專(zhuān)利名稱(chēng)：腺苷拮抗劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性腺苷A3受體掊抗劑或針對(duì)所述受體的RNAi用于治 療心肌梗死和各種心臟病癥，包括心力衰竭的用途。
背景技術(shù)：
充血性心力衰竭(CHF)是一些征兆和癥狀的集合(compilation)，其全部 是由心臟不能隨需要適當(dāng)增加心輸出量所引起的?；颊叩湫偷乇憩F(xiàn)出氣 促、水腫和疲勞。CHF已經(jīng)成為一種流行比例疾病，影響成年人群的3%。 CHF的死亡率高于很多類(lèi)型的癌癥，其五年存活率低于30。/。。心肌梗死(MI) 是引發(fā)CHF的主要原因之一。左心室(LV)重建在很大程度上促進(jìn)CHF。
現(xiàn)在普遍認(rèn)同心肌胞外基質(zhì)(ECM)的改變促進(jìn)進(jìn)行性重建過(guò)程。ECM 合成和降解的平衡，也稱(chēng)作ECM周轉(zhuǎn)，決定組織結(jié)構(gòu)的維持。心臟中ECM 合成的正常速度非常低。病理學(xué)情況過(guò)程，例如MI中，膠原合成和沉積 加速不僅僅發(fā)生梗死的心肌，而且發(fā)生在非-梗死的心肌中。生長(zhǎng)證據(jù)提示 纖維膠原網(wǎng)絡(luò)和膠原基質(zhì)解體的變化促進(jìn)LV重建。
基質(zhì)解體已經(jīng)歸因于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)增高的表達(dá)，該酶分解 基質(zhì)蛋白并降低金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)，即一種蛋白酶抑制劑家 族的表達(dá)。MMPs是重要的分子，它是心肌ECM降解背后的驅(qū)動(dòng)力。近 來(lái)的研究己清楚地證明在心臟中，MMPs促進(jìn)心室重建和心力衰竭。在臨 床水平，我們小組和其他人的研究已顯示升高的血液MMPs水平與MI后 心力衰竭的發(fā)展有關(guān)。因此，測(cè)定患有MI或CHF的患者的MMPs，且特別是MMP-9，提供了與TNF-ou血管緊張素II或去甲腎上腺素類(lèi)似的預(yù)
后測(cè)量。
關(guān)于MMP-9缺失小鼠的研究揭示MMP-9作為潛在治療靶標(biāo)以預(yù)防 MI后LV重建。然而，PREMIER (預(yù)防心肌梗死早期重建，Prevention of Myocardial Infarction Early Remodelling)II期試驗(yàn)表明用PG-116800非特異 性抑制MMPs活性未能預(yù)防LV重建且沒(méi)有改善MI后的結(jié)局。在這個(gè)研 究中，MMP抑制劑在MI后24-72小時(shí)給予。該試驗(yàn)的陰性結(jié)果部分地由 MMP抑制劑的非特異性解釋?zhuān)⑻崾具M(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)工作對(duì)理解MMPs在 LV重建中的意義是必需的。
因此，與神經(jīng)激素和促炎細(xì)胞因子例如腫瘤壞死因子-(x(TNF-cO類(lèi)似， MMPs代表了可促進(jìn)心力衰竭進(jìn)展的另一種不同類(lèi)型的生物學(xué)活性分子。 不斷增多的證據(jù)提示調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子和MMP水平可能代表一種治療心 力衰竭患者的新型治療范例。
多形核白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞或PMNs)和巨噬細(xì)胞是MMPs的豐富來(lái) 源。嗜中性粒細(xì)胞包括在第一波募集到梗死組織的細(xì)胞中。募集到梗死組 織的第二波炎性細(xì)胞主要由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞組成。在這些當(dāng)中，巨噬細(xì) 胞是MMP-9分泌的主要貢獻(xiàn)者。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在梗死心肌中的募集 和活化已表明主要促進(jìn)MI后所發(fā)生的過(guò)程。這些細(xì)胞沿趨化因子單核細(xì) 胞趨化蛋白(MCP)-1的梯度遷移，所述趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1與其 在細(xì)胞表面表達(dá)的受體CC趨化因子受體-2 (CCR2)結(jié)合。
只是在最近才認(rèn)識(shí)到巨噬細(xì)胞在心臟重建過(guò)程中起著重要作用。這是 通過(guò)這樣的事實(shí)表明的，即在MI后的心臟中和在衰竭的人類(lèi)和動(dòng)物心臟 中MCP-1表達(dá)和巨噬細(xì)胞滲入心肌增加。已知MCP-1介導(dǎo)募集巨噬細(xì)胞 進(jìn)入心肌組織。此外，轉(zhuǎn)基因心臟過(guò)表達(dá)MCP-1引起心臟重建和心力衰 竭。然而另一方面，在MI鼠科模型中，已表明MCP-1信號(hào)傳導(dǎo)的抑制減 輕進(jìn)行性心臟機(jī)能障礙。
心血管系統(tǒng)的細(xì)胞在應(yīng)激和損傷條件下，生成腺苷(ado卜嘌呤核苷。 長(zhǎng)久以來(lái)認(rèn)為腺苷在心肌局部缺血(ischaemia)的背景中是心臟保護(hù)的。迄今為止，已經(jīng)表征了四個(gè)腺苷受體亞型Al、 A2a、 A2b、和A3。所有
四個(gè)亞型似乎都在心血管系統(tǒng)內(nèi)部表達(dá)。局部缺血期間釋放的腺苷引起心 肌細(xì)胞中的有效預(yù)先調(diào)節(jié)。
腺苷A2a受體參與主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈的血管舒張。20世紀(jì)60年代后 期和70年代，腺苷A2激動(dòng)劑在臨床上作為抗高血壓劑進(jìn)行測(cè)試，但是由 于體內(nèi)選擇性差而放棄。在血小板中，已經(jīng)表明腺苷A2激動(dòng)劑通過(guò)增加 細(xì)胞內(nèi)cAMP水平而抑制血小板聚集。也開(kāi)發(fā)了腺苷A2激動(dòng)劑以用于心 肌應(yīng)激成像，從而通過(guò)在不能在自行車(chē)或踏車(chē)上鍛煉的患者中實(shí)現(xiàn)血管舒 張而評(píng)估冠狀動(dòng)脈疾病。Regadenoson(CVT-3146)，即一種選擇性腺苷A2 激動(dòng)劑，目前正在關(guān)于心肌灌流成像的III期研究中進(jìn)行評(píng)估。
已經(jīng)表明腺苷A2a激動(dòng)劑在若干組織中減輕炎癥和再灌流損傷。腺苷 A2a受體在幾乎所有的免疫細(xì)胞，包括嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)， 且該受體巳被稱(chēng)為"炎癥制動(dòng)器(brakeforinflammation)"。的確，腺苷A2a 敲除小鼠顯示該受體對(duì)限制炎癥是必要的。我們以前已顯示腺苷A2a受體 激動(dòng)劑抑制心肌細(xì)胞中TNF-a的產(chǎn)生。當(dāng)前正在針對(duì)治療膿毒、炎性腸疾 病和傷口愈合，評(píng)估腺苷A2A激動(dòng)劑。由于腺苷A2a受體和多巴胺D受 體之間的相互作用，當(dāng)前正在帕金森氏病中評(píng)估腺苷A2a拮抗劑。已顯示 出腺苷A2b受體激動(dòng)劑抑制心成纖維細(xì)胞和促進(jìn)血管發(fā)生。
