實施方案是用于說明而非限制?？蓪λ鰧嵤┓桨高M行多種變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。將本文引用的所有文獻均明確地以參考方式并入本文。
權(quán)利要求
1.通式I所代表的胰高血糖素樣肽2(GLP-2)或者其可藥用鹽或衍生物
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1是氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙?；?；
X2是Gly、Ala或Sar；
X3是Glu或Asp；
X5是Ser或Thr；
X6是Phe或Pro或保守性替換；
X7是Ser或Thr；
X8是Asp或Ser或保守性替換；
X9是Glu或Asp或保守性替換；
X10是Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸；
X11是Y1；
X12是Thr或Lys或保守性替換；
X13是Ile、Glu或Gln或保守性替換；
X14是Leu、Met或Nle或保守性替換；
X15是Asp或Glu或保守性替換；
X16是Y2；
X17是Leu或Glu或保守性替換；
X18是Ala或Aib或非保守性替換；
X19是Ala或Thr或保守性替換；
X20是Y3；
X21是Asp或IIe或保守性替換；
X24是Y4；
X28是Y5；
X31是Pro、Ile或缺失；
X32是Thr或缺失；
X33是Asp、Asn或缺失；
R2是NH2或OH；
其中
Z1和Z2獨立地為不存在或者是選自以下的1-10個氨基酸單元的肽序列Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn；如下計算式I中X11、X16、X20、X24、X28殘基的親水性圖(HPP)≥-10
HPP＝∑hpiX11+hpiX16+hpiX20+hpiX24+hpiX28
其中
Y1、Y2、Y4和Y5各自可選自Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe；并且
Y3可選自Asn、Asp、Glu、Gln、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、GIy、Leu、Ile、Val、Met或Phe；
前提條件是，當X20是Arg時，則X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的胰高血糖素樣肽2(GLP-2)類似物，其中HPP≥-4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的胰高血糖素樣肽2(GLP-2)類似物，其中HPP≥0。
4.通式II代表的胰高血糖素樣肽2(GLP-2)類似物或者其可藥用鹽或衍生物
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1是氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙?；?；
X2是Gly、Ala或Sar；
X3是Glu或Asp；
X5是Ser或Thr；
X6是Phe或Pro；
X7是Ser或Thr；
X8是Asp或Ser；
X9是Glu或Asp；
X10是Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸；
X11是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X12是Thr或Lys；
X13是Ile、Glu或Gln；
X14是Leu、Met或Nle；
X15是Asp或Glu；
X16是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X17是Leu或Glu；
X18是Ala或Aib；
X19是Ala或Thr；
X20是Asn、Arg、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X21是Asp或Ile；
X24是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X28是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X31是Pro、Ile或缺失；
X32是Thr或缺失；
X33是Asp、Asn或缺失；
R2是NH2或OH；
其中
Z1和Z2獨立地為不存在或者是選自以下的1-10個氨基酸單元的肽序列Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn；
前提條件是，當X20是Arg時，則X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的GLP胰高血糖素樣肽2(GLP-2)，其中
X11是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X16是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X20是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X24是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X28是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的GLP胰高血糖素樣肽2(GLP-2)，其中
X11是Ala、Ile、Leu、Phe或Val；
X16是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X20是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X24是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X28是Ala、Ile、Leu、Phe或Val。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物與野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，并且具有在體內(nèi)導(dǎo)致腸質(zhì)量增加的生物活性。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位的多于一個替換和/或一個或多個所述替換與X3、X5、X7和/或X10位的一個或多個替換相組合。
9.權(quán)利要求1或4的GLP-2類似物，其中所述X10位替換是Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸，例如Met(O)或Met(O)2。
