專利名稱：：包含抗hb-egf抗體作為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及治療癌癥的方法和抗癌劑。
背景技術：
：可結合肝素的表皮生長因子樣生長因子，或HB-EGF，是屬于EGF配體家族的一種生長因子。HB-EGF基因敲除小鼠顯示非常有害的表型，如心臟功能衰竭伴心臟肥大和出生后快速死亡(非專利文獻1)。這表明HB-EGF對于妊娠期間心臟的形成做出了極大的貢獻。另一方面，在成年人中，其表達分布在較廣范圍的組織中，如肺、心臟、腦和骨膝肌中(非專利文獻2),HB-EGF不僅在妊娠期間，而且在維持成年人的生物功能方面，都具有非常重要的作用(非專利文獻3)。HB-EGF在體內(nèi)以兩種不同的結構存在在表達HB-EGF的細胞的細胞表面表達的膜結合HB-EGF(下文稱為proHB-EGF)和不含細胞的分泌型(下文稱為sHB-EGF或活性型HB-EGF)。圖1示意性地顯示了proHB-EGF和sHB-EGF的結構。proHB-EGF前體蛋白由208個氨基酸組成，從N-末端開始，由信號肽、前肽、肝素結合域、EGF樣結構域、近膜結構域、跨膜結構域和胞質域組成。信號肽從proHB-EGF前體蛋白上裂解下來導致proHB-EGF的作為1型跨膜蛋白質表達。隨后，proHB-EGF受到蛋白酶的消化，這被稱為胞外域脫落，由73-87個氨基酸殘基組成的sHB-EGF被釋放到胞外環(huán)境中。這種sHB-EGF僅由肝素結合域和EGF樣結構域這兩個結構域組成，并作為活性配體結合EGF受體(Herl)和EGF受體4(Her4)。這導致通過下游的ERK/MAPK信號路徑，在例如NIH3T3細胞、平滑肌細胞、上皮細胞、角化細胞、腎小管細胞等多種細胞中誘導增殖(非專利文獻4)。由于將突變引入?yún)⑴c胞外域脫落的區(qū)域內(nèi)，只表達proHB-EGF的細胞發(fā)生增殖能力的實質性減少。另外，只表達proHB-EGF的轉基因小鼠具有與HB-EGF敲除小鼠同樣的表型?；谶@些發(fā)現(xiàn)，作為生長因子的HB-EGF的功能被認為主要由分泌型HB-EGF承擔(非專利文獻5和6)。另一方面，也知道proHB-EGF在體內(nèi)具有不同于sHB-EGF的獨特功能。即，起初已知proHB-EGF作為白喉毒素(DT)的受體發(fā)揮功能(非專利文獻7和8)。但是，隨后的研究證明proHB-EGF在細胞表面與諸如DRAP27/CD9的分子以及整聯(lián)蛋白和硫酸肝素形成復合物，并參與細胞粘附和遷移。也已表明通過EGF受體(下文稱為EGFR)經(jīng)近分泌機制作用，proHB-EGF抑制鄰近細胞的生長并誘導鄰近細胞的死亡。因此，關于HB-EGF作為EGFR配體的作用方面，已知膜結合proHB-EGF和分泌型sHB-EGF傳送完全相反的信號(非專利文獻5和8)。HB-EGF對例如癌細胞的多種細胞抹的細胞增殖、細胞運動和浸潤具有強烈的促進活性。另外，已報道廣泛范圍的癌癥類型(例如，胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌和腦瘤)比正常組織中的HB-EGF表達增加，提示HB-EGF深入地參與了癌增生或惡性轉化(非專利文獻4和10)。因此，基于這些發(fā)現(xiàn)，繼續(xù)研究通過抑制HB-EGF活性抑制癌細胞生長。對于使用抗HB-EGF中和抗體抑制HB-EGF作用的努力，尤其報道了以下效應對3T3細胞中的DNA合成的抑制(非專利文獻ll),對角化細胞生長的抑制(非專利文獻12)、對神經(jīng)膠質瘤細胞生長的抑制(非專利文獻13)和對骨髓瘤細胞中的DNA合成的抑制(非專利文獻14)。同時，也已繼續(xù)研究了特異性結合HB-EGF的減毒白喉毒素(CRM197)作為HB-EGF抑制劑的應用。事實上，在小鼠異種移植模型(移植有卵巢癌細胞抹)上的有效性測試中，接受CRM197的組呈現(xiàn)出較好的胂瘤縮小效應(非專利文獻15)。另外，也使用CRM197在癌癥患者中進行了臨床試驗(非專利文獻16)。本說明書中引用的參考文獻在下面列出。本文完整引用這些文獻的內(nèi)容作為參考。沒有承認這些文獻作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術非專利文獻1:IwamotoR,YamazakiS,AsakuraM等人，Heparin-bindingEGF-likegrowthfactorandErbBsignalingisessentialforheartfunction.P亂淑/.*a<i.園，2003;100:3221-6.非專利文獻2:AbrahamJA，DammD,BajardiA,MillerJ，KlagsbrunM,EzekowitzRA.Heparin-bindingEGF-Hkegrowthfactor:characterizationofratandmousecDNAclones,proteindomainconservationacrossspecies,andtranscriptexpressionintissues,歷oc/em所o/A"iesCcwmww,1993;190:125-33.非專利文獻3:KarenM.,尸row,/ens1別osr/e"ce，3，288-299，1998.非專利文南大4:RaabG,KlagsbrunM.Heparin-bindingEGF-likegrowthfactor.AW^m1997;1333:F179-99.非專利文獻5:YamazakiS,IwamotoR,SaekiK等人，MicewithdefectsinHB-EGFectodomainsheddingshowseveredevelopmentalabnormalities.JC"/編，2003;163:469-75.非專利文獻6:OngusahaP.,Ca"cwA^，(2004)64,5283-5290.非專利文獻7:IwamotoR.,HigashiyamaS.,J.13,2322-2330(1994).非專利文獻8:NaglichJG.，MetherallJE.,CW/，69，1051-1061(1992).非專利文獻9:IwamotoR,HandaK,MekadaE.Contact-dependentgrowthinhibitionandapoptosisofepidermalgrowthfactor(EGF)receptor-expressingcellsbythemembrane-anchoredformofheparin-bindingEGF-likegrowthfactor.CAem.1999;274:25906-12.非專利文獻10:MiyamotoS,Ca"cer化Z.97,341-347(2006).非專利文獻11:BlotnickS.,/Voc.iVW/.Jccwf.Sd.L^4,(1994)91，2890-2894.非專利文獻12:HashimotoK.,腸/.CTz亂(1994)269，20060-20066.非專利文獻13:MishimaK.,爿"iVewro;^Ao/.(1998)96，322-328.非專利文獻14:WangYD.(9"coge"e,(2002)21,2584-2592.非專矛J文南史15:MiyamotoS.,CawcerW".(2004)64,5720-非專利文獻16:BuzziS.，Qzwcer/附mwwo//mmwwo/7^r,(2004)53，1041-1048.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種新型的包含抗HB-EGF抗體的藥物組合物。更具體的目的是提供一種使用抗HB-EGF抗體、包含抗HB-EGF抗體的新型細胞增殖抑制劑、包含抗HB-EGF抗體的新型抗癌劑以及新型抗HB-EGF抗體治療癌癥的新方法。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)抗HB-EGF(其是一種在癌細胞中高度表達的蛋白質)的抗體顯示內(nèi)化活性。本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)抗HB-EGF抗體顯示抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴的細胞介導的細胞毒性(CDC)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)抗HB-EGF抗體對于治療HB-EGF表達上調(diào)的癌癥(最明顯的是卵巢癌)有效，由此實現(xiàn)了本發(fā)明。當本發(fā)明人通過用HB-EGF蛋白免疫小鼠產(chǎn)生單克隆抗體時，他們發(fā)現(xiàn)獲得的抗體具有內(nèi)化活性。另外，當細胞毒性物質與獲得的內(nèi)化抗HB-EGF抗體結合并測定細胞死亡誘導活性時，注意到顯著的細胞死亡誘導活性。而且，當測定獲得的抗HB-EGF抗體的ADCC活性和CDC活性時，發(fā)現(xiàn)抗HB-EGF抗體顯示ADCC活性和/或CDC活性。因此，本申請?zhí)峁┝诉x自下面的(l)-(24)的單克隆抗體和低分子量抗體衍生物8(1)一種具有內(nèi)化活性的抗HB-EGF抗體；(2)—種結合有細胞毒性物質的抗HB-EGF抗體；(3)具有內(nèi)化活性的如(2)所述的抗體；(4)一種具有ADCC活性或CDC活性的抗HB-EGF抗體；(5)進一步具有內(nèi)化活性的如(l)-(4)中任一項所述的抗體；(6)—種選自下面的[1]-[13]的抗體包含具有作為CDR1的SEQIDNO:14的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:16的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:18的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:20的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:22的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；包含如[1]所述的重鏈和如[2]所述的輕鏈的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:26的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:28的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:30的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:32的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:34的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:36的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；包含如[4]所述的重鏈和如[5]所述的輕鏈的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:76的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:77的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HE-39H鏈)的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:79的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:80的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:81的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(HE-39L鏈-1)的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:82的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:83的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:84的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(HE-39L鏈-2)的抗體；[10]包含如[7]所述的重鏈和如[8]所述的輕鏈的抗體；[11]包含如[7]所述的重鏈和如[9]所述的輕鏈的抗體；[l2]具有與[l]-[ll]中任一項所述抗體的活性相當?shù)幕钚缘目贵w；和與[1]-[12]中任一項所述的抗體結合相同的表位的抗體。(7)—種包含如(1)-(6)中任一項所述的抗體的藥物組合物；(8)—種包含結合在如(l)-(6)中任一項所述的抗體上的細胞毒性物質的藥物組合物；(9)如(7)或(8)所述的藥物組合物，其是細胞增殖抑制劑；(10)如(9)所述的藥物組合物，其是抗癌劑；(11)如(10)所述的藥物組合物，其中，所述癌癥是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、腦瘤或血液癌；(12)—種利用抗HB-EGF抗體將細胞毒性物質遞送到細胞內(nèi)的方法；(13)—種用結合在抗HB-EGF抗體上的細胞毒性物質抑制細胞增殖的方法；(14)如(13)所述的方法，其中，所述細胞是癌細胞；(1》如(12)-(M)中的任一項所述的方法，其中，所述細胞毒性物質是化學治療劑、放射性物質或毒性肽；(16)抗HB-EGF抗體將細胞毒性物質轉運到細胞內(nèi)的用途；(17)具有內(nèi)化活性的抗HB-EGF抗體在抑制細胞增殖中的用途；(18)如(17)所述的用途，其中，所述抗HB-EGF抗體進一步包含中和活性；(19)如(18)所述的用途，其中，所述抗HB-EGF抗體進一步包含ADCC活性或CDC活性；(20)如(16)-(19)中的任一項所述的用途，其中，所述細胞是癌細胞;10(21)如(16)-(19)中的任一項所述的用途，其中，所述細胞毒性物質結合在抗HB-EGF抗體上；(22)—種制備藥物組合物的方法，包括以下步驟(a)提供抗HB-EGF抗體；(b)確定(a)的抗體是否具有內(nèi)化活性；(c)選擇具有內(nèi)化活性的抗體；和(d)將細胞毒性物質結合于(c)中選擇的抗體上；(23)如(22)所述的制備方法，其中，所述藥物組合物是抗癌劑；(24)—種^(吏用抗HB-EGF抗體i貪斷癌癥的方法；(25)如(24)所述的診斷方法，包括使用結合有標記物質的抗HB-EGF抗體；(26)如(24)或(25)所述的診斷方法,其中，檢測摻入細胞內(nèi)的抗HB-EGF抗體；(27)—種結合有標記物質的抗HB-EGF抗體；(28)如(27)所述的抗體，其具有內(nèi)化活性。附圖簡述圖1是示意性地描述用作免疫原的proHB-EGF、sHB-EGF和HB-EGF—Fc的結構的圖2a是示意性地描述HB-EGF與EGFR_Ba/F3細胞結合的影響的圖2b是顯示EGFR—Ba/F3細胞增殖對HB-EGF濃度的依賴性的曲線圖3a是顯示HB-EGF抗體(HA-1、HA-3、HA-9、HA-10和HA-20)對EGFR_Ba/F3細胞的HB-EGF依賴性生長的中和活性的曲線圖3b是顯示HB-EGF抗體(HB-IO、HB-13、HB-20、HB-22和HC-74)對EGFR—Ba/F3細胞的HB-EGF依賴性生長的中和活性的曲線圖3c是顯示HB-EGF抗體(HC-15、HC-19、HC-26和HC-42)對EGFR—Ba/F3細胞的HB-EGF依賴性生長的中和活性的曲線圖；圖4是HB-EGF中和抗體的可變區(qū)序列的比較；圖5是顯示抗體HA-20、HB-20和HC-15對活性型HB-EGF的結合活性的曲線圖6是顯示抗體HA-20、HB-20和HC-15對proHB-EGF的結合活性的圖7是顯示HB-EGF抗體抑制固相上HB-EGF與EGFR之間的結合的示意圖8是顯示對于EGFR/HB-EGF結合模式的基于ELISA的分析模型的示意圖9是顯示在對于EGFR/HB-EGF結合模式的基于ELISA的分析模型中檢測到的HB-EGF濃度曲線的圖10是顯示抗體HA-20、HB-20和HC-15抑制HB-EGF與EGFR結合的圖11是比較抗體HA-20、HB-20和HC-15抑制EGFR—Ba/F3細胞的生長的曲線圖12a是顯示在含有8%FCS的培養(yǎng)基中，抗體HA-20、HB-20和HC-15抑制卵巢癌細胞株RMG-1的生長的圖12b是顯示在含有2%FCS的培養(yǎng)基中，抗體HA-20、HB-20和HC畫15抑制卵巢癌細胞林RMG-1的生長的圖;圖13是通過將結合抗原的抗體(HB-EGF靶向抗體與肥皂草毒蛋白(saporin)標記抗體的復合物)內(nèi)化到細胞內(nèi)而誘導細胞死亡的過程的示意圖14是顯示HA-20、HB-20和HC-15抗體誘導SKOV-3細胞(原始細胞抹)和HB-EGF_SKOV3細胞(HB-EGF高表達的SKOV-3細胞)細胞死亡的內(nèi)化介導的活性的圖15是顯示HA-20、HB-20和HC-15抗體對ES-2細胞上的HB-EGF的結合活性的圖16是顯示HA-20、HB-20和HC-15對ES-2卵巢癌細胞的內(nèi)12化介導的細胞死亡誘導活性的圖17顯示對卵巢癌細胞抹(RMG-1、MCAS)表達HB-EGF的FACS分析的圖18是在軟瓊脂集落形成試驗中，分析抗體HA-20和HC-15抑制RMG-1細胞增殖的中和活性的圖19是在軟瓊脂集落形成試驗中，分析抗體HA-20和HC-15對RMG-1卵巢癌細胞的內(nèi)化介導的增殖抑制活性的圖20是在軟瓊脂集落形成試驗中，分析抗體HA-20和HC-15對MCAS卵巢癌細胞的內(nèi)化介導的增殖抑制活性的圖21顯示對幾種血液癌細胞林表達HB-EGF的FACS分析的圖22顯示HA-20和HC-15抗體對幾種血液癌細胞株的內(nèi)化介導的增殖抑制；圖23a是分析肥皂草毒蛋白標記的HA-20抗體(HA-SAP)、月巴皂草毒蛋白標記的HC-15抗體(HC-SAP)和肥皂草毒蛋白標記的對照抗體(IgG-SAP)顯示的對各種實體癌細胞林和正常人內(nèi)皮細胞的增殖抑制活性的圖23b是分析肥皂草毒蛋白標記的HA-20抗體(HA-SAP)和肥急草毒蛋白標記的HC-15抗體(HC-SAP)顯示的對各種血液癌細胞抹的增殖抑制活性的圖24是將抗體HE-39對活性型HB-EGF的結合活性與抗體HA-20、HB-20及HC-15對活性型HB-EGF的結合活性進行比較的曲線圖25是顯示抗體HE-39和抗體HA-20、HB-20及HC-15對在DG44細胞中過量表達的proHB-EGF的結合活性的圖26是顯示HA-20、HB-20、HC-15和HE-39抗體抑制HB-EGF與EGFR結合的能力的曲線圖27顯示比較HA-20、HB-20、HC-15和HE-39抗體顯示的對EGFR_Ba/F3細胞的生長抑制活性的曲線圖28是HE-39抗體的可變區(qū)序列的比較；圖29a顯示通過對HE-39抗體進行另外的有限稀釋而獲得的單克隆抗體(HE39-1、HE39-5、HE39-14)對DG44細胞中過量表達的proHB-EGF的結合活性；圖29b是一張圖片，其中，對于HE-39抗體經(jīng)另外的有限稀釋獲得的單克隆抗體(HE39-1、HE39-5、HE39-14),通過RT-PCR確認各個可變區(qū)(VH、VL-1、VL-2)的表達；圖30是顯示抗體HE-39、HA-20和HC-15顯示的對HB-EGF—DG44細胞的內(nèi)化介導的細胞死亡誘導活性的圖31a是示意性地顯示HB-EGF的結構(上圖)、GST蛋白質與成熟HB-EGF或各個結構域(肝素結合域、EGF樣結構域)之間的融合蛋白的結構(下圖)的圖31b顯示在大腸桿菌(五.co/O中表達的GST融合蛋白的SDS-PAGE和CBB染色(左側)及用HE-39抗體進行Western印跡分析(右側)的結果；圖32a顯示HB-EGF的EGF樣結構域(EGFD)的氨基酸序列和分成3個片段(EGFD5、EGFD6、EGFD7)的EGF樣結構域的氨基酸序列；這些序列與GST蛋白質的C末端融合用于表位作圖32b顯示在大腸桿菌中表達的GST融合蛋白(GST-EGFD、GST-EGFD5、GST-EGFD6、GST-EGFD7)的SDS-PAGE和CBB染色(左圖)及用HE-39抗體進行Western印跡分析(右圖)的結果；圖33a是各種抗HB-EGF抗體顯示的對在Ba/F3細胞中過量表達的HB-EGF的結合活性的FACS分析圖；在縱軸上顯示作為G-平均值的焚光強度；和圖33b顯示各種抗HB-EGF抗體顯示的對HB-EGF_Ba/F3細胞的ADCC活性(上圖)和各種抗HB-EGF抗體顯示的對HB-EGF—Ba/F3細胞的CDC活性(下圖)；縱軸顯示由于ADCC介導的或CDC介導的細胞毒性而從細胞中釋放的鉻的量。發(fā)明優(yōu)選的實施方式HB-EGF的分子形式HB-EGF是屬于EGF配體家族的一種生長因子；編碼人HB-EGF的基因的序列以GenBank登記號NM_001945(SEQIDNO:49)公開，HB-EGF的氨基酸序列以GenBank登記號NP_001936(SEQIDNO:50)公開。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"HB-EGF蛋白"是包括全長蛋白質及其片段的術語。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"片段"指包含HB-EGF蛋白質的任何區(qū)域的多肽，其中，該片段可能不顯示天然存在的HB-EGF蛋白的功能。在本文用作片段的特定實施方式的sHB-EGF是由73-87個氨基酸殘基組成的分子，并且當在表達HB-EGF的細胞的細胞表面上表達的proHB-EGF在被稱為胞外域脫落的過程中被蛋白酶裂解時，在體內(nèi)產(chǎn)生。已知多種sHB-EGF分子；這些sHB-EGF分子具有下面的結構其中，羧基末端是位于proHB-EGF分子中的第149位點的脯氨酸殘基，proHB-EGF分子由SEQIDNO:50所示的208個氨基酸組成，而氨基末端是位于proHB-EGF分子中的第63位點的天冬酰胺殘基、位于proHB-EGF分子中的第73位點的精氨酸殘基、位于proHB-EGF分子中的第74位點的纈氨酸殘基或位于proHB-EGF分子中的第77位點的絲氨酸殘基?？笻B-EGF抗體本發(fā)明的抗HB-EGF抗體是可結合HB-EGF蛋白的抗體，但對其來源(小鼠、大鼠、人類等)、類型(單克隆抗體、多克隆抗體)和構型(工程抗體、低分子量抗體、修飾抗體等)沒有限制。用于本發(fā)明的抗HB-EGF抗體優(yōu)選地特異性結合HB-EGF。用于本發(fā)明的抗HB-EGF抗體也優(yōu)選地是單克隆抗體。具有內(nèi)化活性的抗體是用于本發(fā)明的抗體的一種優(yōu)選實施方式。"具有內(nèi)化活性的抗體"指一經(jīng)結合細胞表面上的HB-EGF就被轉運到細胞(細胞質、嚢泡、其它細胞器等)內(nèi)的抗體?？