專利名稱：：用作血管再形成刺激劑的細(xì)胞制備物的制作方法用作血管再形成刺激劑的細(xì)胞制備物本發(fā)明涉及細(xì)胞制備物和該細(xì)胞制備物作為刺激血管再形成(revascularization)的作用劑的用途。本文針對(duì)多種疾病，它們均為導(dǎo)致血管系統(tǒng)變性或破壞的疾病。特別是當(dāng)向組織或器官中的動(dòng)脈血供給減少或停止時(shí)會(huì)遭遇這樣的情況。細(xì)胞治療確切地是指降解組織(無論是何種組織)的再生，其基礎(chǔ)是體外培養(yǎng)或以其它方法培養(yǎng)特定細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞植入降解的組織。通過這些細(xì)胞治療的手段來治療多種疾病已經(jīng)取得了許多進(jìn)展。繁殖并分化生成特化細(xì)胞的能力，所述特化細(xì)胞可獲得它們所植入的組織的形態(tài)和特定功能。胚胎干細(xì)胞在受精之后的最初階段是未分化的，并且將能夠?qū)е滤猩眢w組織的形成。相反，成體干細(xì)胞已經(jīng)參與了特定的組織程序(tissueprogram),它們僅能夠?qū)е绿囟ńM織的形成或再生；它們被稱為是多能(multipotent)的，而胚胎干細(xì)胞是全能(totipotent)的。另外，通過干細(xì)胞分化而衍生的前體細(xì)胞在它們的發(fā)育過程中已經(jīng)得到了某種程度的特化并且具有生理學(xué)功能。由此，已經(jīng)有人提出了以來自骨骼肌的組織為基礎(chǔ)來制備多能干細(xì)胞群體的想法。具體可以參考文獻(xiàn)WO03/027281,其描述了一種制備這樣的多能干細(xì)胞的方法，所述多能干細(xì)胞能夠分化成骨骼肌細(xì)胞和許多其它的細(xì)胞，具體而言分化成平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。這種方法能夠以多種類型組織的再生為目的來制備多能千細(xì)胞群體，另一方面，其實(shí)施相對(duì)較復(fù)雜。另外，由于心肌(myocardium)的組織缺乏能夠形成心肌細(xì)胞來進(jìn)行再生的干細(xì)胞，已經(jīng)提出了這樣一種想法，制備相對(duì)同質(zhì)的細(xì)胞群體，群體中的優(yōu)勢類型具有成肌細(xì)胞(myoblasticcell)的特征，再將這些群體直接注射至心肌組織中或者間接注射至動(dòng)脈循環(huán)中。也可以參考文獻(xiàn)WO01/94555,其中描述了這種方法。同樣，對(duì)不同細(xì)胞群體的分選需要觀察特異性的細(xì)胞標(biāo)記物。另外，獲得的細(xì)胞群體專門適合于心肌的再生。因此，上文分析的第一篇文獻(xiàn)為獲得的多能干細(xì)胞群體提供了較寬的使用范圍，然而并未能獲得關(guān)于促血管生成活性(pro-angiogenicactivity)的令人信服的結(jié)果，而第二篇所文獻(xiàn)公開的是呈現(xiàn)成肌細(xì)胞特征的特定細(xì)胞群體，因此它們的用途更受局限。同樣，還有這樣一個(gè)問題，這也是而本發(fā)明旨在解決的問題，即提供一種用作刺激血管再形成的作用劑的細(xì)胞制備物，該細(xì)胞制備物被施用時(shí)，使得哺乳動(dòng)物(特別是人)的受損組織的血管系統(tǒng)的重建成為可能。另外，必須能夠相對(duì)容易地獲得這樣的制備物。以解決這個(gè)問題為目的，本發(fā)明提出了一種含有內(nèi)皮細(xì)胞的前體(EPC，代表內(nèi)皮前體細(xì)胞(EndothelialPrecursorCells))和平滑肌細(xì)胞的前體(SMC，代表平滑肌細(xì)胞(SmoothMuscleCells))的細(xì)胞制備物，其作為同時(shí)(simultan6e)、分開(s印ar&)或時(shí)間上分散(6tal6edansletemps)施用的組合產(chǎn)品，用作刺激血管再形成的作用劑。因此，本發(fā)明的一個(gè)特征在于利用兩種類型的細(xì)胞，即內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體二者，然后它們相互作用從而刺激在預(yù)先存在的血管的基礎(chǔ)上形成和發(fā)育毛細(xì)血管。