在動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)中都已報(bào)道了腺苷或腺苷類(lèi)似物的治療潛力。 在動(dòng)物中，在關(guān)于局部缺血-再灌流的潛在治療作用的三個(gè)期限治療前、 局部缺血期間或再灌流期間過(guò)程中，存在腺苷的心臟保護(hù)活性。首先假設(shè) 參與的受體類(lèi)型之間的二分法(dichotomy)，將A1受體提議為在治療前 期間和局部缺血期間，主要通過(guò)代謝變化，介導(dǎo)腺苷的心臟保護(hù)作用，且 A2受體在再灌流期間內(nèi)是有益的，主要是通過(guò)抑制嗜中性粒細(xì)胞活性。 我們以前的數(shù)據(jù)支持A2a受體參與缺血性損傷后的期間內(nèi)由腺苷提供的 保護(hù)，這是通過(guò)抑制嗜中性粒細(xì)胞釋放MMP-9實(shí)現(xiàn)的(Emens等，"腺 苷抑制嗜中性粒細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9: A2a受體和cAMP/PKA/Ca2+ 途徑的意義"("Adenosine inhibits matrix metal loproteinase-9 secretion byneutrophils: implication of A2a receptor and cAMP/PKA/Ca2+ pathway.") 循環(huán)研究(CircRes.) 2006;99(6):590-597,引入本文作為參考)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在局部缺血之前或局部缺血期間內(nèi)腺苷A3受體活化的心臟保護(hù)作用，這是通過(guò)嗜中性粒細(xì)胞-依賴(lài)性以及嗜中性粒細(xì)胞-非依賴(lài)性機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。
少數(shù)臨床試驗(yàn)測(cè)試了腺苷(ado)在MI背景中的治療潛力。當(dāng)與利多卡因或初期血管成形術(shù)組合添加時(shí)，腺苷改善了MI患者的心臟功能。然而，這些試驗(yàn)盡管報(bào)告了有益的臨床結(jié)果，但是僅對(duì)少量患者進(jìn)行了實(shí)施。對(duì)較大樣本尺寸(分別是236和2,118名患者)實(shí)施的AMISTAD I和II試驗(yàn)證
明了腺苷作為再灌流治療的輔助劑在梗死后早期添加時(shí)減小梗死的尺寸。AMISTAD-II試驗(yàn)的事后檢定(post-hoc)分析揭示腺苷只有在梗死后3小時(shí)內(nèi)添加時(shí)降低死亡率。值得注意的是，在這個(gè)試驗(yàn)中，腺苷在MI后的施用超過(guò)48小時(shí)。
因此，在這個(gè)領(lǐng)域中需要關(guān)于充血性心力衰竭的其他治療，尤其著眼于針對(duì)這些經(jīng)常致命的心臟病癥或疾病，改善生存率和減小惡化心力衰竭的發(fā)展。
存在大量關(guān)于腺苷或腺苷受體激動(dòng)劑用途的主題的現(xiàn)有技術(shù)。例如，我們?cè)贓mens等中顯示腺苷通過(guò)A2a受體減少嗜中性粒細(xì)胞中的MMP-9分泌。因此，該技術(shù)指明腺苷在很多，如果不是全部，心力衰竭病情中的用途。
然而，令人驚訝的是我們現(xiàn)在已顯示出腺苷可以刺激和抑制MMP-9釋放，這取決于細(xì)胞類(lèi)型和參與的受體類(lèi)型。事實(shí)上，與以前的技術(shù)包括我們自己的發(fā)現(xiàn)相反，我們發(fā)現(xiàn)腺苷實(shí)際上通過(guò)腺苷A3受體來(lái)誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌MMP-9。
發(fā)明概述
因此，在第一方面，本發(fā)明提供了腺苷A3受體拮抗劑在治療或預(yù)防與充血性心力衰竭相關(guān)的疾病或病癥中的用途。
7優(yōu)選，腺苷A3受體拮抗劑用于治療心肌梗死或心力衰竭(包括急性心 力衰竭或慢性心力衰竭)的患者。還優(yōu)選地，使用腺苷A3受體拮抗劑降低 心肌梗死或心力衰竭的患者中基質(zhì)金屬蛋白酶的水平。
優(yōu)選，腺苷A3受體拮抗劑用于預(yù)防心肌梗死后心室重建和心力衰竭的 發(fā)展。特別地，這將預(yù)防或降低心肌的不適應(yīng)性(maladaptive)重建。這 可以包括纖維質(zhì)生成、程序性細(xì)胞死亡和壞死。
優(yōu)選，腺苷A3受體拮抗劑是多肽或蛋白，或編碼它的多核苷酸，所述 多核苷酸優(yōu)選處于具有與該多核苷酸可操作連接的合適啟動(dòng)子的載體中 施用。
腺苷A3受體拮抗劑優(yōu)選是核苷，但也可以是非-核苷抑制劑。腺苷A3 受體拮抗劑的合適實(shí)例是MRS 1067、 MRS 1097、 L-249313、 L-268605、 CGS15943、 KF26777。特別優(yōu)選的是MRS1220、 MRS1523、 PSBIO。 MRS1220、 MRS1523可以商購(gòu)自西格瑪-奧爾德里奇(Sigma-Aldrich)。 PSB10可以商購(gòu)自Tocris。
還優(yōu)選地，具有效應(yīng)子功能的其他藥物活性成分或多肽或多核苷酸可 以與腺苷A3受體拮抗劑一起施用。這些優(yōu)選地是其他腺苷激動(dòng)劑或拮抗 劑，且最優(yōu)選地，腺苷A2a受體激動(dòng)劑。
優(yōu)選，腺苷A3受體拮抗劑還具有其他腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑活性。特別 優(yōu)選的是具有A3受體拮抗劑活性和A2a受體激動(dòng)劑活性二者的分子，例 如(211,311，48,511)-2-(6-氨基-2-{[(18)-2-羥基-1 -(苯甲基)乙基]氨基}-9&嘌 呤-9-基)-5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)四氫-3，4-呋喃二醇。
編碼腺苷A3受體的核苷酸序列優(yōu)選是NO 1給出的序列，但可以或可 以不包括例如聚腺苷酸尾。蛋白序列優(yōu)選是SEQIDN0 2提供的序列，盡 管可以預(yù)期翻譯后修飾，尤其是除去N-端Met。
優(yōu)選地，腺苷A3受體拮抗劑能夠降低血液或心臟組織中，尤其是在心 臟內(nèi)部或周?chē)?，和尤其是任何梗死或局部缺血組織周?chē)腗MP水平。該 水平可以通過(guò)降低腺苷A3受體表達(dá)或通過(guò)與其結(jié)合，優(yōu)選以非-永久性競(jìng)
8爭(zhēng)方式來(lái)降低，從而暫時(shí)阻斷腺苷或腺苷類(lèi)似物或腺苷激動(dòng)劑與其結(jié)合的 能力，和由此刺激腺苷A3受體啟動(dòng)從細(xì)胞釋放或優(yōu)選分泌MMP。因此，
預(yù)期腺苷A3受體拮抗劑優(yōu)選能夠減少?gòu)募?xì)胞分泌MMP。所述細(xì)胞優(yōu)選是 單核細(xì)胞和最優(yōu)選是巨噬細(xì)胞，盡管在特殊的實(shí)施方案中也預(yù)期攜帶腺苷 A3受體的其他細(xì)胞。
A3拮抗劑優(yōu)選是選擇性的。甚至更優(yōu)選地，該拮抗劑特異于A3受體。 可以認(rèn)為化合物或分子是A3受體位點(diǎn)的特異性或至少選擇性拮抗劑，條 件是該化合物以高于腺苷的親和力，優(yōu)選以腺苷的至少5倍和更優(yōu)選至少 10倍的親和力結(jié)合A3受體。
A3拮抗劑的作用優(yōu)逸是可逆的，不是不可逆的。該拮抗劑可以是不可 逆的，但是這在臨床上背景中不是優(yōu)選的，因?yàn)檫@可以導(dǎo)致A3受體的永 久抑制，和由此永久抑制患者中MMP (尤其是MMP-9)水平。
上述內(nèi)容也針對(duì)另外提供的激動(dòng)劑或拮抗劑，它們也可以是選擇性或 特異性的，并且也可以是優(yōu)選可逆的。
MMP最優(yōu)選是MMP-9，盡管在備選實(shí)施方案中預(yù)期其他MMPs。 MMP-9優(yōu)選具有SEQ ID NO 3顯示的蛋白序列，盡管可以預(yù)期翻譯后修 飾，尤其是除去N-端Met。
本發(fā)明還提供了反義多核苷酸的用途，具體地，反義RNA，例如干擾 RNA (RNAi)，包括微小RNA (miR或miRNA)或小干擾RNA (siRNA)及其 他基因抑制的形式，它們耙向腺苷A3受體(A3 AR)或能夠降低其水平或表 達(dá)。當(dāng)使用A3AR拮抗劑或反義多核苷酸時(shí)，作用是降低由腺苷A3受體 介導(dǎo)的腺苷-刺激的應(yīng)答。
