專利名稱：新前列腺激肽釋放酶過敏原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及過敏反應(yīng)領(lǐng)域。更具體，本發(fā)明涉及新的哺乳動物過敏原 的鑒定以及診斷和治療對哺乳動物的過敏反應(yīng)。
背景技術(shù)：
犬的毛皮垢屑是導(dǎo)致室內(nèi)過敏反應(yīng)的常見原因，癥狀包括鼻炎，結(jié)膜 炎，支氣管感染和哮喘。犬過敏原不僅可在飼養(yǎng)寵物犬的室內(nèi)檢測到也可 在犬不經(jīng)常存在的其他地方諸如學(xué)校和日托中心檢測到(l)。
對犬的過敏反應(yīng)伴隨有并有賴于從犬毛和毛皮垢屑釋放的蛋白的致敏 作用。在可疑對犬過敏的病例中，臨床研究包括利用犬毛和/或毛皮垢屑提
取物通過皮膚針刺試驗(yàn)或特異性IgE抗體測定進(jìn)行評估。特異性IgE的實(shí) 驗(yàn)室免疫分析，諸如Phadia ImmunoCAP，可利用天然犬毛皮垢屑提取物檢 測出大多數(shù)對犬的過敏反應(yīng)，這是由于實(shí)驗(yàn)條件有利并且存在大的允許過 敏原附著的固相。
犬毛和毛皮垢屑提取物包含過敏原性和非過敏原性蛋白的復(fù)合物(2， 3)。目前鑒定并詳細(xì)研究了三種犬過敏原Canf 1，Canf2和Canf3。 Can f 1，其為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族成員，報(bào)道的分子量21-25 kD，由de Groot et al. (4)首次純化，隨后克隆并表達(dá)為重組蛋白(5)。 Canf2屬于相同的蛋白家 族但與Canf l不同(4, 5)。 Can f 3，犬血清白蛋白，是相對保守的蛋白，對 其他哺乳動物白蛋白顯示廣泛的交叉反應(yīng)性(6)。
在已知的犬過敏原中，Can f 1是最為重要的，結(jié)合來自大約半數(shù)發(fā)生犬 過敏反應(yīng)的對象的IgE抗體(7)。大約20%發(fā)生過敏反應(yīng)的犬顯示與Can f 2 結(jié)合的IgE，但大多數(shù)也對Can f 1過敏。盡管30-40%成年犬過敏反應(yīng)個 體也顯示結(jié)合Can f 3的IgE(2, 8),哺乳動物血清白蛋白的特定臨床相關(guān)性 不確定。
很長時間以來，已知與嚙齒類諸如小鼠和大鼠過敏反應(yīng)有關(guān)的主要過 敏原存在動物尿液中并且它們已經(jīng)被分離且定性(9-13)。 IgE抗體結(jié)合活性據(jù)報(bào)道存在其他動物包括貓和犬的尿液中(14)，但沒有從這些動物的尿液中 純化出過敏原并在分子水平定性。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，利用犬毛皮垢屑提取物，特異性IgE的實(shí)驗(yàn)室免疫測定可 檢測大多數(shù)對犬的過敏反應(yīng)，這是由于實(shí)驗(yàn)條件有利并且存在大的允許過 敏原附著的固相。但是，在微型或非實(shí)驗(yàn)室免疫測定諸如過敏原微陣列或 醫(yī)生辦公室測定中，檢測環(huán)境不佳，抗體結(jié)合過敏原試劑結(jié)合能力較低， 天然過敏原提取物效力有限，導(dǎo)致診斷敏感性不足。其他動物表皮的特異 性IgE的免疫測定也存在類似的情況。因此，需要在一些情況下使用純過 敏原性蛋白來實(shí)現(xiàn)足夠的特異性IgE診斷試驗(yàn)的敏感性。
此外，對犬過敏個體有很大一部分不對已知的犬過敏原產(chǎn)生任何反 應(yīng)，并且最近在芬蘭人群中得以證實(shí)(7)。
上述內(nèi)容導(dǎo)致本發(fā)明人尋找另外的未知犬過敏原。所述新過敏原可用 作試劑增加常規(guī)診斷試驗(yàn)的敏感性，也可作為已知的犬過敏原的補(bǔ)充用于 不同類型的組分分辨診斷應(yīng)用中(15， 16)。純過敏原蛋白質(zhì)，或其具有改善 的非致敏性的片段或變體也可用于組分分辨免疫治療中(16-20)。
由此從犬尿液純化新的主過敏原并鑒定為前列腺激肽釋放酶。其在所 有方面都和已經(jīng)知道的犬過敏原不同。此外，類似或相同的免疫等同的過 敏原存在犬毛皮垢屑提取物中。激肽釋放酶是已知的犬過敏原的重要補(bǔ)充 并且可用于診斷犬過敏反應(yīng)。還認(rèn)為其他哺乳動物諸如貓，馬和嚙齒類的 同源蛋白也有相似的過敏原性質(zhì)和診斷用途。
前列腺激肽釋放酶不僅存在尿液中也存在犬類的毛屑中。然而，在前 列腺組織中特異性表達(dá)的蛋白僅限于雄性個體的事實(shí)提示雌性犬類缺乏這 種過敏原。本實(shí)驗(yàn)室的初步結(jié)果支持該觀點(diǎn)并且如果被大量研究結(jié)果證 實(shí)，則僅僅對前列腺激肽釋放酶過敏的犬類過敏反應(yīng)個體可耐受雌性犬 類。
最近公開的報(bào)道中，證實(shí)了陰道對精液的超敏反應(yīng)與對存在精液中的 人前列腺特異性抗原PSA的IgE敏化作用相關(guān)(21)。由于犬類和人前列腺激肽釋放酶以及人前列腺4寺異性抗原具有部分序列相似性，有可能對犬類 前列腺特異性激肽釋放酶過敏導(dǎo)致出現(xiàn)所述過敏反應(yīng)的可能性增加。也可
預(yù)期對前列腺特異性激肽釋放酶的IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對于某些的人類不
育有一定影響。
本發(fā)明的一方面涉及利用激肽釋放酶診斷I型過敏反應(yīng)以及利用激肽 釋放酶制備診斷I型過敏反應(yīng)的組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及與激肽釋放酶"混合(spiked)"的過敏原組合 物。所述過敏原組合物可為過敏原提取物或具有低或無激肽釋放酶成分的 純化或重組過敏原組分的混合物，其中加入激肽釋放酶以結(jié)合來自患者的 IgE，所述患者的IgE不結(jié)合或幾乎不結(jié)合組合物中的其他過敏原成分。本 發(fā)明的該方面還涉及制備所述組合物的方法，包括將激肽釋放酶加入過敏 原組合物諸如過敏原提取物(任選與其他組分混合)或純化天然或重組過 敏原組分的步驟。
本發(fā)明另一方面涉及一種體外診斷方法，用于診斷患者中的I型過敏 反應(yīng)，其中體液樣品諸如患者的血液或血清樣品與激肽釋放酶或前一方面 的組合物接觸，并且檢測患者樣品是否含有特異性結(jié)合激肽釋放酶的IgE 抗體。所述診斷方法可以本領(lǐng)域已知的任何方式進(jìn)行。所述激肽釋放酶可 例如固定在固體支持物上，諸如在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室免疫測定中，在微陣列中或 在支流測定法中。
