專利名稱：人il-12抗體的制作方法
人IL-12抗體本申請(qǐng)是中國申請(qǐng)99802310.8的分案申請(qǐng)，該母案于1999年1月15 日以國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP99/00202提交，于2000年7月21日進(jìn)入中國國家 階段，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱。本發(fā)明一般涉及IL-12抗體，更具體地涉及抗-人IL-12的多克隆和單 克隆抗體。白細(xì)胞介素-12(IL-12)以前被稱為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子或天然殺傷 細(xì)胞刺激因子，它是75-kDa(p75)的異二聚體細(xì)胞因子，由以二石;U建連接的 40-kDa(p40)和35-kDa (p35)亞單位組成。p40和p35亞單位分別是含有306 個(gè)氨基酸殘基和197個(gè)氨基酸殘基的多肽(Gubler U等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo1.88， 4143-4147(1991))。p75異二聚體是IL-12的生物活性形式(Gubler U等，1991， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4143; Wolf， S. F等，1991,免疫學(xué)雜志，146:3074)。 IL-12 p75異二聚體通過刺激Thl輔助細(xì)胞產(chǎn)生，刺激激活的T和天然殺傷(NK) 細(xì)胞，增強(qiáng)NK/LAK細(xì)胞的裂解活性，并通過^f木眠和激活的T和NK細(xì)胞 刺激IFN-y的產(chǎn)生來激活和增強(qiáng)針對(duì)外源抗原的由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。IL-12的p40亞單位產(chǎn)生的量超過p35亞單位，發(fā)現(xiàn)呈單體和二聚體 形式中的p40亞單位(Podlaski, F. J等，1992， Arch. Biochem. Biophys. 294:230; D，Andrea,A等，1992，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，176:1387)。 IL-12 p40同二聚體是強(qiáng)有 力的IL-12拮抗劑(Ling， P等，1995，免疫學(xué)雜志，154: 116; Gillessen. S等, 1995,歐洲免疫學(xué)雜志，25:200)。與p40亞單位形成對(duì)照的是，IL-12p35亞 單位的生物活性仍是未知的，僅發(fā)現(xiàn)p35蛋白作為IL-12p75異二聚體的一 部分與p40亞單位相連。因此，人IL-12提供了兩種重要的表位類型(1) 由p40亞單位提供的表位；和(2)由IL-12p75異二聚體的三維構(gòu)象提供的表 位。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了識(shí)別IL-12p75異二聚體蛋白質(zhì)上提供的表位但不識(shí) 別IL-12p40亞單位蛋白質(zhì)上提供的表位的抗體，即所謂的"異二聚體特異 性"抗體?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)已知的IL-12抗體在基本上中和IL-12生物活性方面不是最有 效的。與p40亞單位免疫反應(yīng)的IL-12抗體不能最理想地阻斷人IL-12的生 物活性。例如，由于IL-12 p75異二聚體的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致過量的無活性p40亞 單位(相對(duì)于生物活性的p75異二聚體而言)，與p40亞單位提供的表位反應(yīng)的抗體的J吏用4艮成問題(Podlaski， F. J.， 1992 , Arch. Biochem. Biophys. 294:230; D'Andrea, A.等，1992， 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，176:1387)。結(jié)果，在 減少IL-12的有害作用方面，p40抗體不如異二聚體特異性抗體那樣有效， 這是因?yàn)閱为?dú)的p40亞單位是無生物活性的，p40抗體趨向于與無活性的 p40亞單位而不是與那些是具有生物活性的p75異二聚體的一部分的p40亞 單位結(jié)合。甚至僅與p75異二聚體反應(yīng)的已知抗體也不能有效地中和IL-U生物活 性。例如，以前被鑒定的IL-12 p75異二聚體特異性抗體20C2(Chizzonite 等，細(xì)胞因子，6:A82a(1994)和D，Andrea等，1992，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，176巻 1387-1398)基本上不能阻斷人IL-12刺激的PHA-激活的淋巴母細(xì)胞增殖和 IFN-y的產(chǎn)生。需要能更有效地中和IL-12生物活性的異二聚體特異性抗體以減少IL-12 的有害作用。 已知，血清或組織中IL-12水平的增加與自身免疫病的發(fā) 展進(jìn)程相關(guān)，因此，IL-12抗體是控制具有由免疫機(jī)制介導(dǎo)之病理學(xué)的疾 病，尤其是與異常Thl-型輔助細(xì)胞活性相關(guān)之疾病的有用的拮抗劑。所述 自身免疫病的例子為多發(fā)性硬化，包括節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎的炎 性腸疾病(IBD),風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫性糖尿病。施用IL-12抗體能治 療的其它疾病包括移植/移植物-抗宿主疾病和膿毒性休克。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)從編碼p35亞單位的基因和/或編碼p40亞單位的基 因有缺損的哺乳動(dòng)物得到的IL-12抗體基本上能中和IL-12生物活性。根據(jù)本發(fā)明，使用本文所述的方法首次產(chǎn)生了基本上能中和人IL-12 生物活性的抗體。與其它IL-12p75異二聚體特異性抗體不同的是，本發(fā)明 的異二聚體特異性抗體至少能中和卯％的人IL-12生物活性。另外，本發(fā)明 的IL-12 p75異二聚體特異性抗體能與獼猴IL-12交叉反應(yīng)。本文所述的p75異二聚體特異性IL-12抗體是用于阻斷IL-12生物活性 以治療由不需要的IL-12刺激的免疫學(xué)反應(yīng)所介導(dǎo)的疾病的有效治療劑。本 文所述的高度中和的異二聚體特異性IL-12抗體是特別有用的抑制劑，它可 抑制IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖并抑制PHA-激活的人淋巴 母細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y。

圖1圖示了雜交瘤HIL-12F3-5F2(本文稱之為"5F2 " ), HIL-12F3-16F2(本文稱之為"16F2 " )， HIL-12F3-16G2(本文稱之為"16G2 "),HIL-12F3-20E11(本文稱之為"20E11 ")和HIL-12F1-17E2(本文稱之為 "17E2")上清液中所含的抗體對(duì)1251-標(biāo)記的人正-12的捕獲(空心柱)。免 疫沉淀反應(yīng)過程中未經(jīng)標(biāo)記的人IL-12 p40亞單位的存在(實(shí)心柱)不能阻斷 單克隆抗體5F2， 16F2, 16G2和20E11捕獲^I-標(biāo)記的人IL-12，這表明這 些抗體對(duì)單獨(dú)的IL-12p40亞單位不具有高的親和性。圖2顯示了 p75異二聚體特異性抗人IL-12單克隆抗體20C2, 16G2, 16F2,20E11和5F2的等電聚焦模式。如圖2所示，單克隆抗體20C2, 20E11 和5F2是獨(dú)特的免疫球蛋白。等電聚焦顯示出單克隆抗體16G2和16F2相 同，但都與20C2,20E11和5F2不同。圖3圖解顯示出p75異二聚體特異性IL-12單克隆抗體20C2(+), 16G2(A)， 16F2( O ), 20E11 (+)和5F2( ▲)抑制天然人IL-12刺激的PHA-激活的 人淋巴母細(xì)胞增殖。測定對(duì)天然人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞 增殖的抑制作用，圖3中9940cpm處的水平虛線為缺乏IL-12抗體時(shí) 0.25ng/ml人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖水平，1480cpm處 的水平虛線為PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖的背景水平(即缺乏IL-12和 IL-12抗體時(shí)的水平)。如圖3所示，IL-12單克隆抗體16G2(A),16F2(〇), 20Ell(+)和5F2(a )至少90%抑制0.25ng/ml人IL-12刺激的PHA-激活的人 淋巴母細(xì)胞增殖。與之形成對(duì)照的是，如圖3所示，以前已知的20C2(+) 抗體基本上不能抑制IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖。圖4圖解顯示出本發(fā)明的p75異二聚體特異性IL-12單克隆抗體 16G2(A)， 16F2(0)， 20Ell(+)和5F2(▲)相對(duì)于以前已知的20C2(+)抗體而言 抑制獼猴IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖的情況。圖上方的水 平虛線為存在0.5ng/ml獼猴IL-12和缺乏IL-12抗體時(shí)淋巴母細(xì)胞的增殖水 平。圖下方的水平虛線為淋巴母細(xì)胞增殖的背景水平(即缺乏IL-12和IL-12 抗體時(shí)的水平)。如圖4所示，本發(fā)明的抗體是獼猴IL-12刺激的PHA-激活 的淋巴母細(xì)胞增殖的強(qiáng)有力的抑制劑，相反，20C2(+)抗體對(duì)獼猴IL-12刺 激的淋巴母細(xì)胞增殖僅有最小的抑制作用。圖5圖解顯示出p75異二聚體特異性單克隆抗體16F2(0), 16G2(B)，20E11(a)和5F2(參)和20C2(承)對(duì)IFN-y產(chǎn)生的抑制作用。如圖5 所示，抗體16F2(0 ), 16G2(讓),20E11(a )和5F2(參)至少90°/。抑制0.25ng/ml 人IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生。圖下方的水平點(diǎn)劃線表示缺乏IL-12時(shí)IFN-y產(chǎn)生的背景水平。相反，20C2("單克隆抗體對(duì)0.25ng/ml人IL-12刺激的 IFN-y產(chǎn)生的抑制作用不超過65%。圖6是編碼p75異二聚體特異性16G2抗體重鏈可變區(qū)部分的核苷酸序 列及由此核香酸序列推定的氨基酸序列。圖7是編碼p75異二聚體特異性20E11抗體重鏈可變區(qū)部分的核苷酸 序列及由此核香酸序列推定的氨基酸序列。才艮據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IL-12抗體由編碼p35IL-12亞單位之基因和/或編 碼p40 IL-12亞單位之基因有缺損的哺乳動(dòng)物產(chǎn)生時(shí)，得到與IL-12 p75異 二聚體的表位選擇性地免疫反應(yīng)的抗體，通過它們與人IL-12p75異二聚體 選擇性免疫反應(yīng)但不與單獨(dú)的p40亞單位免疫反應(yīng)的能力可鑒定這些抗 體。與以前已知的IL-12p75抗體不同，本文所述方法產(chǎn)生的抗體基本上能 中和人IL-12的生物活性，即至少中和約90。/o的人IL-12生物活性。另夕卜， 本發(fā)明的IL-12p75異二聚體特異性抗體能與獼猴IL-12交叉反應(yīng)。本文所述的IL-12抗體通過在濃度至少約為0.5|iig/ml時(shí)抑制至少約 90% IL-12謗導(dǎo)的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖，和/或在濃度至少約為 0.5pg/ml時(shí)抑制至少約卯％ IL-12刺激的由PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-y, 乂人而至少中和約90。/o的人IL-12生物活性。另夕卜，本文所述的抗體 可特異性地抑制IL-12(而不是IL-2)誘導(dǎo)的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖。 按下述制備PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞。分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)(Gately 等，J. Natl. Cancer Inst,， 69:1245(1982))并用0.1% PHA畫P(Difco Labs" Detroit, MI)刺激。3天后，按Gately, M. K" Chizzonite， R.和Presky, D. H.,測定人和 小鼠的白細(xì)胞介素12 ,免疫學(xué)最新方法，第1巻，J. E.Coligan， A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. ML Shevach和W. Strober編，John Wiley & Sons公司，紐約，1995,pp6.16.1-6.16.15所述，用新鮮培養(yǎng)基和重組的50U/ml 人IL-2將培養(yǎng)物分成1:1的兩份。再保溫l天之后，即可使用PHA-激活的 淋巴母細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，鑒定出IL-12抗體選擇性結(jié)合p75異二聚體提供的表位， 而不與p40亞單位提供的任何表位進(jìn)行免疫反應(yīng)的能力。這種選擇性是由 下述事實(shí)所決定的，即本發(fā)明的IL-12抗體可在某個(gè)極低濃度時(shí)與給定量的 p75異二聚體單獨(dú)提供的表位反應(yīng)，而在該濃度下不與相同給定量該P(yáng)75 二聚體的p40亞單位所提供的表位反應(yīng)。通過這種方式，本發(fā)明的抗體對(duì)p75 異二聚體單獨(dú)提供的表位比對(duì)p40亞單位提供的任何表位具有更高的親和 性?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的試驗(yàn)來鑒定抗體與p75異二聚體的選擇性結(jié)合。 通常，在這種試驗(yàn)中，將抗體與人IL-12p75異二聚體一起保溫以確定抗體 是否與p75異二聚體結(jié)合。也在存在和缺乏p40亞單位時(shí)將抗體與人IL-12 p75異二聚體一起保溫以確定p40亞單位的存在是否阻斷抗體結(jié)合或捕獲 p75異二聚體。例如，可使用竟?fàn)幮悦庖叱恋碓囼?yàn)(見本文實(shí)施例7)來闡明 本文所述的抗體與人IL-12p75異二聚體選才奪性地免疫反應(yīng)，而不與單獨(dú)的 p40亞單位進(jìn)行免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，通過使用敲除(knock-out)哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生本文所述的IL-12抗體。在敲除哺乳動(dòng)物中，編碼p35亞單位的基因和/或編碼IL-12 p40 亞單位的基因有缺損，因此，不能表達(dá)IL-12p75異二聚體。當(dāng)用IL-12p75 異二聚體免疫時(shí)，IL-12 p35亞單位缺損和/或IL-12 p40亞單位缺損的敲除 哺乳動(dòng)物能將IL-12 p75異二聚體識(shí)別為外來物，從而產(chǎn)生針對(duì)其的抗體。 優(yōu)選地,敲除哺乳動(dòng)物是小鼠。才艮據(jù)本發(fā)明，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn) 生敲除哺乳動(dòng)物。通過常規(guī)方法，例如通過突變編碼p35 IL-12亞單位和/ 或p40IL-12亞單位的基因可產(chǎn)生敲除哺乳動(dòng)物。例如，按Mattner， F.等，歐 洲免疫學(xué)雜志，26:1553-1559(1996)所述可產(chǎn)生IL-12 p35亞單位基因中帶有 突變的小鼠。按Magram, J等，免疫力，4:471-481(1"6)所述可產(chǎn)生IL-12 p40 亞單位基因具有突變的小鼠。才艮據(jù)本發(fā)明，通過本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法，可由上述敲除哺乳動(dòng) 物的激活細(xì)胞產(chǎn)生與人IL-12p75異二聚體選擇性免疫反應(yīng)的多克隆和單克 隆抗體。 一般地說，通過(a)用人p75異二聚體免疫p35亞單位和/或p40亞 單位之編碼基因缺損的"敲除"哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生抗體；(b)從經(jīng)免疫的哺乳 動(dòng)物中得到抗體；和(c)篩選抗體選擇性結(jié)合p75異二聚體所提供的表位的 能力以得到選擇性結(jié)合的抗體。一般通過包括下列步驟的方法產(chǎn)生本發(fā)明的IL-12單克隆抗體，所述抗 體能與人IL-12 p75異二聚體選擇性地進(jìn)行免疫反應(yīng)(1) 用人IL-12 p75異二聚體免疫敲除哺乳動(dòng)物，例如IL-12 p35亞單位 和/或IL-12p40亞單位之編碼基因缺損的小鼠；(2) 從經(jīng)免疫的已被激活的以表達(dá)IL-12抗體的敲除哺乳動(dòng)物中選4奪細(xì)胞，例如脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞；(3) 將收集的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞；(4) 通過例如使用標(biāo)記或未標(biāo)記的人IL-12采用ELISA或免疫沉淀法檢 測雜交瘤條件培養(yǎng)基中抗人IL-12抗體的存在，從而選擇可分泌識(shí)別人IL-12 之抗體的雜交瘤細(xì)胞； 和(5) 通過將抗體與人IL-12 p75異二聚體一起保溫以確定抗體是否與p75 異二聚體結(jié)合，然后在存在和缺乏p40亞單位時(shí)將抗體與人IL-12 p75異二 聚體一起保溫以確定p40亞單位的存在是否阻斷抗體結(jié)合或捕獲p75異二 聚體，闡明抗體與P75 IL-12異二聚體之表位免疫反應(yīng)而不與p40亞單位的 任何表位免疫反應(yīng)，從而測定抗體是否為p75異二聚體特異性的抗體。例IL-12 p75異二聚體選纟奪性地免疫反應(yīng)，而不與單獨(dú)的p40亞單位進(jìn)行免疫 反應(yīng)。