梢允褂帽绢I域的技術人員已知的方法確定抗體的內(nèi)化活性的存在/不存在。例如，可以通過以下步驟來測定內(nèi)化活性將結合標記物的抗HB-EGF抗體接觸表達HB-EGF的細胞，并檢查標記物是否摻入細胞內(nèi)；或將結合細胞毒素的抗HB-EGF抗體接觸表達HB-EGF的細胞，并檢查在表達HB-EGF的細胞中是否誘導細胞死亡。更具體地二沈，例如，可以4吏用下文4是供的實施例中所述的方法確定抗體的內(nèi)化活性的存在/不存在。在抗HB-EGF抗體具有內(nèi)化活性的情況下，抗HB-EGF抗體優(yōu)選地是能夠結合proHB-EGF的抗體，更優(yōu)選地是比結合sHB-EGF更強烈i也結合proHB-EGF的抗體。細胞毒性物質用于本發(fā)明的抗體的另一種優(yōu)選的實施方式是結合有細胞毒性物質的抗體。這樣的結合有細胞毒性物質的抗體可以摻入細胞內(nèi)，導致細胞毒性物質介導的已摻入抗體的細胞死亡的誘導。因此，結合有細胞毒性物質的抗體優(yōu)選地也具有內(nèi)化活性。用于本發(fā)明的細胞毒性物質可以是能夠誘導細胞的細胞死亡的任何物質，且可以包括毒素、放射性物質、化療劑等。用于本發(fā)明的細胞毒性物質包括前藥，其在體內(nèi)經(jīng)歷向活性細胞毒性物質的轉化?？梢越?jīng)過酶轉化或非酶轉化來進行前藥活化。在本發(fā)明的內(nèi)容中，毒素指微生物、動物或植物來源的各種細胞毒性蛋白質多肽等。用于本發(fā)明的毒素可以包括以下白喉毒素A鏈(LangoneJ丄等人,M"/oc/sZw五wz，o/og7，93，307-308,1983)、假單胞菌外毒素(A^w"M^/W"e,2，350-353，1996)、蓖麻毒蛋白A鏈(FultonR丄等人，《/.腸/.C/^m.，261，5314-5319,1986;SivamG.,等人，Omceri仏，47，3169-3173,1987;CumberA丄等人，/mww"o/.砲Wa135，15-24,1990;WawrzynczakEJ.等人，C羅w紐，50,7519-7562，1990;GheeiteV.等人，/國畫/.M"W:142，223-230，1991)、去糖基化蓖麻毒蛋白A鏈(ThorpeP,E.等人，Omcer/仏，47,5924-5931,1987)、相思豆毒蛋白A鏈(WawrzynczakE丄等人，5廣/66，361-366，1992;WawrzynczakE丄等人,CVmcerie&，50,7519-7562，1990;SivamG.等人,C羅wM,47,3169-3173，1987;ThorpeP.E.等人，Ca"cw尺仏，47，5924-5931,1987)、多花白樹毒蛋白(gelonin)(SivamG.等人，i".，47，3169-3173,1987;CumberA丄等人，//畫畫/.M"Ws,135,15-24，1990;WawrzynczakE丄等人，C匿"L，50,7519-7562，1990;BolognesiA.等人，C"".五x;Jm羅"o/.，89，341-346,1992)、PAP-s(來自種子的美洲商陸4元病毒蛋白；BolognesiA.等人,C""./mmtmo/.，89，341-346,1992)、briodin(BolognesiA.等人，d/mm畫/.，89,341-346,1992)、肥急草毒蛋白(BolognesiA.等人，C"".Exp./mm簡o/.,89,341-346,1992)、苦瓜毒蛋白(momordin)(CumberA丄等人，J./mmtmo/.135，15-24，1990;WawrzynczakE丄等人，C朋cer紐，50，7519-7562，1990;BolognesiA.等人，C//w./扁,/.，89，341-346，1992)、木鳘子蛋白(momorcochin)(BolognesiA.等人,C""./mwwwo/.,89,341-346,1992)、香石竹毒蛋白(dianthin)32(BolognesiA.等人，C""./mmw"o/.,89,341-346，1992)、香石竹毒蛋白30(StirpeF.，BarbieriL.，/^5S丄e"er,195，1-8,1986)、塑蓮根毒蛋白II(modeccin)(StirpeF.,BarbieriL.,F五^S195,1-8,1986)、槲寄生毒蛋白(viscumin)(StirpeF.,BarbieriL.,F五^S丄e"er,195,1-8,1986)、塑蓮根毒蛋白I(volkesin)(StirpeF.，BarbieriL"^mS丄"/^,195，1-8,1986)、商陸毒蛋白(dodecandrin)(StirpeF.,BarbieriL.,F五^S丄e"w，195,1-8,1986)、小麥毒蛋白(tritin)(StirpeF.,BarbieriL.，F(xiàn)五^S丄e"er,195，1-8,1986)、軟瓜蛋白(luffin)(StirpeF.，BarbieriL.,/^^S丄e"e。195,1-8，1986)和括蔞種子毒蛋白(trichokirin)(CasellasP.，等人，J.腸"亂，176，581-588,1988;BolognesiA.等人，d￡xp./國,/.,89,341-346，1992)。本發(fā)明中的放射性物質指含有放射性同位素的物質。對放射性同位素沒有特別的限制，可以使用任何放射性同位素。可用的放射性同位素的例子是32p、14C、125I、3H、131I、186Re、^Re等。17本發(fā)明中的化療劑指除了上文列舉的毒素和放射性物質之外的細胞毒性物質，包括例如，細胞因子、抗肺瘤藥、酶等。用于本發(fā)明的化療劑沒有特別限制，但優(yōu)選低分子量的化療劑。據(jù)信，低分子量的化療劑具有較低的干擾抗體功能的可能性，甚至在化療劑已結合抗體之后依然如此。在本發(fā)明的內(nèi)容中，低分子量的化療劑一般指100-2000的分子量，優(yōu)選200-1000的分子量。對本發(fā)明中的化療劑沒有特別的限制，可用的化療劑的例子如下美法侖(melphalan)(RowlandG.F.等人，淑,，255，487-488，1975)、順4白(cis-platinum)(HurwitzE.禾口HaimovichJ.,A/"/od&五wzymo/og少，178,369-375，1986;SchechterB.等人,Ca聰r，48，167-172,1991)、卡4白(carboplatin)(OtaY.等人，顏a-(9ce麵'aJ.G，aeco/.,19,449-457，1993)、絲裂霉素C(mitomycinC)(NoguchiA.等人，歷oco"^ga&C7^肌，3,132-137，1992)、阿霉素(多柔比星)(ShihL.B.等人，C羅erL，51，4192-4198,1991;ZhuZ.等人,Cawcer/wmtmo/./mm簡o^er.,40，257-267,1995;TrailP.A.等人,iS"'ewce,261，212-215,1993;ZhuZ.等人,Ccmcer/mmtmo/./wwwwo,力er,40，257-267，1995;KondoY.等人，々".C"wcer,86，1072-1079，1995;ZhuZ.等人,Cawcer/mmwwo/./mmwwc^er,40，257-267,1995;ZhuZ.等人，CVmcer/mmwwo/./mmtmof/^廣,40,257-267,1995)、柔紅霉素(daunorubicin)(DillmanR.O.等人，Oz"cwM,48，6097-6102，1988;HudeczF.等人，CAem.,1，197-204，1990;TukadaY.等人，《/.A^,/.Omcer75,721-729，1984)、博來霉素(bleomycin)(ManabeY.等人，腸c/z亂腸p一.A"Cowmw".,115,1009-1014,1983)、新制癌菌素(neocarzinostatin)(KitamuraK.等人，CVwcer/mmwwo/./mmwwc^/zer.,36，177-184,1993;YamaguchiT.等人，J;"./.Oz"c^i仏，85，167-171，1994)、氨曱蝶p令(methotrexate)(KralovecJ.等人,CVzwcer/mmwwo/./mmtmoAer.,29,293-302,1989;KulkarniP.N.等人，Oz"cwi^s"41,2700-2706，1981;ShinL.B.等人，M/Om匿，41,832-839，1988;GamettM.C.等人，M/Omcer,31，661-670，1983)、5-氟尿苷(5畫fluorouridine)(ShinL.B.C,46,1101-1106，1990)、5畫氟-2'陽脫氧尿苷(deoxyuridine)(GoerlachA.等人，5/oco"乂wg"/eC7^w.,2，96-101，1991)、P可4唐月包苦(cytosinearabinoside)(HurwitzE.等人，/Met/.C7ew.，28,137-140,1985)、氛基蟲萊p令(aminopterin)(KanellosJ.等人,/mmw"o/.Ce〃.S/o/.,65,483-493，1987)、長春新堿(vincristine)(JohnsonJ.R.等人，Sr./C羅"，42,17，1980)、長春地辛(vindesine)(JohnsonJ.R.等人,Ca"cer，44,472-475，1981)、白介素2(IL-2)、肺瘤壞死因子a(TNFa)、干擾素(INF)、羧肽酶(carboxypeptidase)、石咸性石粦酸酶(alkalinephosphatase)、卩-內(nèi)酰胺酶(lactamase)和月包香脫氨酶(cytidinedeaminase)。本發(fā)明可以使用一種細胞毒性物質或兩種或多種細胞毒性物質的組合。上述細胞毒性物質可以通過共價4建或非共價4建與抗HB-EGF抗體結合或偶聯(lián)。制備與這些細胞毒性物質結合的抗體的方法是公知的。細胞毒性物質可以通過例如這些物質本身存在的連接基團直接結合抗HB-EGF抗體，或者可以通過如連接體或中間支持體(intermediarysupport)的另一種物質間接結合抗HB-EGF抗體。在抗HB-EGF抗體與細胞毒性物質直接結合的情況下，連接基團包括基于利用SH基團的二硫鍵。具體來說，抗體的Fc區(qū)域內(nèi)的分子內(nèi)二硫鍵可以用如二硫蘇糖醇的還原劑還原；細胞毒性物質中的二硫4建可以;波類似地還原；且兩個物質可以通過二石危4建彼此連接?？梢酝ㄟ^用如Ellman試劑的活化促進劑初步活化抗體或細胞毒性物質以促進兩個物質之間的二碌u4建的形成。用于實現(xiàn)抗HB-EGF抗體與細胞毒性物質之間直接結合的其它方法的例子如下使用席夫堿(Schiffbase)的方法、碳二亞胺法、活性酯法(N-羥基琥珀酰亞胺法)、使用混合酐的方法和使用重氮反應的方法。也可以通過經(jīng)另一種物質的間接結合實現(xiàn)抗HB-EGF抗體與細19胞毒性物質之間的結合。對于用于間接結合的其它物質沒有特另'J的限制，該其它物質可以包括具有至少兩個選自氨基、羧基、巰基等的基團(包括單一類型或兩個或多個類型的組合)的化合物，也可以包括肽連接體和具有結合抗HB-EGF抗體的能力的化合物。下面是具有至少兩個選自氨基、羧基、巰基等的基團(包括單一類型或兩個或多個類型的組合)的化合物的例子N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP;WawrzynczakE丄等人，OmcwA"，50,7519-7562,1990;ThorpeP.E.等人，Omcw/仏，47,5924-5931，1987)、琥珀酰亞胺6-(3-[2-吡啶二硫基]丙酰胺基)己酸酯(LC-SPDP;HermansonG.T.,S/0CCWJI/O4:TErec/mwM，230-232,1996)、磺基琥珀酰亞胺6-(3-[2-吡咬二硫基]丙酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP;HermansonG.T.,S/0CCW7"04T五rec/m^w^，230—232，1996)、N陽琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯(SPDB;WawrzynczakE丄等人，/Ca"cw,66，361-366,1992)、琥珀酰亞胺氧羰基-a-(2-吡啶二硫基)曱苯(SMPT;ThorpeP.E.等人，Omcer丑仏，47,5924-5931,1987)、琥珀酰亞胺6-(oc-甲基-[2-吡p定二硫基]甲苯酰胺)己酸酯(LC-SMPT;HermansonG.T.，萬/OCCW/"(X47^rec/m^ww,232-235,1996)、磺基琥珀酰亞胺6-(ot-曱基-[2-吡啶二硫基]甲苯酰胺)己酸酯(磺基-LC-SMPT;HermansonG.T.,j5/(9CCW/"04r五rec/m~ww，232-235,1996)、琥珀酰亞胺基-4-(對-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(SMPB;HermansonG.T.，S/OCCWJI/047^rec/mw^,242-243，1996)、磺基-琥珀酰亞胺基-4-(對-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(磺基-SMPB;HermansonG,T.,5/0CCW/"O4r五Tec/mw^，242-243,1996)、間-馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS;HermansonG.T.,S/(XXWJI/04r五rec/m^ww,237-238,1996)、間-馬來酰亞胺苯甲?；鵢N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-MBS;HermansonG.T.,S/OCCW/C/a4r五rec/m^w^,237-238,1996)、S-乙酰基巰基琥珀酸酐(SAMSA;CasellasP.等人，五w.,川oc/^m.,176，581-588，1988)、3,3，-二石克雙丙亞氨酸二甲酯(dimethyl3，3'-dithiobispropionimidate)(DTBP;CasellasP.等人，/腸c/z諷，176，581-588,1988)、2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(2-iminothiolane)(ThorpeP.E.等人，Ca"cerW".,47，5924-5931，1987)等。能夠用來將HB-EGF抗體與細胞毒性物質結合的其它物質的例子是肽、抗體、聚-L-谷氨酸(PGA)、羧曱基葡聚糖、葡聚糖、氨基葡聚糖、抗生物素蛋白-生物素、順烏頭酸、谷氨酸二酰肼、人血清白蛋白(HSA)等。另外，也可以通過基因工程技術將細胞毒性蛋白質結合在抗體上。作為具體的實例，可以將上述編碼細胞毒性肽的DNA與編碼抗HB-EGF抗體的DNA符合讀框地融合，且可以通過并入表達載體內(nèi)構建重組載體。將載體轉染到合適的宿主細胞內(nèi)，并培養(yǎng)產(chǎn)生的轉化細胞，以表達并入的DNA并獲得包含與毒性肽結合的抗HB-EGF抗體的融合蛋白。在制備具有抗體的融合蛋白時，藥物蛋白質或蛋白質毒素一般位于抗體的C-末端側。另外，肽連接體可以介于抗體和藥物蛋白或蛋白質毒素之間。中和活性用于本發(fā)明的抗HB-EGF抗體可以具有中和活性。中和活性一般指抑制顯示對細胞具有生物活性的配體的生物活性的能力，激動劑為這樣的配體的一個例子。因此，具有中和活性的物質指與這樣的配體結合或與結合該配體的受體結合從而抑制該配體或該受體的結合的物質。由于中和活性而^皮阻止與配體結合的受體于是不能表現(xiàn)出通過該受體進行的生物活性。顯示這樣的中和活性的抗體一般稱為中和抗體?？梢酝ㄟ^將在配體和測試物質存在下的生物活性與在存在配體而不存在測試物質的情況下的生物活性進4亍比4交，測定特定測試物質的中和活性。EGF受體被認為是此處所述的HB-EGF的主要受體。在這種情況下，由于配體的結合形成二聚體，因而酪氨酸激酶(它是細胞內(nèi)的自身結構域)被活化?；罨睦野彼峒っ笇е峦ㄟ^自身磷酸化形21成磷酸化的含酪氨酸的肽，各種信號轉導輔助分子與該肽結合。主要有PLCy(磷月旨酶Cy)、Shc、Grb2等。在這些輔助分子中，前兩者另外還被EGF受體的酪氨酸激酶磷酸化。從EGF受體信號轉導的主要路徑是磷酸化沿Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的順序轉導的路徑。此外還認為存在從PLCy到PKC的^各徑，這是第二路徑。這種細胞內(nèi)的信號級聯(lián)在每種細胞類型中是不同的，因而可以為每種需要的靶細胞確定合適的靶分子。對于上述的因素沒有限制?？梢酝ㄟ^測定體內(nèi)信號活化評價中和活性?？梢赃m當?shù)厥褂糜糜跍y定體內(nèi)信號活化的可商購的試劑盒(例如，來自GEHealthcareBiosciences的蛋白激酶C活化測定系統(tǒng))。也可以通過集中于位于體內(nèi)信號級聯(lián)下游的靶基因的轉錄的誘導來檢測體內(nèi)信號活化。使用報道分子測定概念檢測靶基因的轉錄活性的變化。具體地說，報道基因(例如，綠色熒光蛋白(GFP)或螢光素酶)可以位于靶基因的轉錄因子或啟動子區(qū)域的下游，且通過測定報道基因活性可以根據(jù)報道基因活性測定轉錄活性的變化。另外，由于通過EGF受體的信號轉導一般沿促進細胞生長的方向作用，可以通過測定靶細胞的生長活性評價中和活性。具有中和活性和內(nèi)化活性的抗體可以是非常有效的對抗高表達HB-EGF的癌癥的抗癌劑。ADCC活性和/或CDC活性用于本發(fā)明的抗HB-EGF抗體可以具有抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒性(CDC)。在本發(fā)明中，CDC活性指由補體系統(tǒng)引起的細胞破壞活性。另一方面，ADCC活性指如下描述的活性其中，特異性抗體附著于耙細胞上的細胞表面抗原上，F(xiàn)cy受體遞呈細胞(免疫細胞等)通過其Fcy受體與結合抗原的抗體的Fc區(qū)域結合，然后攻擊靶細胞。本發(fā)明中可以使用已知方法確定抗體是否顯示ADCC活性和抗體是否顯示CDC活性(例如，CurrentProtocolsinImmunology.第7章ImmunologicStudiesinHumans.編者JohnE.CoHgan等人，JohnWiley&Sons,Inc.(1993)，等等)。具體地說，首先制備效應細胞、補體溶液和耙細胞。n)效應細胞的制備例如，從CBA/N小鼠中取出脾，并在RPMI1640培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation)中分離脾細胞。然后通過以下步驟來制備效應細胞用含有10%胎牛血清(FBS,HyClone)的相同培養(yǎng)基洗滌，接著調(diào)整細胞濃度為5x106/毫升。(2)補體溶液的制備可以通過用含有10%FBS(InvitrogenCorporation)的培養(yǎng)基10倍稀釋幼兔補體(CedarlaneLaboratoriesLtd.)來制備補體溶液。(3)靶細胞的制備為了放射性標記靶細胞，在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中、37。C下，用0.2mCi510*-鉻酸鈉(GEHealthcareBiosciences)培養(yǎng)表達HB-EGF蛋白的細胞1小時。例如，癌細胞(例如，卵巢癌細胞)或用編碼HB-EGF蛋白的基因轉化的細胞可以用作表達HB-EGF蛋白的細胞。在放射性標記之后，用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細胞3遍，并通過調(diào)節(jié)細胞濃度為2x105/毫升來制備靶細胞?？梢酝ㄟ^以下方法測定ADCC活性和CDC活性。為了測定ADCC活性，向96孑LU形底板(Becton,DickinsonandCompany)中加入50|iL耙細胞和50抗HB-EGF抗體，并在冰上反應15分鐘。然后加入100|LiL效應細胞，并在C02孵箱中培養(yǎng)4小時。采用0或10ng/mL的最終抗體濃度。培養(yǎng)后，回收100nL上清液，并用y計數(shù)器(COBRAIIAUTO隱GAMMA，MODELD5005,PackardInstrumentCompany)測定放射性。使用獲得的數(shù)值，由公式(A-C)/(B-C)x100計算細胞毒性(％),其中，A是特定樣品的放射性(cpm),B是向其中加入1%NP-40(NacalaiTesque，Inc.)的樣品的放射性(cpm),C是只含有靶細胞的樣品的放射性(cpm)。另一方面，當要測定CDC活性時，向96孔平底板(Becton，DickinsonandCompany)中力口入50juL耙細胞和50jiL抗HB-EGF抗體，并在水上反應15分鐘。接著加入100iuL補體溶液，并在C02孵箱中培養(yǎng)4小時。采用0或3pg/mL的最終抗體濃度。培養(yǎng)后，回收100)iL上清液，并用y計數(shù)器測定放射性?？梢酝ㄟ^與測定ADCC活性相同的方式計算細胞毒性。具有內(nèi)化活性和ADCC活性和/或CDC活性的抗體可以是非常有效的對抗高表達HB-EGF的癌癥的抗癌劑。另外，具有中和活性和ADCC活性和/或CDC活性的抗體可以是非常有效的對抗高表達HB-EGF的癌癥的抗癌劑。而且，具有內(nèi)化活性加中和活性加ADCC活性和/或CDC活性的抗體可以是非常有效的對抗高表達HB-EGF的癌癥的抗癌劑?？贵w的產(chǎn)生可以使用已知方法獲得本發(fā)明的單克隆抗HB-EGF抗體。本發(fā)明的抗HB-EGF抗體尤其優(yōu)選哺乳動物來源的單克隆抗體。哺乳動物來源的單克隆抗體尤其包括由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體和由已經(jīng)克隆抗體。通過使用已知技術可以制備產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，例如，以下所述的技術。首先根據(jù)通常的免疫方法，使用HB-EGF蛋白作為致敏抗原免疫動物。通過通常的細胞融合技術將從免疫動物獲得的免疫細胞與已知的伴侶細胞融合以獲得雜交瘤。使用通常的篩選技術，通過篩選產(chǎn)生需要的抗體的細胞，選擇這些雜交瘤中的產(chǎn)生抗HB-EGF抗體的雜交瘤。具體地說，例如可以如下進行單克隆抗體的產(chǎn)生。首先，通過HB-EGF基因的表達可以獲得用作獲得抗體的致敏抗原的HB-EGF蛋白。例如，公開了作為GenBank登記號NM—001945(SEQIDNO:49)的人HB-EGF基因的堿基序列。因此，將編碼HB-EGF的基因24序列插入已知的表達載體中，然后用表達載體轉化合適的宿主細胞；隨后從宿主細胞內(nèi)或從培養(yǎng)上清液中純化需要的人HB-EGF蛋白。也可以以同樣的方式^f吏用純化的天然HB-EGF蛋白?？