本發(fā)明另一方面涉及用于進(jìn)行前一方面所述方法的診斷試劑盒，其中 包括激肽釋放酶。
上述的方面中，野生型激肽釋放酶分子也可用激肽釋放酶的片段或變 體取代，其可為天然或人工制造的，具有與野生型激肽釋放酶相同的抗體 結(jié)合表位(epitopes for antibodies),如下所述。
本發(fā)明還涉及治療I型過敏反應(yīng)的方法，包括給予需要所述治療的患 者激肽釋放酶或修飾的激肽釋放酶，如下所述。本發(fā)明的該方面還涉及激 肽釋放酶在所述免疫治療包括例如組分分辨的免疫治療中的應(yīng)用(16)。該 方面的一個實(shí)施方案中，激肽釋放酶可以天然形式或顯示與天然分子相似 的免疫性質(zhì)的重組形式使用。另一實(shí)施方案中，激肽釋放酶可通過化學(xué)或遺傳方法修飾，以消除或減弱其IgE抗體結(jié)合能力，同時優(yōu)選能激發(fā)經(jīng)過 治療的個體中的IgG反應(yīng)。修飾的實(shí)例包括但不限于，分子的片段化、截 短或串聯(lián)，缺失內(nèi)部片段，取代氮基酸殘基，結(jié)構(gòu)域重排或通過破壞二硫 橋或其與其他大分子結(jié)構(gòu)的結(jié)合來破壞至少部分三維結(jié)構(gòu)，或消除蛋白質(zhì) 結(jié)合鈣離子或其他低分子量化合物的能力。該方面的其他實(shí)施方案中，與 完整分子相比顯示降低的IgE結(jié)合活性的單獨(dú)的激肽釋放酶10 kDa和域 18 kDa亞基用作修飾的激肽釋放酶。
上述本發(fā)明的所有方面中，激肽釋放酶可源自任何產(chǎn)生可在患者中誘 導(dǎo)過敏反應(yīng)的激肽釋放酶的哺乳動物。所述的激肽釋放酶可純化自其天然 來源，諸如目的哺乳動物的尿液、唾液或其他體液，或純化自組織，諸如 毛發(fā)或毛皮垢屑。也可通過重組DNA技術(shù)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué) 合成方法制備。
本發(fā)明還涉及犬類前列腺激肽釋放酶在診斷和治療中的用途，例如診 斷和治療對犬類的I型過敏反應(yīng)。
本發(fā)明還涉及從哺乳動物尿液中純化激肽釋放酶的方法，包括以下步
驟
-過濾哺乳動物尿液；
-用適合疏水相互作用層析的緩沖液進(jìn)行緩沖液交換； -過濾緩沖液交換后的尿液樣品；
-將緩沖液交換后的尿液樣品施加于疏水相互作用層析柱上;和
-收集包含激肽釋放酶的流出級分。
所述哺乳動物尿液可為犬類的尿液。
定義
激肽釋放酶是來自常規(guī)血液和尿液的絲氨酸內(nèi)肽酶家族的蛋白水解 酶。在IUBMB酶命名法系統(tǒng)中，血漿激肽釋放酶編號為EC 3.4.21.34，組 織激肽釋放酶編號為EC 3.4.21.35。犬尿激肽釋放酶是28 kDa異源二聚體 蛋白，包含分別大約為10±2和18±2 kDa的兩個亞基，在本發(fā)明中分別記 為10和18 kDa亞基。其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1， GenBank登記號 P09582,并且在很多哺乳動物中描述了其同源蛋白，所述哺乳動物包括馬，牛，豬，小鼠，大鼠和靈長類(例如登記號AAQ23713-4 (馬)， NP_001008416 (牛)，P00752 (豬)，P00755-6和P15947 (小鼠)，P36373和 P00758 (大鼠)，Q28773 (狒狒)，XP—001174026 (黑猩猩)，Q07276 (短尾猿)， P20151, Q07276和AAM11874 (人)。
激肽釋放酶的變體和片段可以是這樣的蛋白質(zhì)或肽，其長度為至少10 個氨基酸，優(yōu)選至少50個，更優(yōu)選至少75或IOO個氨基酸殘基，并且與 所述激肽釋放酶具有至少50 %，優(yōu)選超過60 %, 70 %, 80 %, 90 %或95 %的 序列相同性。
修飾的激肽釋放酶在本發(fā)明中理解為這樣的激肽釋放酶，其通過化學(xué) 或遺傳方法進(jìn)行修飾而改變了免疫學(xué)性質(zhì)，例如本發(fā)明上文中與免疫治療 方面有關(guān)的內(nèi)容所示。
具有與野生型激肽釋放酶相同的抗體結(jié)合表位的激肽釋放酶的變體和 片段應(yīng)理解為這樣的片段和變體，其與來自代表性激肽釋放酶敏化患者的 血清樣品的IgE抗體的結(jié)合可被激肽釋放酶顯著抑制。所述抑制試驗(yàn)可例 如根據(jù)實(shí)施例8公開的方案進(jìn)行。
低過敏原性修飾的激肽釋放酶或激肽釋放酶的變體或片段應(yīng)理解為這 樣的修飾的激肽釋放酶或激肽釋放酶的變體或片段，其不能結(jié)合來自代表 性激肽釋放酶敏化患者的血清樣品的激肽釋放酶反應(yīng)性IgE抗體，例如通 過實(shí)施例3所述的方法測定的那樣，或其顯示不具有生物過敏原活性或具 有明顯降低的生物過敏原活性，如通過細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)如嗜堿性粒細(xì)胞組胺 釋放實(shí)驗(yàn)測定的那樣(22，23)。
附圖簡述


圖1顯示通過大小排阻層析對犬尿蛋白進(jìn)行分級分離。包含圖中所示 三個峰(標(biāo)記為1-3)的每一個的級分被匯集用于分析IgE結(jié)合活性。
圖2顯示通過反相層析從圖1的峰2純化IgE結(jié)合蛋白。含有被選用 于進(jìn)一步分析的蛋白的峰通過箭頭標(biāo)出。
圖3是對通過大小排阻層析和反相層析純化自犬尿的IgE結(jié)合蛋白的 還原(red)或非還原(ox)樣品進(jìn)行的SDS-PAGE分析。泳道M含有分 子量標(biāo)記蛋白。圖4顯示激肽釋放酶作為流體相抑制劑對特異性IgE與固定的犬毛皮 垢屑提取物的結(jié)合的影響。
圖5a-b是通過對37份犬過敏反應(yīng)對象血清中犬毛皮垢屑提取物的IgE 抗體反應(yīng)性的免疫印跡分析進(jìn)行的評估。在與膜條帶保溫之前，血清樣品 如所指示的那樣進(jìn)行稀釋。泳道M含有分子量標(biāo)記蛋白。
圖6顯示通過實(shí)驗(yàn)性ImmunoCAP分析比較相對于血清稀釋度校正的 28kDa條帶的免疫印跡信號強(qiáng)度與激肽釋放酶-特異性IgE的水平。應(yīng)用的 ImmunoCAP和免疫印跡檢測限用虛線表示。免疫印跡信號強(qiáng)度以任意單 位(AU)表示。
圖7顯示純化的犬尿激肽釋放酶對28kDa蛋白帶的特異性免疫印跡抑 制。泳道M含有分子量標(biāo)記蛋白。
圖8顯示通過大小排阻層析從犬毛皮街屑純化激肽釋放酶的第一步。 對圖中所示的六個級分(標(biāo)記為l-6)進(jìn)行IgE結(jié)合活性分析。