生產(chǎn)本發(fā)明的p75異二聚體特異性IL-12單克隆抗體的方法還可包括測 定異二聚體特異性IL-12抗體在任何體外或體內(nèi)IL-12生物活性檢測系統(tǒng)中 抑制人和獼猴IL-12生物活性之能力的步驟，所述檢測系統(tǒng)如測定IL-12刺 激的激活淋巴細(xì)胞增殖，IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生或IL-12刺激的細(xì)胞溶解 活性增強(qiáng)的試驗(yàn)。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如辟u酸銨沉淀，親和層析或離子交換 層析可將本發(fā)明的抗人IL-12抗體分離成基本上純的形式。得到本發(fā)明抗體的方法的改變也包括在本發(fā)明范圍之中。也可使用本 領(lǐng)域已知的方法，例如Western印跡，竟?fàn)幮悦庖叱恋碓囼?yàn)或交叉-阻斷結(jié) 合試驗(yàn)測定抗體是否為p75異二聚體特異性的抗體。除小鼠外，也可用IL-12 p75異二聚體免疫IL-12 p35亞單位基因和/或 IL-12 p40亞單位基因缺損的其它哺乳動(dòng)物，如大鼠和兔以產(chǎn)生本文所述的 抗體。IL-12 p35亞單位基因和/或IL-12 p40亞單位基因的缺損或突變可以 是導(dǎo)致IL-12 p75異二聚體不能表達(dá)的任何缺損或突變。另外，可使用任何 常規(guī)方法得到IL-12 p35亞單位基因和/或IL-12 p40亞單位基因發(fā)生突變從 而導(dǎo)致IL-12 p75缺損表型的哺乳動(dòng)物細(xì).胞。根據(jù)本發(fā)明，通過用天然人IL-12或重組IL-12免疫小鼠或其它哺乳動(dòng) 物可得到激活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該細(xì)胞能表達(dá)抗人IL-12 p75異二聚體的抗體。通過本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)技術(shù)，如本文實(shí)施例中提供的技術(shù)可制備天然人IL-12或重組IL-12 。生產(chǎn)可分泌本發(fā)明IL-12抗體的雜交瘤所用的適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞系，即 融合配對(duì)物包括本領(lǐng)域眾所周知的骨髓瘤細(xì)胞系，如SP2/0和NS/O細(xì)胞 系，優(yōu)選SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞。優(yōu)選骨髓瘤融合配對(duì)物和針對(duì)IL-12 p75 異二聚體被激活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞得自相同的種。通過本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法可選擇和分離產(chǎn)生本發(fā)明抗體的雜交 瘤細(xì)胞。優(yōu)選在含有能殺死骨髓瘤細(xì)胞但不能殺死淋巴細(xì)胞的選<#劑的培 養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞和針對(duì)IL-12 p75異二聚體被激活的淋巴細(xì)胞。 骨髓瘤細(xì)胞與針對(duì)IL-12 p75異二聚體被激活的淋巴細(xì)胞融合，從而形成雜 交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞能在含有選^f奪劑的培養(yǎng)基中生長，因?yàn)榱馨图?xì)胞的 DNA為骨髓瘤細(xì)胞系提供了必需的編碼酶的基因，所述酶通過用另一代謝 途徑替代被選擇劑阻斷的代謝途徑而避免了選擇劑的毒性作用。任何未融 合的淋巴細(xì)胞都會(huì)死亡，因?yàn)樗鼈兾幢晦D(zhuǎn)化，在體外的壽命短暫而有限。 根據(jù)本發(fā)明，選出雜交瘤細(xì)胞所用的適當(dāng)選擇劑是氨基蝶呤。培養(yǎng)雜交瘤 細(xì)胞的優(yōu)選培養(yǎng)基是Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM),其中添加有 10% FBS(Hydone), 100單位/ml青霉素G(BioWhittaker), 100|xg/ml鏈霉素 (BioWhittaker) , 250ng/ml Fungizone(BioWhittaker) ， 2mM谷氨酰胺 (BioWhittaker), 100|xg/ml石克酸雙生霉素(BioWhittaker), 50|iM 2-巰基乙醇 (BioRad), 1 OOpM次黃噤呤(Sigma), 400nM氨基蝶呤(Sigma)， 16pM胸苷 (Sigma)和2.5% P388D1上清液(按Nordan， R. P等，免疫學(xué)雜志， 139:813(1987)所述制備)。通過IL-12刺激的人淋巴母細(xì)胞增殖或IFN-y產(chǎn)生試驗(yàn)測出IL-12抗體 50%最大抑制IL-12生物活性時(shí)的濃度，以該濃度確定本發(fā)明IL-12抗體的 效力。本發(fā)明的抗人IL-12抗體表現(xiàn)出比以前鑒定的異二聚體特異性IL-12 抗體更高的效力。另外，通過測定對(duì)IL-12刺激的淋巴細(xì)胞增殖或IFN-y產(chǎn) 生的最大抑制程度，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗人抗體表現(xiàn)出比以前鑒定的異二聚體 特異性IL-12抗體更高的效力。通過本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)試驗(yàn)，例如IL-12誘導(dǎo)的淋巴母細(xì)胞增殖試 一險(xiǎn)或IFN-y合成試^r可測定本文所述抗體的效力和潛力。才艮據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法測定IL-12抗體對(duì)人IL-12刺激的淋巴母細(xì)胞增殖的抑制作用。
一般地說，通過很多種方法可激活人淋巴細(xì)胞，包括單獨(dú)或組合使用促分裂凝集素，如植物凝集素A(PHA) 或其它激活劑，例如細(xì)胞因子，佛波酯和離子載體，針對(duì)細(xì)胞表面分子的 抗體進(jìn)行處理，或?qū)е铝馨图?xì)胞激活的任何其它方法。在缺乏或存在抗體 時(shí)，將激活的淋巴細(xì)胞與和不與IL-12—起保溫，通過測定DNA中SH-胸 香的摻入以確定DNA合成的速率，通過計(jì)數(shù)多個(gè)處理階段過后存在的細(xì)胞 數(shù)目，或通過可用于監(jiān)測細(xì)胞增殖速率的任何其它方法來測定淋巴細(xì)胞增 殖的速率。通過在缺乏和存在多種濃度抗IL-12抗體時(shí)比較確定濃度的IL-12 誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖來測定對(duì)增殖的抑制作用。在標(biāo)準(zhǔn)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，在沒有加入任何抗體，也沒有PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖背景水平，即在缺乏IL-12和抗體的情況下增殖 時(shí)，針對(duì)人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖的水平來測定對(duì)人 IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖的抑制作用。 一般說來，在我 們的標(biāo)準(zhǔn)人淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，IL-12刺激的增殖水平約產(chǎn)生10,000-80,000cpm，增殖的背景水平約產(chǎn)生5，000-20,000cpm 。由于由IL-12刺激 的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞各批間固有的差異，只有其中經(jīng)刺激的增殖與 背景增殖的比率(即刺激指數(shù))等于或大于3的試驗(yàn)才能有效測定IL-12刺激 的增殖。根據(jù)本發(fā)明，可使用任何常規(guī)方法測定IL-12抗體對(duì)IFN-y產(chǎn)生的抑制 作用。例如，在缺乏和存在抗體的情況下，將按本文所述制備的激活的人 淋巴細(xì)胞，或激活的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)與或木與IL-12和多種其它 試劑，如IL-12和/或IL-ip—起保溫，所述激活的人PBMC是通過單獨(dú)或 聯(lián)合使用包括凝集素的促分裂劑，細(xì)胞因子，佛波酯，離子載體或針對(duì)細(xì) 胞表面分子的抗體處理全血或分離的PBMC ,或?qū)е录せ畹娜薖BMC產(chǎn)生 的任何其它方法制備的。然后通過例如對(duì)培養(yǎng)基取樣并用ELISA或可定量在缺乏和存在多種濃度的抗IL-12抗體的情況下比較確定濃度的IL-12下的 IFN-y產(chǎn)生來測定對(duì)IFN々產(chǎn)生的抑制作用。在標(biāo)準(zhǔn)的IFN-y合成試驗(yàn)中，針對(duì)IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生和IFN-y產(chǎn) 生的背景水平，即存在或缺乏IL-12下的IFN-y合成來測定對(duì)IFN-y的抑制 作用。 