10.由通式III所定義的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物R1-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2；
其中
R1是氫、C1-4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲?；⒈郊柞；蛉阴；?；
X8是Asp或Ser，優(yōu)選Asp；
X11是Ser、Ala、Glu、Lys或Asn；
X15是Glu或Asp，優(yōu)選Glu；
X16是Ser、Ala或Glu；
X20是Ser、Ala或Glu；
X24是Ser、Ala或Glu；并且
X28是Ser、Ala、Gln或Glu。
11.公開于本文表1和表2中的前述權(quán)利要求中任一項的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物。
12.權(quán)利要求11的GLP-2類似物，其為
2263 HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITD-NH2
2264 HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLIATKITD-NH2
2266 HGEGSFSDELETILEELAAEDFIEWLIETKITD-NH2
2267 HGEGSFSDELSTILESLAAADFIAWLIATKITD-NH2
2268 HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITD-NH2
2269 HGEGSFSDELKTILESLAAADFIEWLIQTKITD-NH2
2270 HGEGSFSDELNTILESLAASDFISWLISTKITD-NH2
2272 HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITD-NH2
2242 HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH
13.前述權(quán)利要求中任一項的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含X3、X5、X7、X11、X16、X20、X24、X28、X31、X32和/或X33位上的多于一個替換。
14.權(quán)利要求13的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，其中所述GLP-2類似物包含選自X11、X16、X20、X24、X28位是Ile、Ala、Leu、Phe或Val的一個或多個替換；并且X31、X32和X33位的氨基酸殘基任選是缺失的。
15.權(quán)利要求1-9中任一項的GLP-2類似物，其包含X11、X16、X20、X24和/或X28位中一個或多個位置上的替換。
16.權(quán)利要求1、4或10的GLP-2類似物，其中X11、X16、X20、X24和X28各自獨立地選自Ala、Ser、Gly和Thr，并且其中所述類似物相對于結(jié)腸而言對小腸具有偏好性生長促進活性。
17.權(quán)利要求16的GLP-2類似物，其中X11和X16各自獨立地選自Ala和Ser，X20、X24和X28各自獨立地選自Ala、Ser、Gly和Thr。
18.權(quán)利要求17的GLP-2類似物，其中X11和X16都是Ala，X20、X24和X28獨立地選自Ala、Ser、Gly和Thr。
19.權(quán)利要求17的GLP-2類似物，其中X11和X16都是Ala，X20、X24和X28獨立地選自Ala和Ser。
20.權(quán)利要求16的GLP-2類似物，其包含X11、X16、X20、X24和X28位殘基的下述組合之一
Ser/Ser/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ala/Ala/Ser，Ser/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ser/Ala/Ala；Ser/Ala/Ala/Ala/Ala；Ser/Ala/Arg/Ala/Ala；Ala/Ser/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ala/Ala/Ala。
21.權(quán)利要求16的GLP-2類似物，其為
ZP2264，ZP2268，ZP2242，ZP2272，ZP2411，ZP2380，ZP2384，ZP2398，ZP2417，ZP2423，ZP2385，ZP2399，ZP2418，ZP2381，ZP2420或ZP2397。
22.權(quán)利要求1、4或10的GLP-2類似物，其中
X11選自Leu、Phe和Lys；
X16選自Leu、Phe和Lys；
X20選自Ala、Ser、Leu、Gly和Thr；
X24選自Ala和Ser；
X28選自Ala、Ser或Lys；
并且其中所述類似物相當于結(jié)腸而言對胃具有偏好性生長促進活性。
23.權(quán)利要求22的GLP-2類似物，其中X11和X16獨立地選自Leu和Phe，X24和X28獨立地選自Lys和Ser，X20是Ser。
24.權(quán)利要求23的GLP-2類似物，其中X11和X16獨立地選自Leu和Phe，X20、X24和X28是Ser。
25.權(quán)利要求22的GLP-2類似物，其包含X11、X16、X20、X24和X28位殘基的下述組合之一
Lys/Lys/Lys/Lys/Lys；Phe/Phe/Ser/Ser/Ser；Leu/Leu/Ser/Ser/Ser；Leu/Leu/Ala/Ala/Ala。
26.權(quán)利要求22的GLP-2類似物，其為ZP2400，ZP2412，ZP2396，ZP2394，ZP2401或ZP2395。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的GLP-2類似物，其中小腸特異性GLP-2類似物的11、16、20、24和28位中各個位置的HBP區(qū)間對所有位置來說應(yīng)獨立地至少為0≤HBP11、16、20、24、28≤2。
28.權(quán)利要求27的GLP-2類似物，其中11和16位的HBP區(qū)間為HBP11、16＝0，20、24和28位的HBP區(qū)間獨立地為0≤HBP20、24、28≤2。
29.權(quán)利要求1-26中任一項的GLP-2類似物，其中胃特異性GLP-2類似物的11、16、20、24和28位中各個位置的HBP區(qū)間對所有位置來說應(yīng)獨立地至少為0≤HBP11、16、20、24、28≤2。
30.權(quán)利要求29的GLP-2類似物，其中11和16位的HBP區(qū)間為HBP11、16＝0，20、24和28位的HBP區(qū)間獨立地為0≤HBP20、24、28≤2。
31.用于治療的前述權(quán)利要求中任一項的GLP-2類似物。