圖9顯示通過反相層析從犬毛皮垢屑純化激肽釋放酶的第二步。分析 圖中所示三個峰(標(biāo)記為1-3)的上部級分的IgE抗體結(jié)合活性。
圖10顯示與犬毛皮垢屑提取物、從犬毛皮垢屑純化的尿激肽釋放酶 以及部分純化的激肽釋放酶的特異性IgE抗體結(jié)合的比較性免疫印跡分 析。使用了兩種激肽釋放酶-反應(yīng)性血清(第6和第8)以及一種激肽釋放酶 非反應(yīng)性血清(第11)。分析了還原和非還原形式的過敏原制備物，如附圖 說明中所述。泳道M含有分子量標(biāo)記蛋白。
圖11顯示純化的重組犬尿激肽釋放酶的SDSPage分析。
圖12顯示純化的重組犬尿激肽釋放酶的分析型膠體過濾分析法。
圖13顯示天然和重組犬尿激肽釋放酶的特異性IgE抗體結(jié)合活性的比較。
發(fā)明詳述
以下實(shí)施例舉例說明了犬激肽釋放酶的分離及其用途。所述實(shí)施例僅 僅用于舉例不應(yīng)被理解為限制權(quán)利要求所說明的本發(fā)明。實(shí)施例1:檢測和分離犬尿IgE結(jié)合蛋白
為了研究犬尿是否含有與人類的犬過敏反應(yīng)相關(guān)的過敏原，進(jìn)行以下 試驗(yàn)。從7歲齡雄性Siberian Husky與Vorsteh雜交犬收集尿液。用0.45 pm混合纖維素酯濾膜過濾之后，將10 mL尿液加載于Superdex 75大小排 阻層析(SEC)柱(XK26/100, Vt= 505 mL， GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden),該柱用20 mM MOPS pH 7.6, 0.5 M NaCl (MBS)平衡，并用相同 的緩沖液以2mL/min的流速洗脫。收集來自圖1所示的層析圖中所示的三 個峰的級分，分析過敏原活性。每種級分的蛋白成分固定在ImmunoCAP (Phadia， Uppsala, Sweden)固相上，利用來自犬毛皮垢屑敏化的8名對象的 血清檢測其IgE抗體結(jié)合活性。選擇的這些血清中大部分具有高IgE與犬 毛皮垢屑提取物的結(jié)合，但與rCan f 1， rCan f 2和nCan f 3的結(jié)合相對較 低。在三個檢測的峰中，峰2含有目前最高水平的IgE結(jié)合活性(表 1)。利用NuPAGE MES緩沖液系統(tǒng)(10% NuPAGE gel， Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)對峰2的還原樣品的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電 泳(SDS-PAGE)顯示兩條明顯的蛋白帶，其表觀分子量分別為大約10和18 kDa (未顯示)。
從對應(yīng)峰2的匯集物進(jìn)一步純化蛋白是利用Source 15反相層析(RPC) 柱(ST4.6/100， Vt= 1.66 mL, GE Healthcare Biosciences)進(jìn)行的。加入三氟乙 酸(TFA)至終濃度為0.065%之后，將該匯集物施加在柱上，然后利用9倍柱 體積的0.065% TFA水溶液洗漆。利用0-45%含有0.05% TFA的乙腈水溶 液的線性梯度洗脫，產(chǎn)生一個獨(dú)特但有些不對稱的峰(圖2，用箭頭指示 峰)。含有該峰的級分的還原樣品的SDS-PAGE顯示存在10和18 kDa 帶，似乎不能分開(圖3)。覆蓋整個峰的級分由此收集在一起，在圖2中用 橫條標(biāo)示。該匯集物的非還原樣品的SDS-PAGE顯示另外的28 kD條帶以 及10 kDa和18 kDa帶的遷移率略有偏移(圖3)。還原態(tài)中也可見大約55 kDa的蛋白帶，其可能是28kDa蛋白的二聚體。非還原狀態(tài)中出現(xiàn)28kDa 帶提示該蛋白可能是10和18 kDa多肽通過一或多個半胱氨酸橋連接而成 的。隨后的線性質(zhì)譜分析(數(shù)據(jù)未顯示)顯示28kDa蛋白在還原和烷基化 之后解離進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。實(shí)施例2:鑒定犬尿IgE結(jié)合蛋白為前列腺激肽釋放酶
利用質(zhì)譜法和N末端測序確定分離自犬尿的IgE結(jié)合蛋白。 淑爐ZZ)/-靜遂療顏量微分析
為了對PRC純化的尿蛋白進(jìn)行溶液內(nèi)消化，通過依次分別以大約45-和100-倍摩爾過量加入樣品DTT和碘代乙酰胺進(jìn)行還原和烷基化。胰蛋 白酶消化隨后在37。C進(jìn)行過夜，其中利用豬胰蛋白酶(Trypsin Gold,質(zhì)譜級， Promega, Madison, WI, USA)。含有消化的肽的樣品點(diǎn)樣在MALDI靶標(biāo)板 上，加入含50%乙腈，10 mM NH4[H2P04]， 0.1 % TFA的oc-氰基基質(zhì)溶液。 蒸發(fā)溶劑之后，在Bruker Daltonics Autoflex 2儀(Bruker Daltonics， Bremen, Germany)上進(jìn)行肽質(zhì)量指紋(PMF)。為了鑒定匹配獲得的PMF結(jié)果的蛋白 質(zhì)，利用Mascot服務(wù)器(Matrixscience, London, UK)搜索MSDB數(shù)據(jù)庫。 對所選的肽進(jìn)行源后裂解(Post source decay) (PSD)分析。利用肽校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 品(Bruker Daltonics)進(jìn)行外部校準(zhǔn)。
對SDS-PAGE的單個蛋白帶的凝膠內(nèi)消化分析基本上按照Shevchenko (24)進(jìn)行。從考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠切下實(shí)施例1中所述的10， 18和28 kDa條帶。凝膠片依次用含有50%乙腈的50 mM碳酸氫銨洗滌然 后在純乙腈中收縮。用50 mM碳酸氫銨再水化該凝膠片之后，加入乙腈 至50%并再次用乙腈洗滌，真空離心干燥所述的凝膠片。利用50mM碳 酸氫銨中的45 mM DTT和100 mM碘代乙酰胺依次進(jìn)行離析和垸基化。 用50mM碳酸氫銨中的50。/。乙腈重復(fù)洗滌，最后用100%乙腈洗滌，然后 再次通過真空離心干燥凝膠顆粒。利用豬胰蛋白酶如上所述在37°C消化 過夜。消化的樣品隨后經(jīng)超聲處理并在含有0.1% TFA的50%乙腈中從凝 膠顆粒提取肽。樣品制備和肽質(zhì)量指紋如上所述進(jìn)行。