這樣，從(^partirde)任何一種其中血液循環(huán)減少或停止的細(xì)胞組織，將內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體注射到梗塞組織中將誘導(dǎo)毛細(xì)血管的再生，當(dāng)然，條件是血液循環(huán)正常重現(xiàn)。的體外分化獲得的臍帶血、或造血骨髓、或外周循環(huán)血、或任何其它組織。如后文將會(huì)更詳細(xì)闡釋的，分離單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearcell),例如從臍帶血分離單核細(xì)胞，然后誘導(dǎo)其體外分化，從而隨后回收它們并且將它們與平滑肌前體細(xì)胞組合。特別有利的是，所述內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)表達(dá)能夠接受蛋白質(zhì)材料從而活化所述內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)的特異性受體。由此內(nèi)皮前體細(xì)胞的活化可誘導(dǎo)這些前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體之間的補(bǔ)充性協(xié)同作用(supplementarysynergy),然后這種協(xié)同作用導(dǎo)致血管再形成或促血管生成活性，這樣的血管再形成或促血管生成活性大于單獨(dú)的未活化的前體細(xì)胞或單獨(dú)的平滑肌細(xì)胞前體的血管再形成或促血管生成活性。有利的是，所述特異性受體是具有酪氨酸激酶活性的Eph受體，例如EphB型的，更確切地說是EphB4。另外，蛋白質(zhì)材料優(yōu)選含有所述標(biāo)記物的特異性配體，所述配體與結(jié)合性多肽相結(jié)合。進(jìn)一步地，且根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，特異性配體是肝配蛋白配體，例如肝配蛋白B或更確切地說是肝配蛋白B2或另外的肝配蛋白Bl。至于結(jié)合性多肽，其優(yōu)選是Fc免疫球蛋白片段。如此，獲得了展示特異性受體的內(nèi)皮細(xì)胞，所述特異性受體與由配體和結(jié)合性多肽組成的蛋白質(zhì)材料結(jié)合；然后將這種內(nèi)皮前體細(xì)胞活化。至于平滑肌細(xì)胞前體(SMC)，優(yōu)選通過源自臍帶血、造血骨髓、外周循環(huán)血、或事實(shí)上任何其它組織的祖細(xì)胞的體外分化來獲得。正如內(nèi)皮前體細(xì)胞一樣，首先分離單個(gè)核細(xì)胞，例如>^人臍帶血分離單個(gè)核細(xì)胞，然后誘導(dǎo)其分化成平滑肌細(xì)胞前體。然后將它們回收，再與內(nèi)皮前體細(xì)胞組合來施用。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，所述平滑肌細(xì)胞前體(SMC)獲得自肌肉細(xì)胞前體。事實(shí)上可基于特異性的細(xì)胞標(biāo)記物而清楚地鑒定這些平滑肌細(xì)胞前體。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提出了使用組合了內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的細(xì)胞制備物用于制備細(xì)胞組合物的用途，所述細(xì)胞組合物旨在用于刺激哺乳動(dòng)物特別是人體內(nèi)缺血組織的血管再形成或血管發(fā)生。此外，還預(yù)期了這些內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的組合，所述組合用于制備旨在用于正?；瘟鲅茉偕乃幬?。更寬泛地，預(yù)期了使用組合了內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的細(xì)胞制備物用于制備藥物的用途，所述藥物旨在用于刺激處于愈合階段的損傷組織的血管再形成。因此，預(yù)期了在本發(fā)明的細(xì)胞制備物的輔助下對(duì)以下述為例的病理狀態(tài)的治療方丈射性皮炎或》丈射后皮炎(radiationorpost-radiationdermatitis)、灼傷(burns)或創(chuàng)傷后或任何其它來源的皮膚損傷。