一舶:說來，IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生的水平約為7-220ng/ml, IFN-y產(chǎn)生的背景水平約為l-3ng/ml。本文所述的抗體中和獼猴IL-12生物活性的效力與抑制人IL-12生物活 性的效力類似，因此使它們可用作獼猴體內(nèi)研究的IL-12拮抗劑。這些抗人 IL-12抗體增加的效力和潛能及其與獼猴IL-12的交叉反應(yīng)性使其成為設(shè)計(jì) 有效的人用IL-12拮抗劑時(shí)極好的候逸者。具體地說，本發(fā)明提供了 4種抗體，即針對(duì)人IL-12 p75異二聚體的5F2, 16F2， 16G2和20E11 。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，已于1997年12月11日 將產(chǎn)生這些抗體的相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞系保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，它 們的ATCC保藏號(hào)分別為HB-12446, HB-12447, HB-12449和HB-12448 。然 而，本發(fā)明并不4又限于這4種抗體。具有本文所述特性的任何抗體都包含 在本發(fā)明中。圖6提供了編碼p75異二聚體特異性16G2抗體的重鏈可變區(qū)部分的核 苷酸序列和由此核苷酸序列推定的氨基酸序列。圖7才是供了編碼p75異二 聚體特異性20E11抗體的重鏈可變區(qū)部分的核普S吏序列和由此核香酸序列 推定的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解對(duì)本文所述異二聚體特異性 IL-12抗體的恒定區(qū)可進(jìn)行保守的氨基酸改變而不會(huì)顯著影響抗原結(jié)合特異 性/親和性?？勺兛蚣軈^(qū)或更具體地為互補(bǔ)決定區(qū)中含有氨基酸變化的異二 聚體特異性IL-12抗體有望對(duì)抗原結(jié)合特異性/親和性產(chǎn)生更大的影響。本發(fā)明的IL-12抗體可以是包括兩個(gè)全長重鏈和兩個(gè)全長輕鏈的完整 抗體?；蛘?，IL-12抗體也可以是構(gòu)建體，例如保留與IL-12 p75異二聚體 的一個(gè)或多個(gè)表位的結(jié)合活性的單鏈抗體或"微型"抗體。通過本領(lǐng)域已 知的方法可制備這種構(gòu)建體，所述方法如PCR介導(dǎo)的克隆和裝配單鏈抗體 以在大腸桿菌中表達(dá)(描述于抗體工程，實(shí)驗(yàn)方法系列，J. McCafferty, H. R. Hoogenboom和D. J. Chiswell編，牛津大學(xué)出版社，1996)。在這種類型的構(gòu) 建體中，抗體分子重鏈和輕鏈的可變區(qū)是由cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。然 后在第二個(gè)PCR步驟中，通過編碼由氨基酸GLY和SER組成的柔性蛋白 質(zhì)接頭的接頭DNA來裝配所得的擴(kuò)增子。該接頭能使可變的重鏈和輕鏈部 分以特定的方式折疊，從而使抗原結(jié)合袋再生，抗原結(jié)合親和性經(jīng)常與親 本全長二聚體免疫球蛋白分子差不多。本文所述的抗人IL-12抗體可被人源化以形成對(duì)IL-12 p75異二聚體的 親和性與哺乳動(dòng)物抗人IL-12抗體相同或基本上類似，但對(duì)人基本上無免疫原性的抗體。例如，本發(fā)明的人源化IL-12抗體包括人抗體的重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)。優(yōu)選人源化抗體構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與供體構(gòu)架區(qū)約60%至95%相 同。通過本領(lǐng)域眾所周知的重組」技術(shù)可產(chǎn)生人源化抗體。產(chǎn)生人源化免疫 球蛋白的方法描述于例如美國專利5530101中。本發(fā)明的IL-12抗體是有用的拮抗劑，其可用于控制具有由免疫機(jī)制介 導(dǎo)之病理學(xué)的疾病，尤其是與由導(dǎo)致異常Thl-型輔助細(xì)胞活性的增加的 IL-12生物活性相關(guān)之疾病。根據(jù)本發(fā)明，IL-12抗體可用于治療人或其它 哺乳動(dòng)物的自身免疫病，例如多發(fā)性硬化，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，自身免疫性糖 尿病和包括節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎的炎性腸疾病(IBD)。本文所述的 抗體也可用于治療其它疾病，包括例如移植/移植物-抗宿主疾病和膿毒性休 克，這些疾病通過施用IL-12抗體是能治療的。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需進(jìn)行過度的實(shí)驗(yàn)即可確定施用本文IL-12抗體的 劑量范圍。通常，適當(dāng)?shù)膭┝繎?yīng)大到足以能產(chǎn)生所需的效果，即中和至少 90°/。IL-12生物活性。然而，劑量也不應(yīng)大到導(dǎo)致不良副作用，如不需要的 交叉反應(yīng)，過敏性反應(yīng)等的程度。 一般說來，劑量隨患者年齡，身體狀況， 性別和疾病嚴(yán)重程度，禁忌癥，(如果有的話，還隨)免疫耐受性和可由各個(gè) 醫(yī)生調(diào)整的其它這類變量的不同而不同?？赏ㄟ^注射或逐漸灌流非腸道施用IL-12抗體。給藥方式為靜脈內(nèi)，肌 內(nèi)或皮下。非腸道給藥的制劑包括無菌或含水或不含水的溶液，懸浮液和 乳化液。不含水溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，和可 注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。含水載體包括水，醇/水溶液，乳化液或懸浮 液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非腸道給藥的載體包括氯化鈉溶液，林格葡萄 糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸化林格溶液或固定油。靜脈內(nèi)給藥的載體包括 流體和營養(yǎng)補(bǔ)充物，電解質(zhì)補(bǔ)充物，如基于林格葡萄糖的那些補(bǔ)充物等。 也可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，惰 性氣體等。例見Remington藥物科學(xué)，第16版，Mack編，1980。本發(fā)明IL-12抗體的優(yōu)選劑量約為0.1mg/kg至10mg/kg ,每周2至3 次。然而，施用本文IL-12抗體的劑量和劑量計(jì)劃度將根據(jù)治療的個(gè)體，施 用的抗體和上文討論的變量而變化。根據(jù)本發(fā)明，可單獨(dú)或與其它治療活 性劑聯(lián)合施用IL-12抗體。實(shí)施例 實(shí)施例1制備天然人IL-12用含有無防腐劑肝素(Sigma， St. Louis, MO, USA)的注射器從正常自愿 供體體內(nèi)抽血至終濃度約為5個(gè)單位肝素/ml血液。將1個(gè)體積的含肝素血 液稀釋到9個(gè)體積的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基由RPMI 1640和Dulbecco氏改 良的Eagle氏培養(yǎng)基按1:1混合而成，其中添加有O.lmM非必需氨基酸， 60jag/ml精氨酸HC1, lOmMHEPES緩沖液，2mML-谷氨酰胺，100U/ml 青霉素，100嗎/ml鏈霉素(都得自GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)， 50jxM 2-巰基乙醇(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ， USA)和lmg/ml葡萄糖 (Fisher)。向此混合物中加入人干擾素-y, 20U/ml(PeproTech， Inc., Rocky Hill, NJ, USA)和最終稀釋度為1/4000的Pansorbin細(xì)胞(加福爾馬林的金黃色葡 萄球菌，Cowan菌抹；Calbiochem, San Diego， CA, USA)。(使用前用 Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(GIBCO BRL)將Pansorbin細(xì)胞洗2次，并重建 至與廠商提供的相同的體積)。將所得細(xì)胞懸浮液以80ml/瓶等分至162cm2 組織培養(yǎng)瓶(Costar， Cambridge, MA, USA)中，37 。C在含5。/。 (:02/95%空氣的 潮濕空氣中水平保溫培養(yǎng)瓶24小時(shí)。然后離心收集培養(yǎng)物上清液，穿過 0.22|im濾器(Costar)過濾除菌。通過免疫親和層4斤從培養(yǎng)物上清液中純化 11^-12異二聚體+ IL-12p40，所述層析與下文所述的純化獼猴IL-12的相同 之處是都使用了 2-4A1 G蛋白sepharose(PGS)柱，不同之處是本洗脫緩沖液 含有0.01 %明膠(Sigma)以使與表面非特異性吸附所致的蛋白質(zhì)損失降至最 小。將洗脫液對(duì)100至200體積的Dulbecco氏-舞酸鹽緩沖鹽水透析4至6 小時(shí)，然后對(duì)相同體積的含有100pg/ml雙生霉素的RPMI 1640透析過夜。 使經(jīng)透析的洗脫液穿過0.22|am濾器過濾除菌，通過ELISA檢測IL-12異二 聚體和IL-12 p40的含量(Gately, M. K.