溶液內(nèi)消化的尿蛋白的PMF分析的結(jié)果顯示與犬前列腺激肽釋放酶 (登記號P09582)高度明顯匹配(p<0.05)。兩種肽的PSD分析，m/z=1224.6 和m/z=l632.8,其也存在18kDa帶的凝膠內(nèi)消化分析中，顯示與具有相同 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫入口的氨基酸序列FMLCAGVLEGK和 SHDLMLLHLEEPAK顯著匹配，分別對應(yīng)殘基194-204和117-130。由于28 kDa帶的PMF也與犬激肽釋放酶(P09582)有非常顯著的數(shù)據(jù) 庫匹配(p0.05)，對其進(jìn)行的凝膠內(nèi)消化的蛋白帶分析也支持上述分析結(jié) 果。10kDa帶的凝膠內(nèi)消化樣品的分析也進(jìn)一步證實(shí)了分離的尿蛋白的鑒 定，該肽的PSD分析結(jié)果m/z=1004.6顯示其與氨基酸序列SFIHPLYK高 度顯著(p〈0.05)數(shù)據(jù)庫匹配，對應(yīng)P09582的殘基95-102。
贈端富基麼靜
為了進(jìn)行N-末端測序，從SDS-PAGE凝膠分別切下還原的10kDa和 18 kDa蛋白帶，并在6 M鹽酸胍，20 mM Tris pH 8.0， 0.5 MNaCl中利用塑 料棒攪勻進(jìn)行提取。提取的10 kDa和18 kDa帶的N-末端測序利用 Hewlett-Packard G1000A儀(Hewlett-Packard， Palo Alto, CA)進(jìn)行，分別產(chǎn)生 氨基酸序列IIGGREXLKN和AVIRPGEDRS，其與登記號P09582的犬前 列腺激肽釋放酶前體序列中的殘基25-34和108-117殘基匹配。
總而言之，本實(shí)施例中描述的結(jié)果證實(shí)了純化的犬尿蛋白的主要成分 (對應(yīng)還原SDS-PAGE分析中的10和18 kDa帶)與犬前列腺激肽釋放酶相 同。此外，觀察到的結(jié)果提示該10和18 kDa多肽通過最初的基因產(chǎn)物的 翻譯后切割形成，并由二硫橋連接形成非還原條件下所見的28 kDa蛋白 質(zhì)，與先前對于人激肽釋放酶所述的情況相似(25)。
前列腺激肽釋放酶也已知為精氨酸酯酶并且在描述相同或基本相同的 氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫入口中攜帶該標(biāo)簽，所述的氨基酸序列包括 NP_001003284， CAA68720和AAA30831。此外，我們注意到在腎、胰腺 和唾液腺組織中表達(dá)的激肽釋放酶的另一變體，已經(jīng)在犬中鑒定(登記號 CAA53210)并且與前列腺激肽釋放酶具有68%的氨基酸相同性。
實(shí)施例3:評估激肽釋放酶，rCan f 1, rCan f 2和nCan f 3的IgE結(jié)合
活性
純化的重組和天然犬過敏原的體外IgE結(jié)合活性利用ImmunoCAP (Phadia， Uppsala, Sweden)檢測，ImmunoCAP 為臨床診斷遺傳性過敏反應(yīng) 中使用的特異性IgE抗體檢測的免疫測定系統(tǒng)?？寺≈亟MCan f 1和Can f 2 (5)并在大腸桿菌中表達(dá)(26)。犬白蛋白利用以離子交換層析和藍(lán)色瓊脂糖層析自血清純化，如(27)所述。利用試驗(yàn)性ImmunoCAP檢測進(jìn)行血清 分析(26)。
本研究利用來自瑞典(n-9)、西班牙(11=23)和北美洲(11=4)的37名犬過 敏反應(yīng)患者的血清。所有的患者都對犬毛皮垢屑提取物具有陽性皮膚針刺 試驗(yàn)結(jié)果并且經(jīng)過醫(yī)生診斷為患有犬過敏反應(yīng)，癥狀為哮喘、過敏性鼻-結(jié) 膜炎和/或風(fēng)疹。所有血清對犬毛皮垢屑提取物的特異性IgE試驗(yàn) (ImmunoCAP)都呈陽性。
對犬毛皮垢屑提取物，rCan f 1， rCan f 2， nCan f 3以及純化的激肽釋放 酶的特異性IgE水平顯示于表2，結(jié)果總結(jié)于表3。在受試血清中，29份 顯示對激肽釋放酶的IgE反應(yīng)性，18份顯示對rCan f 1的IgE反應(yīng)性。 rCan f 2和nCan f 3對于受試者而言表現(xiàn)為較弱的過敏原，僅僅分別結(jié)合 37份中的8和6份。37份血清中的14份(38%)僅僅與激肽釋放酶反應(yīng)。激 肽釋放酶-反應(yīng)性血清平均而言，結(jié)合激肽釋放酶的IgE水平達(dá)到結(jié)合犬毛 皮垢屑的IgE的64%。在對于那些過敏原有特異性反應(yīng)的血清中，結(jié)合 rCan f 1, rCan f 2和nCan f 3的IgE相應(yīng)的相對水平分別為45%, 25%和 47%。 37份受試血清中僅僅有2份缺乏對所有四種犬過敏原的IgE反應(yīng) 性。IgE與激肽釋放酶的結(jié)合顯示與其他任何犬過敏原沒有關(guān)系，證實(shí)了 對激肽釋放酶的免疫反應(yīng)是獨(dú)立變量并且不是與Can f 1, Can f 2或Can f 3 交叉反應(yīng)的結(jié)果。
所得結(jié)果明顯說明犬前列腺激肽釋放酶是本文所研究犬過敏反應(yīng)對象 的主要獨(dú)特過敏原。通過研究發(fā)病率和IgE結(jié)合程度，發(fā)現(xiàn)激肽釋放酶是 目前最為重要的犬過敏反應(yīng)過敏原，并且在所研究的對象中，超過三分之 一對激肽釋放酶有反應(yīng)但對其他檢測的過敏原都沒有反應(yīng)。
實(shí)施例4:證實(shí)犬毛皮垢屑提取物中激肽釋放酶-特異性IgE抗體結(jié)合
活性
進(jìn)行IgE抑制試驗(yàn)檢驗(yàn)犬毛皮垢屑是否含有能結(jié)合激肽釋放酶反應(yīng)性 IgE抗體的表位。具有對激肽釋放酶的IgE反應(yīng)性的來自三名對犬過敏的 對象(A-C)的血清樣品首先在室溫與終濃度100 ng/mL的純化的激肽釋放酶保溫，同時作為陰性對照，與稀釋的血清或大腸桿菌非過敏原性麥芽糖結(jié)
合蛋白(MBP)保溫。所有樣品隨后一式雙份進(jìn)行分析，分析IgE與攜帶固 定的犬毛皮垢屑提取物的ImmimoCAP檢測系統(tǒng)的結(jié)合以研究與激肽釋放 酶預(yù)先保溫是否阻止IgE與附著于固相的毛皮垢屑蛋白結(jié)合。作為激肽釋 放酶抑制作用的特異性的對照，對Can f 1和Can f 2過敏但對激肽釋放酶 不過敏的個體(D)的血清,與其他血清一并包括在試驗(yàn)內(nèi)。