32.藥物組合物，其包含與載體混合的前述權(quán)利要求中任一項的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述GLP-2類似物是可藥用的酸加成鹽。
34.權(quán)利要求32或33的藥物組合物，其配制成適于通過注射或輸注施用的液體，或者配制成緩慢釋放所述GLP-2類似物。
35.權(quán)利要求1-26中任一項的GLP-2類似物在制備用于治療和/或預(yù)防胃腸相關(guān)疾病的藥物中的用途。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述胃腸相關(guān)疾病是潰瘍、佐-埃綜合征、消化疾病、吸收障礙綜合征、短腸綜合征(short-gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸損傷和短腸綜合征(shortbowel syndrome)。
37.權(quán)利要求35的用途，其中所述胃腸相關(guān)疾病是放射性腸炎、感染性或感染后腸炎或者由于有毒試劑或其它化學治療劑造成的小腸損傷。
38.權(quán)利要求1至26中任一項的GLP-2類似物在制備用于治療和/或預(yù)防化學治療或放射治療之副作用的藥物上的用途。
39.權(quán)利要求39的用途，其中所述化學治療的副作用是腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐或者化學治療導(dǎo)致的腸上皮的結(jié)構(gòu)性和功能性損傷。
40.權(quán)利要求1至26中任一項的GLP-2類似物在制備用于治療新生兒、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介導(dǎo)疾病的藥物上的用途。
41.權(quán)利要求1至26中任一項的GLP-2類似物在制備用于治療和/或預(yù)防與營養(yǎng)不良相關(guān)之病癥的藥物上的用途。
42.權(quán)利要求41的用途，其中所述與營養(yǎng)不良相關(guān)的病癥是惡病質(zhì)或厭食癥。
43.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-26中任一項的GLP-2類似物的核酸序列。
44.表達載體，其包含權(quán)利要求40的核酸序列與指導(dǎo)其表達的控制序列的組合。
45.轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求34之表達載體的宿主細胞。
46.產(chǎn)生權(quán)利要求1-26中任一項的GLP-2類似物的方法，所述方法包括在適于表達所述GLP-2類似物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求41的宿主細胞以及純化由此產(chǎn)生的所述GLP-2類似物。
47.用于治療的權(quán)利要求43的核酸分子、權(quán)利要求44的表達載體或權(quán)利要求41的宿主細胞。
48.權(quán)利要求43的核酸分子、權(quán)利要求40的表達載體或權(quán)利要求45的宿主細胞在制備用于治療和/或預(yù)防胃腸相關(guān)疾病或者用于治療和/或預(yù)防化學治療或放射治療副作用或者用于治療新生兒、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介導(dǎo)疾病之藥物中的用途。
49.通過施用有效量的權(quán)利要求1-26任一項的GLP-2類似物、權(quán)利要求43的核酸、權(quán)利要求44的表達載體或權(quán)利要求45的宿主細胞而在有此需要的患者中治療胃腸相關(guān)疾病的方法。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述胃腸相關(guān)疾病是潰瘍、佐-埃綜合征、消化疾病、吸收障礙綜合征、短腸綜合征(short-gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸損傷和短腸綜合征(shortbowel syndrome)。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述胃腸相關(guān)疾病是放射性腸炎、感染性或感染后腸炎、或者由于毒性試劑或其它化學治療劑造成的小腸損傷。
52.一種在有此需要的患者中治療或預(yù)防化學治療或放射治療之副作用的方法，所述方法包括施用有效量的權(quán)利要求1-26任一項的GLP-2類似物、權(quán)利要求43的核酸、權(quán)利要求44的表達載體或權(quán)利要求45的宿主細胞。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述化學治療的副作用是腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐或者化學治療導(dǎo)致的腸上皮的結(jié)構(gòu)性和功能性損傷。
54.一種在有此需要的患者中治療新生兒疾病、肥胖、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)疾病的方法，所述方法包括施用有效量的權(quán)利要求1-26任一項的GLP-2類似物、權(quán)利要求43的核酸、權(quán)利要求44的表達載體或權(quán)利要求45的宿主細胞。
55.治療藥盒，其包含癌癥化學治療藥物以及權(quán)利要求1-26任一項的GLP-2類似物、權(quán)利要求43的核酸、權(quán)利要求44的表達載體或權(quán)利要求45的宿主細胞，它們各自任選地與可藥用載體相組合。
56.藥物組合物，其包含癌癥化學治療藥物以及權(quán)利要求1-26任一項的GLP-2類似物、權(quán)利要求43的核酸、權(quán)利要求44的表達載體或權(quán)利要求45的宿主細胞，并與可藥用載體相組合。
全文摘要
本文公開了與h[Gly2]GLP-2相比包含一個或多個替換的GLP-2類似物，其可具有提高的小腸/結(jié)腸和胃/結(jié)腸選擇性的特性。更具體地，本文公開的優(yōu)選GLP-2類似物包含野生型GLP-2序列中(11、16、20、24)和/或(28)位中一個或多個位置上的替換，其任選地與以下相組合(2)位以及(3、5、7)位和(10)位中一個或多個位置上的其他替換，和/或缺失(31)至(33)位的一個或多個氨基酸，和/或添加N端或C端穩(wěn)定肽序列。所述類似物在預(yù)防或治療胃腸相關(guān)疾病以及減輕化學治療的副作用方面特別有用。
文檔編號A61K38/26GK101573376SQ200780041490
公開日2009年11月4日 申請日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日
發(fā)明者比亞內(nèi)·杜·拉森, 伊薇特·米亞塔·彼得森 申請人:西蘭制藥公司