專利名稱：：蜂王膠分解酶含有物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由西方蜜蜂(^&me仏/em)的2~3日齡蜂王幼蟲制備的蜂王膠分解酶含有物、上述蜂王膠分解酶含有物中所含有的蜂王膠分解酶、以使用上述蜂王膠分解酶含有物或上述蜂王膠分解酶進(jìn)行制備為特征的蜂王膠分解物、以及使用上述蜂王膠分解酶含有物或上述蜂王膠分解酶的蜂王膠的分解方法。
背景技術(shù)：
：蜂王膠是為了使蜂王幼蟲生長，工蜂從咽下腺和上顎(mandible)腺分泌的乳白色膠狀的營養(yǎng)物質(zhì)。由于蜂王與工蜂在遺傳上是同質(zhì)的，因此認(rèn)為蜂王膠中包含某些誘導(dǎo)向蜂王分化的控制因子，但上述物質(zhì)尚未明確。上述控制因子以及向蜂王分化的誘導(dǎo)機(jī)理的闡明對(duì)于提高蜂王的人工生產(chǎn)效率等是有用的，因此正由世界上的研究者進(jìn)行研究。蜂王膠根據(jù)蜂群、品種、蜜蜂采花蜜或花粉等的花的種類等而變化，但是通常鮮重的約2/3為水分，且以蛋白質(zhì)、糖類和脂肪酸為主要成分。此外，也含有大量的維生素或礦物質(zhì)等，營養(yǎng)價(jià)值非常優(yōu)異。此外，雖然未在科學(xué)上得到證實(shí)，但是一直認(rèn)為具有疲勞恢復(fù)作用、抗過敏作用、抗癌作用、免疫增強(qiáng)作用等大量的藥理作用。因此，廣泛用于營養(yǎng)輔助食品或藥品原料。近年，約占蜂王膠干燥重量的40%的蛋白質(zhì)作為蜂王膠的主要生理活性物質(zhì)而備受矚目。特別是，大量報(bào)告了利用蜂王膠蛋白質(zhì)分解物的生理活性的發(fā)明。例如，報(bào)告了(1)涉及感染防御機(jī)能增強(qiáng)劑的發(fā)明，其特征在于，含有作為有效成分的、通過蛋白酶分解蜂王膠中的蛋白質(zhì)而得到的分子量為3000以下的肽(例如，參照專利文獻(xiàn)l。)。上述發(fā)明是基于下述知識(shí)而提出的發(fā)明即，通過蛋白酶產(chǎn)生的蜂王膠蛋白質(zhì)分解物，與未分解的蜂王膠蛋白質(zhì)相比，感染防御機(jī)能優(yōu)異，而且粘度低且為水溶性，穩(wěn)定性優(yōu)異，所以容易添加到食品中以及口服攝取。此外，還報(bào)告了(2)涉及用胰蛋白酶處理蜂王膠原料而得到的具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用的蛋白分解物的發(fā)明(例如，參照專利文獻(xiàn)2。)。此外，作為涉及用作食品的蜂王膠分解物的發(fā)明，還報(bào)告了(3)低過敏原蜂王膠，該低過敏原蜂王膠為降低了過敏性的低過敏原蜂王膠，其特征在于，含有10-羥基癸烯酸和來自蜂王膠的肽性成分，所述肽性成分由分子量4.5kDa以下的成分構(gòu)成(例如，參照專利文獻(xiàn)3。)。上述發(fā)明是基于下述知識(shí)而提出的發(fā)明即，通過蛋白質(zhì)分解酶處理和使用p-甘露糖苷酶的糖分解酶處理，在來自蜂王膠的肽性成分中分解除去易引起過敏的分子量超過4.5kDa的成分，/人而容易降低過壽丈性。如此，對(duì)于蜂王膠分解物、特別是對(duì)蜂王膠蛋白質(zhì)分解物所具有的各種各樣的生理活性有很多報(bào)告，但是闡明具體的生理活性物質(zhì)、以至其具體的作用機(jī)理的報(bào)告非常少。生理活性物質(zhì)的特定和作用機(jī)理的闡明有助于蜜蜂的分化機(jī)理的闡明、對(duì)人等動(dòng)物更有效的藥品或機(jī)能性食品等的開發(fā)，所以強(qiáng)烈期望對(duì)蜂王膠分解物進(jìn)行進(jìn)一步的研究、研究。而且，為了有效地進(jìn)行蜂王膠分解物的研究等，重要的是得到含有豐富的機(jī)能性肽等生理活性高的分解物的蜂王膠分解物。專利文獻(xiàn)1:日本特開平8-59499號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特開2005-255670號(hào)7>才艮專利文獻(xiàn)3:日本特開2005-287411號(hào)公4艮但是，以上述(1)方法為代表的現(xiàn)在使用的方法大多只是使用通用的蛋白酶等來適當(dāng)?shù)胤纸夥渫跄z蛋白質(zhì)而已。