抑制試驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖4。純化自犬尿的激肽釋放酶完全抑制IgE 結(jié)合三份激肽釋放酶反應(yīng)性血清中的兩份(A和B)的犬毛皮垢屑并且部 分抑制第三份血清(C)中的結(jié)合，已知第三份血清也對其他犬過敏原有 反應(yīng)性。陰性對照蛋白MBP與稀釋的血清相比沒有顯示明顯的抑制效 應(yīng)。此外，激肽釋放酶對于Can f l-和Can f 2-反應(yīng)性血清(D)的IgE結(jié) 合沒有抑制作用。
結(jié)果表明能結(jié)合激肽釋放酶-反應(yīng)性IgE抗體的表位結(jié)構(gòu)存在犬毛皮垢 屑中，而不限于尿液中。
實(shí)施例5:利用免疫印跡分析評估IgE與來自犬毛皮垢屑提取物的激肽 釋放酶-樣28kDa蛋白的結(jié)合
為了鑒定存在犬毛皮垢屑中的蛋白(其可能產(chǎn)生觀察到的激肽釋放酶樣 過敏原活性),將具有已知水平的激肽釋放酶反應(yīng)性IgE的37份血清用于免 疫印跡實(shí)驗(yàn)中。對通過SDS-PAGE (12.5% Excel 2-D gel， GE Healthcare Biosciences)分離的非還原犬毛皮垢屑提取物進(jìn)行免疫印跡分析，并電印跡 (electroblot)到硝酸纖維素膜(Hybond ECL， GE Healthcare Biosciences)。蛋 白質(zhì)印跡在室溫利用封閉緩沖液(50 mM磷酸鹽pH 7.4， 0.1 % (v/v) Tween-20， 0.9°/。 (w/v) NaCl， 0.3% (w/v) Dextran T10)封閉lh，然后與每份患者血清 保溫過夜，在封閉緩沖液中稀釋1.5到20倍。每份血清的稀釋因子顯示在 圖5中其相應(yīng)膜條帶的上方括號中。在封閉緩沖液中利用0.5% (v/v) Tween-20洗滌之后，在室溫將膜與封閉緩沖液中的1251-標(biāo)記的抗人IgE抗 體保溫，并利用儲存磷光質(zhì)屏(storage phosphor screen)和Variable Mode Imager, Typhoon 9410 (GE Healthcare Biosciences)對結(jié)合的IgE進(jìn)行放射圖 像檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖5a-b。在使用的37份血清中，有30份顯示IgE與 28kDa蛋白結(jié)合，21份顯示IgE與23 kDa帶結(jié)合，所述的23kDa帶對應(yīng) Can f 1和/或可能對應(yīng)Can f 2。免疫印跡信號強(qiáng)度利用Phoretix ID軟件 (Nonlinear Dynamics Ltd, Newcastle upon Tyne， UK)定量。每種血清中IgE 與每條帶的反應(yīng)水平通過用信號強(qiáng)度乘以血清稀釋因子來計(jì)算。圖6顯示 免疫印跡分析中IgE與28 kDa帶結(jié)合水平與實(shí)施例3中所述激肽釋放酶 ImmunoCAP測定的比較，顯示密切相關(guān)。
為了直接檢驗(yàn)?zāi)蚣る尼尫琶概c犬毛皮垢屑中28kDa帶的關(guān)系，進(jìn)行免 疫印跡抑制試驗(yàn)。將與28 kDa帶產(chǎn)生免疫反應(yīng)的血清在室溫與純化的尿 激肽釋放酶或rCan f 1預(yù)保溫2hr，終濃度均為100 pg/mL，或與血清稀釋 物預(yù)保溫。攜帶免疫印跡的非還原犬毛皮垢屑提取物的膜條帶隨后與預(yù)保 溫的血清樣品接觸，如上所述分析IgE結(jié)合。試驗(yàn)顯示犬毛皮垢屑中 28kDa帶的IgE結(jié)合完全被血清與激肽釋放酶的預(yù)保溫消除，但與單獨(dú)的 rCanf 1和緩沖液預(yù)保溫仍然保持所述的結(jié)合(圖7)。
總而言之，本實(shí)施例的結(jié)果顯示犬毛皮垢屑提取物中存在在電泳以及 免疫學(xué)性質(zhì)方面與尿激肽釋放酶非常相似的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例6:犬毛皮垢屑中激肽釋放酶的部分純化和鑒定
犬毛皮垢屑的激肽釋放酶-樣蛋白通過SEC和RPC純化，進(jìn)行生化定 性。將3克犬毛皮垢屑(Allergon， Valinge, Sweden)在室溫在100 mL MBS 中通過持續(xù)滾動(end-over-end rotation" hr進(jìn)行提取。20,000 x g離心并用 Amicon濾膜(PM-10， Millipore， Billerica， MA, USA)濃縮后，提取物施加在 XK50/100 Superdex 75柱(GE Healthcare Biosciences)上并用MBS洗脫(圖 8)。匯集來自6個峰的級分(在圖8中表示為l-6)并分析過敏原活性。每個 級分的蛋白成分固定在ImmunoCAP (Phadia， Uppsala, Sweden)固相上并且 利用來自犬毛皮標(biāo)屑敏化的對象的8份血清檢測IgE抗體結(jié)合活性，如表 4所示。這些血清中大多數(shù)對犬毛皮垢屑提取物具有高IgE結(jié)合但對rCan f 1，rCanf2或nCanf3的結(jié)合相對較低。從表4可見，SEC分離的3個峰含 有的IgE水平是測試的6個峰中最高的。選擇該匯集物進(jìn)一步純化。加入TFA至終濃度0.065%,將該匯集物施加在ST4.6/100 Source 15 RPC柱(GE Healthcare Biosciences)上，利用含有0.05% TFA的0-54%線性 梯度乙腈水溶液進(jìn)行洗脫(圖8)。圖9所示的三個峰的過敏原反應(yīng)性分析利 用上述標(biāo)準(zhǔn)選出的5份血清進(jìn)行。分析結(jié)果(表5)明顯表明第1個峰具有最 高的IgE抗體結(jié)合水平。該峰的還原SDS-PAGE分析顯示存在10 kDa, 18 kDa和23kDa蛋白帶(未顯示)。
峰1中存在的三條帶從凝膠切下，并進(jìn)行凝膠內(nèi)消化和質(zhì)譜分析，如 實(shí)施例2所述。對選擇的肽的PSD分析(m/z4004.52和m/z-1632.98)之 后，23kDa條帶鑒定為Canfl, 10kDa和18 kDa帶鑒定為犬前列腺激肽釋 放酶(登記號P09582)。
此外，從切下的凝膠帶中洗脫10 kDa和18 kDa帶，進(jìn)行N末端氨基 酸測序。所得序列為xIGGRExLKN和AVxRPGEDRx(其中"x"表示不確定 殘基)匹配犬前列腺激肽釋放酶前體序列(登記號P09582)的殘基25-34和 108-117。
本實(shí)施例的結(jié)果表明具有與前列腺激肽釋放酶相同或非常相關(guān)的一級 結(jié)構(gòu)的蛋白存在犬毛皮塘屑中。