優(yōu)選，反義多核苷酸靶向腺苷A3受體的序列。該受體的序列優(yōu)選是 SEQIDNOl中顯示的序列。在微小RNA的情形中，反義多核苷酸優(yōu)選 耙向腺苷A3受體的3' UTR。關(guān)于反義多核苷酸的優(yōu)選靶序列在SEQ ID NOS6、 7或8中的任一項(xiàng)中給出，SEQIDN0 8是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗?是A3受體序列。反義多核苷酸施用、引入或體內(nèi)表達(dá)的合適方法是本領(lǐng)域公知的，但 可以包括直接施用反義多核苷酸或通過(guò)合適的載體表達(dá)反義多核苷酸。
如上，施用可以通過(guò)口服，經(jīng)粘膜，經(jīng)皮，例如通過(guò)合適的貼劑或基 因-槍?zhuān)は拢?nèi)或靜脈內(nèi)。
還提供了治療心力衰竭或與其相關(guān)病癥患者的方法，所述方法包括將
腺苷A3受體拮抗劑施用于所述患者。優(yōu)選，腺苷A2a受體激動(dòng)劑也可以 與腺苷A3受體拮抗劑同時(shí)或在其之后，但優(yōu)選在其之前施用。編碼腺苷 A2a受體的核苷酸序列優(yōu)選是N0 3提供的序列，但可以或可以不包括例 如聚腺苷酸尾。蛋白序列優(yōu)選是SEQIDN0 4提供的序列，盡管可以預(yù)期 翻譯后修飾，尤其是除去N-端Met。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示如通過(guò)條件培養(yǎng)基中的ELISA或通過(guò)細(xì)胞中的定量PCR評(píng)估 地，腺苷增加原代人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9。
圖2顯示腺苷劑量-和時(shí)間-依賴(lài)性地增加THP-l-來(lái)源的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 MMP-9。
圖3顯示腺苷通過(guò)其A3受體增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9。
圖4顯示腺苷-介導(dǎo)的MMP-9產(chǎn)量增加促進(jìn)單核細(xì)胞通過(guò)明膠基質(zhì)遷移。
發(fā)明簡(jiǎn)述
A3介導(dǎo)的保護(hù)似乎是劑量依賴(lài)性的，因?yàn)橹卸冗^(guò)表達(dá)A3的小鼠部分 地受到保護(hù)免受缺血性損傷，而高度過(guò)表達(dá)A3受體的小鼠發(fā)展為擴(kuò)張性 心肌病。這與我們的觀察，即A3受體刺激與MMP-9分泌和巨噬細(xì)胞遷
移有關(guān)相一致。
腺苷阻止嗜中性粒細(xì)胞釋放MMP-9，而提高巨噬細(xì)胞分泌MM-9的事 實(shí)具有若干解釋和生物學(xué)意義。嗜中性粒細(xì)胞在MI后早期(<2天)募集到梗死區(qū)域，而巨噬細(xì)胞在MI后2-4天侵入病灶。負(fù)責(zé)這兩種細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)
生MMP-9的機(jī)制從根本上不同。
嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)脫粒迅速釋放大量MMP-9。相反，在8小時(shí)前檢測(cè) 不到巨噬細(xì)胞分泌MMP-9，這與從頭蛋白合成相一致。我們以前證明了 在嗜中性粒細(xì)胞中，腺苷通過(guò)A2a受體發(fā)信號(hào)，從而減少M(fèi)MP-9分泌， 且該機(jī)制包括伴隨快速Ca轉(zhuǎn)移的迅速信號(hào)級(jí)聯(lián)放大(參見(jiàn)Emens等，上 述)。相反，我們現(xiàn)在顯示巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9的增加是通過(guò)A3受體活 化介導(dǎo)的并且包括轉(zhuǎn)錄作用。因此，腺苷對(duì)炎性細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9的作用 高度依賴(lài)于腺苷受體的類(lèi)型和被激活的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
腺苷在治療多種心臟問(wèn)題包括梗死和局部缺血中的用途是公知的。實(shí) 際上，本發(fā)明人已經(jīng)在2006年8月發(fā)表了一篇論文(Emens等)，其顯示腺 苷通過(guò)A2a受體減少嗜中性粒細(xì)胞釋放MMP-9。然而，他們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)腺 苷還通過(guò)A3受體誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌MMP-9。換句話說(shuō)，當(dāng)攜 帶A2a受體的嗜中性粒細(xì)胞存在時(shí)，腺苷降低MMP-9水平(例如在梗死后 的極早期)。然而， 一段時(shí)間后，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在梗死組織處出現(xiàn)， 且這些細(xì)胞攜帶A3受體?，F(xiàn)在已經(jīng)顯示，在A3受體存在下，腺苷增高 MMP-9水平。因此，在不同受體存在下，施用腺苷對(duì)MMP-9水平具有不 同的影響。
我們證明了腺苷在梗死和重建背景中不必然是有益的。這與當(dāng)前的范 例，即腺苷是報(bào)復(fù)性(retaliatory)代謝物，和腺苷在應(yīng)激過(guò)程中是保護(hù)性 的完全矛盾。腺苷對(duì)MMP-9的作用在嗜中性粒細(xì)胞中(抑制)通過(guò)腺苷A2a 受體和在巨噬細(xì)胞中(刺激)通過(guò)腺苷A3受體介導(dǎo)。迄今為止，己知腺苷 A2a受體抑制若干免疫過(guò)程，包括多形核白細(xì)胞的脫粒、氧自由基和TNF-(x 的產(chǎn)生。因此，腺苷已被認(rèn)為是可以限制器官由炎癥引起損害的生理學(xué)制 動(dòng)器。
我們的結(jié)果首次揭示了腺苷A3受體可引起心肌重建。因此在腺苷和應(yīng) 激，MMPs和促炎細(xì)胞因子之間存在緊密聯(lián)系，這可能代表心肌衰竭中涉 及的惡性循環(huán)。
ii因此，我們提出了通過(guò)抑制A3受體來(lái)預(yù)防和治療與充血性心力衰竭相
關(guān)的病癥或疾病，包括心肌梗死的全新方法。因此腺苷A3拮抗劑可以有 效用于急性MI和心力衰竭患者，以抑制MMPs釋放，尤其是由單核細(xì)胞 和巨噬細(xì)胞釋放的。而且，由于巨噬細(xì)胞釋放MMP-9是急性心肌梗死和 心力衰竭中左心室重建的驅(qū)動(dòng)力，因此我們推論腺苷A3拮抗劑可以有助 于預(yù)防左心室重建。
這與本領(lǐng)域以前采用的方法完全相反。例如Liang等(US6，211， 165 Bl) 公開(kāi)了腺苷A2a受體拮抗劑和腺苷A3受體激動(dòng)劑，其是與按照本發(fā)明實(shí) 施方案的激動(dòng)劑和拮抗劑的相反排列。
還預(yù)期本發(fā)明可與其他治療組合使用。這些可以是適合于施用于患者 以治療他們的病癥的其他藥物或活性成分。然而，特別優(yōu)選地，另外的治 療包括或基于使用其他腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑。例如，腺苷A3拮抗劑連同 腺苷A2a激動(dòng)劑也可以對(duì)急性MI和心力衰竭患者有效，從而有效抑制嗜 中性粒細(xì)胞(A2a)和巨噬細(xì)胞(A3)釋放MMPs。類(lèi)似地，腺苷A3拮抗劑與 腺苷A2a激動(dòng)劑的組合可以有助于預(yù)防左心室重建。這與當(dāng)前的理念完全 相反。
因此，由腺苷激動(dòng)劑或腺苷類(lèi)似物刺激腺苷A2a受體是特別優(yōu)選的。 關(guān)于A2a受體的合適腺苷激動(dòng)劑或腺苷類(lèi)似物是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選，這 些包括A2a激動(dòng)劑Regadenoson(CVT-3146)、 CGS 21680、 APEC禾口 2HE-NECA。也可以使用腺苷。