上述通用蛋白酶等由于不以蜂王膠作為本來的基質(zhì)，因此在不適當(dāng)?shù)牟课环纸?，有可能使本來有用的肽的機(jī)能失去活性。通過使用以蜂王膠作為基質(zhì)的蛋白酶等，可以解決上述問題，但是尚未發(fā)現(xiàn)這種酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供最佳的蜂王膠分解酶以及上述蜂王膠分解酶含有物，用于從蜂王膠中有效地得到機(jī)能性肽等生理活性高的分解物。此外，本發(fā)明的目的在于，提供以使用上述蜂王膠分解酶含有物等進(jìn)行制備為特征的蜂王膠分解物、以及使用上述蜂王膠分解酶含有物等的蜂王膠的分解方法。本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果認(rèn)為，以蜂王膠為主食、且通過攝食蜂王膠來控制向蜂王分化的蜂王幼蟲先天具有最適于分解蜂王膠的分解酶，從而，通過從蜂王幼蟲的幼蟲體液提取物中分離含有具有蜂王膠蛋白質(zhì)的分解活性的酶的餾分來完成本發(fā)明。即，本發(fā)明提供蜂王膠分解酶含有物，通過包括下述工序的方法由西方蜜蜂(^^me仏/era)的2~3日齡蜂王幼蟲制備(a)在6。C以下對(duì)上述蜂王幼蟲的體組織懸浮物進(jìn)行離心處理，從而分離為三層，即固體上層、溶液中層、沉淀下層的工序；(b)回收上述中層作為:fe奪王膠分解酶含有物的工序。此外，本發(fā)明提供蜂王膠分解酶含有物，其特征在于，上述離心處理為8000-12000xg、5分鐘以上的離心處理。此外，本發(fā)明提供蜂王膠分解酶含有物，通過包括下述工序的方法由西方蜜蜂的2~3日齡蜂王幼蟲制備(a，)將上述蜂王幼蟲用冰冷卻生理鹽水洗滌后過濾，從而制備體組織懸浮物的工序；(b，)使用pH7的50mM磷酸緩沖液稀釋上述體組織懸浮物后，在10000xg、5。C下進(jìn)行10分鐘的離心處理，從而分離為三層，即固體上層、懸浮溶液中層、沉淀下層的工序。(c，)回收上述中層作為蜂王膠分解酶含有物的工序。此外，本發(fā)明提供蜂王膠分解物，使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解6酶含有物制備。此外，本發(fā)明提供蜂王膠分解物，通過使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到，并且，其具有下述特點(diǎn)(1)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的非特異性的細(xì)胞變性作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王月交水溶性餾分相比降低；(2)對(duì)由淀粉樣蛋白所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相等；(3)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖作用，與未進(jìn)行酶處理的蟲奪王膠水溶性餾分相比增大；(4)對(duì)人輪狀病毒感染的感染抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比增大。此外，本發(fā)明提供抗氧化劑，將通過使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。此外，本發(fā)明提供細(xì)胞增殖劑，將通過使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。此外，本發(fā)明提供感染抑制劑，將通過使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。此外，本發(fā)明提供神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)抑制劑，將通過使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。