梢?使用一種通常的色譜技術或其組合純化蛋白質，例如，離子色譜、親和色譜等，采用一個運行或多個運行。用于本發(fā)明的免疫原也可以是通過將一種來自HB-EGF蛋白的需要的部分多肽與一種不同的多肽融合獲得的融合蛋白。例如，來自抗體的肽標簽或Fc片段可以用來產(chǎn)生將要用作免疫原的融合蛋白。可以通過將編碼需要的兩種或多種多肽片段的基因符合讀框地融合并將融合基因插入上述表達載體中來制備表達融合蛋白的載體。在MolecularCloning第2版(Sambrook,J.等人，MolecularCloning第2版，9.47-9.58,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中描述了產(chǎn)生融合蛋白的方法。以所述方式純化的HB-EGF蛋白可以用作用來免疫哺乳動物的致敏性抗原。來自HB-EGF的部分肽也可以用作致敏性抗原。例如，下面的肽可以用作致敏性抗原通過化學合成由人HB-EGF的氨基酸序列獲得的肽；通過將人HB-EGF基因的一部分并入表達載體內(nèi)并表達該部分而獲得的肽；和通過用蛋白質降解酶降解人HB-EGF蛋白獲得的肽。對于用作部分肽的HB-EGF區(qū)域或部分肽的大小沒有限制。優(yōu)選的區(qū)域可以選自構成HB-EGF的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO:50的氨基酸序列中的位點22-149)。構成將要用作致敏性抗原的肽的氨基酸的數(shù)目優(yōu)選為至少3個，例如至少5個或至少6個。更具體地說，8-50個殘基、優(yōu)選10-30個殘基的肽可以用作致敏性抗原。對于可以用上述的致敏性抗原免疫的哺乳動物沒有特別的限制。為了通過細胞融合技術獲得單克隆抗體，優(yōu)選地考慮與將要在細胞融合中使用的伴倡細胞的相容性選擇免疫動物。一般優(yōu)選嚙齒類作為免疫動物。特別地，小鼠、大鼠、倉鼠或兔可以用作免疫動物。猴也可以用作免疫動物?？梢?4居已知方法用致^:性抗原免疫上述動物。例如，作為一般的方法，可以通過皮下或腹膜內(nèi)注射致敏性抗原免疫哺乳動物。具體地說，可以以4-21天的時間表多次向哺乳動物施用致敏性抗原。例如，用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水將致敏性抗原稀釋至適當?shù)南♂尡稊?shù)。也可以與佐劑組合施用致敏性抗原。例如，可以通過與弗氏完全佐劑混合并乳化來制備致敏性抗原。合適的載體也可以用于致敏性抗原免疫。尤其是在使用低分子量的部分肽作為致敏性抗原的情況中，理想地用與諸如白蛋白、匙孔蜮血藍蛋白等蛋白質載體結合的致敏性肽抗原實現(xiàn)免疫。以所述的方式免疫動物并觀察到預期的血清抗體效價升高之后，從哺乳動物收集免疫細胞，并進行細胞融合。脾細胞是尤其優(yōu)選的免疫細胞。使用哺乳動物骨髓瘤細胞作為與上述免疫細胞融合的細胞。骨髓瘤細胞優(yōu)選地具有合適的選擇標記以支持篩選。選擇標記指在特定培養(yǎng)條件下可以出現(xiàn)(或不出現(xiàn))的性狀。已知的選擇標記包括次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉移酶缺陷(下文縮寫為HGPRT缺陷)和胸苷激酶缺陷(下文縮寫為KT缺陷)。HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞顯示次黃嘌呤-氨噪呤-胸腺嘧啶敏感性(下文縮寫為HAT敏感性)。HAT敏感的細胞不能在HAT選擇培養(yǎng)基上進行DNA合成并死亡；但是，當與正常細胞融合時，DNA合成能夠使用正常細胞的補救途徑而繼續(xù)，也能在HAT選擇培養(yǎng)基上發(fā)生生長?？梢栽诤?-硫代鳥。票呤或8-氮鳥。票呤(8AG)的培養(yǎng)基上選擇HGPRT缺陷的細胞，而可以在含有5'-溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基上選才奪TK缺陷的細胞。正常細胞將這些嘧咬類似物摻入其DNA內(nèi)并死亡，而這些酶缺陷的細胞不會摻入這些嘧啶類似物于是能夠在選擇培養(yǎng)基上存活下來。稱為G418抗性的另一種選擇標記基于新霉素抗性基因提供對2-脫氧鏈霉胺型抗生素(慶大霉素類似物)的抗性。適于細胞融合的各種骨髓瘤細胞是已知的。例如，可以使用以下骨髓瘤細胞P3(P3x63Ag8.653)(//www"o/.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Cwrrewf7bp^s1MZcro^Wogyawc//wmwwo/ogy(1978)81,1-7)、NS-1(Kohler，G.和Milstein,C.五w廣《//mww"o/.(1976)6，511-519)、MPC畫ll(Margulies，D.H.等人，Ce〃(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman,M.等人，A^w"(1978)276，269-270)、FO(deSt.Groth，S.F.等人，//mww"o/.M"/zoA(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge,I.S,/(1978)148，313-323)和R210(Galfre，G.等人，A^w(1979)277,131-133)。可以根據(jù)已知方法，例如，根據(jù)Kohler和Milstein的方法(Kohler，G.和Milstein,C.,M^o&五wz少廳/.(1981)73,3-46)，進行上述免疫細胞與骨髓瘤細胞之間的細胞融合。更具體地，例如可以在細胞融合促進劑的存在下，在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液體中進行細胞融合。例如，聚乙二醇(PEG)或仙臺病毒(HVJ)可以用作融合促進劑。需要的話，為了提高融合效率，可以加入如二曱亞石風的輔劑?？梢宰杂蛇x擇免疫細胞與骨髓瘤細胞的比例。例如，優(yōu)選地相對于骨髓瘤細胞以1X-10X使用免疫細胞。例如，用于細胞融合的培養(yǎng)液可以是RPMI1640培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基，它們非常適于上述骨髓瘤細胞抹的生長，或是用于這種類型的細胞培養(yǎng)的常用的培養(yǎng)基。也可以向培養(yǎng)基中加入如胎牛血清(FCS)的血清補充物。通過在上述培養(yǎng)液中充分混合規(guī)定量的免疫細胞和骨髓瘤細胞并混合已預加熱至大約37。C的PEG溶液，通過細胞融合形成需要的融合細胞(雜交瘤)。例如，可以以一般為30-60%(w/v)的濃度將具有1000-6000的平均分子量的PEG加入到細胞融合過程中。然后，通過重復加入上述的合適的培養(yǎng)液、離心及除去上清液的過程除去雜交瘤生長不需要的細胞融合劑等?？赏ㄟ^使用適合用于細胞融合的骨髓瘤所顯示的選擇標記的選擇性培養(yǎng)基來選擇以所述方式獲得的雜交瘤。例如，可通過在HAT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨嘌呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基)上的培養(yǎng)選擇HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞。因此，當HAT敏感的骨髓瘤細胞用于細胞融合時，由與正常細胞的細胞融合產(chǎn)生的細胞能夠在HAT培養(yǎng)基上選擇性地生長。在HAT培養(yǎng)基上的培養(yǎng)持續(xù)足以使除了需要的雜交瘤之外的細胞(未融合的細胞)死亡的一段時間。具體地說，一般可通過幾天至幾周的培養(yǎng)來選擇需要的雜交瘤。通常的有限稀釋方法可以用來篩選并單克隆產(chǎn)生需要的抗體的雜交瘤。或者，也可以通過WO03/104453中所述的方法產(chǎn)生識別HB-EGF的抗體?？梢酝ㄟ^基于已知的抗原-抗體反應的篩選程序適當?shù)剡M行需要的抗體的篩選和單克隆。例如，抗原可以與載體(例如，如聚苯乙烯的珠或可商購的96孔微量滴定板)結合，然后與雜交瘤培養(yǎng)上清液反應。接著，在洗滌載體后，細胞與(例如)酶標記的第二抗體反應。如果培養(yǎng)上清液中存在需要的致敏性抗原反應性抗體，那么第二抗體將通過抗體結合到載體上。最終可通過檢測結合到載體上的第二抗體確定培養(yǎng)上清液中需要的抗體的存在/不存在。例如，通過有限稀釋法可以克隆產(chǎn)生需要的抗原結合性抗體的雜交瘤。在本文中，適當?shù)厥褂没旧舷嗤腍B-EGF蛋白作為抗原，包括那些用于免疫的HB-EGF蛋白。例如，包含HB-EGF的胞外域或包含來自該區(qū)域的部分氨基酸序列的寡肽可以用作抗原。以通過人類淋巴細胞的抗原致敏獲得需要的抗體。具體地說，首先在體內(nèi)用HB-EGF蛋白致敏人類淋巴細胞。然后將免疫致敏的淋巴細胞與合適的融合伴倡融合。例如，具有永久細胞分裂能力的人源骨髓瘤細胞可以用作融合伴估(參考日本專利公開第H1-59878號)。通過該方法獲得的抗HB-EGF抗體是具有結合HB-EGF蛋白的活性的人抗體。也可以通過向具有完整的人抗體基因所有組成成分(repertoire)的轉基因動物施用作為抗原的HB-EGF蛋白獲得人抗HB-EGF抗體?？梢酝ㄟ^與合適的融合伴倡進行細胞融合或者通過如用EB病毒感生的無限增殖化細胞中分離針對HB-EGF蛋白的人抗體(參考國際公開WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918和WO94/02602)。而且，也可以通過克隆無限增殖化細胞克隆產(chǎn)生具有希望的反應特異性的抗體的細胞。當采用轉基因動物作為免疫動物時，動物的免疫系統(tǒng)將人HB-EGF識別為外源性的。這使得能夠容易地獲得針對人HB-EGF的人抗體。以所述方式構建的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。雜交瘤也可以在液氮中長期保存?？梢愿鶕?jù)通常的方法培養(yǎng)上述雜交瘤，且可以從產(chǎn)生的培養(yǎng)上清液中獲得需要的單克隆抗體。或者，可以將雜交瘤注射到與該細胞相容的哺乳動物中，且可以從哺乳動物的腹水中獲得單克隆抗體。前述方法很好地適于產(chǎn)生高純度的抗體。本發(fā)明也可以使用由從抗體生產(chǎn)細胞克隆的抗體基因編碼的抗體?？梢酝ㄟ^將克隆的抗體基因摻入合適的載體中接著通過轉染宿主來實現(xiàn)抗體的表達。已經(jīng)建立了分離抗體基因并將其插入載體內(nèi)和轉化宿主細胞的方法(參考，例如，Vandamme，A.M.等人，J.(1990)192,767-775)。例如，可以從產(chǎn)生抗HB-EGF抗體的雜交瘤細胞獲得編碼抗HB-EGF抗體的可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。一般首先從雜交瘤中提取總RNA?？梢杂脕韽募毎刑崛RNA的方法是，例如，胍超離心法(Chirgwin，J.M.等人，腸cA畫勿(1979)18，5294-5299)和AGPC法(Chomczynski，P.等人，Aoc/^m.(1987)162,156-159)?？梢?使用例如mRNA純化試劑盒(GEHealthcareBiosciences)純化提取的mRNA?；蛘?，用于從細胞中直接提取mRNA的試劑盒也是可商購的，如QuickPrepmRNA純化試劑盒(GEHealthcareBiosciences)。如這些的試劑盒也可以用來從雜交瘤中獲得總mRNA?？梢允褂媚孓D錄酶由獲得的mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA。例如，可以使用AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(SeikagakuCorporation)合成cDNA。另外，5'-AmpliFINDERRACE試劑盒(Clontech)和基于PCR的5'畫RACE法(Frohman,M.A.等人，iVoc.iVW/.^c^/.t/W(1988)85,8998-9002;Belyavsky，A.，等人，iVwc/dc^"'心(1989)17，2919-2932)也可以用來合成和擴增cDNA。而且，在這樣的cDNA合成方法中可以將以下合適的限制性酶切位點引入cDNA的兩端。從獲得的PCR產(chǎn)物中純化靶cDNA片段，然后與載體DNA連接；將以這種方式制備的重組載體轉染到(例如)大腸桿菌內(nèi)，并選擇菌落；可以由顯示菌落形成的大腸桿菌制備需要的重組載體。另外，如二脫氧核苷酸鏈終止法的已知方法可以用來確認重組載體是否具有靶cDNA的堿基序列。為了獲得編碼可變區(qū)的基因，也可以采用使用可變區(qū)基因擴增引物的PCR。首先，為了獲得cDNA文庫，使用提取的mRNA作為模板合成cDNA?？梢苑奖愕厥褂每缮藤彽脑噭┖衼砗铣蒫DNA文庫。實際上，從只是少量的細胞獲得的mRNA的量非常少，因而直接純化具有低收率。因此，一般在加入明顯不包含抗體基因的載體RNA之后進行純化?；蛘?，在那些可以提取一定量的RNA的情況下，甚至可以只用來自抗體生產(chǎn)細胞的RNA實現(xiàn)有效的提取。例如，在某些情況下，不是必須向從至少10個或至少30個、優(yōu)選至少50個抗體生產(chǎn)細胞的RNA提取中加入載體RNA。使用獲得的cDNA文庫作為模板，通過PCR可以擴增抗體基因。用于基于PCR擴增抗體基因的引物是已知的。例如，可以根據(jù)文獻中的信息(例如，乂Mo/.所o/.(1991)222,581-597)設計用于擴增人抗體基因的引物。這些引物具有隨免疫球蛋白亞類變化的堿基序列。因此，當采用未知亞類的cDNA文庫作為模板時，考慮所有的可能性進行PCR。具體地說，例如，當目標是獲得編碼人IgG的基因時，可以使用具有擴增編碼重鏈的yl-y5和輕鏈的K鏈和X鏈的基因的能力的引物。為了擴增IgG可變區(qū)基因，對于3'-側引物，通常使用與對應于鉸鏈區(qū)的區(qū)域退火的引物。另一方面，對于5'-側引物，可以使用適于每個亞類的引物?；谟糜诿糠N重鏈和輕鏈亞類的基因擴增引物制備PCR產(chǎn)物，作為各自獨立的文庫。使用這樣合成的文庫，可以重建包含重鏈加輕鏈組合的免疫球蛋白?？梢允褂弥亟ǖ拿庖咔虻鞍讓B-EGF的結合活性作為指標，篩選需要的抗體。本發(fā)明的抗體與HB-EGF的結合更優(yōu)選地是特異性結合。例如，通過以下步驟可以進行對于結合HB-EGF的抗體的篩選(1)將HB-EGF與包含由從雜交瘤獲得的cDNA編碼的V區(qū)的抗體纟妾觸；(2)檢測HB-EGF與該抗體的結合；和(3)選擇結合HB-EGF的抗體。檢測抗體與HB-EGF結合的方法是已知的。具體地說，測試抗體可與固定在載體上的HB-EGF反應，然后與識別該抗體的標記抗體反應。在洗滌后，可以檢測載體上的標記抗體，作為測試抗體與HB-EGF結合的指示。如FITC的熒光物質或如過氧化物酶的酶蛋白質或(3-半乳糖苷可以用作標記。固定形式的表達HB-EGF的細胞也可以用來評價抗體的結合活性。也可以采用使用噬菌體載體的淘選(Panning)作為使用結合活性作為指示的抗體篩選方法。當如上所述獲得抗體基因作為重鏈亞類和輕鏈亞類文庫時，使用噬菌體載體的篩選是有利的。通過與適當?shù)倪B接體序列連接可以將編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因制成單鏈Fv(scFv)?？梢詫⒕幋ascFv的基因插入噬菌體載體內(nèi)，以獲得在其表面上表達scFv的噬菌體。將噬菌體與靶抗原接觸，回收結合抗原的噬菌體能夠回收編碼具有需要的結合活性的scFv的DNA。需要時，可通過重復這一過程富集具有需要的結合活性的scFv。在本發(fā)明中，編碼抗體的多核苷酸可以編碼抗體的全長或可以編碼抗體的一部分。所述的抗體的部分可以是抗體分子的任一部分。抗體片段是以下在某些情況中用于表示抗體的一部分的術語。本發(fā)明中優(yōu)選的抗體片段包含互補決定區(qū)(CDR)。本發(fā)明中更優(yōu)選的抗體片段包含構成可變區(qū)的全部3個CDR。一旦獲得編碼目標抗HB-EGF抗體的V區(qū)的cDNA,則通過識別已^L插入cDNA的兩個末端的限制性酶切位點的限制性內(nèi)切酶消化cDNA。優(yōu)選的限制性內(nèi)切酶識別并消化在構成抗體基因的堿基序列中出現(xiàn)可能性較低的堿基序列。為了在載體中以正確的方向插入1個拷貝的消化片段，優(yōu)選產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶。可以通過將如前所述消化的編碼抗HB-EGF抗體V區(qū)的cDNA插入合適的表達載體內(nèi)，獲得抗體表達載體。在這點上，通過將編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的基因與前述的編碼V區(qū)的基因符合讀框地融合，可獲得嵌合抗體。本文中，嵌合抗體指恒定區(qū)和可變區(qū)具有不同的來源的產(chǎn)物。因此，在本發(fā)明的范圍中，"嵌合抗體，，除了如小鼠-人的異(allochimericantibodies)。也可以通過將前述V區(qū)基因插入已攜帶恒定區(qū)的表達載體內(nèi)構建嵌合抗體表達載體。具體地說，例如，用于消化前述V區(qū)基因的限制性內(nèi)切酶的限制性內(nèi)切酶識別序列可以預先設置于攜帶編碼需要的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達載體的5'側。將二者用同樣的限制性內(nèi)切酶組合消化并符合讀框地融合，導致嵌合抗體表達載體的構建。為了產(chǎn)生本發(fā)明的抗HB-EGF抗體，可以以一定的方式將抗體基因摻入表達載體內(nèi)，使得表達在表達控制區(qū)的控制之下發(fā)生?？贵w表達的表達控制區(qū)包括，例如，增強子和啟動子。然后可以通過用所述表達載體轉化合適的宿主細胞獲得表達編碼抗HB-EGF抗體的DNA的重組細胞。為了表達抗體基因，可以將編碼抗體重鏈(H鏈)的DNA和編碼抗體輕鏈(L鏈)的DNA摻入單獨的表達載體中。通過用摻有H鏈的載體和摻有L鏈的載體同時轉化(共轉染)同一宿主細胞，可以表達具有H鏈和L鏈的抗體分子?；蛘?，可以將編碼H鏈和L鏈的DNA摻入一個表達載體中，然后可轉化宿主細胞(國際公開W094/11523)。對于通過分離抗體基因并轉染合適的宿主來產(chǎn)生抗體，已知許多宿主/表達載體組合。這些表達系統(tǒng)中的任一種可以應用于本發(fā)明中。當真核細胞用作宿主時，可以使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞?？捎糜诒景l(fā)明的動物細胞的具體例子是哺乳動物細胞(例如，CHO、COS、骨髓瘤、幼倉鼠腎(BHK)、Hela、Vero等)、兩棲動物細月包(例如，非洲爪蟾(Jre"o/w/"ev&)卵母細胞等)和昆蟲細胞(例如，sf9、sf21、Tn5等)。對于植物細胞，已知基于來自煙草屬如煙草(Mco"""a/"Zacww)等的細胞的抗體基因表達系統(tǒng)。愈傷組織培養(yǎng)的細胞可以用于植物細胞轉化。以下這些例如可以作為真菌細胞使用酵母(例如，酵母屬(5"acc/^rom少c^)^口酉良酒酵母(iSacc/mromycescewWWae)，畢赤酵母屬(尸,c/n.")如巴斯德畢赤酵母(尸,a戶倉&)等)和絲狀真菌(i"列^口,曲霉屬(y^/ergz7/ws)^口,、曲霉(y^/erg〃/w51))。使用原核細胞的抗體基因表達系統(tǒng)也是已知的。以細菌為例，如大腸桿菌、枯草桿菌等細菌可以用于本發(fā)明。當使用哺乳動物細胞時，可以通過功能性地連接一種有效的、常用的啟動子、待表達的抗體基因和位于該抗體基因3'-末端下游的polyA信號來構建表達載體。啟動子/增強子的一個例子是人巨細胞病毒直接早期啟動子/增強子。可以用來表達本發(fā)明的抗體的其它啟動子/增強子有，例如，病毒啟動子/增強子和來源于哺乳動物細胞的啟動子/增強子，如人延伸因子la(HEFloc)。能夠提供可用的啟動子/增強子的具體例子有逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)?？梢愿鶕?jù)Mulligan等人(iV^w"(1979)277,108)的方法使用SV40啟動子/增強子。另夕卜，可以根據(jù)Mizushima等人(7Vwc/eZc^cZAi仏(1990)18,5322)的方法容易地利用HEFla啟動子/增強子進行希望的基因表達。對于大腸桿菌，可以通過功能性地連接一種有效的、常用的啟動子、用于抗體分泌的信號序列和待表達的抗體基因來實現(xiàn)所研究的基因的表達。例如，啟動子可以是lacZ啟動子或araB啟動子。可以根據(jù)Ward等人(A^wre(1989)341,544-546;FAS五^/.(1992)6,2422-2427)的方法使用lacZ啟動子?；蛘?，可以根據(jù)Better等人(5W匿e(1988)240,1041-1043)的方法使用araB啟動子進行希望的基因表達。關于用于抗體分泌的信號序列，pe舊信號序列(Lei,S.P.等人，/.5acten'o/.(1987)169,4379)可以在大腸桿菌周質中生產(chǎn)的情況中使用。在已分離出周質中產(chǎn)生的抗體之后，可以通過使用如鹽酸胍和尿素的蛋白質變性劑來改造(重折疊)抗體結構，使其顯示需要的結合活性。例如，插入表達載體內(nèi)的復制起點可以是來源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復制起點。另外，為了擴增宿主細胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)，可以將選擇標記插入表達載體中。具體地說，可用的選擇標記有氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃噪呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等?？梢酝ㄟ^將所研究的表達載體轉染到宿主細胞內(nèi)并在體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉化的宿主細胞來產(chǎn)生靶抗體?？梢愿鶕?jù)已知方法進行宿主細胞培養(yǎng)。例如，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM作為培養(yǎng)基；也可以加入如胎牛血清(FCS)的血清補充物?？梢酝ㄟ^已知用于蛋白質純化的常用方法來純化如上述表達和產(chǎn)生的抗體；可以使用一種這樣的方法或使用這些方法的適當?shù)慕M合?？