盡管不是優(yōu)選的，但是如果除A3激動(dòng)劑外還需要或?yàn)榱穗S后施用，合 適的其他A3激動(dòng)劑是IB-MECA。盡管也不是優(yōu)選，但是合適的A2a拮 抗劑是SCH58261。
盡管特別優(yōu)選腺苷A2a受體激動(dòng)劑與本發(fā)明的腺苷A3受體拮抗劑組 合使用，但是預(yù)期也可以使用其他腺苷受體激動(dòng)劑或拮抗劑。
12因此，優(yōu)選另外的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑與本發(fā)明的腺苷A3受體拮抗劑 一起使用。優(yōu)選，這是另外的腺苷激動(dòng)劑，其可以是腺苷本身或其類(lèi)似物。 備選地，可以使用另外的腺苷拮抗劑。
另外的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑可以靶向不同的腺苷受體，或在其誘導(dǎo)的 強(qiáng)度和應(yīng)答時(shí)間方面可以具有不同的活性。例如，另外的腺苷激動(dòng)劑或拮 抗劑可以以不同的速度從血液中清除，或也可以具有可以對(duì)患者有益的另
外的治療作用。優(yōu)選，所述受體是A1受體，更優(yōu)選A2受體，其中A2a 受體是特別優(yōu)選的。A2b受體不甚優(yōu)選，因?yàn)樗鼘?duì)腺苷具有比其他的受體 低的親和力，但是可以不使用腺苷或的時(shí)受到靶向。A3受體也可以受到 另一種A3拮抗劑靶向。
合適的腺苷受體激動(dòng)劑或拮抗劑是本領(lǐng)域己知的，且一些實(shí)例記述在 本文中。
所述由另外的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑引起的刺激可以與腺苷A3受體抑 制是同時(shí)或相伴的，或可以在不同的時(shí)間。例如，可以首先施用腺苷A3 受體拮抗劑，隨后施用另外的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑。
然而，優(yōu)選在任何梗死的8小時(shí)內(nèi)施用腺苷A2a受體激動(dòng)劑，因?yàn)檎J(rèn) 為攜帶A3受體的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通常在經(jīng)過(guò)接近該時(shí)間量前不能到 達(dá)梗死組織，盡管這將改變或?qū)⑿枰_估計(jì)梗死時(shí)間。
這可以意味著腺苷A2a受體激動(dòng)劑在腺苷A3受體拮抗劑之前施用。 備選地，它們可以在大約相同的時(shí)間施用。
還特別優(yōu)選地，由同一化合物提供腺苷A3受體拮抗劑活性和任何另外 的激動(dòng)劑或拮抗劑活性。備選地，由相連或綴合的化合物提供腺苷A3受 體拮抗劑活性和任何另外的激動(dòng)劑或拮抗劑活性，其中所述相連或綴合的 化合物的一個(gè)或多個(gè)部分具有腺苷A3受體拮抗劑活性，而另一部分具有 另外的激動(dòng)劑或拮抗劑活性。換句話說(shuō)，這可以是連接在一起的兩種正常 分開(kāi)或不同的分子，或者這可以由單分子提供。后者的優(yōu)選實(shí)例是具有A3受體拮抗劑活性和A2a受體激動(dòng)劑活性二 者的分子。特別優(yōu)選的是來(lái)自GlaxoSmithKline的(2R,3R，4S,5R)-2-(6-氨基 -2-{[(18)-2-羥基-1-(苯甲基)乙基]氨基}-附-嘌呤-9-基)-5-(2-乙基-2^四唑 -5-基)四氫-3，4-呋喃二醇，發(fā)表于2007年6月(歐洲藥理學(xué)雜志(EurJ Pharmacol.) 2007年6月14日；564(1-3):219-25. (2R,3R，4S,5R)-2-(6-氨基 -2-U(lS)-2-羥基-l-(苯甲基)乙萄氨基)-9H-嘌呤力-基"-P-乙基-m-四唑 -5-基)四氫-3,4-呋喃二醇，即證明腺苷A (2A)受體激動(dòng)劑和腺苷A (3) 受體拮抗劑話性的新型配體的藥理學(xué)特征和抑制作用(Pharmacological characterisation and inhibitory effects of
(2R，3R,4S,5R)-2-(6-amino-2- {[(1 S)-2-hydroxy-1 -(phenylmethyl)ethyl] amino} -9H-purin-9-yl)-5-(2-ethyl-2H-tetrazol-5-yl)tetrahydro-3,4-furandiol， a novel ligand that demonstrates both adenosine A(2A)receptor agonist and adenosine A(3)receptor antagonist activity) . Bevan N， Butchers PR, Cousins R, Coates J, Edgar EV, Morrison V, Sheehan MJ, Reeves J, Wilson DJ)。這篇論文關(guān)注該 分子與嗜中性粒細(xì)胞有關(guān)的A2a激動(dòng)劑活性。提到A3拮抗劑活性涉及抑 制由嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)氧種類(lèi)，但是嗜酸性粒細(xì)胞不是心臟對(duì)局部缺 血的病理生理應(yīng)答的一部分，因此不直接參與心力衰竭的發(fā)展。
A2a和A3受體二者的核苷酸和蛋白序列優(yōu)選是以NCBI登記號(hào) NM—000675 (A2a)和NM一000677 (A3)得到的序列。MMP-9蛋白序列優(yōu)選 是NCBI登記號(hào)NM—004994。
在提及腺苷A3拮抗劑時(shí)，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到這優(yōu)選地可以是一種A3拮抗劑， 或是至少一種A3拮抗劑(即2或更多種不同A3拮抗劑的混合物)。上述內(nèi) 容經(jīng)必要修正同樣適用于腺苷A2a激動(dòng)劑。
提及特殊序列也優(yōu)選包括具有一定程度序列同源性，同時(shí)仍然保持合 理程度的參考序列功能的變體。對(duì)于核苷酸序列，這優(yōu)選是與參考序列具 有至少70%的序列，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%， 更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99.5%， 和最優(yōu)選至少99.9%序列同源性的序列，視情況而定，其可以歸因于許多 錯(cuò)配、置換、插入或缺失。當(dāng)參考序列是DNA時(shí)，這包括相應(yīng)的RNA序列且反之亦然。實(shí)際上，能夠在高度嚴(yán)格條件下與參考序列結(jié)合的序列，
例如6XSSC，也是優(yōu)選的。術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)格條件下雜交"意指在如Sambrook， 等.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning: A laboratory manual)(1989)， 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),紐約，美國(guó) 中所述的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下，兩個(gè)寡核苷酸能夠彼此雜交。為了這個(gè)目的， 也可以使用例如普通的嚴(yán)格雜交條件(例如60DEGC， O.lxSSC， 0.1% SDS)。
在參考序列是多肽序列的情況下，變體序列優(yōu)選與參考序列具有至少 85%,更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少 99.5%，和最優(yōu)選至少99.9%序列同源性，視情況而定。
用于評(píng)估序列同源性的合適方法是本領(lǐng)域已知的，并包括BLAST程序。