此外，組合了內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的細(xì)胞制備物適合于制備旨在用于防止或治療癌癥的治療性組合物，將所述治療性組合物在通過化療或放療進(jìn)行的抗癌治療之前或與之同時(shí)施用。其也適合于治療血管畸形，特另寸是血管瘤(angiomas)。更概括地，預(yù)期了屬于依據(jù)本發(fā)明的類型的細(xì)胞制備物作為促血管生成活性成分與生理學(xué)可接受的賦形劑相組合用于制備組合物的用途；所述組合物在對(duì)血管機(jī)能不全(vascularinsufficiency)的治療中用于治療，特別是在心、腦或外周缺血組織的血管再形成中用于治療。式的描述來體現(xiàn)，其旨在提供信息，而非進(jìn)行限定，并參考單獨(dú)隨附的圖示，即-圖1,顯示本發(fā)明的主題細(xì)胞制備物的促血管生成活性效力的比較的柱狀圖。第一種實(shí)施方式如此，根據(jù)本發(fā)明的第一種實(shí)施方式，內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)和平滑肌細(xì)胞前體(SMC)共同(jointly)自人的臍帶血獲得。同樣，根據(jù)第一種制備模式，首先收集人臍帶血樣品，每個(gè)樣品30-50ml，再將它們置于裝有肝素鈉抗凝溶液的無菌試管中。然后通過用Pancoll(1.077g/ml(gparmilliliter),產(chǎn)口$由Z)o附Zw/《MeZ)w&c/zer萬rwwa/Zz,F/Ywce4肖售)密度梯度離心從臍帶血分離單個(gè)核細(xì)胞。然后通過在37。C塑料盒上培養(yǎng)24小時(shí)，將分離的單核細(xì)胞與貼壁細(xì)胞分開。然后回收經(jīng)分離并和除去了貼壁細(xì)胞的單核細(xì)胞混合物，并且再將所述混合物置于平板的孔中，所述平板具有六個(gè)覆蓋有確定成分基質(zhì)(definedmatrix)的孔。這種確定成分基質(zhì)含有纖連蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素鈉、I型和IV型膠原(這些產(chǎn)品全部由^Vgma-J/A/c//供應(yīng))和生長因子hVEGF(ic&Z)5ywem又OxfordUK)。以這種方式，在培養(yǎng)15天之后，可清楚地辨別鱗片型集落和紡錘型集落的出現(xiàn)(叩pearance)。然后將這些集落中的每一種回收從而將它們再次彼此獨(dú)立地挑出，然后擴(kuò)增它們以獲得大量的這兩種類型的細(xì)胞。鱗片型細(xì)胞事實(shí)上是內(nèi)皮前體細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)這種細(xì)胞類型的主要標(biāo)記物，馮維勒布蘭德因子(VonWillebrandFactor)、CD31、eNOS、VE-Cadherine、VEGF-R1或VEGF-R2。而紡錘型細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞前體，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)的標(biāo)記物是aSMA、鈣調(diào)理蛋白(calponin)、SM22a和SM-MHC。按照下文定義的第一方案，將含有內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的第一細(xì)胞制備物在多個(gè)批次的雄性棵小鼠上進(jìn)行測試。將前述制備物的效力相對(duì)于不含細(xì)胞集落的含有PBS的中性對(duì)照制備物(緩沖液137mMNaCl、2.7mMKC1、10mMNa2HP04、1.84mMKH2P04)、以及相對(duì)于僅含內(nèi)皮前體細(xì)胞的制備物和僅含平滑肌細(xì)胞前體的制備物進(jìn)行比較。因此將準(zhǔn)備四個(gè)批次，每個(gè)批次六只動(dòng)物，并且向四個(gè)批次的動(dòng)物分別施用所述四種制備物。首先，在^0的時(shí)刻，為所有七周齡的小鼠進(jìn)行右側(cè)股動(dòng)脈結(jié)扎以刺激缺血。