實(shí)施例7:對來自犬毛皮垢屑和尿的激肽釋放酶的相似的IgE抗體反應(yīng)
性
為比較犬尿和毛皮垢屑激肽釋放酶的IgE抗體結(jié)合活性，在犬毛皮垢 屑提取物的非還原樣品、純化的尿激肽釋放酶以及部分純化的犬毛皮垢屑 激肽釋放酶的免疫印跡分析中使用兩份激肽釋放酶-反應(yīng)血清(表2中的6 和8號血清)以及一種激肽釋放酶非反應(yīng)性血清(ll號)。兩份激肽釋放酶-反應(yīng)性血清顯示對所有3份制備物中的28 kDa帶的IgE結(jié)合，表明犬毛皮 垢屑提取物中28 kDa的IgE結(jié)合是由于激肽釋放酶導(dǎo)致的。此外，很明顯 對純化尿激肽釋放酶中28 kDa帶的顯著反應(yīng)性與相同制備物的考馬斯染色 的蛋白帶的情況一致。與非還原激肽釋放酶制備物中大約55kDa的帶的 IgE結(jié)合與實(shí)施例1中推定的激肽釋放酶二聚體的情況一致。根據(jù)ImmunoCAP是非激肽釋放酶反應(yīng)性的血清顯示與分析的三種過敏原制備 物中的28 kDa帶都沒有IgE結(jié)合。
對還原的含激肽釋放酶樣品的免疫印跡反應(yīng)性明顯弱于非還原樣品中 的情況。僅僅純化的尿激肽釋放酶制備物(其激肽釋放酶濃度高于其他分析 的制備物)產(chǎn)生與還原時形成的18kDa帶的可檢出的IgE反應(yīng)。
觀察到對免疫印跡分析中純化的尿激肽釋放酶的免疫反應(yīng)性針對28 kDa的主要蛋白帶的情況，支持實(shí)驗(yàn)性激肽釋放酶ImmunoCAP檢測的正 確性，其IgE結(jié)合不是所用蛋白質(zhì)制備物中的污染物導(dǎo)致的。結(jié)果進(jìn)一步 顯示激肽釋放酶上的至少一些IgE結(jié)合表位對于分子的還原敏感，如10 kDa和18 kDa亞基的結(jié)合比與28 kDa非還原分子的結(jié)合弱也表明了這一 點(diǎn)。
實(shí)施例8:評估修飾的激肽釋放酶或激肽釋放酶的變體或片段(分析 物)的IgE結(jié)合性質(zhì)
將分析物固定于固體支持物，諸如ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)。來自至少三個對相關(guān)物種過敏的代表性人患者并顯示對該物種 激肽釋放酶的IgE反應(yīng)性的血清樣品在室溫與終濃度100 lag/mL的激肽釋 放酶保溫3h，同時與單獨(dú)的緩沖液和大腸桿菌非過敏性麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)保溫作為陰性對照。隨后分析樣品的IgE與攜帶固定的分析物的 ImmunoCAP (Phadia, Uppsala， Sweden)檢測的結(jié)合來研究與激肽釋放酶預(yù) 保溫是否特異性已知或明顯降低IgE結(jié)合。
實(shí)施例9:通過疏水相互作用層析(HIC)從犬尿純化激肽釋放酶
犬尿匯集樣品用5 Mm和0.45 pm濾膜在氮壓下過濾。所有層析操作均 用 AKTA Explorer 100 Air system (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)進(jìn)行。4等份的120 ml過濾犬尿利用Sephadex G-25柱(GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden) (column volume 461 ml)進(jìn)行緩沖液 交換，每次在走柱后洗滌該柱。使用的緩沖液為:50 mM磷酸鈉，1M(NH4)2SO4,0.02%NaN3，pH = 7。樣品(大約505 ml)隨后通過0.45nm濾 膜過濾，施加在HIC柱(HiPrep Phenyl FF (high sub), 20ml， GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)上。用于HIC分離的緩沖液為A) 50 mM磷 酸鈉，1 M (NH4)2S04, 0.02% NaN3, pH = 7，和B) 50 mM磷酸鈉，0,02% NaN3, pH = 7。流出級分(含有激肽釋放酶)以流速5 ml/min收集在10 ml級分 (Frac 950)中，匯集流出級分。吸收的物質(zhì)利用100%緩沖液B在梯度中洗 脫。
所述級分利用BCA (bicinchoninic acid)測定和SDS-PAGE (非還原樣 品，含銀)分析。非還原條件下的SDS-PAGE顯示激肽釋放酶存在流出級 分中，隨后匯集所述級分用于進(jìn)一步處理。
兩等份的大約125 ml和一等份大約87 ml的匯集HIC流出級分隨后利 用Sephadex G-25 SF柱(GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)進(jìn)行緩 沖液交換，所用緩沖液為20mM磷酸鈉，0.02。/。NaN3,pH-8。激肽釋放酶 匯集物(456 ml)隨后在Amicon cell (350 ml， Millipore濾膜，PBCC，截留值 5000 kDa,直徑76 mm)上濃縮到體積約為43 ml。利用BCA測定法，測定 最終的匯集物中的蛋白濃度為0.9 mg/ml (in 43 ml =共38，7 mg)。施加于 HIC-柱的樣品含有101 mg蛋白質(zhì)，其在HIC純化后的激肽釋放酶回收率 為38%。
激肽釋放酶制備物的純度通過在Superdex 75 HR 10/30柱上在AKTA purifier XT10系統(tǒng)中進(jìn)行分析凝膠過濾來評估。對于該試驗(yàn)，樣品體積為 100 |il，緩沖液為10 mM磷酸鈉，150 mM NaCl, 0.02% NaN3, pH = 7.4。
實(shí)施例10:利用電泳和質(zhì)譜法鑒定并定性犬尿激肽釋放酶
利用電泳在相同的凝膠上比較下述樣品，應(yīng)用膠體考馬斯亮藍(lán)(CBB) 染色
1. 標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物
2. 犬尿
3. HIC-洗脫物(還原型)
4. HIC流出級分(還原型)5. HIC流出級分(非還原型)
6. HIC-洗脫物(非還原型)
對于樣品2， 3和6,檢出大量蛋白。但是在樣品4 (還原型HIC流出 級分)中，僅僅可見兩條主帶。這兩條主帶通過利用MALDI-TOF(-TOF) 分析(參見下文)，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)激肽釋放酶的兩種不同的變體(由于精氨酸 酯酶活性在R107的蛋白水解產(chǎn)生的)。樣品5 (非還原HIC流出級分) 中，MALDI-TOF(-TOF)分析檢測到7個不同的帶(見下文)，其對應(yīng)激肽 釋放酶蛋白的不同變體。激肽釋放酶包含12個半胱氨酸殘基，由此可能在 非還原條件下由于形成半胱氨酸-半胱氨酸橋形成不同變體。因此，可能在 非還原條件下形成二聚體、三聚體等。