提及治療或預(yù)防可以解釋為改善患者臨床結(jié)局。提及預(yù)防和治療與充 血性心力衰竭"相關(guān)"的病癥或疾病可以理解為包括直接引起或造成充血 性心力衰竭的疾病或病癥。本文中提供若干實(shí)例，諸如心肌梗死、急性冠 狀動(dòng)脈綜合癥、缺血性心肌病、非-缺血性心肌病，或急性或慢性心力衰竭 等等。
本發(fā)明還提供通過(guò)施用腺苷A3受體拮抗劑和任選另外的腺苷激動(dòng)劑 或腺苷拮抗劑治療心肌梗死或心力衰竭患者的方法。所述另外的腺苷激動(dòng) 劑或腺苷拮抗劑優(yōu)選是腺苷A2a受體激動(dòng)劑。
在又一方面，本發(fā)明提供抑制心室重建的方法。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于降低或減少患者心臟中MMP-9水平的 方法。在有關(guān)方面，本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防與較低MMP-9水平相 關(guān)的心力衰竭的方法。較低的MMP-9水平預(yù)示心肌梗死后較好的臨床結(jié) 局。本發(fā)明的這些方面可以?xún)?yōu)選通過(guò)施用腺苷A3受體拮抗劑和腺苷A2a 受體激動(dòng)劑抑制嗜中性粒細(xì)胞(通過(guò)A2a受體抑制)和巨噬細(xì)胞(通過(guò)A3受 體抑制)產(chǎn)生MMP-9而提供。還提供了預(yù)防與心肌梗死或急性心力衰竭有關(guān)的心肌組織降解的方 法，包括施用腺苷A3受體拮抗劑和任選另外的腺苷激動(dòng)劑或腺苷拮抗劑。
所述另外的腺苷激動(dòng)劑或腺苷拮抗劑優(yōu)選是腺苷A2a受體激動(dòng)劑。
這些方法允許治療新確診患者，從而改進(jìn)患者現(xiàn)有的治療策略，例如 心肌梗死后。
所述病癥優(yōu)選是心肌梗死、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、缺血性心肌病、非-缺血性心肌病、急性心力衰竭或充血性心力衰竭。
提及治療，適當(dāng)時(shí)，還包括預(yù)防。當(dāng)提及使用或施用具體的活性成分 時(shí)，其應(yīng)該處于治療有效量。
還提供預(yù)防與晚期(end-stage)心臟病相關(guān)的心肌組織降解的方法。
本發(fā)明還提供治療表現(xiàn)出充血性心力衰竭癥狀的患者的方法，包括施 用減少心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生的試劑。優(yōu)選，所述癥狀指示急性 心力衰竭，并且其中所述減少心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生的試劑由治 療有效的A3受體拮抗劑和任選A2a激動(dòng)劑組成。優(yōu)選，所述癥狀指示慢 性心力衰竭，并且其中所述減少心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生的試劑由 治療有效的A3受體拮抗劑和任選A2a激動(dòng)劑組成。
本文中引用的全部參考文獻(xiàn)由此引入作為參考?，F(xiàn)在將參考附圖和下 面的實(shí)施例中描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案。
實(shí)施例
介紹
基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，尤其是MMP-9，是非常重要的化合物，是降 解心肌胞外基質(zhì)背后的驅(qū)動(dòng)力。近來(lái)的研究已清楚地證明在心臟中，MMPs 促進(jìn)心室重建和心力衰竭。在臨床水平，最近被其他人證實(shí)的我們小組的 研究己表明血液MMPs水平升高與MI后心力衰竭的發(fā)展有關(guān)。嗜中性粒 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，至少部分地通過(guò)產(chǎn)生大量MMP-9，在引起心肌損傷和 纖維質(zhì)生成的炎性應(yīng)答中起著重要作用。核苷腺苷的心臟保護(hù)性性質(zhì)是已知的。它在心肌梗死和心力衰竭背景
中的潛在治療用途值得考慮。已經(jīng)表征了四種腺苷受體Al、 A2a、 A2b、 A3。我們以前已經(jīng)顯示腺苷通過(guò)其A2a受體抑制嗜中性粒細(xì)胞分泌 MMP-9(Emens等，上述)。我們現(xiàn)在己經(jīng)發(fā)現(xiàn)施用腺苷通過(guò)其A3受體增 加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9，這與我們以前在嗜中性粒細(xì)胞中得到的結(jié)果形 成鮮明的對(duì)照。
我們因此提出使用A3拮抗劑(抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9)治療心肌梗 死或心力衰竭患者的新治療策略。我們還提出A2a激動(dòng)劑(抑制嗜中性粒 細(xì)胞分泌MMP-9)和A3拮抗劑(抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9)的組合。
結(jié)果
1. 腺苷增加原代巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9
單核細(xì)胞通過(guò)陰性選擇從獲自健康志愿者的PBMCs中分離，并通過(guò) M-CSF按照巨噬細(xì)胞譜系分化。使用ELISA(圖1A)和定量PCR(圖1B)， 我們?cè)谔砑酉佘者B同腺苷脫氨酶抑制劑EHNA(其減少腺苷降解)的條件 下，檢測(cè)到MMP-9分泌中等但顯著的增加。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到LPS活化時(shí)， 再現(xiàn)該作用。通過(guò)明膠酶譜法(zymography)，我們觀察到巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 兩種形式的MMP-9: pro-MMP-9同型二聚體和pro-MMP-9。與嗜中性粒 細(xì)胞相反，在巨噬細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到MMP-9-脂籠蛋白復(fù)合物。此外，通 過(guò)酶譜法沒(méi)有檢測(cè)到MMP-9和MMP-2的活性形式(未顯示)。
2. 腺苷增加THP-l-來(lái)源的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9
已經(jīng)證明腺苷一貫增加原代巨噬細(xì)胞分泌MMP-9，我們探究了在由單 核細(xì)胞系THP-1分化的巨噬細(xì)胞中負(fù)責(zé)該作用的機(jī)制。用濃度不斷增加的 Ado禾a 10jaMEHNA溫育細(xì)胞15分鐘，之后用150nMPMA分化48小時(shí)。 腺苷以濃度依賴(lài)性方式增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9，在100pM Ado時(shí)增加 達(dá)到3倍(圖2A下圖)。在另外的實(shí)驗(yàn)中使用lOiaMAdo和10pMEHNA的 濃度。考慮到在病癥如心力衰竭和膿毒中體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Ado濃度是微摩爾范 圍，因此我們的結(jié)果提示在此報(bào)告的作用具有生物學(xué)相關(guān)性。
173. 內(nèi)源和外源Ado都提高M(jìn)MP-9分泌
為表征內(nèi)源和外源Ado在MMP-9產(chǎn)生中的相對(duì)貢獻(xiàn)，我們使用了若 干Ado代謝的調(diào)節(jié)劑。當(dāng)單獨(dú)添加時(shí)，Ado、通過(guò)抑制Ado脫氨酶提高內(nèi) 源Ado濃度的EHNA，和抑制Ado運(yùn)輸?shù)腄IP，全部觸發(fā)MMP-9分泌。 Ado和EHNA的作用是疊加的，因?yàn)閮煞N藥物組合引起的MMP-9分泌比 每個(gè)物質(zhì)單獨(dú)使用更高(圖2B)。這些數(shù)據(jù)顯示內(nèi)源和外源Ado都刺激 MMP-9分泌，而且它們的作用是疊加的。