五個(gè)小時(shí)之后，將第一種內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的細(xì)胞制備物在眶后竇(retro-orbitalsinus)的水平通過靜脈內(nèi)途徑同時(shí)進(jìn)行注射，對(duì)于第一批次的每只小鼠以大約250,000個(gè)細(xì)胞的比率注射所述兩種類型的細(xì)胞，將其它制備物分別注射給另外三個(gè)批次的動(dòng)物。被測試的其它細(xì)胞制備物含有約500,000個(gè)細(xì)胞。然后，在結(jié)扎之后12天，處死小鼠并取出缺血小腿(ischemizedleg)和未缺血小腿(non-ischemizedleg)的腓腸肌。然后測量了三個(gè)參數(shù)，血管造影得分(angiographyscore)、毛纟田血管密度(capillarydensity)和皮血流量(cutaneousbloodflow)。血管造影得分是血管的密度的量度，其是通過微血管造影術(shù)來測定的(操作流程見SilvestreJ.S等，i仏，2M/;卵259-264的文章中)。在這個(gè)特定的情況下，測量每只動(dòng)物缺血肢和未缺血肢的血管的密度，并且將獲得的結(jié)果以比例形式呈現(xiàn)用缺血小腿除以非缺血小腿。毛細(xì)血管密度代表每平方毫米的毛細(xì)血管數(shù)，毛細(xì)血管密度是這樣來測量的，依靠針對(duì)標(biāo)記物CD31的抗體來標(biāo)記朋，腸肌的切片(如上所述，CD31是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的)，再將這些切片與來自未缺血肢的相同肌肉的切片比較。由此獲得的結(jié)果以比例的形式呈現(xiàn)，用缺血小腿除以未缺血小腿。對(duì)于皮血流量，通過在缺血肢上測得的血流量與在未缺血肢上測得的血流量的比值來定量地評(píng)估皮血流量。這證實(shí)(check)了血管數(shù)的變化與功能性適應(yīng)相對(duì)應(yīng)，并且因此與缺血肢灌注的變化相對(duì)應(yīng)。結(jié)果表I將對(duì)于每組六個(gè)個(gè)體的四個(gè)組中每一組的前述三個(gè)參數(shù)的測量結(jié)果列于下表。該測量結(jié)果取的是六只動(dòng)物的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>皮血流量100150±6141±5217±18由此可見，注射內(nèi)皮前體細(xì)胞EPC或平滑肌細(xì)胞前體SMC引起血管密度與施用對(duì)照PBS的"對(duì)照，，組動(dòng)物的相比稍有增加，分別為大約60%和35%(或分別增加到1.60和1.35倍)。出乎意料的是，當(dāng)同時(shí)注射內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體時(shí)，血管的密度與"對(duì)照"組動(dòng)物的相比基本上增加到了2.4倍。至于毛細(xì)血管密度，可見同時(shí)注射了內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的動(dòng)物展現(xiàn)了與僅施用內(nèi)皮前體細(xì)胞或僅施用平滑肌細(xì)胞前體的動(dòng)物的毛細(xì)血管密度相比基本上高50%的毛細(xì)血管密度。四組動(dòng)物的皮血流量測量值進(jìn)一步支持了以上結(jié)果，因?yàn)橥瑫r(shí)施用了內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的動(dòng)物的皮血流量比4又施用內(nèi)皮前體細(xì)胞或僅施用平滑肌細(xì)胞前體的動(dòng)物的血流量高約50%。由此可見，所測量的三個(gè)參數(shù)(血管造影得分、毛細(xì)血管密度和皮血流量，它們是生血管活性或血管再形成的量度)的結(jié)果看起來是一致的，并且還成相當(dāng)?shù)谋壤?。因此在預(yù)先造成缺血的組織內(nèi)，內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑月幾細(xì)胞前體的聯(lián)合作用似乎誘導(dǎo)了血管和毛細(xì)血管的再生。因此，內(nèi)皮前體細(xì)月包和平滑肌細(xì)胞前體的協(xié)同作用由于某種增強(qiáng)效應(yīng)而在缺血化的組織內(nèi)誘導(dǎo)了這種血管再生。