梢允褂靡韵路椒ǖ暮线m的選擇和組合來分離和純化抗體例如，親和柱(例如，蛋白A柱)、柱色語、過濾、超濾、鹽析、透析等(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlow,DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。除了前迷的宿主細胞以外，轉基因動物也可以用來產(chǎn)生重組抗體。即，可以從已向其中引入編碼靶抗體的基因的動物獲得所研究的抗體。例如，可以通過在編碼乳汁中天然產(chǎn)生的蛋白質的基因中符合讀框地插入抗體基因來制備融合的基因。例如，山羊[3-酪蛋白可用作分泌到乳汁中的蛋白質?？梢詫瑩饺肟贵w基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎內(nèi)，并且可以將注射過的胚胎引入雌山羊中。可以作為與乳汁蛋白質的融合蛋白獲得需要的抗體，所述乳汁蛋白質來自由植入胚胎的山羊生出的轉基因山羊(或其后代)所產(chǎn)生的乳汁。另外，為了增加轉基因山羊產(chǎn)生的包含所需抗體的乳汁的量，可以對轉基因山羊適當?shù)厥褂眉に?Ebert,K.M.等人，Bio/Technology(1994)12,699-702)。來源于動物抗體的C區(qū)可以用作本發(fā)明的重組抗體的C區(qū)?？梢允褂妹麨镃yl、Cy2a、Cy2b、Cy3、Cp、C5、Cocl、Ca2和Cs的小鼠抗體H鏈C區(qū)，還可以使用命名為Ck和C入的L鏈C區(qū)。除了小鼠抗體，來自例如大鼠、兔、山羊、綿羊、駱駝、猴子等的動物抗體也可以用作動物抗體。這些序列是已知的。為了改進抗體或提高其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，可以修飾C區(qū)。當抗體將要向人施用時，在本發(fā)明中可以制備人工改造的基因重組抗體，目的是例如降低在人體中的外來抗原性。這樣的基因重組抗體包括，例如，嵌合抗體和人源化抗體?？梢允褂靡阎椒óa(chǎn)生這些工程抗體。嵌合抗體指這樣的抗體，其中，可變區(qū)與具有與可變區(qū)不同來源的恒定區(qū)連接。例如，一種具有來自小鼠抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)和來自人抗體的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的抗體是小鼠-人-異種嵌合抗體。可以通過將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接并將其摻入表達載體中來構建表達嵌合抗體的重組載體。然后培養(yǎng)被載體轉化的重組細胞，以使摻入的DNA表達，然后可以回收培養(yǎng)基中的產(chǎn)生的嵌合抗體。人抗體的C區(qū)用于嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)。對于H鏈，例如，Cyl、Cy2、Cy3、Cy4、C)a、C5、Cal、Ca2和Cs可以用于C區(qū)。對于L鏈，Ck和CX可以用于C區(qū)。這些C區(qū)的氨基酸序列是已知的，編碼這些氨基酸序列的堿基序列也是已知的。另外，為了改善抗體本身或提高抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定性，可以修飾人抗體的C區(qū)。嵌合抗體通常由非人類動物來源的抗體的V區(qū)和人源抗體的C區(qū)構建。相反地，人源化抗體由非人類動物來源的抗體的互補決定區(qū)(CDR)、動物來源的抗體的框架區(qū)(FR)和人源抗體的C區(qū)構成。為了降低在人體中的抗原性，人源化抗體可用作本發(fā)明的治療劑中的活性成分?？贵w的可變區(qū)典型地由夾在4個FR之間的3個CDR構成。CDR是實質上確定抗體的結合特異性的區(qū)域。CDR的氨基酸序列具有豐富的多樣性。另一方面，構成FR的氨基酸序列經(jīng)常顯示高度的同源性，甚至在具有不同的結合特異性的抗體之間。由于此原因，某種抗體的結合特異性能夠典型地通過CDR移植而轉移給另一種抗體。人源化抗體也^皮稱為重構人抗體。具體地i兌，例如，已知其中來自如小鼠抗體的非人類動物抗體的CDR已被移植到人抗體中的人源化抗體。也已知一般的用于獲得人源化抗體的基因重組技術。具體地說，例如，已知重疊延伸PCR是一種將小鼠抗體CDR移植到人FR內(nèi)的方法。在重疊延伸PCR中，將編碼待移植的小鼠抗體CDR的堿基序列添加到用于合成人抗體FR的引物中。為4種FR中的每一種制備引物。選擇顯示與小鼠FR高度同源性的人FR一般有利于在向人FR上移植小鼠CDR中保持CDR功能。因此，一般優(yōu)選使用這樣的人FR，其氨基酸序列顯示與鄰近待移植的小鼠CDR的FR的氨基酸序列具有高度同源性。另外，設計將要連接的堿基序列，使其能夠彼此符合讀框地連接。分別使用各自的引物合成人FR。以這種方式，獲得其中編碼小鼠CDR的DNA附著在每個FR上的產(chǎn)物。設計編碼每種產(chǎn)物中小鼠CDR的堿基序列，使其彼此重疊。然后，使用人抗體基因作為模板合成的產(chǎn)物的重疊CDR區(qū)彼此退火，并進行互補鏈合成反應。該反應導致人FR經(jīng)小鼠CDR序列連接。最后，將包含與3個CDR連接的4個FR的可變區(qū)基因通過使已添加合適的限制性酶識別序列的引物在其5'末端和3'末端退火，進行全長擴增。通過將如上所述獲得的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA插入表達載體中，-使它們符合讀框地融合，以此構建人型抗體的表達載體。將這樣制成的載體插入到宿主中并建立重組細胞；培養(yǎng)該重組細胞以表達編碼人源化抗體的DNA;由此在培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中產(chǎn)生人源化抗體(參考歐洲專利公開EP239,400和國際公開WO96/02576)?？梢酝ㄟ^定性和定量地測定和評價如前所述構建的人源化抗體對抗原的結合活性來適當?shù)剡x擇當跨過CDR連接時能夠使CDR形成高質量的抗原結合位點的人抗體FR。必要時也可以在FR上進行氨基酸置換，以使重構人抗體的CDR能夠形成良好適應的抗原結合位點。例如，可以使用用于將小鼠CDR移植到人FR上的PCR方法，將氨基酸序列中的突變引入FR中。具體地說，可以將部分堿基序列突變引入到將與FR退火的引物中。然后將堿基序列突變引入到使用這些引物合成的FR中。通過用上述方法測定和評價突變的、氨基酸取代的抗體的抗原結合活性，可以選擇具有需要的性質的突變FR序列(Sato，K.等人，Omc^i^.,1993,53,851-856)。也已知獲得人抗體的方法。例如，可以在體外用需要的抗原或表達需要的抗原的細胞致敏人淋巴細胞。然后可以通過將致敏的淋巴細胞與人骨髓瘤細胞融合獲得需要的能夠結合抗原的人抗體(參考日本專利公開第H1-59878號)。例如，U266可以用于用作融合伴倡的人骨髓瘤細胞。也可以通過用需要的抗原免疫具有完整人抗體基因全部組成成分(repertoire)的轉基因動物獲得需要的人抗體(參考國際公開WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096和WO96/33735)。也已知使用人抗體文庫通過淘選獲得人抗體的技術。例如，通過噬菌體展示方法可以在噬菌體表面上表達作為單鏈抗體(scFv)的人抗體V區(qū)，并可以選擇結合抗原的噬菌體。然后可以通過分析選擇的噬菌體的基因確定編碼結合抗原的人抗體的V區(qū)的DNA序列。一旦確定了結合抗原的scFv的DNA序列，就可以將V區(qū)序列與需要的人抗體C區(qū)的序列符合讀框地融合，這之后通過將其插入合適的表達載體中構建表達載體?？梢詫⒈磉_載體轉染到如上所述的合適的表達細胞中，并可以通過編碼人抗體的基因的表達獲得人抗體。這些方法是已知的(國際公開92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438和WO95/15388)。在與HB-EGF蛋白發(fā)生結合的范圍內(nèi)，本發(fā)明的抗體不僅包括由IgG代表的二價抗體，還包括由IgM代表的多價抗體和單價抗體。本發(fā)明的多價抗體包括其中所有抗原結合位點相同的多價抗體，和其中某些或所有抗原結合位點不同的多價抗體。本發(fā)明的抗體不限于全長抗體分子，也包括低分子量抗體及其修飾，只要它們能夠結合HB-EGF蛋白。低分子量抗體包括通過刪除完整抗體(例如，完整的IgG)的一部分產(chǎn)生的抗體片段。抗體分子的部分刪除是允許的，只要存在結合HB-EGF抗原的能力。用于本發(fā)明的抗體片段優(yōu)選地包含重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)或這兩者。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、添加和/或插入。而且，只要仍然存在結合HB-EGF抗原的能力，也可以刪除VH或VL的一部分或這兩者的一部分。也可以將可變區(qū)嵌合或人源化。抗體片段的具體例子是Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。低分子量抗體的具體例子是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(單鏈Fv)、雙抗體和sc(Fv)2(單鏈(Fv)2)。本發(fā)明的低分子量抗體也包括這些抗體的多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體、多聚體)。也可以通過酶處理抗體產(chǎn)生抗體片段來獲得抗體片段。例如，已知木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纖維蛋白溶酶等為產(chǎn)生抗體片段的酶?；蛘?，可以構建編碼這樣的抗體片段的基因，并將其插入表達載體中，接著由合適的宿主細胞表達(參考，例如，Co,M.S.等人，/羅訓/.(1994)152,2968-2976;Better,M.&Horwitz，A.H.M"/^細，o/ogy(1989)178，476-496;Plueckth叫A.&Skerra,A.MeAc^^fiVzzymo/ogj(1989)178，476-496;Lamoyi，E.她AoA&￡Vzz_ywo/ogy(1989)121,652-663;Rousseaux,J.等人,M"/oA五wz少mo/og;;(1989)121,663-669;和Bird,R.E.等人，T7S7^C/f(1991)9,132-137)。消化酶切割特定的抗體片段位點以產(chǎn)生具有如下所述的特定結構的抗體片段。當對這些酶促產(chǎn)生的抗體片段應用基因工程技術時，可以刪除抗體的任意部分。木瓜蛋白酶消化F(ab)2或Fab胃蛋白酶消化F(ab')2或Fab'纖維蛋白溶酶消化Facb雙抗體表示通過基因融合構建的二價抗體片段(Holliger，P.等人A^/.^cadOSJ90,6444-6448(1993)、EP404,097、WO93/11161等)。雙抗體是由兩個多肽鏈構成的二聚體。一般地，構成雙抗體的每個多肽鏈是通過連接體連接為一個相同鏈的VL和VH。用于雙抗體的連接體一般足夠短而使得VL和VH不能彼此結合。具體地說，例如，大約5個氨基酸殘基組成連接體。由于此原因，在同一多肽鏈上編碼的VL和VH不能形成單鏈可變區(qū)片段，與單獨的單鏈可變區(qū)片段形成二聚體。因此，雙抗體具有兩個抗原結合位點。通過將抗體的H鏈V區(qū)與L鏈V區(qū)連接獲得scFv。scFv中的H鏈V區(qū)與L鏈V區(qū)通過連接體且優(yōu)選地通過肽連接體彼此連接(Huston，J.S.等人,Proc.脂/.爿cW.園85,5879-5883(1988))。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以來源于本文所述的任何抗體。對于連接V區(qū)的肽連接體沒有特別的限制。例如，可以使用任何具有大約3-25個殘基的單肽鏈作為連接體。例如，可以使用前述的PCR技術連接V區(qū)。為了通過PCR連接V區(qū)，首先使用編碼來自編碼抗體H鏈或H鏈V區(qū)的DNA序列的氨基酸序列的全部或所需部分的DNA和編碼來自編碼抗體L鏈或L鏈V區(qū)的DNA序列的氨基酸序列的全部或所需部分的DNA作為模板。使用具有對應于待擴增DNA的兩個末端處的序列的引物對，通過PCR分別擴增編碼H鏈V區(qū)的DNA和編碼L鏈V區(qū)的DNA。然后制備編碼肽連接體區(qū)域的DNA。也可以〗吏用PCR合成編碼肽連接體的DNA。在所用的引物的5'側之前，加入能夠與分別合成的每種V區(qū)擴增產(chǎn)物連接的堿基序列。然后使用裝配PCR引物和用于[H鏈V區(qū)DNA]-[肽連接體DNA]-[L鏈V區(qū)DNA]的每種DNA進行PCR反應。裝配PCR引物是與[H鏈V區(qū)DNA]的5'側退火的引物和與[L鏈V區(qū)DNA]的3'側退火的引物的組合。即，裝配PCR引物形成能擴增編碼待合成的scFv的全長序列的DNA的引物集。另一方面，向[肽連接體DNA]上添加可與每個V區(qū)DNA連接的堿基序列。結果，這些DNA連接在一起，而且，最終通過裝配PCR引物產(chǎn)生全長scFv作為擴增產(chǎn)物。一旦已產(chǎn)生編碼scFv的DNA,就可以通過通常的方法獲得含有該DNA的表達載體以及由該表達載體轉化的重組細胞。另外，可以培養(yǎng)這樣獲得的重組細胞，并可以通過編碼scFv的DNA的表達獲得scFv。sc(Fv)2是低分子量抗體，其中，兩個VH和兩個VL通過(例^口)連4妾體連4妄成單鏈(Hudson等人，《/./mwwwo/.T^e^otfc,231，177-189(1999))。例如，可以通過用連接體連接scFv制備sc(Fv)2。優(yōu)選特征性地具有在序列中排列的兩個VH和兩個VL的抗體，從單鏈多肽的N-末端側起，為VH、VL、VH、VL([VH]連接體-[VL]連接體-[VH]連接體-[VL])。兩個VH和兩個VL的序列不特別限于上述的排列，它們可以排列成任一序列?？梢蕴峁┫旅娴男蛄凶鳛槔印＿B接體-[VH]連接體-[VH]連接體-[VL]連接體-[VL]連接體-[VL]連接體-[VH]連接體-[VH]連接體-[VL]連接體-[VL]連接體-[VL]連接體-[VH]連接體-[VH]連接體-[VH]連接體-[VL]連接體-[VH]連接抗體的可變區(qū)的連接體可以是，例如，可以通過基因工程插入的肽連^妄體或合成的化合物連4妄體，例如，如Pro&纟"五"g《'"een'wg9(3)，299-305(1996)中所公開的。在本發(fā)明中，優(yōu)選肽連接體。肽連接體的長度沒有特別限制，可以由本領域的技術人員考慮到預期應用適當?shù)剡x擇。一般地，肽連接體中有1-100個氨基酸殘基，優(yōu)選3-50個氨基酸殘基，更優(yōu)選5-30個氨基酸殘基，尤其優(yōu)選12-18個氨基酸殘基(例如，15個氨基酸殘基)。肽連接體的氨基酸序列可以是不干擾scFv的結合作用的任何序列?；蛘?，也可以使用合成的化學連接體(化學交聯(lián)劑)連接V區(qū)。本發(fā)明中可以使用那些典型地用于交聯(lián)如肽化合物的交聯(lián)劑。例如，可以使用以下化合物N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)、雙磺基琥珀酰亞胺辛二酸酯(BS3)、二硫代雙琥珀酰亞胺丙酸酯(DSP)、二硫代雙磺基琥珀酰亞胺丙酸酯(DTSSP)、乙二醇雙琥珀酰亞胺琥珀酸酯(EGS)、乙二醇雙石黃基琥珀酰亞胺琥珀酸酯(磺基-EGS)、二琥珀酰亞胺酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亞胺酒石酸酯(磺基-DST)、二[2-(琥珀酰亞胺氧羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、二[2-(磺基琥珀酰亞胺氧羰基氧基)乙基](磺基-BSOCOES)等。當連接4個抗體可變區(qū)時，通常需要3個連接體。多個連接體可以是彼此相同的，或者可以使用不同的連接體。雙抗體和sc(Fv)2是本發(fā)明優(yōu)選的低分子量抗體。為了獲得這樣的低分子量抗體，可以用酶(例如，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)處理抗體以產(chǎn)生抗體片段，或者可以構建編碼這些抗體片段的DNA并插入表達載體中，接著在合適的宿主細胞中表達(參考，例如，Co，M.S.等人，J./mww"o/.(1994)152,2968-2976;Better,M.和Horwitz,A.H.M"/m<iy(1989)178,476-496;Plueckthun,A.和Skerra,A.M"/c^五"，o/'(1989)178,497-515;Lamoyi，E.Af"/oA五"^mo/.(1986)121,652-663;Rousseaux,J.等人，飽Ws￡，歸/.(1986)121，663-669;與Bird,R.E.和Walker,B.W.7>e"A腸^c/mo/.(1991)9，132-137)。另外，也可以以結合有如聚乙二醇(PEG)等各種分子的修飾抗體的形式使用本發(fā)明的抗體。可以通過對本發(fā)明的抗體的化學修飾獲得這些修飾抗體。本領域中已經(jīng)建立了抗體修飾方法。本發(fā)明的抗體也可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體是在同一抗體分子內(nèi)具有識別不同表位的可變區(qū)的抗體，其中，這些表位可以存在于不同的分子中或者可以存在于一個分子中。因此，在本發(fā)明的范圍中，雙特異性抗體可以具有識別HB-EGF分子上的不同表位的抗原結合位點。使用這樣的雙特異性抗體，兩個抗體分子可以與一個HB-EGF分子結合。因此，可以預期有更強的細胞毒性。本發(fā)明的"抗體"也包括這些抗體。本發(fā)明也包括識別除HB-EGF以外的抗原的雙特異性抗體。例如，本發(fā)明包括識別不同于HB-EGF的抗原的雙特異性抗體，其中，該抗原在作為與HB-EGF相同的靶標的癌細胞的細胞表面上特異性地表達。已知產(chǎn)生雙特異性抗體的方法。例如，可以通過連4妄兩個識別不同抗原的抗體產(chǎn)生雙特異性抗體。連接的每個抗體可以是具有H鏈和L鏈的半分子或可以是只具有H鏈的四分之一分子?；蛘撸部梢酝ㄟ^融合產(chǎn)生不同單克隆抗體的雜交瘤產(chǎn)生能產(chǎn)生雙特異性抗體的融合細胞。另外也可以通過基因工程技術產(chǎn)生雙特異性抗體。本發(fā)明的抗體也可以是具有改造的糖鏈的抗體。已知可以通過工程改造抗體上的糖鏈提高抗體的細胞毒性。下面是具有改造的糖鏈的抗體的例子糖基化改造的抗體(例如，WO99/54342)、已刪除存在于糖^1中的巖藻糖的抗體(例如，WO00/61739、WO02/3140、WO2006/067847、WO2006/067913)和攜帶具有等分GlcNAc的糖鏈的抗體(例如，WO02/79255)。巖藻糖陰性的抗體是本發(fā)明優(yōu)選的糖鏈改造的抗體的一個例子。連接到抗體上的糖鏈可以是連接到抗體分子中天冬酰胺的側鏈N原子上的N-糖香連接的糖鏈，或可以是連接到抗體分子中絲氨酸或蘇氨酸的側鏈羥基上的O-糖苷連接的糖鏈；但是，在本發(fā)明中，巖藻糖的存在/不存在是與N-糖苷連接的糖鏈有關的問題。在本發(fā)明的范圍中，巖藻糖陰性的抗體表示基于特定組合物中的抗體上的N-糖苷連接的糖鏈，在至少20%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%、甚至更優(yōu)選至少90%的N-糖苦連接的糖鏈中已刪除巖藻糖?？梢酝ㄟ^本領域技術人員熟知的方法制備巖藻糖陰性的抗體；例如，可以通過在幾乎不具有或不具有添加a-l,6核心巖藻糖的能力的宿主細胞中表達抗體蛋白而產(chǎn)生。幾乎不具有或不具有添加巖藻糖的能力的宿主細胞包括但不限于YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20大鼠骨髓瘤細胞(縮寫為YB2/0細胞，作為ATCCCRL1662保藏)、FTVIII敲除CHO細胞(WO02/31140)、Lecl3細胞(WO03/035835)和巖藻糖轉運蛋白陰性細胞(例如，WO2006/067847、WO2006/067913)?？梢酝ㄟ^本領域中技術人員已知的方法分析糖鏈。例如，可以通過如N-糖苷酶F(Roche)對抗體的作用從抗體上釋放糖鏈。然后，使用纖維素柱通過固相提取將樣品脫鹽(ShimizuY.等人，Ca^7o/^dra化i^^wcA332(2001),381-388),接著濃縮至干并用2-氨基口比口定熒光才示i己(KondoA.等人,y4grz'cw//wra;/awc/5z'o/og7'ca/C7^m&^y54:8(1990)，2169-2170)。在從使用纖維素柱通過固相提取獲得的PA標記的糖鏈中除去試劑之后，通過離心機濃縮獲得純化的PA標記的糖鏈，并使用ODS柱通過反相HPLC分析進行測定。另外，在制備PA標記的糖鏈之后，也可以進行二維作圖(two-dimensionalmapping),其中，使用ODS柱的反相HPLC分析與使用胺柱的正相HPLC分析相結合。在下面的[1]-[13]中描述的抗體是可以用于本發(fā)明的抗體的例子。包含具有作為CDR1的SEQIDNO:14的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:16的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:18的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:20的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:22的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；包含如[1]所述的重鏈和如[2]所述的輕鏈的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:26的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:28的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:30的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:32的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:34的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:36的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；包含如[4]所述的重鏈和如[5]所述的輕鏈的抗體；包含具有作為CDR1的SEQIDNO:76的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:77的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；(HE-39重鏈)包含具有作為CDR1的SEQIDNO:79的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:80的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:81的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(HE-39L鏈-l)包含具有作為CDR1的SEQIDNO:82的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:83的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:84的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；(HE-39L鏈-2)[10]包含如[7]所述的重^t連和如[8]所述的輕^隨的抗體；[11]包含如[7]所述的重《連和如[9]所述的輕鏈的抗體；[12]具有與[l]-[ll]中任一項所述的抗體的活性相當?shù)幕钚缘目贵w^和與[1]-[12]中任一項所述的抗體結合相同表位的抗體。