SDS-PAGE條件，胰蛋白酶消化和MDI-TOF-TOF分析 稀釋樣品利用SDS-PAGE cleanup試劑盒根據(jù)產(chǎn)品說明(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)制備。凝膠在MES緩沖液中在200 V、 35分鐘。還原和 非還原樣品在分離的聚集體中跑膠。利用膠狀CBB染色過夜(隨后在水中 浸泡大約5小時脫色)。利用移液管尖端從凝膠人工選出樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方 案處理(利用乙醇取代乙腈)，與12.5 ng/Vl胰蛋白酶在37攝氏度保溫過 夜。將0.5 pl消化樣品施加在MALDI系統(tǒng)的靶標(biāo)板上并與0.5 |il MALDI 基質(zhì)溶液混合(HCCA在50%乙腈，0.1% TFA中的飽和溶液)。利用 MALDI-TOF-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)質(zhì)譜儀分析所有樣 品。為了鑒定匹配所得PMF結(jié)果的蛋白，利用Mascot服務(wù)器(Matrixscience: London, UK)搜索MSDB數(shù)據(jù)庫。對所選肽進(jìn)行MS-MS分析。利用肽校準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)品(Bruker Daltonics)進(jìn)行外部校準(zhǔn)。利用如下搜索標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜 索
分類:哺乳動物 質(zhì)量允差100 ppm
允許氧化的蛋氨酸和1個缺失的裂解。 數(shù)據(jù)庫中的激肽釋放酶序列FJ朋ZHK尸及---------
爿ra 戶G^mSffl)丄肌丄肌^/MXITKAVRVMDLPKKEPPLGSTCYVSG
AKDTCKGDSGGPLICDGELVGITSWGATPCGKPQMPSLYTRPW肌AfW MZ)7MJTANT (SEQ ID NO: 1)
(斜粗體是通過MALDI-TOF (/TOF) MS (/MS)鑒定的肽序列)
實(shí)施例11:克隆、純化和評估在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的重組犬激肽 釋放酶的IgE結(jié)合活性
為了證實(shí)尿激肽釋放酶作為犬過敏原的性質(zhì)和重要性，制備所述蛋白 作為重組過敏原利用巴斯德畢赤酵母作為表達(dá)宿主，純化并分析IgE抗體 結(jié)合活性。
虔y備編媽;^尿激iif釋i^^游會y^^^^^達(dá)沐 合成犬尿激肽釋放酶基因通過將犬前列腺精氨酸酯酶的報(bào)道的氨基酸 序列中對應(yīng)成熟蛋白的部分回翻譯成核苷酸序列設(shè)計(jì)(尿激肽釋放酶，登記
號P09582)。核苷酸序列設(shè)計(jì)為最優(yōu)密碼子翻譯并且經(jīng)同義修飾最小化二 級結(jié)構(gòu)并消除或增加合意的限制酶位點(diǎn)。獲得并組裝對應(yīng)最終編碼序列的 寡核苷酸，PCR擴(kuò)增全長合成基因，并克隆入載體pPICZ A (Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)的屈ol和位點(diǎn)，添加C末端六組氨酸標(biāo)記以使得 能通過固定金屬離子親和層析(IMAC)純化蛋白。通過Sac I消化使得質(zhì)粒 DNA構(gòu)建體線性化，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入巴斯德畢赤酵母X-33以同源重組進(jìn)入染 色體A0X1基因座。
教微眾激犬微做籐2
重組蛋白在巴斯德畢赤酵母X-33 (Invitrogen)中利用7 L生物反應(yīng)器 (Belach Bioteknik, Solna， Sweden)產(chǎn)生。使用豐富肉湯培養(yǎng)基(20 g/L蛋白胨 10 g/L酵母提取物，3.4 g/L酵母氮源，10 g/L硫酸銨，0.4 mg/L生物素和0.1M磷酸鉀)在30°C培養(yǎng)。誘導(dǎo)表達(dá)并通過向培養(yǎng)物中加入甲醇到穩(wěn)態(tài)濃度 0.P/。(v/v)進(jìn)行保持。發(fā)酵70hr之后，在+4。C在10 000 g離心10min收獲 培養(yǎng)物并回收上清用于蛋白純化。
根據(jù)說明，通過加入咪唑至5 mM以及加入NaCl至.15 M調(diào)節(jié)上清以 純化，利用Tris base調(diào)節(jié)pH到7.2，然后將其施加到通過NiS04帶電的 Streamline 25螯合柱(GE Healthcare Biosciences)。加樣后，在分離的步驟 中用20 mM和60 mM咪唑洗柱，用500 mM咪唑洗脫重組蛋白，均在包 含20 mM Tris-HCl pH 8.0和0.15 M NaCl的緩沖液中進(jìn)行。
利用陽離子交換層析進(jìn)一步純化重組蛋白。含有重組激肽釋放酶的 IMAC級分通過SDS-PAGE鑒定，匯集并用2個體積的20 mM MES pH 6.0 稀釋。調(diào)節(jié)pH到6.0，稀釋的匯集物施加在XK26/100 SP瓊脂糖FF柱(GE Healthcare Biosciences)上。該柱隨后用2倍柱體積的20 mM MES pH 6.0中 的0.15 M NaCl洗滌，用相同緩沖液中的0.30 M NaCl洗脫重組蛋白。測 定所得蛋白在280 nm的吸光度，所用的計(jì)算的消光系數(shù)為1.46 per mg/mLo
盡管合成激肽釋放酶基因構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為指導(dǎo)單多肽鏈的產(chǎn)生，從培 養(yǎng)基中純化的蛋白部分裂解成18kDa和12kDa鏈(圖11)，類似天然尿激肽 釋放酶的加工。事實(shí)上，N末端測序顯示重組激肽釋放酶的裂解位置與天 然分子的相同(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了評估重組蛋白在生理?xiàng)l件下的聚合狀態(tài)和完整度，對制備樣品進(jìn) 行分析性大小排阻層析。如圖12所示，層析圖主要包括單個對稱峰，通 過LMW校準(zhǔn)試劑盒(GE Healthcare Bioseiences)確定對應(yīng)分子量為34 kDa。該分析顯示重組蛋白盡管部分被加工，但在溶液中仍保持在一起并 為均質(zhì)的很可能是單體的聚合狀態(tài)。