4. 腺苷增加MMP-9 mRNA表達(dá)
為研究提高M(jìn)MP-9的分泌中涉及的機(jī)制，我們實(shí)施了時(shí)間-進(jìn)程實(shí)驗(yàn)。 至少18小時(shí)的溫育期是重現(xiàn)Ado對(duì)MMP-9的作用所必需的(圖2C)。使 用定量PCR，我們觀察到Ado誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中MMP-9 mRNA表達(dá)增 加多于兩倍，這比原代巨噬細(xì)胞中稍有增加(圖2D)?？偟恼f(shuō)來(lái)，這些觀察 提示Ado引起的MMP-9分泌的增加是通過(guò)轉(zhuǎn)錄機(jī)制發(fā)生的，這與在嗜中 性粒細(xì)胞中確定的負(fù)責(zé)MMP-9的高度和快速釋放的脫粒作用相反。
5. 腺苷通過(guò)其A3受體增加MMP-9產(chǎn)生
為了探索哪種類(lèi)型的受體介導(dǎo)Ado對(duì)MMP-9分泌的作用，我們使用 了藥理學(xué)和分子方法。首先，我們確定四種Ado受體中每一種由巨噬細(xì)胞 的相對(duì)表達(dá)。定量PCR顯示A2a型受體是巨噬細(xì)胞中Ado受體的主要形 式(圖3A)。在我們的實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)到Al受體mRNA。腺苷誘導(dǎo)A3和 A2b表達(dá)增加多于兩倍。在使用Ado受體激動(dòng)劑的實(shí)驗(yàn)中，為特別研究外 源Ado的作用，省略EHNA。圖3B顯示僅A3特異性激動(dòng)劑IB-MECA 能使MMP-9分泌增加到與Ado相同的程度。最后，采用使用特異于A2a、 A2b和A3受體的siRNA的基因組方法。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，我們通過(guò)定量PCR 檢查每種siRNA下調(diào)其耙受體表達(dá)而非其他Ado受體的表達(dá)(未顯示)。酶 譜法揭示僅A3特異性siRNA能夠顯著抑制Ado-介導(dǎo)的MMP-9分泌增加 (圖3C)?？傮w來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果顯示A3受體介導(dǎo)Ado對(duì)MMP-9分泌的作 用。6.腺苷提高單核細(xì)胞遷移能力
單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞滲入心肌是MI后心室重建的標(biāo)志。MMP-9引起的 ECM降解促進(jìn)細(xì)胞遷移。因此我們測(cè)試Ado引起的MMP-9分泌增加是否 能夠改進(jìn)單核細(xì)胞沿MCP-1梯度遷移。為了這個(gè)目的，改進(jìn)的Boyden室 頂端包被明膠B并在底室添加MCP-1。在接種到室微孔膜上之前，用Ado 處理單核細(xì)胞。如圖4所示，Ado增加細(xì)胞通過(guò)明膠層遷移。合成MMP 抑制劑GM6001和內(nèi)源MMP-9抑制劑TIMP-1抑制該作用(圖4)?？傊?， 這些結(jié)果證明Ado通過(guò)增加MMP-9活性而提高單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞遷移。
圖例
圖1.腺苷增加原代巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9。通過(guò)陰性選擇從健康志愿者 PBMCs分離的單核細(xì)胞在使用50 ng/ml M-CSF條件下分化7天。巨噬細(xì) 胞與Ado和EHNA (各10nmol/L)或載體溫育15分鐘，然后添加LPS (100 ng/ml)或載體，并在收獲前再溫育細(xì)胞24小時(shí)。A. ELISA測(cè)定的細(xì)胞上 清液中MMP-9分泌受到Ado顯著增加，無(wú)論是否用LPS處理巨噬細(xì)胞。 B.定量PCR揭示Ado也增加MMP-9 mRNA表達(dá)。結(jié)果是平均值土 SD (對(duì) 于A， n=12，對(duì)于B， n = 8)。承PO.05對(duì)比對(duì)照(用Ado/EHNA載體處 理的巨噬細(xì)胞)，** PO.01對(duì)比LPS。
圖2.腺苷增加THP-l-來(lái)源的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9。用Ado和10nM EHNA或載體處理THP-1細(xì)胞15分鐘，之后使用150nMPMA， 48小時(shí)， 使其分化為巨噬細(xì)胞。使用抑制Ado脫氨酶的EHNA，和抑制Ado運(yùn)輸 的DIP提高內(nèi)源Ado濃度。在無(wú)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，用酶譜法和光密度測(cè) 定法測(cè)量明膠酶活性。A.顯示了代表性的酶譜。光密度測(cè)定分析揭示Ado 濃度依賴(lài)性地增加巨噬細(xì)胞分泌MMP-9。 B.酶譜法表明內(nèi)源和外源Ado 都提高M(jìn)MP-9分泌。單獨(dú)Ado和EHNA觸發(fā)MMP-9分泌并且它們的作 用是疊加的。DIP也增加MMP-9分泌。C.時(shí)間-進(jìn)程實(shí)驗(yàn)。通過(guò)酶譜法測(cè) 量培養(yǎng)基中的MMP-9釋放揭示18小時(shí)的分化期是觸發(fā)MMP-9分泌所必 需的，而且也從18小時(shí)起觀察到Ado的作用。D. MMP-9增加涉及轉(zhuǎn)錄 機(jī)制。定量PCR顯示Ado在分化48小時(shí)后增加MMP-9 mRNA表達(dá)。結(jié)
19果是平均值士 SD (對(duì)于A和B，n = 4，對(duì)于C，n = 1 ，對(duì)于D，n = 6)。* PO.05 對(duì)比對(duì)照(用Ado/EHNA載體處理的巨噬細(xì)胞)，** P<0.01對(duì)比對(duì)照。
圖3.腺苷通過(guò)其A3受體增加MMP-9產(chǎn)生。A.用10pM Ado和lO(iM EHNA或載體處理THP-1細(xì)胞15分鐘，之后使用150nMPMA， 48小時(shí)， 使其分化為巨噬細(xì)胞。定量PCR揭示A2a和A2b是巨噬細(xì)胞中Ado受體 的主要形式。腺苷誘導(dǎo)A3和A2b表達(dá)增加多于兩倍。結(jié)果是平均值iSD (n = 6)。* P<0.05對(duì)比對(duì)照(用Ado/EHNA載體處理的巨噬細(xì)胞)。B.用0.1、 1或10pMAdo受體激動(dòng)劑(CPA， Al-特異性的;CGS21680， A2a-特異性 的；IB-MECA， A3-特異性的)處理THP-1細(xì)胞15分鐘。隨后，用150nM PMA48小時(shí)完成分化。在條件培養(yǎng)基中評(píng)估明膠酶活性。進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果相似。CA3-特異性siRNA抑制Ado-介導(dǎo)的MMP-9分泌增加。用特 異于A2a、 A2b或A3 Ado受體的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，溫育48小時(shí)以實(shí)現(xiàn) Ado受體表達(dá)的下調(diào)，用10nMAdo和10|iMEHNA或載體處理15分鐘， 之后使用150nMPMA， 48小時(shí)，使其分化為巨噬細(xì)胞。用明膠酶譜法分 析條件培養(yǎng)基。結(jié)果是平均值±SD(n = 3)。 ^PO.05對(duì)比Ado(用 Ado/EHNA處理巨噬細(xì)胞)。