， Chizzonite, R.和Presky, D. H.,測定人 和小鼠的白細(xì)胞介素12,免疫學(xué)最新方法，第1巻，J. E.Coligan, A, M. Kruisbeek， D. H. Margulies, E. M. Shevach和W. Strober編，John Wiley & Sons公司,紐約，1995, p6.16.1-6.16.15)和IL-12生物活性(文獻(xiàn)同上)。通常， 由ELISA測定的IL-12 p40:IL-12異二聚體的重量比約為5:1 。實(shí)施例2生產(chǎn)重組人IL-12按美國專利5536657所述制備，鑒定和產(chǎn)生重組人IL-12 。實(shí)施例3產(chǎn)生獼猴IL-12使用標(biāo)準(zhǔn)方法(分子生物學(xué)最新方法，F(xiàn). Ausubel編，J. Wiley和Sons, Inc.,紐約(1993))改造獼猴IL-12 p35和p40亞單位cDNA序列(F. Villinger 等，免疫學(xué)雜志，155:3946_3954 (l"")以在CHO-dhfr-細(xì)胞中，在兩個(gè)獨(dú)立 的質(zhì)粒上進(jìn)行表達(dá)?？寺〉米晕磾U(kuò)增的細(xì)胞群體，通過IL-12特異性ELISA 監(jiān)測其IL-12的產(chǎn)生。選擇最佳生產(chǎn)克隆，使其適應(yīng)在CHO無血清培養(yǎng)基 (Sigma)中的生長。隨后以旋動(dòng)培養(yǎng)生長細(xì)胞以生產(chǎn)蛋白質(zhì)。通過抗體親和 層析義人上清液中純化獼猴IL-12 。通過以lmg mAb/ml凝膠的密度將10mg 抗人IL-12 p40mAb2-4Al(Chizzonite等，免疫學(xué)雜志，147:1548-1556(1991)) 與G蛋白Sepharose(Pharmacia Biotech)寸吏用 10mM 二甲基pimelimidate (Pierce, Rockford, IL, USA)交聯(lián)以產(chǎn)生親和柱(Stem和Podlaski,蛋白質(zhì)化學(xué) 技術(shù)，IV, Acad. Press,紐約，353-360(1993))。穿過0.2)iim濾器過濾含有獼猴 IL-12的無血清CHO上清液，將其直接上樣于10ml預(yù)先用PBS pH7.2平衡 過的2-4 Al PGS柱，流速為lml/分鐘，用10倍體積的PBS洗滌柱，用0.1M 甘氨酸-HCl, 0.15M NaCl, pH3.0洗脫柱。立即用3M Tris-HCl， pH9中和洗脫 物，經(jīng)Bradford和SDS-PAGE測定，親和柱每輪能與約2mg獼猴IL-12 , 包括過量的p40單體結(jié)合。其它污染物為痕量水平。為了濃縮并進(jìn)一步純 化獼猴IL-12,用20mM磷酸鈉，pH7透析含有IL-12的洗脫物，將其上樣 于用相同緩沖溶液調(diào)整過的S-Sepharose柱，流速為lml/分鐘，所有蛋白質(zhì) 都被結(jié)合。用10倍體積的磷酸鹽緩沖液洗滌柱，然后用含有0.3MNaCl的 磷酸鹽緩沖液洗脫柱。使用LAL試劑盒(Biowittaker)檢測洗脫收集物的內(nèi)毒 素，發(fā)現(xiàn)其〈10EU/mg蛋白質(zhì)。使用mAb 2-4 Al作為檢測試劑的Western 印跡分析顯示出約80KDa處的獼猴IL-12異二聚體以及40KDa處明顯過量 的p40單體?？捡R斯藍(lán)染色的SDS-PAGE顯示出在約70KDa處與p80異二 聚體強(qiáng)度相同的另一種重要蛋白質(zhì)。用2-巰基乙醇處理之后，80和70KDa 蛋白質(zhì)都還原為其單體形式，但后一蛋白質(zhì)帶不與mAb^4Al反應(yīng)。實(shí)施例4 制備，鑒定和純化雜交瘤抗體按Mattner, F.等，歐洲免疫學(xué)雜志，26:1553-1559(1996)所述生產(chǎn)在 Balb/c背景上攜有IL-12p35亞單位基因突變的小鼠。用5微克溶于完全弗 氏佐劑中的純化的重組人IL-12腹膜內(nèi)免疫IL-12 p35-缺損小鼠。在2.5個(gè) 月期間，小鼠又接受了 3次隨后的腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射，每次為5微克溶于不 完全弗氏佐劑中的人IL-12 。脾摘除術(shù)前3和2天注射溶于PBS中的75微 克人IL-12(50微克腹膜內(nèi)，25微克靜脈內(nèi))，脾摘除術(shù)前1天腹膜內(nèi)注射 50微克溶于PBS中的人IL-12 。收集這些小鼠的脾細(xì)胞，4艮據(jù)Oi和 Herzenberg,細(xì)月包免疫學(xué)選擇方法，B. Mishell和S. Shiigi編，W. H. Freeman and Co.，紐約，1980, pp351-372中的方法，使用50°/o w/v聚乙二醇 1500(Boehringer Mannheim),按1:1的比例將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì) 胞融合。將融合細(xì)胞以60,000個(gè)總細(xì)胞/孔的密度鋪于96孔聚簇板中的 IMDM培養(yǎng)基內(nèi)，所述培養(yǎng)基中添加有10% FBS(HycIone), 100單位/ml 青霉素G(BioWhittaker), 100pg/ml鏈霉素(BioWhittaker), 250ng/ml Fungizone(BioWhittaker)， 2mM谷氨酰胺(BioWhittaker)， 100|ng/ml石危酸雙 生霉素(BioWhittaker), 50pM 2-巰基乙醇(BioRad), 100|uM次黃嗓呤 (Sigma), 400nM氨基蝶呤(Sigma), 16^M胸苷(Sigma)和2.5% P388D1上 清液(按Nordan，R.P等，免疫學(xué)雜志，139:813(1987)所述制備)。通過下文所 述的1251-標(biāo)記的人正-12抗體免疫沉淀試驗(yàn)檢測雜交瘤上清液中特異性的抗 人IL-12抗體。通過有限稀釋克隆分泌抗人IL-U抗體的雜交瘤細(xì)胞系。通 過按Reik，L.等，免疫學(xué)方法雜志，100:123-130(1987)所述依次用辛酸和硫酸 銨處理，從腹水中純化抗體。實(shí)施例5制備1251-標(biāo)記的人IL-12使用以前描述于Chizzonite等，免疫學(xué)雜志，147:1548-1556(1991)和 Chizzonite等，免疫學(xué)雜志，148:3117-3124(1992)(皆列入本文作為參考)的 Iodogen(Pierce Chemical Co.)改良方法放射性標(biāo)記重組人IL-12 ，使其比活約 為2200Ci/mmol 。將Iodogen溶解于氯仿中，將0.05mg在12 x 15mm硼硅 酸鹽玻璃管中干燥。為了進(jìn)行放射性標(biāo)記，向含有O.051111 Tris-碘化緩沖液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.4M NaCl和ImM EDTA)的經(jīng)Iodogen-包被的管中 加入1.0mCi Na[125I](Amersham, Chicago, 111., USA),并于室溫下保溫6分 鐘。將激活的125I溶液轉(zhuǎn)移至含有0.1ml溶于Tris-硤化緩沖液的IL-12(31.5jig)的管中，室溫下保溫反應(yīng)6分鐘。保溫結(jié)束時(shí)，加入0.05ml Iodogen 終止緩沖液(含10mg/ml酪氨酸，10%甘油的Dulbecco氏PBS, pH7.40)并反應(yīng) 5分鐘。然后用1.0ml含l%(w/v)BSA的Tris-石典化緩沖液稀釋混合物，上樣 于Bio-Gel P10DG脫鹽柱(BioRad Laboratories(BRL))進(jìn)行層析。用含l%(w/v) BSA的Tris-石典化緩沖液洗脫柱，將含有峰量標(biāo)記蛋白質(zhì)的級(jí)分(lml)混合， 用含l%(w/v) BSA的Tris-碘化緩沖液稀釋至1 x io8 Cpm/ml 。 TCA可沉淀 的放射性(10。/。TCA終濃度)一般是總放射性的95%以上。重組人IL-12的放 射性比活一^:約為2200Ci/mmol 。實(shí)施例61251標(biāo)記的人IL-12的免疫沉淀試驗(yàn)通過在4 °C下，與100^1/孔含5pg/ml兔抗小鼠IgG的碳酸鹽包被緩沖 液(15mMNa2C03/35mMNaHC03), pH9.6保溫18小時(shí)，籍此用針對(duì)小鼠IgG 的兔親和純化抗體(Cappel, Durham, NC, USA)包4皮Nunc Maxisorp 96-孑L break-apart培養(yǎng)板。用PBS/0.05o/。吐溫-20/0.01。/。乙基汞疏代水楊酸鈉洗滌經(jīng) 包被的孔，然后于37 。C與200|il 1。/。(w/v)BSA/PBS/0.01。/。乙基汞硫代水楊酸 鈉保溫4小時(shí)以封閉這些孔。向抗小鼠IgG-包被的孔中加入雜交瘤上清液 (75|ul)，在22 。C保溫3小時(shí)。用300^1 PBS/0.05。/o吐溫-20/0.01。/o乙基汞硫代 水楊酸鈉將孔洗滌3次，向含100ial抗體稀釋緩沖液(PBS/l。/。BSA(w/v)/0.5M NaCl/0.05%吐溫-20/0.01%乙基汞硫代水楊酸鈉)的每個(gè)孔中加入 100,000cpm 1251-標(biāo)記的人IL-12 。 4 。C保溫18小時(shí)后，用200nl PBS/0.05% 吐溫-20/0.01%乙基汞疏代水楊酸鈉將孔洗滌3次，然后將孔分幵，使用y 計(jì)數(shù)器測定與孔結(jié)合的放射性的量。