對于上述[12]中的抗體，"相當?shù)幕钚?指對于HB-EGF的結合活性是[l]-[ll]中任一項所述的抗體的結合活性的至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%,或者，在與細胞毒性物質結合的情況下，抗肺瘤活性是[l]-[ll]中任一項所述的抗體的抗腫瘤活性的至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少卯％。向多肽中引入突變是本領域技術人員熟知的一種產(chǎn)生與特定多肽功能相當?shù)亩嚯牡姆椒ā＠?，本領域技術人員熟知，可以通過與本發(fā)明抗體相當?shù)幕钚缘目贵w(Hashimoto-Gotoh，T.等人(1995)C152，271-275;Zoller,M丄和Smith,M.(1983)她A油細戸o/.100,468-500;Kramer,W.等人(1984)M/c/ezc^4dA12，9441-9456;Kramer，W,和Fritz,H丄(1987)71/"/oc/5五"z;wzo/.154,350-367;Kunkel，T.A.(1985)iVoc.A^/.^ca《82,488-492;和Kunkel(1988)M"/joA五"，o/'85,2763-2766)。也可以通過自然突變產(chǎn)生氨基酸突變。本發(fā)明的抗體也包括這樣的抗體其具有通過在本發(fā)明抗體的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸突變而產(chǎn)生的氨基酸序列，并且顯示與本發(fā)明抗體的活性相當?shù)幕钚?。關于在這樣的突變體中突變的氨基酸的數(shù)目，可以考慮一般不超過50個氨基酸，優(yōu)選不超過30個氨基酸，更優(yōu)選不超過10個氨基酸(例如，不超過5個氨基酸)。優(yōu)選地，氨基酸殘基被突變?yōu)楸Ａ舭被醾孺湹奶卣鞯牧硪环N氨基酸殘基。例如，已基于氨基酸側鏈的特征建立了下面的分類。疏水性氨基酸(A,I,L,M，F(xiàn)，P,W，Y,V)親水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)具有脂族側鏈的氨基酸(G,A,V,L,I，P)具有含羥基側鏈的氨基酸(S,T,Y)具有含硫側鏈的氨基酸(C,M)具有含羧基或含酰胺側鏈的氨基酸(D,N，E,Q)具有含堿側鏈的氨基酸(R,K,H)具有含芳基側鏈的氨基酸(H，F(xiàn),Y,W)(圓括號中給出了氨基酸的單字母符號)對于一種多肽，其具有通過從特定氨基酸序列中刪除和/或向特定氨基酸序列中添加一個或多個氨基酸殘基和/或通過用另一種氨基酸替換特定氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基而產(chǎn)生的修飾氨基酸序列，已知這樣的多肽能夠保持其生物活性(Mark，D.F.等人，尸rac.A^/.JcW.(1984)81，5662-5666;Zoller，M丄和Smith,M.,vVwc/"c」c油ie廳rcA(1982)10,6487-6500;Wang,A.等人,Sck"ce224,1431-1433;Dalbadie匿McFarland，G.等人,iVoc.淑/.Jcad.L^4(1982)79，6409-6413)。即，一般地，當在特定多肽的氨基酸序列中將一個特定分類中的氨基酸替換為該分類中的其它氨基酸時，保持該特定多肽的活性的可能性較高。以上提供的氨基酸分類中，同一分類中的氨基酸之間的置換在本發(fā)明中被稱為保守置換。在上述的[13]中，本發(fā)明也提供了與本發(fā)明公開的抗HB-EGF抗體結合相同的表位的抗體。例如，可以通過以下方法獲得這樣的抗體?？梢愿鶕?jù)測試抗體和特定抗體對于相同表位的竟爭來確定兩者是否具有相同的表位。例如，可以通過相互阻斷分析(reciprocalblockingassay)檢測抗體之間的竟爭。例如，竟爭性ELISA分析是一種優(yōu)選的相互阻斷分析。具體地說，在相互阻斷分析中，在樣丈量滴定板的孔上包被HB-EGF蛋白；在存在或不存在候選竟爭性抗體的情況下預孵育；然后加入本發(fā)明的抗HB-EGF抗體。已經(jīng)與孔中的HB-EGF蛋白結合的本發(fā)明抗HB-EGF抗體的量與竟爭結合相同表位的候選竟爭性抗體(測試抗體)的結合活性間接相關。即，測試抗體對同樣的表位的親和力越高，與HB-EGF蛋白包被的孔結合的本發(fā)明的抗HB-EGF抗體就越少，測試抗體與HB-EGF蛋白包—皮的孔結合的量就越大。可以通過纟是前標記抗體方使_地測定與孔結合的抗體的量。例如，可以使用抗生物素蛋白-過氧化物酶偶聯(lián)物和合適的底物測定生物素標記的抗體。基于如過氧化物酶的酶標記的相互阻斷分析作為竟爭性ELISA分析尤其是已知的?？梢杂媚承┢渌杀粰z測或測定的標記物標記抗體。具體地說，》文射性標記和熒光標記也是已知的。另外，當測試抗體具有來源于與本發(fā)明的抗HB-EGF抗體不同的物種的恒定區(qū)時，也可以使用識別該抗體恒定區(qū)的標記過的第二抗體測定與孔結合的抗體的量?；蛘?，甚至當抗體來源于相同的物種但種類不同時，可以使用能區(qū)分各個種類的第二抗體測定與孔結合的抗體的量。與在不存在候選竟爭性抗體的情況下進行的對照觀'H式中獲得的結合活性對比，當候選抗體可以阻斷至少20%、優(yōu)選至少20%-50%、甚至更優(yōu)選至少50%的抗HB-EGF抗體的結合時，這樣的候選竟爭性抗體是與本發(fā)明的抗HB-EGF抗體結合基本上相同的表位的抗體或竟爭結合相同的表位的抗體。例如，識別HB-EGF蛋白中具有序列APSCICHPGYHGERCHGLSL的區(qū)域的抗體是與[10]或[11]中的抗體結合相同表位的抗體的一個優(yōu)選的例子?？贵w的結合活性可以利用已知的方法測定抗體的抗原結合活性(Antibodies:ALaboratoryManual,EdHarlow，DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。例如，可以使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、放射性免疫測定(RIA)或免疫熒光法。Antibodies:ALaboratoryManual的第359-420頁所述的方法是用于測定抗體對細胞中表達的抗原的結合活性的方法的一個例子。另外，特別是采用流式細胞儀的方法可以合適地用來測定懸浮于(例如)緩沖液中的細胞表面上表達的抗原與針對該抗原的抗體之間的結合?？捎玫牧魇郊毎麅x的例子如下FACSCantoII、FACSAria、FACSArray、FACSVantageSE和FACSCalibur(上述裝置來自BDBiosciences)和EPICSALTRAHyPerSort、CytomicsFC500、EPICSXL畫MCLADCEPICSXLADC和CellLabQuanta/CellLabQuantaSC(上述裝置來自BeckmanCoulter)。在一種測定測試HB-EGF抗體對抗原的結合活性的便利方法的例子中，測試抗體與表達HB-EGF的細胞反應，并用識別測試抗體的FITC標記的第二抗體染色。用FACSCalibur(Becton，DickinsonandCompany)測定熒光強度，并用CELLQUEST軟件(Becton,DickinsonandCompany)分析。增殖抑制活性可以方Y更地^吏用以下方法來評價或測定由抗HB-EGF抗體引起的細胞增殖抑制效應。在一種可以用來評價或測定體外細胞增殖抑制效應的方法中，測定活細胞對加入培養(yǎng)基中的[3H]標記的胸苷的攝取作為DNA復制能力的指標。更方便的方法包括MTT法和染料排除法，其中使用顯微鏡檢測細胞排斥染料(例如，臺盼藍)的能力。MTT法利用以下事實活細胞具有將四唑鹽MTT(溴化3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)轉化為藍色甲賸產(chǎn)物的能力。更具體地，向測試細胞的培養(yǎng)液中加入配體和測試抗體，并在經(jīng)過特定時間之后，向培養(yǎng)液中加入MTT溶液，并通過靜置一段特定時間使MTT摻入細胞內(nèi)。結果，黃色化合物MTT被細胞線粒體中的琥珀酸脫氬酶轉化為藍色化合物。溶解藍色產(chǎn)物以提供著色，對其吸光度的測定提供活細胞計數(shù)的指標。除了MTT，如MTS、XTT、WST-l、WST-8等試劑也是可商購的(NacalaiTesque，Inc.)并可以適當?shù)厥褂?。在活性測定中，以與抗HB-EGF抗體同樣的方式^f吏用對照抗體；對照抗體是與抗HB-EGF抗體具有相同的同種型而沒有上述細胞增殖抑制活性的結合抗體。當抗HB-EGF抗體顯示比對照抗體更強的細胞增殖抑制活性時，該抗體具有細胞增殖抑制活性。攜帶肺瘤的小鼠模型也可以用作評價或測定體內(nèi)細胞增殖抑制活性的方法。例如，可以將其生長受HB-EGF促進的癌細胞皮下或皮內(nèi)地移植到非人類測試動物內(nèi)，之后可以在移植當天或第二天開始每天或以多天的間隔靜脈內(nèi)或腹內(nèi)施用測試抗體?？梢酝ㄟ^測量隨時間變化的腫瘤大小來評價細胞增殖抑制活性。如同體外評價一樣，施用具有相同同種型的對照抗體，且當接受抗HB-EGF抗體的組的腫瘤大小明顯小于接受對照抗體的組的腫瘤大小時，該抗體具有細胞抑制活性。當使用小鼠作為非人類測試動物時，適當?shù)夭捎每?nu/nu)鼠；由于胸腺的遺傳缺失，棵(nu/nu)鼠缺乏T-淋巴細胞功能。使用這種類型的小鼠可以在評價或測定由于施用的抗體導致的細胞增殖抑制活性時，排除測試動物中的T-淋巴細胞的貢獻。抑制細胞增殖的方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了通過將表達HB-EGF的細胞與本發(fā)明的抗體接觸而抑制該細胞增殖的方法。存在于本發(fā)明的細胞增殖抑制劑中的本發(fā)明的抗體是上述的結合HB-EGF蛋白的抗體。除了這些細胞需表達HB-EGF以外，對于可以與抗HB-EGF抗體接觸的細胞沒有特別限制，但優(yōu)選疾病相關的細胞。癌細胞是疾病相關的細胞的一種優(yōu)選的例子。癌癥優(yōu)選地是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、腦瘤或血液癌。血液癌包括，例如，骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。使用抗HB-EGF抗體的遞送方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種使用抗HB-EGF抗體將細胞毒性物質遞送到細胞內(nèi)的方法。該方法中使用的抗體是上述的結合有細胞毒性的抗HB-EGF抗體。可以通過將表達HB-EGF的細胞與結合有細胞毒性物質的抗HB-EGF抗體接觸實現(xiàn)細胞毒性物質的遞送。在本發(fā)明中，對于向其遞送毒性物質的細胞沒有特別的限制，但優(yōu)選疾病相關的細胞。癌癥細胞是疾病相關的細胞的一個例子。癌癥優(yōu)選地是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、腦瘤或血液癌。血液癌包括，例如，骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。可以在體外或體內(nèi)進行本發(fā)明的接觸。對于其中加入抗體的狀態(tài)，例如，可以適當?shù)厥褂猛ㄟ^冷凍干燥獲得的固體或溶液。在那些以水溶液形式加入抗體的情況中，可以是只含有純抗體的水溶液，或者可以是含有(例如)表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、懸浮劑、張度劑(tonicityagent)、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、掩味劑等的溶液。對于加入的濃度沒有特別的限制，而培養(yǎng)液中的合適的終濃度優(yōu)選地為lpg/mL-lg/mL，更優(yōu)選1ng/mL-lmg/mL,甚至更優(yōu)選1)ag/mL-lmg/mL。在本發(fā)明中，也可以通過向其中已植入或移植表達HB-EGF的細胞的非人類動物給藥，或通過向荷有表達HB-EGF的癌細胞的動物給藥，進行體內(nèi)"接觸，，。給藥方式可以是口服給藥或腸胃外給藥。尤其優(yōu)選腸胃外給藥，相應的給藥途徑可以包括注射、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)肺給藥、經(jīng)皮給藥等。至于注射給藥的例子，作為細胞增殖抑制劑或抗癌劑的本發(fā)明的藥物組合物可以通過如靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射全身施用或局部施用?？梢圆鹏迵?jù)受試動物的年齡和癥狀選擇適當?shù)慕o藥方式。在施用水溶液的情況中，該溶液可以是只含有純抗體的水溶液，或者可以是含有如表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、懸浮劑、張度劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、掩味劑等的溶液。劑量可以選自例如每次主會藥0.0001mg-1000mg/kg體重?；蛘?，劑量可以選自每位患者0.001-100000mg。但是，本發(fā)明的抗體的劑量不限于上述劑量。藥物組合物另一方面，本發(fā)明的一個特征是包含可結合HB-EGF蛋白的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另外一個特征是細胞增殖抑制劑，尤其是抗癌劑，其包含可結合HB-EGF蛋白的抗體。優(yōu)選向患有癌癥的受試者或處于癌癥危險的受試者施用本發(fā)明的細胞增殖抑制劑和本發(fā)明的抗癌劑。在本發(fā)明中，包含可結合HB-EGF蛋白的抗體的細胞增殖抑制劑也涉及包括向受試者施用可結合HB-EGF蛋白的抗體的步驟的抑制細胞增殖的方法，以及可結合HB-EGF蛋白的抗體在產(chǎn)生細胞增殖抑制劑中的用途。另外，在本發(fā)明中，包含可結合HB-EGF蛋白的抗體的抗癌劑涉及包括向受試者施用可結合HB-EGF蛋白的抗體的步驟的預防或治療癌癥的方法，以及可結合HB-EGF蛋白的抗體在產(chǎn)生抗癌劑中的用途。除了該抗體需具有結合HB-EGF蛋白的能力以外，對于本發(fā)明的藥物組合物(例如，細胞增殖抑制劑或抗癌劑；同樣適用于下文)中存在的抗體沒有特別的限制，且也可以使用此處作為實例提供的任<可抗體。本發(fā)明的藥物組合物的施用方式可以是口服給藥或腸胃外給藥。尤其優(yōu)選腸胃外給藥，且相應的給藥途徑可以包括注射、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)肺給藥、經(jīng)皮給藥等。至于注射給藥的例子，可以通過如靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射全身施用或局部施用本發(fā)明的藥物組合物?？梢愿鶕?jù)患者的年齡和癥狀選擇適當?shù)慕o藥方式。劑量可以選自例如每次給藥0.0001mg-1000mg/kg體重?；蛘?，劑量可以選自每位患者0.001-100000mg。但是，本發(fā)明的藥物組合物不限于上述劑量。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)通常的方法制備(例如，Remington'sPharmaceuticalScience,最新版本,MackPublishingCompany,Easton,USA)，且可以包含藥學上可接受的載體和藥學上可接受的添加劑。例子是表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、懸浮劑、張度劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、掩味劑等，但對于前述沒有限制，且可以適當?shù)厥褂闷渌Ｓ玫妮d體。具體的例子有輕硅酐(lightsilicicanhydride)、乳酸、微晶纖維素、甘露醇、淀粉、羧甲纖維素鈣、羧曱纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基曱基纖維素、聚乙烯乙縮醛二乙氨基醋酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧曱基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。生產(chǎn)藥物產(chǎn)品的方法
技術領域：
：本發(fā)明另外提供了生產(chǎn)藥物組合物尤其是抗癌劑的方法，包括以下步驟(a)提供抗HB-EGF抗體；(b)確定(a)的抗體是否具有內(nèi)化活性；(c)選擇具有內(nèi)化活性的抗體；和(d)將細胞毒性物質結合在(c)中選擇的抗體上?？梢酝ㄟ^上述方法確定內(nèi)化活性的存在/不存在。另外，抗HB-EGF抗體和細胞毒性物質可以是上述的抗HB-EGF抗體和細胞毒性物質。癌癥診斷根據(jù)HB-EGF表達在如胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、腦瘤和血液癌等寬范圍的癌癥中增加的事實，本發(fā)明在另外一方面提供了使用抗HB-EGF抗體診斷疾病的方法，尤其是使用抗HB-EGF抗體診斷癌癥的方法?？梢酝ㄟ^檢測已摻入細胞中的抗HB-EGF抗體進行本發(fā)明的診斷方法。本發(fā)明中4吏用的抗HB-EGF抗體優(yōu)選地具有內(nèi)化活性，且優(yōu)選地用標記物質標記。因此，本發(fā)明的診斷方法的一種優(yōu)選實施方式是使用已用標記物質標記且具有內(nèi)化活性的抗HB-EGF抗體的診斷方法。上述的抗HB-EGF抗體可以用于將要與標記物質結合的抗HB-EGF抗體。結合在抗HB-EGF抗體上的標記物質沒有特別的限制，可以使用本領域技術人員已知的那些標記物質，例如，焚光染料、酶、輔酶、化學發(fā)光物質、放射性物質等。具體的例子有放射性同位素(例如，32P、14C、125I、3H、1311等)、熒光素、羅丹明、丹磺酰氯、傘形酮(umbelliferone)、螢光素酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、(3-半乳糖香酶、P-葡糖苷酶、辣根過氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微過氧化物酶、生物素等。當使用生物素作為標記物質時，優(yōu)選加入生物素標記的抗體，接著加入附著在如堿性磷酸酶的酶上的生物素。可以^使用已知方法將標記物質附著在抗HB-EGF抗體上，例如，戊二醛法、馬來酰亞胺法、吡啶二硫化物法、高碘酸法等。可以通過本領域技術人員已知的程序將標記物質附著在抗體上。當癌癥是通過本發(fā)明的方法診斷的疾病時，對于癌癥的類型沒有特別限制，但癌癥優(yōu)選地是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、腦瘤或血液癌。血液癌包括，例如，骨髓瘤、淋巴瘤和白血病?？梢栽隗w內(nèi)或在體外進行本發(fā)明的i貪斷。例如，可以按照包括以下步驟的方法進行體外診斷(a)提供從受試者收集的樣品；(b)將來自(a)的樣品與結合有標記物質的抗HB-EGF抗體接觸；和(c)檢測已摻入細胞中的抗體。對于收集的樣品沒有特別的限制，可以包括從受試者收集的細胞和從受試者收集的組織。本發(fā)明中使用的樣品也包括從測試樣品獲得的次級樣品，例如，細胞培養(yǎng)液或通過固定從活生物體收集的組織或細胞而制備的樣本。例如，可以按照包括以下步驟的方法進行體內(nèi)診斷(a)向受試者施用標記的抗HB-EGF抗體；和(b)檢測已摻入癌細胞中的抗體。本領域技術人員可以根據(jù)諸如標記物質的類型、待診斷的疾病等適當?shù)卦O定抗HB-EGF抗體的劑量。可以使用上述方法制備標記的抗HB-EGF抗體。本發(fā)明另外提供了生產(chǎn)診斷試劑尤其是癌癥診斷試劑的方法，包括以下步驟(a)提供抗HB-EGF抗體；(b)確定(a)的抗體是否具有內(nèi)化活性；(c)選擇具有內(nèi)化活性的抗體；和(d)將標記物質與(c)中選擇的抗體結合?？梢酝ㄟ^上述的方法確定內(nèi)化活性的存在/不存在。另外，抗HB-EGF抗體和標記物質可以是上述的抗HB-EGF抗體和標記物質。說明書中明確引用的所有專利和參考文獻的內(nèi)容完整引入本文作為參考。日本專利申請2006-286824和2007-107207(該申請構成本申請引用的優(yōu)先權的基礎)的說明書和附圖的內(nèi)容也完整引入本文作為參考。實施例通過下面提供的實施例更詳細地描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。免疫1-1.免疫原的產(chǎn)生1-1-1.HB-EGF表達載體的構建為了構建HB-EGF表達載體，首先如下所述克隆HB-EGF基因。4吏用人類心臟cDNA(humanMarathonReadycDNA,ClontechLaboratories,Inc.)作為模板，使用PyrobestTaq聚合酶(TakaraBioInc.)進行RT-PCR,并克隆全長HB-EGF基因。EGF-1:ATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQIDNO:51)EGF畫2:TCAGTGGGAATTAGTCATGCCC(SEQIDNO:52)(94。C/30秒，65。