由此可見，本發(fā)明的包含內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的細(xì)胞制備物可以作為藥物施用，尤其是用于治療血管機(jī)能不全，尤其是在缺血的心、腦或外周組織的血管再形成中。另外，這樣的制備物也適用于使腫瘤血管形成正?；?，并且因此使化療中施用的藥物能夠更好地分散在腫瘤中。事實(shí)上，腫瘤血管形成與健康組織的正常血管形成的相似之處非常少，特別是腫瘤血管形成伴有止血紊亂和化學(xué)紊亂。因此纟皮施用的藥物更難到達(dá)腫瘤核心，這同樣降低了它們的功能和效力。現(xiàn)在，前述細(xì)胞制備物具有使腫瘤恢復(fù)正常的血管形成，從而使紳瘤正常地接收血液中循環(huán)的藥物的作用。胞的單位劑量的形式包裝，或者以單獨(dú)劑量的形式包裝。在這種情況下，將兩種細(xì)胞組合物或者同時(shí)施用，或者分開施用，或者時(shí)間上分散地(6tal6edansletemps)施用。此外，可以將內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體獨(dú)立地冷凍并貯藏在-80。C。必要時(shí)，將它們解凍，然后培養(yǎng)約一周的時(shí)間用于同時(shí)或分開施用。所述細(xì)胞制備物尤其適用于制備意圖用于治療動(dòng)脈炎、冠狀血管或心機(jī)能不全和腦血管機(jī)能不全的組合物。在前述動(dòng)物模型中，其在對(duì)下肢所謂的嚴(yán)重(critical)缺血的治療中提供了良好的結(jié)果，因此有很大希望能夠治愈處于類似狀況的人，使避免截肢成為可能。因此本發(fā)明的細(xì)胞組合物能夠按照本身已知的流程在哺乳動(dòng)物中施用，并且尤其能夠在人中施用。例如，可以將所述細(xì)胞組合物注射于血管病變(vascularlesion)處或其附近，注射入血液，或者依靠適當(dāng)?shù)妮d體直接導(dǎo)入病變部位。作為變化的形式，可以通過注射途徑在一方面施用內(nèi)皮前體細(xì)胞，并且在另一方面單獨(dú)地施用平滑肌細(xì)胞前體。在成年人中，可以通過注射施用含有105和109個(gè)細(xì)胞的本發(fā)明的細(xì)胞組合物。第二種實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明的第二種實(shí)施方式，將活化的內(nèi)皮前體細(xì)胞EPC和平滑肌細(xì)胞前體SMC組合。為了做到這點(diǎn)，提供在細(xì)胞的外膜的表面上展現(xiàn)特異性細(xì)胞標(biāo)記物的內(nèi)皮前體細(xì)胞，所述細(xì)胞標(biāo)記物選自由Eph組成的組，特別是EphB4或EphBl，并且具有結(jié)構(gòu)L-K的蛋白質(zhì)材料與所述細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合(combined)。所述蛋白質(zhì)材料由所述標(biāo)記物的特異性配體(L)和結(jié)合性肽(K)(特別是Fc免疫球蛋白或抗體片段)組成。全部這些形成一個(gè)能夠提供具有結(jié)構(gòu)EPC-Eph-L-K的細(xì)胞群體或細(xì)胞材料的系統(tǒng)?？梢詤⒖嘉墨I(xiàn)FR0508029,其中描述了對(duì)這樣的細(xì)胞材料的利用。因此，為了刺激血管發(fā)生，通過屬于肝配蛋白家族的特異性配體L活化含有Eph標(biāo)記物的EPC細(xì)胞。配體L也可以由肝配蛋白的肽片段(例如由肝配蛋白B2的肽片,殳)組成，其中所述片段具有相同的生物學(xué)活性(quiauraitalorslamemeactivit6biologique)。在這樣的情況下，這些活性內(nèi)皮前體細(xì)胞將與平滑肌細(xì)胞前體組合施用，從而刺激先前造成缺血的組織的血管再形成或血管發(fā)生。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的這種第二種實(shí)施方式，內(nèi)皮前體細(xì)胞藉由細(xì)胞標(biāo)記物EphB4被活化；肝配蛋白B2配體附著于細(xì)胞標(biāo)記物EphB4，而該配體本身與Fc抗體片段結(jié)合。由此獲得了EPC-EphB4-肝配蛋白B2-Fc形式的活化內(nèi)皮前體細(xì)胞。