此外，本發(fā)明提供蜂王膠的分解方法，其特征在于，使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶含有物。此外，本發(fā)明提供蜂王膠分解酶，其特征在于，包含在上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶含有物中。此外，本發(fā)明提供蜂王膠分解酶，其特征在于，酶活性的最佳pH為7或9。此外，本發(fā)明提供蜂王膠分解物，使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶制備。此外，本發(fā)明提供蜂王膠的分解方法，其特征在于，使用上述任意一項(xiàng)記載的蜂王膠分解酶。通過本發(fā)明的蜂王膠分解酶含有物和蜂王膠分解酶，可以不損害蜂王膠中所含有的機(jī)能性肽等所具有的生理活性而將蜂王膠分解。此外，通過本發(fā)明的蜂王膠分解酶含有物等分解的蜂王膠分解物由于含有豐富的生理活性高的機(jī)能性肽等，在蜂王膠的生理活性的研究、研究中，可以提供非常有效的樣品。進(jìn)一步地，通過使用本發(fā)明的蜂王膠分解物，可以提供與以往食用的含有蜂王膠的食品等相比，機(jī)能性和消化吸收性優(yōu)異的食品等。此外，通過本發(fā)明的蜂王膠分解方法，可以有效地分解蜂王膠。圖1為對(duì)添加混合有蜂王膠蛋白質(zhì)和含有蜂王膠分解酶的溶液的酶反應(yīng)液在37。C下進(jìn)行反應(yīng)后，為了分離酶反應(yīng)液中的蜂王膠蛋白質(zhì)而進(jìn)行SDS-PAGE的結(jié)果得到的染色像按照pH表示的圖。圖1A中pH為4、圖1B中pH為5、圖1C中pH為6、圖1D中pH為6.5、圖1E中pH為7、圖1F中pH為7.5、圖1G中pH為8、以及圖1H中pH為9。各圖的泳道上的數(shù)字表示各自的反應(yīng)時(shí)間。此外，M表示分子量標(biāo)記(marker)。箭頭a表示約51kDa的帶，箭頭b表示約46kDa的帶。圖2為對(duì)實(shí)施例1的SDS-PAGE結(jié)果按照pH表示的圖。圖2A為pH7的染色像、圖2B為pH9的染色像。各圖的泳道上的數(shù)字表示各自的反應(yīng)時(shí)間、M表示分子量標(biāo)記。箭頭a表示約51kDa的帶、箭頭b表示約46kDa的帶、箭頭c表示約33kDa的帶、以及箭頭d表示約25kDa的帶。圖3為在實(shí)施例1中對(duì)圖2的染色像的帶的強(qiáng)度進(jìn)行測定，以反應(yīng)開始時(shí)間O下的帶強(qiáng)度為1，表示隨著反應(yīng)時(shí)間的推移帶強(qiáng)度變化的圖。圖3A表示約51kDa的帶的強(qiáng)度比，圖3B表示約46kDa的帶的強(qiáng)度比，圖3C表示約33kDa和約25kDa的帶的強(qiáng)度比。圖3A和圖3B中的表示pH7的帶，0表示pH9的帶。此外，圖3C中的A表示pH7下約33kDa的帶，A表示pH7下約25kDa的帶。圖4為表示在實(shí)施例2中pH9的條件下分解蜂王膠蛋白質(zhì)的結(jié)果的圖。圖4A表示由SDS-PAGE的結(jié)果得到的凝膠的染色像、圖4B表示約46kDa的帶的強(qiáng)度比。圖4A中的泳道上的數(shù)字表示各自的反應(yīng)時(shí)間、M表示分子量標(biāo)記。此外，箭頭a表示約51kDa、箭頭b表示約46kDa。圖5為表示實(shí)施例3中測定的280nm的吸光度的結(jié)果的圖。圖5A為反應(yīng)開始前的結(jié)果、圖5B為反應(yīng)開始后8小時(shí)的結(jié)果、圖5C為反應(yīng)開始后16小時(shí)的結(jié)果、以及圖5D為反應(yīng)開始后24小時(shí)的結(jié)果。此外，圖中的箭頭a表示約350kDa的蛋白質(zhì)的餾分、箭頭b表示約60kDa的蛋白質(zhì)的餾分、箭頭c表示約5kDa的蛋白質(zhì)的餾分、箭頭d表示約3kDa的蛋白質(zhì)的餾分、以及范圍e表示數(shù)百Da的蛋白質(zhì)的餾分。圖6為實(shí)施例8的使用HiTrapDesalting色語柱的柱色譜中，測定吸光度(280nm)和傳導(dǎo)率的結(jié)果得到的圖。