在一些實(shí)驗(yàn)中，在兔抗小鼠IgG-包被 的孔中保溫雜交瘤上清液之后，37 。C，將100|Lil按Gubler等，Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4143-4147(1991)所述制備的得自經(jīng)人IL-12 p40-轉(zhuǎn)染的COS細(xì) 胞的調(diào)整(conditioned)上清液在孔中保溫1小時(shí)，然后加入1251-標(biāo)記的人 IL-12以測定捕獲的小鼠抗人IL-12抗體是否與人IL-12p40亞單位結(jié)合。實(shí)施例7 鑒定單克隆的抗人IL-12抗體使用基于96孔培養(yǎng)板的免疫沉淀試驗(yàn)來鑒定分泌抗人IL-12抗體的雜 交瘤。在缺乏和存在lOOinl含有上述人IL-12 p40亞單位的COS細(xì)胞上清液 時(shí)保溫雜交瘤上清液。加入1251-標(biāo)記的人IL-12(100,000cpm/孔)，測定捕獲 至孔上的1251-標(biāo)記的人IL-12的量。圖1顯示出捕獲1251-標(biāo)記的人IL-12的 雜交瘤5F2, 16F2, 16G2, 20E11和17E2上清液中所含的抗體。另夕卜，免疫 沉淀反應(yīng)過程中未經(jīng)標(biāo)記的人IL-12 p40亞單位的存在不能阻斷抗體5F2, 16F2, 16G2和20E11捕獲'251-標(biāo)記的人IL-12 ,這表明這些抗體對(duì)單獨(dú)的 IL-12 p40亞單位不具有高親和性。與之形成對(duì)照的是，免疫沉淀反應(yīng)過程 中未經(jīng)標(biāo)記的人IL-12 p40亞單位的存在完全阻斷了 17E2捕獲1251-標(biāo)記的 人IL-12 ，這表明17E2識(shí)別人IL-12的p40亞單位。實(shí)施例8抗人IL-12單克隆抗體的分析等電聚焦使用Pharmacia Biotech的pH3.5-9.5 Ampholine PAGplate(編號(hào)為80-1124-80， Uppsala,瑞典)進(jìn)行分析等電聚焦。根據(jù)廠商說明，使用1M磷酸 和IN氫氧化鈉電極溶液進(jìn)行等電聚焦。將5個(gè)樣品上樣于凝膠，每份樣品 含有單個(gè)免疫球蛋白，即20E11, 5F2， 20C2, 16G2和16F2 。標(biāo)準(zhǔn)得自 Pharmacia Biotech的等電聚焦pH3-10校準(zhǔn)試劑盒(編號(hào)為H-0471-01)。電泳 條件為1000伏，10瓦，2.5小時(shí)，4 °C 。使用Pharmacia Biotech的PlusOne 蛋白質(zhì)銀染試劑盒(編號(hào)為17-1150-01),根據(jù)廠商說明銀染凝膠。圖2顯示 出抗人IL-12單克隆抗體20C2， 16G2, 16F2, 20E11和5F2的等電聚焦模式。實(shí)施例9抗人IL-12單克隆抗體的等電聚焦模式如圖2所示，單克隆抗體20C2(Chizzonite等，細(xì)胞因子，6:A82a(1994)), 20E11和5F2是獨(dú)特的免疫球蛋白。單克隆抗體16G2和16F2的等電聚焦 模式相同，但它們與20C2, 20E11和5F2都不同。這些抗體的pi范圍為 pH5-6 。實(shí)施例10 產(chǎn)生PHA-激活的淋巴母細(xì)胞使用PHA-激活4天的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)測定天然人IL-12-誘 導(dǎo)的和獼猴IL-12-誘導(dǎo)的增殖。分離PBMC(Gately等，J. Natl. Cancer Inst.， 69:1245(1982))并用0.1% PHA畫P(Difco Labs" Detroit, MI， USA)進(jìn)行刺激。3 天后，按上述用新鮮培養(yǎng)基和重組50U/ml人IL-12將培養(yǎng)物按1:1分開 (Gately, M. K., Chizzonite, R.和Presky, D. H.,測定人和小鼠的白細(xì)胞介素 12 ，免疫學(xué)最新方法，第1巻，J. E.Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach和W. Strober編，John Wiley & Sons公司，紐約，1995, p6.16.1-6.16.15)。細(xì)胞培養(yǎng)所用的補(bǔ)加培養(yǎng)基為先前所述的用于產(chǎn)生天然人 IL-12的培養(yǎng)基加上5%人AB血清(Irvine Scientific, Santa Ana， CA， USA)。實(shí)施例11淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)通過基于M. K. Gately等人(Gately, M. K,, Chizzonite, R.和Presky， D. H.， 測定人和小鼠的白細(xì)胞介素12 ,免疫學(xué)最新方法，第1巻，J. E.Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach和W. Strober編，John Wiley & Sons公司,紐約，1995， p6.16.1-6.16.15)的方法測定多種抗人IL-12單克隆抗 體對(duì)IL-12-和IL-2-刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖的作用。收集按上 述制備的PHA-激活4天的淋巴母細(xì)胞，將其洗滌并重新懸浮于補(bǔ)加培養(yǎng)基 中至4 x 1()S個(gè)細(xì)胞/ml,在96孔培養(yǎng)板中(2 x 104個(gè)細(xì)胞/孔)與純化的單 克隆抗人IL-12抗體和相關(guān)細(xì)胞因子，即人或猴IL-12保溫。將25pl天然人 IL-12(lng/ml)或猴IL-12(2ng/ml)的等分試樣與25^1多種稀釋度的抗人IL-12 單克隆抗體(mAb)等分試樣混合。孔中最終的抗體濃度為0.0005|ig/ml至 0.5pg/ml 。制備獨(dú)立的相同套的含有多種抗人IL-12 mAb和重組IL-2的孔 以測定抗人IL-12 mAb對(duì)IL-2-刺激的增殖的作用作為抑制特異性的量度。 還包括分別為250pg或500pg至0pg(未加入抗體)/孔人或猴IL-12的標(biāo)準(zhǔn)劑 量反應(yīng)曲線以測定IL-12的反應(yīng)性。37 。C將含有細(xì)胞因子和抗體之混合物 的培養(yǎng)板保溫30分鐘，然后向每孔中加入50pl細(xì)胞懸浮液等分試樣。將培 養(yǎng)板維持在37。C,含5% C02的潮濕空氣氛中達(dá)48小時(shí)，然后進(jìn)行3&胸 苷脈沖。向每孔中加入50|ul 10fxCi/mI 3&胸苷(用含5%FCS而不是5%人AB19血清的補(bǔ)加培養(yǎng)基稀釋)。37 。C再保溫6小時(shí)之后，經(jīng)由細(xì)胞收集器將孔中 的內(nèi)容物收集至玻璃纖維濾器上，使用液體閃爍計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞DNA中摻 入的3&胸苷。圖3和4中所示的ft值是3個(gè)平行試驗(yàn)孔中的平均值。實(shí)施例12通過單克隆抗人IL-12抗體抑制細(xì)胞因子-刺激的PHA-激活的淋巴母 細(xì)胞增殖抗體5F2, 16F2, 16G2和20E11以依賴于劑量的形式抑制0.25ng/ml IL-12刺激的PHA激活的人淋巴母細(xì)胞增殖(圖3)。這些抗人抗體的效力，定 義為對(duì)0.25ng/ml IL-12刺激的增殖產(chǎn)生50%最大抑制作用(1(:50)的濃度為 5F2 0.03)ng/ml, 16F2 0.01pg/ml， 16G2 0.01|ig/ml和20E11 0.01)ug/ml 。淋巴母 細(xì)胞增殖的最大(9440cpm)和背景(1480cpm)水平分別由圖中上方和下方的 水平虛線表示。如圖3所示，5F2, 16F2, 16GS和20E11抗體能夠至少90% 抑制人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母細(xì)胞增殖。與之形成對(duì)照的是， 如圖3所示，以前鑒定的抗人IL-12 p75特異性抗體20C2(Chizzonite等，細(xì) 胞因子，6:A82a(1994))基本上不能抑制人IL-12生物活性。另夕卜，如圖4所示，5F2, 16F2， 16G2和20E11能有效抑制0.5ng/ml獼 猴IL-12刺激的PHA激活的人淋巴母細(xì)胞增殖，其IC5o與在人IL-12-刺激 的增殖中所見的類似。與之形成對(duì)照的是，20C2對(duì)獼猴IL-12-刺激的增殖 僅有極小的抑制作用。因此，抗體5F2， 16F2, 16GS和20E11對(duì)獼猴IL-12 表現(xiàn)出良好的交叉反應(yīng)性，而20C2的交叉反應(yīng)性則低得多。這些單克隆抗 體都不能抑制IL-2誘導(dǎo)的增殖，這表明它們對(duì)IL-12-刺激的增殖的作用是 IL-12特異性的，而不是由于對(duì)細(xì)胞增殖的一般性抑制作用。實(shí)施例13Y干擾素合成試驗(yàn)使用按上述制備的PHA-激活4天的人淋巴母細(xì)胞誘導(dǎo)y干擾素(IFN-力 合成。所用培養(yǎng)基為RPMI1640和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基1:1的 混合物，其中的添加物與上述制備天然人IL-12所用的相同，另外還含有 5%熱-滅活(56 。C, 30分鐘)胎牛血清(Hyclone, Logan, UT, USA)以替代人AB 血清。在24孔組織培養(yǎng)板(Costar)的孔中建立雙份lml培養(yǎng)物。