C/30秒，72°C/60秒35個循環(huán))使用獲得的PCR產(chǎn)物作為模板，在下面給出的條件下進行第二次PCR，獲得全長HB-EGFcDNA片段，其中分別在5'和3'末端添加了SalI和NotI酶切序列。EGF畫3:TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQIDNO:53)EGF-4:ATTAGTCATGCCCAAC(SEQIDNO:54)(94。C/30秒，65。C/30秒，72。C/60秒25個循環(huán))用Sail和Notl消化該片段，并將該片段插入同樣已用Sail和Notl消化的用于動物細胞的表達載體(pMCN)中，從而構建HB-EGF表達載體(pMCN_HB-EGF)。1-1-2.HB-EGF—Fc融合蛋白表達載體的構建使用HB-EGF的胞外域與小鼠IgG2a的Fc區(qū)的融合蛋白(HB-EGF—Fc)作為獲得HB-EGF中和抗體的免疫原。用于免疫的融合蛋白的結構如圖1所示。如下所述構建小鼠Fc區(qū)/HB-EGF融合蛋白的表達載體。首先，使用HB-EGF表達載體(pMCN—HB-EGF)作為模板，在下面的條件下使用PyrobestTaq聚合酶(TakaraBioInc.)進行PCR。EGF-5:AAAGAATTCCACCATGAAGCTGCTGCCGTC(SEQIDNO:55)EGF-6:IDNO:56)(94。C/30秒，68°C/30秒，72。C/30秒25個循環(huán))然后用EcoRI和Cpol消化獲得的PCR產(chǎn)物。將產(chǎn)生的DNA片段插入到含有小鼠IgG2a一Fc的動物細胞表達載體(pMCDN—mlgG2a—Fc)的EcoRI和Cpol之間，以構建HB-EGF-Fc表達載體(pMCDN_HB-EGF-Fc)。1-1-3.HB-EGF—Fc產(chǎn)生林的產(chǎn)生通過以1.5kV、25電穿孑L(來自Bio隱RadLaboratories,Inc.的基因脈沖器)，將已通過使用pvul消化而線性化的15HB-EGF-Fc表達載體pMCDN—HB-EGF-Fc轉染到懸浮于PBS(-)中的DG44細胞(1x107細胞/mL，800|iiL)內(nèi)。在用含有青霉素/鏈霉素(PS)的生長培養(yǎng)基(CHO-S畫SFMII,InvitrogenCorporation)稀釋到合適的細胞計數(shù)之后，將細胞接種到96孔板上，第二天加入500pg/mLG418(遺傳霉素，InvitrogenCorporation)。大約2周后，在顯微鏡下選擇具有單克隆的孔，并使用每孔10pL培養(yǎng)上清液進行SDS-PAGE。使用PVDF膜和山羊抗HB-EGF抗體(AF-259-NA，R&DSystems,Inc.)和HRP-抗山羊抗體(ACI3404,BioSource),通過Western印跡法篩選產(chǎn)生HB-EGF-Fc的細胞抹。選擇最高產(chǎn)量的細胞抹并進行擴大培養(yǎng)。1-1-4.HB-EGF—Fc蛋白質的純化使用HiTrapProteinGHP1mL柱(AmershamBiosciences#17—0404-01)從獲得的HB-EGF—Fc產(chǎn)生抹的培養(yǎng)上清液中純化HB-EGF—Fc蛋白質。以1mL/分鐘的流速吸附培養(yǎng)上清液，接著用20mL20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌，然后用3.5mLO.lM甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脫。在Eppendorf管中以0.5mL的級分回收洗脫物，其中每管已包含50^iLlMTris-HCl(pH9.0)。測定OD，訓。合并含有靶蛋白質的級分，加入PBS(-)以達到2.5mL的總量，然后使用PD-10柱(AmershamBiosciences#17-0851-01)用PBS(—)替換緩沖液。使純化的蛋白質通過0.22的過濾器(Millipore#SLGV033RS)并在4。C儲存。1-2.免疫用完全佐劑(DIFCODF263810)制備HB-EGF—Fc蛋白質的乳劑用于首次免疫，用不完全佐劑(DIFCODF263910)制備用于第二次和隨后的免疫。通過以50iig/鼠的劑量皮下注射(1mLThermo注射器，26號針頭)免疫三只動物[(MRL/lpr，雄性，鼠齡4周)(balb/c，雌性，鼠齡6周)，都購自CharlesRiverJapan]。在首次免疫兩周后，給予第二次免疫，并且以一周的間隔給予總共4-5次免疫。對于最后一次免疫，將HB-EGF—Fc(50|ug)懸浮于100|nLPBS中，并注射到尾靜脈中；3天后進行細胞融合。1-3.雜交瘤的產(chǎn)生如下進行細胞融合。無菌條件下從小鼠中取出脾，并通過在培養(yǎng)基1(RPMI1640+PS)中研磨制備單細胞懸浮液。使懸浮液通過70pm的尼龍篩(Falcon)以除去脂肪組織等，并對細胞計數(shù)。將獲得的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(P3U1細胞)以大約2:1的細胞計數(shù)比例混合；加入1mL50%PEG(Roche，cat#783641);并進行細胞融合。將融合細胞懸浮于培養(yǎng)基2(RPMI1640+PS,10%FCS,HAT(Sigma,H0262),5%BMCondimedHI(Roche#1088947))中,以200pL/孔的量分配到適當數(shù)目的96孔板(10個板)中，并于37。C培養(yǎng)。一周后，使用培養(yǎng)上清液篩選雜交瘤，并分析雜交瘤。源自兩只Balb/c小鼠的雜交瘤分別被命名為HA系列和HB系列，源自一只Mrl/lpr小鼠的雜交瘤被命名為HC系列?？笻B-EGF中和抗體的篩選2-1.表達HB-EGF的人細胞抹的產(chǎn)生2-1-1.HB-EGF_DG44抹的產(chǎn)生如下建立表達HB-EGF的DG44細胞抹。首先，將如1-1-1所述構建的15pgHB-EGF表達栽體pMCN_HB-EGF用pvul消化，并通過使用與1-1-3中所述相同的程序的電穿孔將其轉染到DG44細胞內(nèi)。然后，挑選出G418抗性林，并用山羊抗HB-EGF抗體(R&DSystems,Inc.)和FITC-標記的抗山羊IgG抗體對細胞染色。用FACSCalibur(Becton，DickinsonandCompany)分才斤在細月包表面上表達的HB-EGF,并選擇高表達的克隆。2-1-2.HB-EGFBa/F34朱的產(chǎn)生如下建立在細胞膜上表達HB-EGF的Ba/F3細胞抹。用蛋白酶處理在細胞膜上表達的HB-EGF并切下進入培養(yǎng)基中。因此，首先構建在蛋白酶酶切位點處突變的proHB-EGF的表達載體。使用pMCN-HB-EGF作為模板，使用下面的兩組條件和PyrobestTaq聚合酶(TakaraBioInc.)進行單獨的PCR。PCR反應1EGF-3:TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQIDNO:53)EGF-7:CGATTTTCCACTGTGCTGCTCAGCCCATGACACCTCTC(SEQIDNO:57)(94。C/30秒，68。C/30秒，72。C/30秒20個循環(huán))PCR反應2EGF-8:IDNO:58)EGF-4:ATTAGTCATGCCCAAC(SEQIDNO:54)(94°C/30秒，68°C/30秒，72°C/30秒20個循環(huán))然后混合通過PCR反應1和2獲得的兩個DNA片段；使用PyrobestTaq聚合酶(TakaraBioInc.)進行重組反應(94。C/30秒，72。C/60秒5個循環(huán))；接著在以下條件下使用lfiL的前述反應溶液作為模板進行PCR。EGF-3:TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQIDNO:53)EGF-4:ATTAGTCATGCCCAAC(SEQIDNO:54)(94。C/30秒，68°C/30秒，72。C/60秒22個循環(huán))用SalI和NotI消化獲得的PCR產(chǎn)物，接著將片段插入同樣已用Sail和Notl消化的用于動物細胞的表達載體(pMCN)中，以構建proHB-EGF表達栽體(pMCN-MHB-EGF)。然后如下所述產(chǎn)生表達proHB-EGF的Ba/F3細胞抹。用pvul酶切15jug以上構建的proHB-EGF表達載體pMCN-MHB-EGF,然后通過以0.33kV、950電穿孑L(來自Bio-RadLaboratories,Inc.的基因脈沖器)將其轉染到懸浮于PBS(-)中的Ba/F3細胞(1x107細胞/mL,800iuL)中。然后在96孔板中在含有1ng/mLIL-3和500|ug/mLG418的培養(yǎng)基(RPMI1640,10%FCS，PS)中培養(yǎng)這些細胞，兩周后，挑選出G418抗性林。用山羊抗HB-EGF抗體(R&DSystems,Inc.)和FITC-標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PNIM0819)對細月包染色，并根據(jù)FACS(Becton,DickinsonandCompany)選擇呈現(xiàn)出高水平表達細胞表面HB-EGF的克隆。2-2.表達HB-EGF的SKOV-3細胞的產(chǎn)生如下所述建立表達HB-EGF的SKOV-3細胞林。在含有10%FCS和青霉素/鏈霉素(p/s)的生長培養(yǎng)基(McCoy's5A培養(yǎng)基，InvitrogenCorporation)中培養(yǎng)一種卵巢癌細胞株SKOV-3(購自ATTC)。用pvul消化1-1-1中構建的15HB-EGF表達載體pMCN—HB-EGF。接著通過以1.5kV、25^F電穿孔(來自Bio-RadLaboratories,Inc.的基因脈沖器)，將其轉染到懸浮于PBS(-)中的SKOV-3細胞(1x107細胞/mL，800)中。使用上述生長培養(yǎng)基稀釋到合適的細胞計數(shù)后，將細胞接種到96孔板中。第二天以500)Lig/mL的量力口入G418(遺4專零素，InvitrogenCorporation)。大約2周后，選擇G418抗性單克隆并通過Western印跡法篩選表達HB-EGF的細胞林。選擇最高產(chǎn)量的細胞林并用于隨后的實驗中。2-3.顯示HB-EGF-依賴性生長的EGFRBa/F3細胞林的產(chǎn)生2-3-1.pCV-hEGFR/G-CSFR的構建為了評價本發(fā)明的抗體的活性，構建表達由人EGFR的胞外區(qū)和小鼠G-CSFR的胞外區(qū)組成的嵌合受體(hEGFR/mG-CSFR)的載體。當HB-EGF與表達該嵌合受體的細胞結合時，對該細胞的效應如圖2a所示。為了克隆編碼人表皮生長因子受體(EGFR)的胞外區(qū)的基因，用人類肝cDNA(MarathonReadycDNA，ClontechLaboratories,Inc.)作為模板，使用下面列出的引物組進行PCR。SEQIDNO:59和SEQIDNO:60分別顯示人EGFR的堿基序列(MN—005228)和氨基酸序列(NP—005219)。EGFR-1:ATGCGACCCTCCGGGACGGC(SEQIDNO:61)EGFR畫2:CAGTGGCGATGGACGGGATCT(SEQIDNO:62)(94。C/30秒，65。C/30秒，72。C/2分鐘35個循環(huán))從瓊脂糖凝膠上切下擴增的cDNA(大約2Kb),并插入到pCR-TOPO載體(InvitrogenCorporation)中。分析插入該質粒中的片段的堿基序列，并確認獲得的EGFR基因具有正確的序列。然后用上述獲得的質粒作為模板，使用下面的引物組進行PCR。EGFR-5:TTGCGGCCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGC(SEQIDNO:63)EGFR-6:GATCTTAGGCCCATTCGT(SEQIDNO:64)(94。C/30秒，68。C/30秒，72。C/2分鐘25個循環(huán))獲得編碼EGFR胞外區(qū)并具有5'Notl位點和3'BglII位點的基因片段。用NotI-BglII消化該片段，并將其插入pCV—mG-CSFR中的Notl-BamHI之間。通過用來自人G-CSF的poly(A)添加信號替換pCOSl(國際公開第WO98/13388號)的poly(A)添加信號來構建表達質粒載體pCV。用EcoRI和Xbal消化pEF隱BOS(MizushimaS.等人，M/c.185322(1990))以獲得源自人G-CSF的poly(A)添加信號片段。將此片段插入pBacPAK8(ClontechLaboratories,Inc.)的EcoRI/Xbal位點處。用EcoRI消化之后，平端處理并用BamHI消化兩個末端，從而產(chǎn)生在5'末端添加有BamHI位點和具有平端化3'末端的含有來源于人G-CSF的poly(A)添加信號的片段。該片段在BamHI/EcoRV位點與pCOSl的poly(A)添加信號交換，產(chǎn)生被命名為pCV的表達質粒載體。pCV—mG-CSFR在pCV中包含從位點623處的天冬酰胺殘基到C末端的小鼠G-CSF受體，其是胞內(nèi)區(qū)域。在SEQIDNO:65中顯示小鼠G-CSF受體的堿基序列(M58288),在SEQIDNO:66中顯示小鼠G-CSF受體的氨基酸序列(AAA37673)。但是，由于在pCV—mG-CSFR的插入序列的N-末端區(qū)的編碼cDNA序列中產(chǎn)生了BamHI位點(限制性酶切位點)，SEQIDNO:66中位點632處的甘氨酸殘基被谷氨酸殘基替換。通過證實插入pCV—mG-CSFR中的基因片斷的堿基序列，完成了表達由人EGFR的胞外區(qū)和小鼠G-CSFR的胞內(nèi)區(qū)組成的嵌合受體hEGFR/mG-CSFR的載體pCV—hEGFR/mG-CSFR的構建。在SEQIDNO:67和SEQIDNO:68中分別顯示由表達載體表達的蛋白質(即，人EGFR/小鼠G-CSFR嵌合受體)的堿基序列和氨基酸序列。2-3-2.HB-EGF依賴性細胞抹的產(chǎn)生通過以0.33kV、950電穿孑L(基因脈沖器，Bio-RadLaboratories,Inc.)，將通過用pvul消^f匕而線性化的15hEGFR/mG-CSFR嵌合受體表達載體pCV—hEGFR/mG-CSFR轉染到Ba/F3細胞內(nèi)。在含有10ng/mLHB-EGF和500jig/mLG418的培養(yǎng)基(RPMI1640,10%FCS,PS)中培養(yǎng)這些細胞2周，并挑選出出現(xiàn)的集落。然后在下面的實驗中確定獲得的細胞抹是否顯示出依賴于HB-EGF濃度的生長。在0-100ng/mLHB-EGF(R&DSystems,Inc.,259-HE)的存在下，以1x103細胞/孔的密度向96孔板上接種EGFR_Ba/F3細胞，接著培養(yǎng)3天。然后根據(jù)說明書使用WST-8試劑(細胞計數(shù)試劑盒-8，DojindoLaboratories)確定細胞計數(shù)。結果表明，以依賴于HB-EGF濃度的方式促進建立的EGFR—Ba/F3細胞抹的生長(圖2b)。2-4.雜交瘤篩選2-4-1.對結合HB-EGF的抗體的篩選(初步篩選)為了獲得抗HB-EGF中和抗體，首先篩選結合HB-EGF的抗體。使用ELISA和FACS來篩選結合抗體。2-4-1-1.ELISA雜交瘤培養(yǎng)上清液通過在1|ng/mLHB-EGF蛋白(R&DSystems,Inc.,259-HE)包被的ELISA板(NUNC)中孵育1小時發(fā)生反應。接著與堿性磷酸酯酶(AP)標記的抗小鼠IgG(ZymedLaboratories,Inc.，#62-6622)反應1小時，之后通過力口入1mg/mL底物(Sigma,S0942-50TAB)顯色。用讀板器(Bio-RadLaboratories,Inc.)測定OD4()5，并選擇ELISA陽性孔。2-4-1-2.FACS向HB-EGF_Ba/F3細胞(大約1x105細胞)加入雜交瘤培養(yǎng)上清液，并在4。C孵育1小時。然后加入FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PNIM0819)，并在4°C孵育30分鐘。然后通過FACS(Becton,DickinsonandCompany)分析每一種雜交瘤培養(yǎng)上清液對細胞表面HB-EGF的結合活性。2-4-1-3.有限稀釋為了將根據(jù)ELISA或FACS分析顯示HB-EGF結合活性的克隆分為單克隆，進行有限稀釋(LD)。測定陽性孔中的細胞計數(shù)，并向96孔板上接種以提供3個細胞/孔。在培養(yǎng)大約10天后，再次通過對已經(jīng)出現(xiàn)集落的孔中的培養(yǎng)上清液進行ELISA或FACS分析結合活性。使用這一系列步驟，在HA系列中獲得5個顯示HB-EGF結合活性的單克隆，在HB系列中獲得4個顯示HB-EGF結合活性的單克隆，在HC系列中獲得5個顯示HB-EGF結合活性的單克隆。2-4-1-4.亞型確定使用IsoStrip(Roche#1，493,027)確定抗體亞型。用PBS(-)稀釋IO倍的雜交瘤培養(yǎng)上清液用于亞型確定。表1分離的抗體的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>2-4-2.纟元體純^b使用HiTrapProteinGHP1mL柱(AmershamBiosciences#17—0404-01),從獲得的單克隆雜交瘤的80mL培養(yǎng)上清液中純化抗體。以1mL/min的流速吸附雜交瘤上清液，接著用20mL20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌，然后用3.5mLO.lM甘氨酸-HC1(pH2.7)洗脫。在Eppendorf管中以0.5mL的級分回收洗脫物，其中每個管已包含50pLlMTris-HCl(pH9.0)。測定00280畫。合并含有抗體的級分，加入PBS(-)以達到2.5mL的總量，然后使用PD-10柱(AmershamBiosciences#17-0851-01)用PBS(-)替換緩沖液。使純化的抗體通過0,22nm的過濾器(Millipore#SLGV033RS)，并如下詳細研究各個純化的抗體的性質。2-4-3.在EGFR—Ba/F3細胞中的生長中和活性的分析(第二篩選)分析每種純化的抗體對EGFR_Ba/F3的HB-EGF依賴性生長的中和活性。在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2乂104細胞/孔的密度向％孔板上接種EGFR—Ba/F3細胞，并以0-200ng/mL的量加入特定的純化抗體。培養(yǎng)3天后，使用WST-8(細胞計數(shù)試劑盒-8)測定細胞計數(shù)。結果表明，HA系列中的HA-20、HB系列中的HB-20和HC系列中的HC-20顯示強中和活性(圖3a-3c)。HB-EGF中和抗體(HA-20、HB-20、HC-15)的性質的分析3-1.HA-20、HB-20和HC-15的可變區(qū)的克隆和氨基酸序列的測定使用Trizol(#15596-018,LifeTechnologies)從大約5x106個雜交瘤中純化總RNA。使用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.,#PT3269-1),根據(jù)試劑盒提供的手冊，由1)ug獲得的總RNA進行全長cDNA合成。對于每種抗體，使用獲得的cDNA作為才莫板和<吏用Advantage2PCREnzymeSystem(ClontechLaboratories,Inc.#PT3281-1)，擴增編碼重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的基因。輕鏈可變區(qū)的克隆引物UPM-k(VL-k)UPM:試劑盒提供VL-k:GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG(SEQIDNO:69)重鏈可變區(qū)的克隆引物HA-20:UPM-VH-G1HB-20，HC-15:UPM-VH-2aUPM:試劑盒提供71)94°C/5秒，72°C/2分鐘，5個循環(huán)94°C/5秒，70°C/10秒，72°C/2分鐘5個循環(huán)94。C/5秒，68°C/10秒，72。C/2分鐘，27個循環(huán)將在前述步驟中擴增的基因片段TA-克隆到pCRII-TOPO(InvitrogenTOPOTA-克隆試劑盒，#45-0640)內(nèi)，并測定每個插入片段的堿基序列。測定的可變區(qū)序列如圖4所示。3-2.活性型HB-EGF的結合活性的分析為了比較這樣獲得的3種抗體(HA-20、HB-20、HC-15)結合活性型HB-EGF蛋白的能力，進行下面的實驗。HA-20、HB-20或HC-15抗體在1|ug/mLHB-EGF蛋白(R&DSystems,Inc.,259-HE)包被的板(NUNC)中以各種濃度反應。接著與堿性磷酸酯酶(AP)標"^己的4元小鼠IgG(ZymedLaboratories,Inc.,#62-6622)反應1小時，并加入1mg/mL底物(Sigma,S0942-50TAB)用于顯色。用讀板器測定OD4。5，并根據(jù)用特定抗體獲得的結合曲線計算達到50%結合的抗體濃度(ED5o)。至于對活性型HB-EGF的結合活性，觀察到0.2-1.4nM的ED5o值，因而發(fā)現(xiàn)在所有情況中存在強結合活性(圖表2.抗體HA-20、HB-20和HC-15結合HB-EGF的EDw值mAbHB畫EGF結合(ED50，nmol/L)HA-200.8HB-201.4HC-150.23-3.對proHB-EGF的結合活性的分析然后分析獲得的3種抗體對proHB-EGF的結合活性。在含有10%FCS的生長培養(yǎng)基(Ham'sF12培養(yǎng)基，InvitrogenCorporation)中培養(yǎng)RMG1纟田胞(卵巢癌細胞抹，購自JapanHealthSciencesFoundation),已知其內(nèi)在地表達HB-EGF。每種抗體(10|ag/mL)在4。C下與內(nèi)在地表達HB-EGF的RMG1細胞以及Ba/F3細胞(HB-EGF—Ba/F3)、表達HB-EGF的DG44細胞(HB-EGF—DG44)和SKOV-3細胞(HB-EGF—SKOV-3)(后三者是過量表達HB-EGF的細胞)反應1小時，接著用FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PNIM0819)染色。然后通過FACS(Becton,DickinsonandCompany)分析每種抗體與細胞表面HB-EGF的結合。圖6所示的圖中比較了根據(jù)FACS分析，HA-20、HB-20和HC-15抗體對RMG1細胞中內(nèi)在表達的proHB-EGF和Ba/F3、DG44和SKOV-3細胞中過量表達的proHB-EGF的結合活性。