首先，有必要獲得主要含有展現(xiàn)標(biāo)記物EphB4的內(nèi)皮前體細(xì)胞的細(xì)胞群體。根據(jù)第一種獲得方式，回收了來源于按照前述第一種制備模式獲得的細(xì)胞制備物的鱗片型細(xì)胞集落。這種細(xì)胞制備物含有具有標(biāo)記物EphB4的內(nèi)皮前體細(xì)胞等。然后用3!xg/ml肝配蛋白-B2-Fc融合蛋白在37。C進(jìn)行為期30分鐘的溫育來處理這些細(xì)胞集落。通過用PBS清洗將每個(gè)未結(jié)合的融合蛋白去除(需要至少兩次清洗)。由此獲得了具有結(jié)構(gòu)EPC-EphB4-肝配蛋白B2-Fc的內(nèi)皮前體細(xì)胞的組合物。接著，必須將這種細(xì)胞組合物與平滑肌細(xì)胞前體組合從而構(gòu)成本發(fā)明的第二種細(xì)胞制備物。按照第一種制備模式獲得的前述細(xì)胞制備物含有平滑肌細(xì)胞前體，可以通過它們的紡錘形來加以鑒別。因此，這些平滑月幾細(xì)胞前體將被選入這樣的制備物，并且將它們與具有結(jié)構(gòu)EPC-EphB4-肝配蛋白2-Fc的內(nèi)皮前體細(xì)胞組合。根據(jù)第二種獲得方式，在本發(fā)明第一種實(shí)施方式中敘述的第一種制備模式的第一部分結(jié)束時(shí)，回收細(xì)胞組合物。由此通過離心分離了來自臍帶血的單個(gè)核細(xì)胞，然后通過在塑料盒上在37。C培養(yǎng)24小時(shí)將這些與貼壁的細(xì)胞分開。然后獲得了含有表達(dá)標(biāo)記物EphB4的單個(gè)核細(xì)胞和不表達(dá)所述標(biāo)記物的單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞混合物。然后，通過標(biāo)準(zhǔn)免疫磁性分離技術(shù)，特別是利用含有抗CD34單克隆抗體的"CDM分離試劑盒，，(由M/丄7EA07B/07EO/，ParisFrance銷售)，從非貼壁性細(xì)胞分離并純化CD34+標(biāo)記的細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀并且利用與FITC偶聯(lián)的抗CD34單克隆抗體(優(yōu)選不同于前述抗體)，對(duì)由此獲得的細(xì)胞的分析顯示它們中的75%(士5.6%)擁有CD34標(biāo)記。由此獲得的細(xì)胞混合物含有1.5x106至3.5x106個(gè)CD34+細(xì)胞，可以將所述細(xì)胞混合物置于覆蓋有含纖連蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素鈉、和I型及IV型膠原的基質(zhì)(由前述的57GM4-^LDiJ/C7/銷售的產(chǎn)品)的6孔板的孔中含有hVEGF、bFGF和IGF1的培養(yǎng)基(由稱為ic&Z)5TS7EMS/7VC，Oxford,UnitedKingdom的公司銷售的產(chǎn)品)中。在15天的培養(yǎng)之后，回收富集了EPC-EphB4的細(xì)胞混合物。然后將這種培養(yǎng)物按照與第一種獲得方式相同的方法，用3ing/ml的肝配蛋白-B2-Fc融合蛋白處理。然后獲得了主要包含具有結(jié)構(gòu)EPC-EphB4-肝配蛋白B2-Fc的內(nèi)皮前體細(xì)胞的細(xì)胞組合物。接著，在按照第一種制備模式的細(xì)胞制備物中，將類似于第一種獲得方式選擇的平滑肌細(xì)胞前體與這種細(xì)胞組合物組合。由此獲得本發(fā)明的第三種細(xì)胞制備物。也應(yīng)注意，所述平滑肌細(xì)胞前體也可以按照前述的第二種獲得方式來獲^曰付。按照與上述第一方案基本上相同的第二方案，在多個(gè)批次的雄性棵小鼠上測試同時(shí)含有具有EPC-EphB4-肝配蛋白B2-Fc結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮前體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體的第二種細(xì)胞制備物。應(yīng)當(dāng)指出，前述第三種細(xì)胞制備物將產(chǎn)生與第二種制備物相同的結(jié)果。