向每孔中加入5 x io5個(gè)PHA-激活的淋巴母細(xì)胞，0.25ng/ml純化的天然人IL-12 , 20 單位/ml重組人IL-12 , lng/ml重組人IL-1J3(由Dr. R. Chizzonite, Hoffmann-La Roche提供)，和指定濃度的抗人IL-12抗體。起初將除淋巴母 細(xì)胞外的所有試劑加入孔中并于37 。c保溫30分鐘，接著加入淋巴母細(xì)胞。 于37 °c,在含5%0)2的潮濕空氣氛中將培養(yǎng)物保溫24小時(shí)。保溫結(jié)束時(shí)， 離心收集培養(yǎng)物上清液，使用ELISA檢測其IFN-y含量。含有淋巴母細(xì)胞 與IL-2+IL-l而不是IL-12的培養(yǎng)物中產(chǎn)生的IFN-y量總是比除了含有IL-2+IL-l還含有0.25ng/ml IL-12的培養(yǎng)物產(chǎn)生的IFN-y量低15°/。，通常低5%。 檢測人IFN-y的ELISA使用了 Endogen(Woburn, MA)的單克隆抗人 IFN-y抗體。4 。C ，用100^d/孔含lpg/ml抗人IFN-y(Endogen存M-700A)的包 被緩沖液(含15mM Na2C03 + 35mM NaHC03的蒸餾水，pH9.6)將Nunc EIA 板(Fisher)包被過夜。第2天早晨，從孔中彈出(flicked out)包被緩沖液，每 孔加入200^1含有1。/。牛血清白蛋白(Sigma)的Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水 (D-PBS; Fisher)以封閉孔。室溫下保溫1小時(shí)之后，用含有0.05%吐溫 20(Sigma)的D-PBS洗滌板，向孔中加入100^1重組人IFN-y標(biāo)準(zhǔn)(Endogen) 或用檢測緩沖液(D-PBS+0.5。/。牛血清白蛋白+0.05。/。吐溫20)稀釋的培養(yǎng)物上 清液等分試樣。室溫下將培養(yǎng)板振蕩保溫2小時(shí)，然后再次洗潦板，向每測緩沖液。37 。c保溫培養(yǎng)板1小時(shí)，沖妄著進(jìn)行洗滌。然后向每孔中加入 100^1用檢測緩沖液按1:1000稀釋的鏈霉親和素-過氧化物酶(Sigma)等分試 樣，37 。c將培養(yǎng)板保溫30分鐘。再次洗滌培養(yǎng)板，然后加入100jLd TMB 過氧4匕物酶底物和過氧化物酶B ;容'液(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)的1:1的混合物等分試樣以顯色。約12分鐘之后通 過加入50^1/孔1MH3P04而終止反應(yīng)，減去650nm處的背景讀出450nm處 的吸收值。實(shí)施例14通過單克隆抗人il-12抗體抑制細(xì)胞因子-刺激的ifn吖產(chǎn)生抗體5F2， 16F2， 16G2和20E11以依賴于劑量的形式抑制0.25ng/ml人 IL-12刺激的PHA激活的人淋巴母細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y(圖5)。這些抗人抗體的 效力，定義為對(duì)0.25ng/ml人IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生具有50%最大抑制作用(ICso)的濃度為5F2 0.02|tig/ml, 16F2 0.02)iig/ml, 16G2 0.01嗎/ml和20E11 0.02pg/ml 。當(dāng)以濃度為0.5嗎/ml使用時(shí)，這些抗人異二聚體特異性IL-12 抗體抑制大于90% IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生。與之形成對(duì)照的是，以前筌 定的抗人IL-12 p75特異性抗體20C2(Chizzonite等，細(xì)胞因子，6:A82a(1994)) 效力較差，在濃度低于或等于0.5]ug/ml時(shí)，對(duì)IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生的抑 制作用不超過65%。實(shí)施例15產(chǎn)生抗人il-12抗體的雜交瘤細(xì)胞系中存在的抗體重鏈可變區(qū)的編碼 基因的序列分析使用Ultraspec RNA分離系統(tǒng)，才艮據(jù)廠商i兌明(Biotecx， Houston, TX, USA)從雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA 。在20^1體積中由lOjxg總RNA和寡-dT 引物合成第一鏈cDNA。將4pl cDNA反應(yīng)混合物等分試樣用作PCR擴(kuò)增 小鼠IgG重鏈可變區(qū)時(shí)所用的模板，所述PCR使用的引物是根據(jù) Dattamajumdar等(A. K. Dattamajumdar等，免疫遺傳學(xué)43:141 -151 (1996》報(bào) 道的構(gòu)架1和4的序列資料設(shè)計(jì)的。使用50 °C為退火溫度進(jìn)行30輪PCR 反應(yīng)。苯酚提取，乙醇沉淀整個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在1%低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠上 進(jìn)行以分離擴(kuò)增子。從凝膠上切下DNA片斷，于70 'C融化，取5pl再次 在30輪PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增以產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。凝膠純化再次擴(kuò)增的擴(kuò)增 子，4吏用基于熒光的Sanger測序法，用Applied Biosystems Incorporated自 動(dòng)測序〗義進(jìn)行測序。實(shí)施例16單克隆抗人il-12抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列和推定的氨基酸序列 由雜交瘤細(xì)胞系HIL-12F3-16G2和HIL-12F3-20E11產(chǎn)生IL-12抗體， 包含該抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)l,互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)l， FR2， CDR2， FR3, CDR3和FR4的免疫球蛋白重鏈基因可變區(qū)部分的核苷酸序列及其推定的氨基酸序 列分別示于圖6和圖7。下劃線的是CDR序列?？衫玫男蛄匈Y料的比較 顯示出雜交瘤HIL-12F3-16G2和HIL-12F3-20E11產(chǎn)生的抗體的重鏈在DNA 水平上表現(xiàn)出94%的同源性，在氨基酸水平上表現(xiàn)出93%的相似性。序列表(1) 一般資料(i)申請(qǐng)人(A) 姓名F. Hoffmann-La Roche AG(B) 街道Grenzacherstrasse 124(C) 城市Basle(D) 州BS(E) 國家瑞士(F) 郵政編碼(ZIP): CH-4002(G) 傳真:061-6881395(H) 電報(bào)962292/965542 hlr ch(ii) 發(fā)明題目抗人IL-12抗體(iii) 序列數(shù)4(iv) 計(jì)算機(jī)可讀形式(A) 介質(zhì)類型軟盤(B) 計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C) 操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D) 軟件Patent In Release # 1.0, Version # 1.25(EPO)(2) SEQIDNO:l的資料(i) 序列特征(A) 長度321個(gè)堿基對(duì)(B) 類型核苷酸(C) 鏈型雙鏈(D) 拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii) 分子類型cDNA (ix)特征(A) 名稱/關(guān)鍵詞CDS(B) 位置1..321(xi)序列描述SEQIDNO:l :<formula>formula see original document page 24</formula>Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val 50 55 60Ser 工le Thr Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gin Tyr Tyr Leu Gin Leu Ser 65 70 75 80Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ale Arg Ser Ser 85 90 95Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr 100 105(2) SEQIDNO:3的資料(i) 序列特征(A) 長度308個(gè)堿基對(duì)(B) 類型核苷酸(C) 鏈型雙鏈(D) 拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii) 分子類型cDNA (ix)特征(A) 名稱/關(guān)鍵詞CDS(B) 位置1..306(xi)序列描述SEQIDNO:3:GAG GluGAG GluTCA SerGGA GlyCCT ProCTC LeuGTG ValAAA LysCCT TCT CAG Pro Ser Gin 10ACT CTG TCC CTC Thr