灰色波形顯示在缺乏第一抗體的情況下的染色圖(對照)，而實線顯示在存在特定抗體的情況下的染色圖。橫軸表示染色強度，縱軸表示細胞數(shù)。如圖6所示，HB-20和HC-15識別在細胞膜上過量表達的HB-EGF和卯巢癌細胞林在細胞膜上內(nèi)在表達的HB-EGF，而HA-20根本不結合或只是非常弱地結合。這些結果表明，HA-20是一種強力地結合活性型HB-EGF而不識別proHB-EGF的抗體。3_4.中和活性的分析3_4_1.抑制EGFR/HB-EGF結合的能力的固相分析3-4-1-1.EGFR-Fc蛋白質的產(chǎn)生為了構建在固相條件下可以檢驗HB-EGF與其受體(EGFR)之間的結合的ELISA系統(tǒng)，首先制備EGFR的胞外區(qū)與人IgGl的Fc區(qū)的融合蛋白(EGFR-Fc)作為受體蛋白質。HB-EGF抗體在固相上抑制HB-EGF與EGFR之間的結合的模式如圖7所示。首先構建EGFR-Fc表達載體。使用以下的引物并使用在實施例2-3-1中構建的pCV—hEGFR/mG-CSFR作為模板進行PCR。EGFR-7:GTTAAGCTTCCACCATGCGACCCTCCGGGAC(SEQIDNO:72)EGFR畫8:GTTGGTGACCGACGGGATCTTAGGCCCATTCGTTG(SEQIDNO:73)(94。C/30秒，72。C/30秒25個循環(huán))用BstEII和HindIII酶切擴增的編碼EGFR的胞外區(qū)的基因片段，并將其插入pMCDN2-Fc中的BstEII-HindIII之間。確認插入的基因片段的堿基序列，以完成表達人EGFR的胞外區(qū)與人IgGl的Fc區(qū)的融合蛋白(EGFR-Fc)的載體(pMCDN2—EGFR-Fc)的構建。由表達載體表達的蛋白質(即，EGFR-Fc)的石咸基序列和氨基酸序列分別在SEQIDNO:74和SEQIDNO:75中顯示。然后如下建立產(chǎn)生EGFR-Fc蛋白質的纟田月包林。首先用pvul消化15EGFR-Fc表達載體pMCDN2—EGFR-Fc,然后通過電穿孔將其轉染到DG44細胞內(nèi)。隨后通過Western印跡法分析在G418抗性抹的培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的EGFR-Fc蛋白質。因此，通過SDS-PAGE分離10pL特定培養(yǎng)上清液；印跡在PVDF膜上；并用HRP標記的抗人IgG抗體(Amersham,NA933V)檢測靶蛋白。選擇產(chǎn)生水平最高的克隆，進行擴大培養(yǎng)，并回收培養(yǎng)上清液。如下進行EGFR-F蛋白質的純化。獲得的EGFR-Fc產(chǎn)生抹的培養(yǎng)上清液以1mL/min的流速吸附在HiTrapProteinGHP1mL柱(AmershamBiosciences#17-0404-01)上。在用20mL20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌后，用3.5mL0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脫蛋白質。為了鑒別包含耙蛋白的級分，通過SDS-PAGE分離各lOiuL的回收級分，接著進行Western印跡法和考馬斯亮藍染色。使用PD-10柱(AmershamBiosciences#17-0851-01)用PBS(-)替換緩沖液。純化的蛋白質通過0.22^im的過濾器(Millipore弁SLGV033RS)，并在4。C儲存。3-4-1-2.使用ELISA對HB-EGF與EGFR之間的結合的分析純化的EGFR-Fc以0.5|ig/mL的濃度在抗人IgG抗體包被的ELISA板中反應1小時。0-250ng/mLHB-EGF(R&DSystems,Inc.,259-HE)反應1小時，接著用生物素標記的抗HB-EGF抗體(R&DSystems,Inc.,BAF259)和AP標記的鏈霉抗生物素蛋白(Zymed,糾3-8322)檢測結合EGFR-Fc的HB-EGF蛋白。使用ELISA分析EGFR/HB-EGF結合模式的模型如圖8所示。結果表明，用固相系統(tǒng)從大約4ng/mL的濃度開始可以檢測到HB-EGF與EGFR的結合(圖9)。3-4_l_3.對HB-EGF/EGFR結合的抗體介導的抑制活性的分析使用前述的固相系統(tǒng)分析2-4-2中獲得的抗體對HB-EGF/EGFR結合的抑制活性。向固定有EGFR-Fc的ELISA板中加入各抗體和HB-EGF(50ng/mL),并在室溫下反應1小時。用TBS-T洗板并通過前述步驟檢測結合EGFR的HB-EGF(圖10)。對于全部抗體都觀察到濃度依賴性的抑制結合的活性，確定HA-20、HB-20和HC-15有特別強的結合抑制。3-4-2.對EGFR一Ba/F3細胞的生長抑制活性比較HA-20、HB隱20和HC-15對EGFR—Ba/F3細胞的HB-EGF依賴性生長的中和活性。如上所述，在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2x104細胞/孔的密度向96孔板中接種EGFR—Ba/F3細胞，并加入特定的純化抗體。培養(yǎng)3天后，使用WST-8(細胞計數(shù)試劑盒-8)測定細胞計數(shù)，并構建生長曲線。根據(jù)獲得的結果，計算處于最大抑制效應的50%時的抗體濃度(ECso值)。根據(jù)結果，HC-15顯示對EGFR—Ba/F3細胞有最強的生長抑制效應(EC50=3.8nM),接下來是HA-20(EC5(}=32.6nM)和HB-20(EC50=40.3nM)(圖11)。表3.HA-20、HB-20和HC-15抗體顯示的對EGFR—Ba/F3細胞的生長抑制效應的ED5()值HA-20HB-20HC-15EC50(hM)32,640.33.83-4-3.對RMG陽1細胞的生長抑制活性如下分析對RMG-1細胞的中和活性。將RMG-1細胞(6x103細胞/孔)接種到96孔板中的含有8%或2%FCS的Ham'sF12培養(yǎng)基中，然后加入特定抗體。培養(yǎng)一周后，使用WST-8試劑測定細胞計數(shù)。根據(jù)結果，HA-20以抗體濃度依賴性的方式抑制RMG-1細胞的生長(圖12)。在2。/。FCS濃度時，生長抑制活性尤其明顯。3-5.由抗體的內(nèi)化活性介導的細胞毒性的分析3-5-1.內(nèi)化活性介導的細胞死亡誘導的評價系統(tǒng)使用肥皂草毒蛋白(毒素)標記的抗小鼠IgG抗體(Mab-ZAP,AdvancedTargetingSystems)評價通過抗體內(nèi)化誘導細胞死亡的活性。首先通過混合第一抗體和Mab-ZAP并在室溫下反應15分鐘，制備間接毒素標記的抗體，并向靶細胞加入。當加入的抗體內(nèi)化到細胞內(nèi)時，Mab-ZAP也與第一抗體一起摻入到細胞中，導致在細胞內(nèi)釋放的肥皂草毒蛋白誘導細胞死亡。這在圖13中示意性地顯示。3-5-2.在高表達HB-EGF的細胞抹中內(nèi)化介導的細胞死亡的誘導使用HC-15檢測抗體通過內(nèi)化活性誘導細胞死亡的能力。以2x69103細胞/孔的密度向96孔板中接種SKOV-3細胞和HB-EGF—SKOV3細胞(過量表達HB-EGF的SKOV-3細胞)。過夜培養(yǎng)后，Mab-ZAP以100ng/孔的量與獲得的抗HB-EGF抗體(100ng/孔)反應，并向細胞加入。加入抗體4天后，使用WST-8進行活細胞計數(shù)。對于僅微弱地表達HB-EGF的原始SKOV-3細胞，任何抗體都沒有觀察到誘導細胞死亡的能力；但是，對于過量表達HB-EGF的SKOV-3細胞，每種抗體在Mab-ZAP存在下都觀察到細胞死亡誘導活性。尤其觀察到結合proHB-EGF的HB-20和HC-15的強細胞死亡誘導活性(圖14)。3-5-3.在卵巢癌抹中內(nèi)化介導的細胞死亡誘導3-5-3-1.對卵巢癌抹(ES-2)的細胞毒性的分析3-5-3-1-1.各抗體對ES-2的結合活性然后研究在內(nèi)在地表達HB-EGF的卵巢細胞抹(ES-2)中誘導細胞死亡的能力。ES-2細胞(卵巢癌細胞林，購自ATTC)在含有10%FCS和青霉素/鏈霉素(P/S)的生長培養(yǎng)基(McCoy's5A培養(yǎng)基,InvitrogenCorporation)中培養(yǎng)。首先使用FACS分析每種抗體與ES-2細胞的細胞表面結合的能力。用1mMEDTA剝離細胞；在4。C下在FACS緩沖液(含有2%FCS和0.05o/oNaN3的PBS)中，細胞和特定的抗體(10|Lig/mL)反應1小時；并用FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PNIM0819)在4。C下染色30分鐘。使用FACS(Becton，DickinsonandCompany)分析與細胞表面上表達的HB-EGF結合的抗體。圖15提供了經(jīng)FACS分析比較HA-20、HB-20和HC-15抗體對ES-2細胞的結合活性的圖?；疑ㄐ伪硎驹谌狈Φ谝豢贵w的情況下的染色圖(對照)，而實線表示在存在特定抗體的情況下的染色圖。橫軸表示染色強度，縱軸表示細胞數(shù)。如圖15所示，尤其是對于HC-15,檢測到與ES-2細胞的細胞膜上表達的HB-EGF的結合。3-5-3-1-2.在ES-2中誘導細胞死亡的能力研究了每種抗體對ES-2細胞的內(nèi)化介導的細胞毒性。以2xl03細胞/孔的密度向96孔板中接種ES-2細胞。過夜培養(yǎng)后，特定抗體(100ng/孔)與Mab-ZAP(100ng/孔)反應，并向細胞加入。3天后，使用WST-8進行活細胞計數(shù)。根據(jù)圖16所示的結果，對于顯示最強的HB-EGF結合活性的HC-15,在Mab-ZAP的存在下觀察到細胞死亡誘導活性。3-5-3-2.抑制卵巢癌細胞林(RMG畫1、MCAS)生長的能力的分析3-5-3-2-1.HC-15對MCAS和RMG-1的結合活性然后^f吏用單獨的卵巢癌細胞抹(RMG-1、MCAS)研究抗體抑制生長的能力。MCAS細胞(購自JCRB)在含有20%FCS的生長培養(yǎng)基(Eagle基本必需培養(yǎng)基，InvitrogenCorporation)中培養(yǎng)。為了研究MCAS和RMG-1在細胞表面上是否表達HB-EGF和表達程度，使用HC-15抗體進行FACS分析。用1mMEDTA剝離細胞；在4°C下在FACS緩沖液(含有2%FCS和0.05%NaN3的PBS)中，細胞和HC-15抗體(10pg/mL)反應1小時；并用FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PN畫819)在4°C下染色30分鐘。使用FACS(Becton，DickinsonandCompany)分析與纟田胞表面上表達的HB-EGF結合的抗體。圖17提供了經(jīng)FACS分析比較HC-15抗體對RMG-1和MCAS細胞的結合活性的圖。顯示出在RMG-1細胞和MCAS細胞的細胞表面上都表達HB-EGF。3-5-3-2-2.使用軟瓊脂集落形成試驗對抗體抑制RMG-1和MCAS增殖能力的分析然后使用軟瓊脂集落形成試驗研究抗體對RMG-1和MCAS細胞的不依賴貼壁的增殖的活性。如下所述進行軟瓊脂集落形成試驗。為了制備瓊脂底，以100^L/孔的濃度向96孔板的每孔中加入71含有0.6%瓊脂(3:1NuSieve，Cambrex)的MEM培養(yǎng)基。然后以8000細胞/孔的密度將細胞懸浮于含有0.3%瓊脂的培養(yǎng)基中。將每種測試物(抗體、Mab-ZAP)與細胞一起混合到瓊脂中；以100jaL/孔的濃度將制備物滴加到瓊脂底上。在37。C下培養(yǎng)3周到l個月后，用1%氯化^典硝基四唑鹽(Sigma,18377)對出現(xiàn)的集落染色，并在顯微鏡下檢查集落。首先分析各抗體(HA-20、HC-15)對RMG-1細胞集落形成的作用。將HA-20或HC-15抗體混合到RMG-1細胞中以提供50pg/mL，并在大約3周后觀察瓊脂中形成的集落。根據(jù)結果，與未添加組相比，在HC-15抗體添加組中RMG-1細胞的集落形成受到抑制(圖18)。因而發(fā)現(xiàn)，HC-15抗體僅單獨通過其中和活性就可以抑制RMG-1細胞的不依賴貼壁的集落形成。然后分析HA-20和HC-15抗體的毒素介導的抑制集落形成的活性。將Mab-ZAP(1jag/mL)連同RMG-1細胞、MCAS細胞和HA-20或HC-15抗體(10|ug/mL)—起混合到瓊脂中，并培養(yǎng)大約3周到l個月。對形成的集落染色，并通過顯微鏡觀察。才艮據(jù)結果，觀察到由于在RMG-1細胞(圖19)和MCAS細胞(圖20)中同時加入HC-15抗體和Mab-ZAP導致集落形成的抑制。根據(jù)前述，證明HC-15抗體不僅通過其中和活性也通過其內(nèi)化活性，能夠抑制卵巢癌細胞形成集落的能力。3-5-4.在血液癌細胞抹中內(nèi)化介導的細胞死亡的誘導3-5_4_l.血液癌細胞抹的HB-EG表達的分析然后檢查對于血液癌是否也可觀察到HC-15的內(nèi)化介導的抗腫瘤效應。在含有10%FCS的RPMI1640(InvitrogenCorporation)中培養(yǎng)以下細胞RPMI8226(多發(fā)性骨髓瘤，購自ATCC)、Jurkat(急性T細胞白血病，購自ATCC)、HL-60(急性骨髓性白血病，購自JCRB)、THP-1(急性單核細胞性白血病，購自JCRB)和U937(單核細胞性白血病，購自JCRB)。進行FACS分析以研究這些細胞的HB-EGF表達。HC-15(10fig/mL)抗體與特定的細胞抹(2x105細胞)在冰上反應60分鐘，并用FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PNIM0819)染色。然后通過FACS(Becton,DickinsonandCompany)分析抗體與細胞表面上表達的HB-EGF的結合。圖21給出了基于FACS分析比較各個血液癌細胞抹表達HB-EGF的圖。表明THP-l和U937顯示出特別強的HB-EGF表達。相反，Jurkat和RPMI8226幾乎未見表達。3-5-4-2.對血液癌細胞抹的細胞毒性的分析以1-2x104細胞/孔的密度向96孔板中接種特定的血液癌細胞抹。然后Mab-ZAP以100ng/孔的量與特定的抗HB-EGF抗體(100ng/孔)反應，并向細胞加入。加入抗體5天后，使用WST-8測定活細胞計數(shù)。觀察到向U937細胞和THP-1細胞中同時加入HC-15抗體和Mab-ZAP造成的增殖抑制。根據(jù)這些結果，表明作為抗腫瘤藥，HC-15抗體的內(nèi)化活性對幾種血液癌是有效的。對于肥皂草毒蛋白標記的抗體誘導細胞死亡的分析4-1.抗體的肥皂草毒蛋白標記使用由毒素直接標記的HA-20抗體(HA-SAP)和由毒素直接標記的HC-15抗體(HC-SAP)研究由抗體的內(nèi)化活性介導的細胞毒性。將肥皂草毒蛋白標記純化的HA-20抗體和純化的HC-15抗體外包給AdvancedTargetingSystems。這樣獲得由用平均3個肥皂草毒蛋白分子標記的HA-20和用平均2.4個肥皂草毒蛋白分子標記的HC-15組成的抗體(分別命名為HA-SAP和HC-SAP)。在對誘導癌細胞細胞死亡的能力的研究中使用這些抗體。4-2.肥皂草毒蛋白標記的抗體的細胞毒性的分析4-2-1.肥急草毒蛋白標記的抗體對實體癌細胞抹的細胞毒性的分析73在分析中使用以下癌細胞ES-2、MCAS(卵巢癌)、Capan-2(胰癌，購自JapanHealthSciencesFoundation)、BxPC-3、22Rvl(前列腺癌，購自ATCC)和HUVEC(人內(nèi)皮細胞，購自TakaraBioInc.)。在每種情況下使用由供應商提供的說明書標明的培養(yǎng)條件培養(yǎng)這些細胞。如下分析細胞毒性。以1-5x103細胞/孔的密度向96孔板中接種每種細胞抹并過夜培養(yǎng)。第二天，加入HA-SAP、HC-SAP或對照抗體(肥皂草毒蛋白標記的小鼠IgG(IgG-SAP),AdvancedTargetingSystems),以提供大約100nM-1fM，并培養(yǎng)3-5天。使用WST-8測定活細胞計數(shù)。根據(jù)圖23a所示的結果，HC-SAP強烈地誘導卵巢癌細胞林ES-2和MCAS的細胞死亡。HC-SAP的活性如下對于ES-2細胞EC50=0.09nM,對于MCAS細胞EC50=0.86nM。另一方面，顯示對HUVEC(正常人內(nèi)皮細胞)完全沒有效應。4-2-2.肥急草毒蛋白標記的抗體顯示的對血液癌細胞株的細胞毒性的分析在含有10%FCS的RPMI1640(InvitrogenCorporation)中培養(yǎng)以下細胞抹RPMI8226(多發(fā)性骨髓瘤，購自ATCC)、HL-60(急性骨髓性白血病，購自JCRB)、SKM-1和THP-1(急性單核細胞性白血病，購自JCRB)和U937(單核細胞性白血病，購自JCRB)。如下檢查HA-SAP和HC-SAP對這些血液癌細胞抹的細胞毒性。以1-5x103細胞/孔的密度向96孔板中接種每種細胞林，接著加入大約100nM-1fM的HA-SAP或HC-SAP，并培養(yǎng)3-5天。然后使用WST-8測定活細胞計數(shù)。根據(jù)圖23b所示的結果，HC-SAP在U937、SKM-1和THP-1細胞中基本上誘導細胞死亡。HC-SAP的活性如下對U937細胞EC50=0.33nM，對SKM-1細胞EC50=0.02nM,對THP-1細胞EC50=0.01nM。這些結果表明用(例如)毒素標記的針對HB-EGF的抗體對血液癌也是有效的。DNA免疫5-1.用于分泌型HB-EGF的表達載體的構建如下構建用于分泌型HB-EGF的表達載體。為了擴增編碼HB-EGF胞外區(qū)(氨基酸1-148)的片段，首先在下面條件下使用PyrobestTaq聚合酶(TakamBioInc.)和使用HB-EGF表達載體pMCN—HB-EGF作為模板，進行PCR。EGF-9:TCCGAATTCCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQIDNO:91)EGF畫10:TTTGCGGCCGCTAGAGGCTCAGCCCATGACACCT(SEQIDNO:92)(94。C/30秒，65。C/30秒，72。C/30秒25個循環(huán))用EcoRI和Notl消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。將產(chǎn)生的DNA片段插入用于動物細胞的pMCDN2表達載體中的EcoRI和Notl之間，從而構建用于分泌型HB-EGF的pMCDN—sHB-EGF表達載體。5-2.DNA免疫根據(jù)Bio-RadLaboratories,Inc提供的說明書(#165-2431)所迷，將50分泌型HB-EGF表達載體pMCDN_sHB-EGF包被在金粒子上。4吏用TubingPrepStation(Bio-RadLaboratories,Inc.)將以這種方式獲得的結合有DNA的金粒子涂覆在導管內(nèi)，并用管割刀將導管切割成合適的長度，作為免疫用DNA在4。C下儲存。然后進行DNA免疫。使用Helios基因槍(Bio-RadLaboratories,Inc.),通過轟擊將DNA引入3只動物[(MRL/lpr，雄性，年齡4周)(balb/c,雌性，年齡6周)，購自CharlesRiverJapan]的腹部。然后以3-4天的間隔通過同樣的步驟給予總共11次免疫。對于最后一次免疫，將50iugHB-EGF—Fc懸浮于lOOpLPBS中，并注射到尾靜脈內(nèi)。3天后進行細胞融合。通過與l-3相同的步驟制備雜交瘤。使用與2-4中所述相同的步驟，通過比較克隆的HB-EGF結合活性和中和活性，進行篩選候選抗體的方法。然后，通過2-4中所述的方法進行有限稀釋、亞型確定和抗體純化。通過DNA免疫最終獲得顯示強HB-EGF結合活性和中和活性的抗體HE-39。對新型HB-EGF中和抗體(HE-39)的性質的分析6-1.對HE-39結合活性型HB-EGF的能力的分析為了將獲得的HE-39結合活性型HB-EGF蛋白的能力與3種以前獲得的抗體(HA-20、HB-20、HC-15)結合活性型HB-EGF蛋白的能力進行比較，進行下面的實驗。HA-20、HB-20、HC-15或HE-39抗體在1(ig/mLHB-EGF蛋白(R&DSystems,Inc.,259-HE)包被的ELISA板(NUNC)中以各種濃度反應，并與堿性磷酸酯酶(AP)標i己的4元小鼠IgG(ZymedLaboratories,Inc,，#62-6622)反應1小時。通過加入1mg/mL底物(Sigma,S0942-50TAB)顯色。用讀板器測定OD化s，并根據(jù)用特定抗體獲得的結合曲線計算達到50%結合的抗體濃度(ED5G)。結果，顯示HE-39對活性型HB-EGF的結合活性具有大約0.016nM的EDso值，因而表明HE-39具有比其它3種抗體強得多的結合活性(圖24)。表4.與HB-EGF的結合(ED5。，nmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>6-2.HE-39對proHB-EGF的結合活性的分析為了比較HE-39對proHB-EGF的結合活性與3種以前獲得的抗體(HA-20、HB-20、HC-15)對proHB-EGF的結合活性，進行下面的實驗。特定抗體(10pg/mL)在4。C下與表達HB-EGF的DG44細胞(HB-EGF—DG44)反應1小時，接著用FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PNIM0819)染色。隨后通過FACS(Becton，DickinsonandCompany)分析特定抗體與細胞表面HB-EGF的結合。圖25顯示了根據(jù)FACS分析比較抗體HA-20、HB-20、HC-15和HE-39對在DG44細胞中過量表達的proHB-EGF的結合活性。灰色波形表示在缺乏第一抗體的情況下的染色圖(對照)，而實線表示在存在特定抗體的情況下的染色圖。橫軸表示染色強度，縱軸表示細胞數(shù)。如圖25所示，類似于HB-20和HC-15，HE-39抗體是一種識別細胞膜上的HB-EGF的抗體。6-3.中和活性的分析6-3-1.抑制HB-EGF與EGFR結合的能力使用在3-4-1中所述的固相評價系統(tǒng)，比較HE-39抗體抑制HB-EGF與EGFR結合的能力與3種以前獲得的抗體(HA-20、HB-20、HC-15)的抑制結合能力。向固定有EGFR-Fc的ELISA板上添加HB-EGF(50ng/mL)和系列稀釋的抗體，并在室溫下反應1小時。用TBS-T洗板，并通過3-4-1中所述的步驟檢測結合EGFR的HB-EGF(閨26)。結果證明，HB-EGF與受體的結合尤其被HC-15和HE-39抗體強烈地抑制。表5.對HB-EGF結合EGFR的抑制(EC5。，nmol/L)HA20HB20HC15HE399.529.512.060.836-3-2.抑制EGFR_Ba/F3細胞生長的能力然后分析HE-39抗體對EGFR—Ba/F3細胞的HB-EGF依賴性生長的中和活性，并與HA-20、HB-20和HC-15的中和活性進行比較。