第二種制備物的效力將相對(duì)于對(duì)照制備物(PBS)進(jìn)行比較，并且也相對(duì)于僅含具有EPC-EphB4-肝配蛋白B2-Fc結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮前體細(xì)胞的制備物進(jìn)行比較。因此將準(zhǔn)備三個(gè)批次，每批次六只動(dòng)物，并且將所述三種制備物分別施用給這三個(gè)批次的動(dòng)物。按照這第二種方案，并且類似于第一種，在1=0的時(shí)刻，對(duì)全部七周齡的小鼠的右股動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎從而刺激缺血。五個(gè)小時(shí)之后，在眶后竇的水平通過靜脈內(nèi)途徑以兩種類型的細(xì)胞250,000個(gè)細(xì)胞的比率對(duì)第一批次的每只小鼠注射第二種細(xì)胞制備物，同時(shí)給另外兩個(gè)批次的動(dòng)物分別注射前述制備物以〗乍為比4交。接著，在結(jié)扎之后12天，處死小鼠并且取出使其缺血的小腿和未使其缺血的小腿的腓腸肌。然后測量了在上文已經(jīng)出現(xiàn)過的三個(gè)參數(shù)，血管造影得分、毛細(xì)血管密度和皮血流量。結(jié)果表II在下表中列出了對(duì)三組中每一組(每組六個(gè)個(gè)體)的前述三個(gè)參數(shù)的測量結(jié)果。該測量結(jié)果是在六只動(dòng)物中觀察到的結(jié)果的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>血管造影得分100206±10350±20毛細(xì)血管密度100219±16259±13因此，相當(dāng)令人驚奇的是，觀察到藉由它們的與肝配蛋白B2和抗體片段Fc連接的EphB4標(biāo)記物所活化的內(nèi)皮前體細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞前體的組合引起了血管密度的增加，其相當(dāng)于用不含細(xì)胞的對(duì)照組合物所得血管密度的3.5倍。此夕卜，僅包含藉由它們與配體肝配蛋白B2和Fc抗體片段組合的EphB4才示i己物而活4匕的內(nèi)皮細(xì)月包的細(xì)月包纟且合物(cellcompositioncontainingonlyendothelialcellsactivatedbymeansoftheirEph4markercombinedwiththeligandephrineB2andwiththeFcantibodyfragment)已經(jīng)可以引起血管密度的增加，達(dá)對(duì)照組合物的兩4咅。因此，本發(fā)明的包含活化的內(nèi)皮前體細(xì)胞并且與平滑肌細(xì)胞前體組合的第二種細(xì)胞制備物也可以作為藥物施用來治療血管機(jī)能不全，特別是在心、腦或外周缺血組織的血管再形成中。正如第一種細(xì)胞制備物一樣，這第二種制備物適合于創(chuàng)造用于正?；瘟鲅苄纬傻乃幬?。然后可參照?qǐng)Di,圖i以柱狀圖的形式呈現(xiàn)按照本發(fā)明測試的細(xì)胞制備物的血管造影得分。如此，如果發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞前體獨(dú)立地產(chǎn)生促血管生成效果，那么值得注意的是這兩種細(xì)胞類型的組合作用具有顯著的促血管生成效果。血管的密度相對(duì)于對(duì)照組合物的血管密度確實(shí)增加到了2.4倍。此外，同樣值得注意的是，平滑肌細(xì)胞前體和藉由它們的EphB4受體而活化的內(nèi)皮細(xì)胞前體的組合使血管的密度相對(duì)于用對(duì)照組合物獲得的血管密度增加到3.5倍。權(quán)利要求1.一種包含內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)和平滑肌細(xì)胞前體(SMC)的細(xì)胞制備物，其作為供同時(shí)、分開或時(shí)間上分散施用的組合產(chǎn)品，用于作為血管再形成刺激劑使用。2.權(quán)利要求1的細(xì)胞制備物，其特征在于所述內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)是通過源自臍帶血的祖細(xì)胞的體外分化來獲得的。