Leu Ser Leu 15ACC ThrTGTTCTGTC 20ACTGGCGAC AspTCC SerATC lie 25ACC AGT GGT Thr Ser Giy丁AC TGG AAC TGG Tyr Trp Asr. Trp 30CGGAAA Lys 35TTC PheCCA ProGAT AspAATThr 40CTT LreuGAG TAC ATG Glu Tyr MetGGA TAC ATA AGT Gly Tyr工le Ser"4TAC TyrAGT 50GGT G工ySerACTTAC TyrTAC Tyr 5SAAT AsnCCA ProTCT CTC AGA Ser Leu Arg 60ACT CGA ATC TCC Ser Arg lie SerL92ATC ACT CGA GAC ACA TCC AAG AAC CAG TAC TCC ATG CA^ TTG AAT TCT 工le Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Tyr Ser Met Gin Leu Asn Ser 65 70 75 80240GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA TCC TCG GAT Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Asp 85 90 95288GCT ATG GAC TAC TGG GGC GC Ala Me亡Asp Tyr Trp Gly(2) SEQ IDNO:4的資料(i) 序列特征(A) 長度102個(gè)氨基酸(B) 類型氨基酸 (D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii) 分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO:4 :Glu Glu Ser* Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu 15 10 15Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser lie Thr Ser Gly Tyr Trp Asn Trp 20 25 30工le Arg Lys Phe Pro Asp Asn Thr Leu Glu Tyr Met Gly Tyr工le Ser 35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Ars 工le Ser 50 55 60工le Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Tyr Ser !'!et Gin Leu Asn Ser 65 " O 75 80Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Asp 85 90 "30SAla Met Asp Tyr Trp Gly 100
權(quán)利要求
1.人IL-12p75異二聚體的抗體，所述異二聚體由p35亞單位和p40亞單位組成，所述抗體(a)與人IL-12的p75異二聚體所呈遞的表位發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，但不與所述p40亞單位所呈遞的任何表位發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)；和(b)由哺乳動(dòng)物產(chǎn)生，優(yōu)選由編碼IL-12之p35亞單位或p40亞單位的基因有缺損的小鼠產(chǎn)生。
2. 人IL-12的單克隆抗體，所述IL-12由形成p75異二聚體的p35亞單 位和p40亞單位組成，所述單克隆抗體(a) 與人IL-12的p75異二聚體所呈遞的表位發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，但不與 所述p40亞單位所呈遞的任何表位發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)；和(b) 中和人IL-12的至少約90%生物活性。
3. 權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體通過抑制IL-12刺激的PHA激活 的人淋巴母細(xì)胞增殖而中和人IL-12的至少約90%生物活性，其中所述抗體 的濃度為0.5嗎/ml，所述人IL-12的濃度為0.25ng/ml。
4. 權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體通過抑制IL-12刺激的IFN-y產(chǎn)生 而中和人IL-12的至少約卯％生物活性，其中所述抗體的濃度為0,5pg/ml, 所述人IL-12的濃度為0.25ng/ml。
5. 權(quán)利要求1至4之一的抗體，其中所述抗體與獼猴IL-12交叉反應(yīng)。
6. 權(quán)利要求l-5之一的抗體，其中所述抗體由小鼠的細(xì)胞系產(chǎn)生。
7. 權(quán)利要求l-6之一的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
8. 權(quán)利要求1 -7之一的抗體，其中所述抗體由雜交瘤產(chǎn)生，尤其是ATCC 保藏號(hào)為HB-12446，HB-12447，HB-12448或HB-12449的雜交瘤產(chǎn)生。
9. 權(quán)利要求l-8之一的抗體，其中所述抗體是人源化的。
10. 雜交瘤，其產(chǎn)生權(quán)利要求l-9之一所述的抗體。
11. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求l-9之一所述抗體中的至少一種。
12. 產(chǎn)生抗體的方法，所述抗體選擇性地與由p35亞單位和p40亞單位 組成的人IL-12的p75異二聚體發(fā)生免疫反應(yīng)，所述方法包括步驟(a)用人IL-12的p75異二聚體免疫哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，所述哺乳動(dòng) 物中編碼所述p35亞單位或所述p40亞單位的基因有缺損；(b) 從經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物中得到抗體；(c) 篩選所述抗體選擇性結(jié)合由p75異二聚體所呈遞的表位的能力，以 得到所述的選擇性結(jié)合的抗體。
13. 產(chǎn)生單克隆抗體的方法，所述單克隆抗體選擇性地與由p35亞單位 和p40亞單位組成的人IL-12的p75異二聚體發(fā)生免疫反應(yīng)，所述方法包括 以下步驟(a) 用人IL-12的p75異二聚體免疫哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物中編碼所 述p35亞單位或所述p40亞單位的基因有缺損；(b) 從經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物中收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；(c) 由所述細(xì)胞形成產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，并得到所述單克隆抗體；(d) 篩選由所述雜交瘤產(chǎn)生的所述單克隆抗體選擇性結(jié)合到p75異二聚 體所呈遞的表位上的能力，以得到所述的選擇性結(jié)合的單克隆抗體。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中進(jìn)一步篩選和選擇雜交瘤所產(chǎn)生的抗體與 獼猴IL-12交叉反應(yīng)的能力。
15. 權(quán)利要求l-9之一的抗體，其由權(quán)利要求12-14之一的方法或包含 權(quán)利要求12-14之一所述方法的方法產(chǎn)生。
16. 權(quán)利要求l-9之一的抗體，為治療活性劑。
17. 權(quán)利要求1-9之一的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物可控制具 有由免疫機(jī)制介導(dǎo)之病理學(xué)的疾病，尤其是與導(dǎo)致異常Thl-型輔助細(xì)胞活 性的IL-12生物活性增加相關(guān)之疾病，如自身免疫病，例如多發(fā)性硬化，風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎，自身免疫性糖尿病，包括節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎的炎 性腸疾病(IBD)。
全文摘要
本發(fā)明涉及p75異二聚體特異性抗人IL-12抗體，其特征在于中和人IL-12生物活性的潛力比已知的異二聚體特異性IL-12單克隆抗體更高，效力比其更大。異二聚體特異性抗體識(shí)別人IL-12p75異二聚體的一個(gè)或多個(gè)表位，但不與單獨(dú)的p40亞單位結(jié)合。異二聚體特異性IL-12抗體中和獼猴1L-12生物活性的效力與中和人IL-12生物活性的效力相似，這使得它們成為有用的IL-12拮抗劑。
文檔編號(hào)A61P37/02GK101274962SQ200810001628
公開日2008年10月1日 申請(qǐng)日期1999年1月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月23日
發(fā)明者戴維·H·普雷斯基, 莫爾西·K·蓋特利 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司