圖4. Ado增加單核細(xì)胞遷移能力。在接種到由明膠B預(yù)-包被的改良 Boyden室的微孔膜上之前，用lO(iM Ado和lO(iM EHNA或載體處理 THP-1單核細(xì)胞24小時(shí)。底室添加10ng/mLMCP-l。當(dāng)指定時(shí)，在接種 到膜上之前，細(xì)胞與TIMP-1 (10 ng/mL)或GM6001 (10 nM或liiM)—起預(yù) 溫育。24小時(shí)后用熒光量化細(xì)胞遷移。Ado提高細(xì)胞遷移且TIMP-l或 GM6001部分地阻止該作用。結(jié)果是平均值士SD(n-5)。 * <0.05對(duì)比無(wú) Ado。
方法
材料.除非另外指明，全部材料和試劑來(lái)自西格瑪(Sigma) (Bomem， 比利時(shí))。Ado受體激動(dòng)劑是CPA(C8031， N6-環(huán)戊基Ado,Al特異性的)、 CGS21680 (C141， 2-[ 4-[(2-羧乙基)苯基]乙氨基]-5'-N-乙基氨基甲?；?A2a 特異性的)、IB-MECA, (l-脫氧-l-[ 6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-91"1-嘌呤-9-基]-N-甲基-Dribofiiranuronamide， A3特異性的)。小干擾RNAs (siRNAs)商購(gòu)自凱杰(Qiagen) (Hilden,德國(guó))。GM 6001 ((R)-N4-羥基-Nl-[ (S)-2-(lH陽(yáng)吲哚-3-基)-l-甲基氨基甲?；?乙基]-2-異丁基-琥珀酰胺)和重組人蛋白TEMP-1(R&D系統(tǒng)(R&D Systems)，阿賓登(Abingdon)，英國(guó))用作MMPs抑制齊U。巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(M-CSF)和MCP-l購(gòu)自Peprotech(Levallois-Peret,法國(guó))。使用的全部化學(xué)試劑的內(nèi)毒素污染低于鱟變形細(xì)胞溶解物測(cè)試的檢測(cè)極限(0.05EU/mL， E-Toxate⑧試劑盒，西格瑪(Sigma))。通過(guò)使用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(羅氏診斷學(xué)(Roche Diagnostics), Mannheim德國(guó))按照制造商指示測(cè)量胞質(zhì)酶乳酸脫氫酶的釋放來(lái)檢查各種處理的細(xì)胞毒性缺乏。
細(xì)胞培養(yǎng).除非另外指明，全部細(xì)胞培養(yǎng)試劑來(lái)自Lonza (Venders，比利時(shí))。外周靜脈血從健康志愿者獲得。外周血單核細(xì)胞通過(guò)Ficoll梯度獲得。使用單核細(xì)胞分離試劑盒n (Myltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach,德國(guó))，通過(guò)陰性選擇純化單核細(xì)胞。用50ng/mLM-CSF7天完成分化。巨噬細(xì)胞與Ado/EHNA(10iimol/L)或載體一起溫育15分鐘，然后添加LPS(100ng/ml)或載體，并且在收獲之前再溫育細(xì)胞24小時(shí)。來(lái)自單核細(xì)胞-樣品系THP-1的細(xì)胞(ATCC,LGCPromochem，特丁頓(Teddington),英國(guó))在增補(bǔ)了L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(IOO單位/ml)、鏈霉素(100嗎/ml)、非必需氨基酸溶液(1HM)、丙酮酸鈉(lmM)和10。/。熱失活胎牛血清(FCS)(Eurobio, Les Ulys,法國(guó))的RPMI 1640培養(yǎng)基中37°C-5% C02下增殖。為了實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基中FCS降至1%。用EHNA載體(DMSO)、Ado (O.Ol-lOO(aM)、Ado受體激動(dòng)劑(0.1-10iiM)、 EHNA (10(iM)或雙嘧達(dá)莫(DIP)(10iiM)處理細(xì)胞15分鐘。然后使用150nM乙酰肉豆蔻佛波醇(phorbol myristateacetate) (PMA)， 24小時(shí)，將細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。隨后LPS (1-1000ng/ml)、 fMLP (10—71^)或H2O2(10 mM)處理巨噬細(xì)胞另外24小時(shí)。
使用Nucleofection技術(shù)和Nucleofector 溶液V按照制造商指導(dǎo)完成轉(zhuǎn)染(Amaxa Inc.,科隆(Cologne),德國(guó))。Ado處理前四十八小時(shí)，用1.4pg特異于各種Ado受體的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
所選擇的Ado受體的靶mRNA序列如下siRNA A2a: 5'-CAGGAGTGTCCTGATGATTCA-3' (SEQ ID NO 6);
siRNA A2b: 5'-CACGTATCTAGCTAATATGTA-3' (SEQ ID NO 7);
siRNA A3: 5'-CCCTATCGTCTATGCCTATAA-3' (SEQ ID NO 8)。
細(xì)胞在TriReagent⑧中裂解以收獲RNA。收集無(wú)細(xì)胞條件培養(yǎng)基，與蛋白酶抑制劑(羅氏(Roche),曼海姆(Mannheim),德國(guó))和牛血清清蛋白(BSA， 0.2。/。終濃度)混合進(jìn)行另外的ELISA或酶譜法。全部樣品保存在-S(TC直到分析。
實(shí)時(shí)定量PCR.使用TriReagent⑧和Rneasy小試劑盒(RNeasy mini kit)(凱杰(Qiagen), Hilden，德國(guó))按照制造商指導(dǎo)分離總RNA。用DNA酶I處理(凱杰(Qiagen))消化潛在污染的基因組DNA。使用Superscript⑧H反轉(zhuǎn)錄酶(英杰(Invitrogen)，Merelbeke，比利時(shí))反轉(zhuǎn)錄1微克總RNA。使用Beacon Designer軟件(首要生物軟件(Premier Biosoft) ，PaloAlto，美國(guó))設(shè)計(jì)PCR引物并選擇包含內(nèi)含子。使用iCycler⑧和IQ SYBR GreenSupermix (Biorad, Nazareth,比利時(shí))實(shí)施PCR。使用1/10稀釋的cDNA。PCR條件如下95'C3分鐘，95°C 30秒鐘和退火1分鐘(40次循環(huán))。10秒鐘從55t:升至95t:的80次循環(huán)后得到解鏈溫度分析。每次運(yùn)行包括陰性反應(yīng)對(duì)照。選擇e-肌動(dòng)蛋白作為持家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用Genex軟件(Biorad， Nazareth,比利時(shí))用相對(duì)定量方法(AACt)計(jì)算表達(dá)水平，其考慮了引物配對(duì)效率。
明膠酶活性分析.對(duì)培養(yǎng)上清液實(shí)施明膠酶譜法，從而評(píng)估分泌的MMP-9活性。簡(jiǎn)言之，將條件培養(yǎng)基在非還原條件下加載到含0.2%明膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。電泳后，洗滌凝膠并在測(cè)定緩沖液(50mMTris-HCl, pH 7.6, 200 mM NaCl， 5 mM CaCl2,禾t1 0.02% Brij35)中37。C溫育過(guò)夜。隨后，凝膠在0.1%考馬斯藍(lán)中染色并在25%乙醇/8%乙酸中脫色。使用凝膠邏輯2200數(shù)字成像(Gel Logic 2200 Digital Imaging)系統(tǒng)和Aida軟件(柯達(dá)(Kodak), Zavemtem,比利時(shí))實(shí)現(xiàn)光密度測(cè)定法。ELISA.通過(guò)ELISA測(cè)定條件培養(yǎng)基中總MMP-9和TIMP-1濃度(R &D系統(tǒng)(R & D Systems), Abingdon,英國(guó))。檢測(cè)極限對(duì)MMP-9是0.156ng/mL和對(duì)TIMP-1是0.08 ng/mL。