3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞制備物，其特征在于所述內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)是通過源自循環(huán)血的祖細(xì)胞的體外分化來獲得的。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物，其特征在于所述內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)是通過源自造血骨髓的祖細(xì)胞的體外分化來獲得的。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物，其特征在于所述內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)表達(dá)具有酪氨酸激酶活性的特異性Eph受體，其能夠接受蛋白質(zhì)材料以活化所述內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)。6.權(quán)利要求5的細(xì)胞制備物，其特征在于所述特異性受體是EphB型的受體。7.權(quán)利要求6的細(xì)胞制備物，其特征在于所述特異性受體是EphB4型的受體。8.權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物，其特征在于所述蛋白質(zhì)材料含有所述標(biāo)記物的特異性配體，所述配體與結(jié)合性多肽結(jié)合。9.權(quán)利要求8的細(xì)胞制備物，其特征在于所述標(biāo)記物的所述特異性配體是肝配蛋白配體。10.權(quán)利要求9的細(xì)胞制備物，其特征在于所述標(biāo)記物的所述特異性配體是肝配蛋白B配體。11.權(quán)利要求10的細(xì)胞制備物，其特征在于所述標(biāo)記物的所述特異性配體是肝配蛋白B2配體。12.權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物，其特征在于所述結(jié)合性多肽是Fc免疫球蛋白片段。13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物，其特征在于所述平滑肌細(xì)胞前的。14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物，其特征在于所述平滑肌細(xì)胞前體(SMC)是通過源自造血骨髓的祖細(xì)胞的體外分化來獲得的。15.權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物，其特征在于所述平滑肌細(xì)胞前體(SMC)是從肌肉活檢獲得的。16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物用于制備藥物的用途，所述藥物旨在用于刺激缺血組織的血管再形成。17.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物用于制備藥物的用途，所述藥物旨在用于使腫瘤血管形成正?；栽试S化療中施用的藥物散布到胂瘤中。18.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的細(xì)胞制備物用于制備藥物的用途，所述藥物旨在用于刺激處于愈合階段的損傷組織的血管再形成。全文摘要本發(fā)明涉及一種含有內(nèi)皮細(xì)胞前體(EPC)和平滑肌細(xì)胞前體(SMC)的細(xì)胞制備物，其作為組合產(chǎn)品用于同時(shí)、分開或時(shí)間上分散(time-spread)施用，用作血管再形成刺激劑。本發(fā)明還涉及這樣的細(xì)胞制備物的用途。文檔編號(hào)A61K35/14GK101600446SQ200780050922公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2007年12月6日優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日發(fā)明者杰勒德·托貝萊姆,索菲·勒里庫西-魯桑尼,菲利普·福伯特,讓-塞巴斯蒂安·西爾韋斯特雷申請(qǐng)人:血管與血液研究院;公共救濟(jì)事業(yè)局-巴黎醫(yī)院;巴黎大學(xué)迪德羅特第七分校