^^激i f^f^^^游/gE潛會活絲
產(chǎn)生的重組激肽釋放酶的免疫活性通過與純化自犬尿的天然蛋白進(jìn)行 比較來評估。兩種蛋白分別固定在ImmunoCAP③固相，并且利用37份犬 過敏反應(yīng)個體血清檢驗(yàn)體外IgE結(jié)合能力，如實(shí)施例所述。如圖13所示，兩組數(shù)據(jù)顯示非常強(qiáng)的相關(guān)性(產(chǎn)0.9988)，表明產(chǎn)生的重 組激肽釋放酶與天然尿激肽釋放酶在IgE抗體結(jié)合方面非常相似。由于重 組蛋白制備物中完全沒有任何其他犬來源蛋白，因此所述結(jié)果消除了任何 關(guān)于上述實(shí)施例中的天然激肽釋放酶制備物的活性組分的疑問。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.激肽釋放酶或其具有與野生型激肽釋放酶相同的抗體結(jié)合表位的變體或片段在制備用于體外診斷I型過敏反應(yīng)的診斷組合物中的用途。
2. 權(quán)利要求1的激肽釋放酶，特征在于所述的激肽釋放酶源自靈長類，包括人、犬、貓、馬、牛、豬、大鼠或小鼠。
3. 權(quán)利要求1或2的激肽釋放酶，特征在于所述激肽釋放酶純化自 哺乳動物來源或是重組產(chǎn)生的。
4. 權(quán)利要求1-3之一的激肽釋放酶，特征在于所述的激肽釋放酶 是前列腺激肽釋放酶。
5. 權(quán)利要求1-4之一的激肽釋放酶，特征在于所述的激肽釋放酶 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1 。
6. 制備過敏原組合物的方法，包括將激肽釋放酶或其具有與野生 型激肽釋放酶相同的抗體結(jié)合表位的變體或片段加入包含過敏原提取物和/ 或至少一種純化的過敏原組分的組合物中。
7. 權(quán)利要求6的方法，特征在于所述激肽釋放酶源自靈長類，包 括人，犬，貓，馬，牛，豬，大鼠或小鼠。
8. 權(quán)利要求6或7的方法，特征在于所述激肽釋放酶純化自哺乳 動物來源或是重組產(chǎn)生的。
9. 權(quán)利要求6-8之一的激肽釋放酶，特征在于所述的激肽釋放酶 是前列腺激肽釋放酶。
10. 權(quán)利要求6-9之一的激肽釋放酶，特征在于所述的激肽釋放酶 具有氨基酸序列SEQIDNO: 1。
11. 過敏原組合物，其可通過權(quán)利要求6-10之一的方法獲得。
12. 體外診斷I型過敏反應(yīng)的方法，包括如下步驟 -將來自可疑患有I型過敏反應(yīng)的患者的含有免疫球蛋白的體液樣品與激肽釋放酶或其具有相似IgE-結(jié)合特性的變體或片段接觸，或與權(quán)利要求 ll的過敏原組合物接觸；和-檢測所述樣品中與所述激肽釋放酶特異性結(jié)合的IgE抗體的存在，其中所述特異性結(jié)合激肽釋放酶的IgE抗體的存在指示I型過敏反應(yīng)。
13. 權(quán)利要求12的方法，特征在于所述激肽釋放酶源自靈長類，包 括人，犬，貓，馬，牛，豬，大鼠或小鼠。
14. 權(quán)利要求12或13的方法，特征在于所述激肽釋放酶純化自哺乳 動物來源或是重組產(chǎn)生的。
15. 權(quán)利要求12-14之一的方法，特征在于所述激肽釋放酶是前列腺 激肽釋放酶。
16. 權(quán)利要求12-15之一的激肽釋放酶，特征在于所述的激肽釋放 酶具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1 。
17. 進(jìn)行權(quán)利要求12-16之一的方法的診斷試劑盒，包含權(quán)利要求 l-6之一的激肽釋放酶或權(quán)利要求11的組合物。
18. 治療哺乳動物I型過敏反應(yīng)的方法，包括給予對所述治療易感 的個體來自所述哺乳動物的激肽釋放酶或者所述激肽釋放酶的經(jīng)修飾消除 或減弱其IgE結(jié)合反應(yīng)的形式。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動物選自靈長類組成的組， 包括人，犬，貓，馬，牛，豬，大鼠或小鼠。
20. 權(quán)利要求18或19的方法，其中所述修飾的激肽釋放酶是10 kDa 亞基或18kDa亞基。
21. 權(quán)利要求18-20之一的方法，其中所述低過敏原性激肽釋放酶 衍生物是通過分子的片段化、截短或串聯(lián)，內(nèi)部片段的缺失，結(jié)構(gòu)域重 排，氨基酸殘基取代，二硫橋破壞進(jìn)行修飾的激肽釋放酶。
22. 藥物組合物，包含激肽釋放酶或所述激肽釋放酶的經(jīng)修飾消除 或減弱其IgE結(jié)合反應(yīng)的形式，以及任選的藥物可接受的載體、賦形劑， 緩沖液或稀釋劑。
23. 權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述低過敏原性激肽釋放酶片 段是10kDa亞基。
24. 權(quán)利要求22或23的藥物組合物，其中所述低過敏原性激肽釋放 酶衍生物是通過分子的片段化、截短或串聯(lián)，內(nèi)部片段的缺失，結(jié)構(gòu)域重 排，氨基酸殘基取代，二硫橋破壞進(jìn)行修飾的激肽釋放酶。
25. 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的激肽釋放酶在診斷中的用途， 諸如診斷犬的I型過敏反應(yīng)。
26. 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的激肽釋放酶在治療中的用途， 諸如治療犬的I型過敏反應(yīng)。
27. 從哺乳動物尿液分離激肽釋放酶的方法，包含以下步驟 -過濾哺乳動物尿液；-與適合疏水相互作用層析的緩沖液進(jìn)行緩沖液交換； -過濾緩沖液交換后的尿液樣品；-將緩沖液交換后的尿液樣品施加于疏水相互作用層析柱上；和 -收集包含激肽釋放酶的流出級分。
28. 權(quán)利要求26的方法,其中所述哺乳動物尿液是犬尿。
全文摘要
前列腺激肽釋放酶在制備用于診斷/治療I型過敏反應(yīng)具體是對犬的過敏反應(yīng)的診斷組合物或藥物組合物中的用途。
文檔編號A61P37/00GK101588815SQ200780047710
公開日2009年11月25日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者H·埃韋堡, J·利德霍爾姆, L·馬特松 申請人:法蒂亞公司