遷移測(cè)定使用具有聚碳酸酯微孔膜(孔尺寸5fam， 24-孔室，Costar,Lowell,美國(guó))的Transwell⑧系統(tǒng)研究THP-l單核細(xì)胞的遷移能力。用2%明膠B溶液包被膜并允許在室溫下干燥2小時(shí)。底室中添加MCP-1 (10ng/mL)。在含有或不含有10|iM Ado和10)iMEHNA的無(wú)血清和無(wú)抗菌素培養(yǎng)基中培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞24小時(shí)。在以7.5xl0"個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種到上面的室之前，細(xì)胞與GM 6001 (10nM或lpM)或TIMP-1 (10 ng/mL)一起預(yù)-溫育30分鐘。24小時(shí)后，通過(guò)膜遷移的細(xì)胞被分離、裂解并通過(guò)CyQuant GR⑧染料(英杰(Invitrogen》染色15分鐘。用POLARstar Optima(BMG實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(BMG LABTECH)， Champigny-sur-Mame,法國(guó))微板讀數(shù)器(Xex:492 nm,Xem=520 nm)對(duì)熒光進(jìn)行讀數(shù)。
統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果以平均值士S.D表示。用配對(duì)t-檢驗(yàn)分析高斯分布的數(shù)據(jù)。Mann-Whitney (未配對(duì)數(shù)據(jù))或Wilcoxon (配對(duì)數(shù)據(jù))檢驗(yàn)用于非-高斯數(shù)據(jù)。認(rèn)為P值O.05是顯著的。
2權(quán)利要求
1.腺苷A3受體拮抗劑在治療或預(yù)防與充血性心力衰竭相關(guān)的疾病或病癥中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，用于治療心肌梗死或急性或慢性心力衰竭。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于降低心肌梗死或心力衰竭患者中基質(zhì) 金屬蛋白酶的水平。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于抑制心肌梗死后心室重建和心力衰竭 的發(fā)展。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的用途，用于抑制心肌的不適應(yīng)性重建。
6. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述腺苷a3受體拮抗劑選自 由下列各項(xiàng)組成的組mrs 1067、 mrs 1097、 l-249313、 l-268605、 cgs15943、 kf26777、 mrs 1220、 mrs 1523、 psbio。
7. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中施用另外的腺苷激動(dòng)劑或拮抗劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中另外施用腺苷A2a受體激動(dòng)劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中施用具有A3受體拮抗劑活性和A2a 受體激動(dòng)劑活性二者的分子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述分子是(2r，3r，4s,5r)-2-(6-氨基 -2-{[(18)-2-羥基-1-(苯甲基)乙基]氨基}-姐-嘌呤-9-基)-5-(2-乙基-211-四唑 -5-基)四氫-3,4-呋喃二醇。
11. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述腺苷a3受體的序列是 SEQIDNOl中給出的序列或與其具有至少75%序列同源性的變體，或在 6xSSC的高度嚴(yán)格條件下能夠與所述SEQ ID NO 1雜交的相應(yīng)序列。
12. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述腺苷A3受體拮抗劑能夠 降低血液中以及心臟內(nèi)部和周?chē)幕|(zhì)金屬蛋白酶(mmp)的水平。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述MMP是MMP-9和任選具有 seq ID N0 3顯示的蛋白序列。
14. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求的用途，其中所述a3拮抗劑是選擇性的。
15. 靶向腺苷A3受體(A3 AR)或能夠降低其表達(dá)水平的反義多核苷酸 和其他形式的基因抑制在治療或預(yù)防與充血性心力衰竭相關(guān)的疾病或病 癥中的用途。
16. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述腺苷A2a受體激動(dòng)劑是腺苷、腺苷激動(dòng)劑或腺苷類(lèi)似物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中所述A2a激動(dòng)劑是Regadenoson (CVT-3146)、 CGS 21680、 APEC或2HE-NECA。
18. —種治療患有心力衰竭或其相關(guān)病癥的患者的方法，包括將腺苷 A3受體拮抗劑施用于所述患者。
19. 一種治療心肌梗死或心力衰竭患者的方法，所述方法通過(guò)施用腺 苷A3受體拮抗劑和任選另外的腺苷激動(dòng)劑或腺苷拮抗實(shí)現(xiàn)。
20. —種用于降低或減少患者心臟中MMP-9水平或用于治療或預(yù)防 與較低MMP-9水平相關(guān)的心力衰竭的方法，所述方法通過(guò)施用腺苷A3 受體拮抗劑和腺苷A2a受體激動(dòng)劑實(shí)現(xiàn)。
21. —種預(yù)防與心肌梗死或急性心力衰竭有關(guān)的心肌組織降解的方 法，包括施用腺苷A3受體拮抗劑和任選另外的腺苷激動(dòng)劑或腺苷拮抗劑。
22. —種預(yù)防與晚期心臟病有關(guān)的心肌組織降解的方法，所述方法通 過(guò)施用腺苷A3受體拮抗劑和任選腺苷A2a受體激動(dòng)劑實(shí)現(xiàn)。
23. —種治療表現(xiàn)出充血性心力衰竭癥狀的患者的方法，包括施用減 少心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生的試劑，其中所述試劑是腺苷A3受體 拮抗劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求18或23的方法，其中所述病癥是心肌梗死、急性 冠狀動(dòng)脈綜合癥、缺血性心肌病、非-缺血性心肌病、或急性或慢性心力衰 竭。
25. 根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項(xiàng)的方法，其中還施用腺苷A2a受體 激動(dòng)劑。
全文摘要
提供了選擇性腺苷A3受體拮抗劑或針對(duì)所述受體的RNAi用于治療心肌梗死和心臟病癥，包括心力衰竭的用途。任選地，腺苷A2a受體激動(dòng)劑也可以與腺苷A3受體拮抗劑一起使用。還提供了用于治療心力衰竭的方法。
文檔編號(hào)A61K31/352GK101646434SQ200780049238
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月9日
發(fā)明者丹尼爾·R·瓦格納, 伊萬(wàn)·德沃 申請(qǐng)人:公共健康研究中心