根據(jù)3-4-2中所述的方法，在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2x104細胞/孔的密度向96孔板中接種EGFR—Ba/F3細胞，并加入特定的純化抗體。培養(yǎng)3天后，使用WST-8(細胞計數(shù)試劑盒-8)測定77細胞計數(shù)，并構建生長曲線。根據(jù)獲得的結果，計算處于50%的最大抑制效應的抗體濃度(EC5q值)。根據(jù)結果，HE-39顯示實質上好于HC-15(EC50=2.06nM)的生長抑制活性(EC5o=0.83nM)，另外對EGFR—Ba/F3細胞還顯示出最強的生長抑制效應(圖27)。表6HB-EGF依賴性生長的抑制(EC5。，nmol/L)HA20HB20HC15HE399.529.512.060.83HE-39抗體可變區(qū)的克隆7.1可變區(qū)的克隆才艮據(jù)3-1中所述的方法進行HE-39抗體可變區(qū)的克隆和氨基酸序列的分析。由于HE-39是IgGn使用VL-k引物(SEQIDNO:69)克隆輕鏈可變區(qū)，并使用VH-Gl引物(SEQIDNO:70)克隆重鏈可變區(qū)。將在前述步驟中擴增的基因片段TA-克隆到pCRII-TOPO(InvitrogenTOPOTA-克隆試劑盒，#45-0640)中，之后確認每個插入片段的堿基序列。確認的可變鏈的序列如圖28所示。7-2.輕鏈可變區(qū)的確認根據(jù)克隆可變區(qū)的結果，來源于HE-39雜交瘤的輕鏈可變區(qū)存在兩個不同的基因(VL-l、VL-2)。這導致以下假設HE-39雜交瘤沒有被完全單克隆。因而再次通過有限稀釋進行單克隆。向96孔板中接種HE-39以達到1個細胞/孔。培養(yǎng)大約10天后，使用表達HB-EGF的Ba/F3細胞，用FACS分析出現(xiàn)集落的孔的培養(yǎng)上清液。結果，如圖29a所示，獲得顯示HB-EGF結合活性的3個單克隆抗體(HE39-1、HE39-5、HE39-14)。然后，為了確定在這些單克隆雜交瘤中表達哪些輕鏈可變區(qū)(VL-l、VL-2),進行下面的實驗。78從每種雜交瘤(HE39、HE39-1、HE39-5、HE39-14)純化RNA，并使用SuperscriptIIIFirstStrandSystem(InvitrogenCorporation)合成cDNA。為了檢查在各個雜交瘤中表達哪些輕鏈，用來源于每種雜交瘤的合成的cDNA作為模板，在下面的條件下，使用HE-39重鏈特異性的引物(HE39VH)和對于兩種輕鏈類型(VL-1、VL-2)特異性的引物(HE39VL1,HE39VL2)，進4亍RT-PCR。HE-39重鏈可變區(qū)特異性的引物VH-G1:GGGCCAGTGGATAGACAGATG(SEQIDNO:70)HE39VH:CTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCA(SEQIDNO:93)HE-39輕鏈可變區(qū)特異性的引物VL畫lVL-k:GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG(SEQIDNO:69)HE39VL1:TGAGATTGTGATGACCCAGACTCCA(SEQIDNO:94)VL-2VL-k:GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG(SEQIDNO:69)HE39VL2:TTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCA(SEQIDNO:95)94。C/5秒，72。C/2分鐘5個循環(huán)94。C/5秒，70。C/10秒，72。C/2分鐘5個循環(huán)94。C/5秒，68。C/10秒，72。C/2分鐘27個循環(huán)根據(jù)結果，確定如圖29b所示，不僅在HE39中，而且在已通過另外的有限稀釋單克隆的雜交瘤(HE39-1、HE39-5、HE39-14)中，表達兩種類型的輕鏈(VL-1、VL-2)。這些結果表明，兩種類型VL-1、VL-2存在于HE-39的輕鏈中。HE-39抗體的內(nèi)化活性的分析8-1.對HE-39抗體的內(nèi)化活性介導的細胞毒性的分析也研究了通過DNA免疫獲得的HE-39抗體的內(nèi)化活性介導的細胞毒性的存在/不存在。以2x103細胞/孔的密度向96孔板中接種HB-EGF—DG44(過量表達HB-EGF的DG44細胞)。這些細胞與HA-20、HC-15或HE-39抗體(100ng/孔或1000ng/孔)和Mab-ZAP(100ng/孔)反應，培養(yǎng)4天，并使用WST-8測定活細胞計數(shù)。對于加入抗HB-EGF抗體和Mab-ZAP的組，觀察到誘導細胞死亡的能力。對于HC-15和HE-39,觀察到特別強的誘導細胞死亡的能力(圖30)。對HE-39抗體的表位分析9-1.HE-39抗體的結合結構域的分析HB-EGF具有圖31a所示的結構。成熟型HB-EGF由兩個不同的結構域(即，肝素結合結構域和EGF樣結構域)組成。首先構建如下所述的用于表達GST融合蛋白的大腸桿菌表達載體，其目標是確定這兩個結構域中的哪一個是被HE-39抗體識別的結構域。9-1-1.制備用于表位作圖的GST融合蛋白表達載體9-1-1-1.GST-HBEGF成熟表達載體的構建如下制備用于GST蛋白質/成熟型HB-EGF融合蛋白的表達載體。為了擴增編碼成熟型HB-EGF的片段，在下面條件下使用PyrobestTaq聚合酶(TakamBioInc.),進行以HB-EGF表達載體pMCN—HB-EGF為模板的PCR。EGF11:TTGGATCCGTCACTTTATCCTCCAAGCCACA(SEQIDNO:96)EGF12:TTCTCGAGGAGGCTCAGCCCATGACACCT(SEQIDNO:97)(94。C/30秒，65。C/30秒，72。C/30秒30個循環(huán))然后用BamHI和Xhol消化獲得的PCR產(chǎn)物，并將其插入同樣用BamHI和Xhol消化的大腸桿菌GST融合表達載體(pGEX-6P-l)的GST編碼區(qū)的下游，以構建成熟型HB-EGF/GST融合蛋白表達載體(成熟的pGEX-HBEGF)。9-1-1-2.GST-HBEGFHBD表達載體的構建如下制備表達GST蛋白質/HBD(HB-EGF的肝素結合結構域)融合蛋白的載體。為了擴增編碼肝素結合結構域的片段，首先在下面條件下使用PyrobestTaq聚合酶(TakaraBioInc.)進行以HB-EGF表達載體pMCN—HB-EGF為模板的PCR。EGF11:TTGGATCCGTCACTTTATCCTCCAAGCCACA(SEQIDNO:96)EGF13:TTCTCGAGCCGAAGACATGGGTCCCTCTT(SEQIDNO:98)(94。C/30秒，65。C/30秒，72。C/30秒30個循環(huán))然后用BamHI和Xhol消化獲得的PCR產(chǎn)物，并將其插入同樣用BamHI和Xhol消化的大腸桿菌GST融合表達載體(pGEX-6P-l)的GST編碼區(qū)的下游，以構建HB-EGF肝素結合結構域/GST融合蛋白表達載體(pGEX-HBEGF—HBD)。9-1-1-3.GST-HBEGFEGFD表達載體的構建如下制備表達GST蛋白質/EGFD(HB-EGF的EGF樣結構域)融合蛋白的載體。為了擴增編碼EGF樣結構域的片段，首先在下面條件下使用PyrobestTaq聚合酶(TakaraBioInc.)進行以HB-EGF表達載體pMCN—HB-EGF為才莫板的PCR。EGF14:TAGGATCCAAGAGGGACCCATGTCTTCGG(SEQIDNO:99)EGF12:TTCTCGAGGAGGCTCAGCCCATGACACCT(SEQIDNO:97)(94。C/30秒，65。C/30秒，72。C/30秒30個循環(huán))然后用BamHI和Xhol消化獲得的PCR產(chǎn)物，并將其插入同樣81用BamHI和Xhol消化的大腸桿菌GST融合表達載體(pGEX-6P-l)的GST編碼區(qū)的下游，以構建HB-EGFEGF樣結構域/GST融合蛋白表達載體(pGEX-HBEGF—EGFD)。9-1-2.各GST融合蛋白的表達的誘導將如上所述構建的各種大腸桿菌表達載體轉化到大腸桿菌BL21內(nèi)。在LB培養(yǎng)基(各lmL)中培養(yǎng)大腸桿菌轉化體，并在對數(shù)生長期加入IPTG(終濃度為ImM)以誘導蛋白質表達。4-5小時后回收大腸桿菌；通過在SDS樣品緩沖液(0.5mL)中裂解制備裂解物；通過標準方法用5裂解物進行SDS-PAGE,然后印跡到PVDF膜上進行Western印跡分析。9-1-3.成熟HB-EGF蛋白上的HE-39識別結構域的分析使用如上所述制備的GST融合蛋白(其中，成熟HB-EGF蛋白的各個區(qū)域(肝素結合結構域、EGF樣結構域)融合)，通過Western印跡法研究被HE-39抗體識別的成熟HB-EGF蛋白的區(qū)域。圖31b所示的Western印跡分析結果i正明，HE-39抗體識別成熟HB-EGF蛋白的EGF樣結構域。9-2.EGF結構域中的表位的分析由于HE-39識別成熟HB-EGF蛋白的EGF樣結構域，為了確定表位序列，如圖32a所示，更細地分割EGF樣結構域。9-2-1.GST-EGFD5、GST-EGFD6和GST-EGFD7表達載體的構建如下所述制備GST融合蛋白的大腸桿菌表達載體，該GST融合蛋白具有分為3個片段(EGFD5、EGFD6、EGFD7)的EGF結構域。為了構建編碼各區(qū)域(EGFD5、EGFD6、EGFD7)的DNA片段，首先為每個區(qū)域設計如下的兩個低聚物。用于EGFD5合成的低聚物HEP9:82GATCCAAGAGGGACCCATGTCTTCGGAAATACAAGGACTTCTGCATCCATGGAGAATGCAAATATC(SEQIDNO:100)HEP10:TCGAGATATTTGCATTCTCCATGGATGCAGAAGTCCTTGTATTTCCGAAGACATGGGTCCCTCTTG(SEQIDNO:101)用于EGFD6合成的低聚物HEP11:GATCCTGCATCCATGGAGAATGCAAATATGTGAAGGAGCTCCGGGCTCCCTCCTGCATCTGCCACCCGC(SEQIDNO:102)HEP12:TCGAGCGGGTGGCAGATGCAGGAGGGAGCCCGGAGCTCCTTCACATATTTGCATTCTCCATGGATGCAG(SEQIDNO:103)用于EGFD7合成的低聚物HEP13:GATCCGCTCCCTCCTGCATCTGCCACCCGGGTTACCATGGAGAGAGGTGTCATGGGCTGAGCCTCC(SEQIDNO:104)HEP14:TCGAGGAGGCTCAGCCCATGACACCTCTCTCCATGGTAACCCGGGTGGCAGATGCAGGAGGGAGCG(SEQIDNO:105)在每種情況下，組合兩個低聚物并通過標準方法退火以制備雙鏈DNA片段，并將其插入已用BamHI和Xhol消化的大腸桿菌GST融合表達載體(pGEX-6P-l)的GST編碼區(qū)的下游，以產(chǎn)生各個構建體(pGEX-HBEGFEGFD5、pGEX畫HBEGF一EGFD6、pGEX-HBEGF—EGFD7)。9-2-2.各GST融合蛋白的表達的誘導將如上所述構建的各種大腸桿菌表達載體轉化到大腸桿菌BL21內(nèi)。在LB培養(yǎng)基(各lmL)中培養(yǎng)大腸桿菌轉化體，并在對數(shù)生長期加入IPTG(終濃度為1mM)以誘導蛋白質表達。4-5小時后回收大腸桿菌；通過在SDS樣品緩沖液(0.5mL)中裂解制備裂解物；通過標準方法用5nL裂解物進行SDS-PAGE,然后印跡于PVDF膜上進行Western印跡分析。9-2-3.HE-39的表位作圖使用如上所述制備的GST融合蛋白(GST-EGFD5、GST-EGFD6、GST-EGFD7)，使用EGF樣結構域的3個片段中的一個，通過Western印跡法研究HE-39抗體的識別序列。圖32b所示的Western印跡分析結果證明，由于HE-39抗體結合GST-EGFD7,故HE-39抗體識別EGF樣結構域中的序列[APSCICHPGYHGERCHGLSL]?？笻B-EGF抗體介導的ADCC活性的分析10-1.各抗體顯示的對膜表達HB-EGF的結合活性的分析經(jīng)FACS分析，比較到目前為止獲得的抗體對膜表達的HB-EGF的結合活性。特定抗體(10|ug/mL)在4。C下與HB-EGF—Ba/F3細胞(過量表達HB-EGF的Ba/F3細胞)反應1小時，接著用FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BeckmanCoulter,PNIM0819)染色。通過FACS(Becton，DickinsonandCompany)分析該特定抗體與細胞表面HB-EGF的結合。圖33a顯示了通過FACS分析測定的各抗體對HB-EGF—Ba/F3的結合活性?？v軸上的G-平均值(幾何平均值)是通過將細胞的抗體誘導的熒光強度轉化為數(shù)值獲得的值。分析結果表明HC-15是對細胞膜上的HB-EGF具有最強的結合活性的抗體，且HE-39、HE-48和HE-58也具有強結合活性。10-2.抗HB-EGF抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的分析使用鉻釋放法和已顯示出對HB-EGF—Ba/F3細胞的結合活性的抗體(HB-IO、HB-20、HB-22、HC-15、HE曙39、HE-48、HE-58)分析對HB-EGF—Ba/F3細胞的ADCC活性。向在96孔板中增殖的HB-EGF_Ba/F3細胞加入鉻-51，并繼續(xù)培養(yǎng)幾小時。除去培養(yǎng)基；用培養(yǎng)基洗滌細胞；然后加入新鮮的培養(yǎng)基。加入抗體以達到10)ig/mL的終濃度；也向每個孔中以相對于靶細胞大約5X或10X的量加入效應細胞(通過誘導在NK-92(ATCC、CRL-2407)中強制表達小鼠Fc-y受體(NM—010188)而獲得的重組細胞)；使培養(yǎng)板在37。C、5%C02孵箱中靜置4小時。靜置后，離心培養(yǎng)板，并從每個孔中回收恒定量的上清液；使用Wallac1480y計數(shù)器測定放射性；并確定特異的鉻釋放率(％)。根據(jù)在圖33b的上圖中顯示的結果，在測試中使用的抗HB-EGF單克隆抗體中，HB畫22、HC-15、HE-39、HE-48和HE-58特別誘導了非常強的ADCC活性。這些結果表明，針對HB-EGF的抗腫瘤抗體治療非常有用。使用下面的公式計算特異的鉻釋放率。特異的鉻釋放率(%)=(A-C)x100/(B-C)其中A是特定孔中的放射性；B是通過用1%終濃度的NonidetP-40進行細胞裂解釋放到培養(yǎng)基中的放射性的平均值；C是只加入培養(yǎng)基的放射性的平均值。10-3.抗HB-EGF抗體的補體依賴性細胞毒性(ADCC)的測定通過離心分離(1000rpm,5分鐘，4。C)回收HB-EGF—Ba/F3細胞；將細胞沉淀懸浮于大約200pL培養(yǎng)基和3.7MBq鉻-51(編號CJS4，AmershamPharmaciaBiotech)中；并在37。C、5%(302孵箱85中培養(yǎng)1小時。然后用培養(yǎng)基洗滌細胞3遍；隨后用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1x10VmL;并向96孔平底板的每孔中加入100jaL。用培養(yǎng)基稀釋抗HB-EGF單克隆抗體(HB-IO、HB-20、HB-22、HC-15、HE-39、HE-48、HE-58)和對照小鼠IgG2a抗體(目錄號553453,BDBiosciencesPharmingen)，然后以50pL/孑L的量力口入。調(diào)整抗體至10fig/mL的終濃度。然后向每個板孔中加入幼兔補體(目錄號CL3441,Cedarlane)以達到3%或10%的濃度，接著在37。C、5%(:02孵箱中靜置1.5小時。靜置后，離心培養(yǎng)板(1000rpm,5分鐘，4。C);從每個孔中回收100pL上清液；并使用y計數(shù)器(1480WIZARD3",Wallac)測定回收的上清液中的放射性。根據(jù)圖33b的下圖中顯示的結果，在該測試中使用的抗HB-EGF單克隆抗體中，HB-20、HB-22、HC-15和HE-48顯示CDC活性。另一方面，用作對照的小鼠IgG2a抗體在同樣的濃度下不顯示CDC活性。工業(yè)實用性本發(fā)明的抗體和包含本發(fā)明的抗體的藥物組合物可用于治療和診斷癌癥。8權利要求1.一種具有內(nèi)化活性的抗HB-EGF抗體。2.—種結合有細胞毒性物質的抗HB-EGF抗體。3.如權利要求2所述的抗體，其具有內(nèi)化活性。4.一種具有ADCC活性或CDC活性的抗HB-EGF抗體。5.如權利要求1-4中的任一項所述的抗體，其進一步具有中和活性。6.—種選自下面的[1]-[13]的抗體[1]包含具有作為CDR1的SEQIDNO:14的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:16的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:18的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；[2]包含具有作為CDR1的SEQIDNO:20的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:22的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；[3]包含如[1]所述的重鏈和如[2]所述的輕鏈的抗體；[4]包含具有作為CDR1的SEQIDNO:26的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:28的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:30的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；[5〗包含具有作為CDR1的SEQIDNO:32的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:34的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:36的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；[6〗包含如[4]所述的重鏈和如[5]所述的輕鏈的抗體；[7]包含具有作為CDR1的SEQIDNO:76的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:77的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HE-39重鏈)的抗體；[8]包含具有作為CDR1的SEQIDNO:79的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:80的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:81的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(HE-39輕鏈-l)的抗體；[9]包含具有作為CDR1的SEQIDNO:82的氨基酸序列、作為CDR2的SEQIDNO:83的氨基酸序列和作為CDR3的SEQIDNO:84的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(HE-39輕鏈-2)的抗體；[10]包含如[7]所述的重鏈和如[8]所述的輕鏈的抗體；[11]包含如[7]所述的重鏈和如[9]所述的輕鏈的抗體；[l2]具有與[l]-[ll]中任一項所述抗體的活性相當?shù)幕钚缘目贵w；和[13]與[1]-[12]中任一項所述的抗體結合相同的表位的抗體。7.—種包含如權利要求1-6中任一項所述的抗體的藥物組合物。8.—種包含結合在如權利要求1-6中任一項所述抗體上的細胞毒性物質的藥物組合物。9.如權利要求7或8所述的藥物組合物，其是細胞增殖抑制劑。10.如權利要求9所述的藥物組合物，其是抗癌劑。11.如權利要求10所述的藥物組合物，其中，所述癌癥是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、腦瘤或血液癌。12.—種利用抗HB-EGF抗體將細胞毒性物質遞送到細胞內(nèi)的方法。13.—種用結合在抗HB-EGF抗體上的細胞毒性物質抑制細胞增殖的方法。14.如權利要求13所述的方法，其中，所述細胞是癌細胞。15.如權利要求12-14中的任一項所述的方法，其中，所述細胞毒性物質是化學治療劑、放射性物質或毒性肽。16.抗HB-EGF抗體將細胞毒性物質轉運到細胞內(nèi)的用途。17.具有內(nèi)化活性的抗HB-EGF抗體在抑制細胞增殖中的用途。18.如權利要求17所述的用途，其中，所述抗HB-EGF抗體進一步包含中和活性。19.如權利要求18所述的用途，其中，所述抗HB-EGF抗體進一步包含抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴的細胞毒性(CDC)。20.如權利要求16-19中的任一項所述的用途，其中，所述細胞是癌細月包。21.如權利要求16-19中的任一項所述的用途，其中，細胞毒性物質結合在所述抗HB-EGF抗體上。22.—種制備藥物組合物的方法，包括以下步驟(a)提供抗HB-EGF抗體；(b)確定(a)的抗體是否具有內(nèi)化活性；(c)選擇具有內(nèi)化活性的抗體；和(d)將細胞毒性物質結合于(c)中選擇的抗體上。23.如權利要求22所述的方法，其中，所述藥物組合物是抗癌劑。24.—種使用抗HB-EGF抗體診斷癌癥的方法。25.如權利要求24所述的方法，包括使用結合有標記物質的抗HB-EGF抗體。26.如權利要求24或25所述的方法，其中，4企測摻入細胞內(nèi)的抗HB-EGF抗體。27.—種結合有標記物質的抗HB-EGF抗體。28.如權利要求27所述的抗體，其具有內(nèi)化活性。全文摘要本發(fā)明公開了一種具有內(nèi)化活性的抗HB-EGF抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗HB-EGF抗體結合有細胞毒性物質。本發(fā)明也公開了一種包含本發(fā)明的抗體作為活性成分的癌癥治療劑或細胞增殖抑制劑，以及以施用本發(fā)明的抗體為特征的癌癥治療方法和癌癥診斷方法?？梢杂杀景l(fā)明的癌癥治療劑治療的癌癥包括胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、腦瘤和血液癌。文檔編號A61P35/00GK101589059SQ20078004514公開日2009年11月25日申請日期2007年10月19日優(yōu)先權日2006年10月20日發(fā)明者木村直紀申請人:株式會社未來創(chuàng)藥研究所