實(shí)線表示蜂王膠分解物(pH9)的吸光度、虛線表示蜂王膠分解物(pH7)的吸光度、雙點(diǎn)劃線表示蜂王膠分解物(pH9)的傳導(dǎo)率、點(diǎn)劃線表示蜂王膠分解物(pH7)的傳導(dǎo)率。圖中，"D1"為作為餾分D1取出的餾分，"D2"為作為餾分D2取出的餾分。圖7為表示實(shí)施例8中使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量的圖。圖7A為添加含有餾分Dl(pH9)的培養(yǎng)液時(shí)的結(jié)果，圖7B為添加含有餾分Dl(pH7)的培養(yǎng)液時(shí)的結(jié)果。圖中，"NC"表示對(duì)照培養(yǎng)液、"PC"表示含有10%FCS的培養(yǎng)液。此外，各濃度表示各培養(yǎng)液中的來自餾分D1的蛋白質(zhì)濃度。圖8為實(shí)施例9的使用Cosmosil(注冊(cè)商標(biāo))5C18-AR色i普柱的柱色i普中，測定吸光度(215nm)和傳導(dǎo)率的結(jié)果得到的圖。實(shí)線表示餾分D2(pH9)的吸光度、虛線表示餾分D2(pH7)的吸光度、雙點(diǎn)劃線表示餾分D2(pH9)的傳導(dǎo)率、點(diǎn)劃線表示鎦分D2(pH7)的傳導(dǎo)率。圖中，"C1(pH7)"為作為餾分C1(pH7)取出的餾分、"C1(pH9)"為作為餾分C1(pH9)取出的餾分、"C2(pH7)"為作為餾分C2(pH7)取出的餾分、"C2(pH9)，，為作為餾分C2(pH9)取出的條分。圖9為表示實(shí)施例9中使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量的圖。圖9A為添加含有餾分Cl(pH9)的培養(yǎng)液時(shí)的結(jié)果，圖9B為添加含有餾分Cl(pH7)的培養(yǎng)液時(shí)的結(jié)果。圖中，"NC"表示對(duì)照培養(yǎng)液、"PC"表示含有10%FCS的i咅養(yǎng)液。圖10為表示實(shí)施例9中使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量的圖。圖10A為添加含有餾分C2(pH9)的培養(yǎng)液時(shí)的結(jié)果，圖10B為添加含有餾分C2(pH7)的培養(yǎng)液時(shí)的結(jié)果。圖中，"NC"表示對(duì)照培養(yǎng)液。此外，各濃度表示各培養(yǎng)液中的來自餾分C2的蛋白質(zhì)濃度。圖ll為表示實(shí)施例10中各PBS樣品溶液的BSA濃度結(jié)果的圖。圖11A為添加蜂王膠分解物時(shí)的結(jié)果、圖11B為添加抗壞血酸時(shí)的結(jié)果、圖11C為添加肌肽時(shí)的結(jié)果。圖12為表示實(shí)施例7中蜂王膠分解物的細(xì)胞增殖活性的圖。圖12A為在pH7下對(duì)蜂王膠分解酶含有物進(jìn)行處理時(shí)的結(jié)果，圖12B為在pH9下對(duì)蜂王膠分解酶含有物進(jìn)行處理時(shí)的結(jié)果。圖13為表示實(shí)施例11中SDS-PAGE結(jié)果的圖。箭頭a表示約55kDa的帶、箭頭b表示約46kDa的帶。具體實(shí)施方式本發(fā)明中的蜂王幼蟲若為西方蜜蜂的2~3日齡的蜂王幼蟲則不特別限定。可以為活著的新鮮幼蟲或冷凍保存后的幼蟲。由于認(rèn)為蜂王膠(下文簡稱為RJ。)分解酶等的活性高，優(yōu)選使用活著的新鮮幼蟲。幼蟲的冷凍保存可以通過常規(guī)方法進(jìn)行，但是為了防止RJ分解酶失去活性，優(yōu)選使用液氮等急速冷卻后，在-80。C下保存。本發(fā)明中的體組織懸浮物是指幼蟲的體組織、主要是內(nèi)臟和體液的懸浮物。對(duì)上述內(nèi)臟等不特別限定，但是優(yōu)選為幼蟲個(gè)體的全部體組織的懸浮物。由幼蟲制備體組織懸浮物的方法若為通常由動(dòng)物等制備組織懸浮液的方法則不特別限定。例如，可以使用篩等過濾幼蟲的全部體組織或內(nèi)臟或者體液，也可以使用研缽、混合器、均化器等制備。由于可以在緩和的條件下制備體組織懸浮物，優(yōu)選使用篩等進(jìn)行過濾。上述篩優(yōu)選篩眼的尺寸為80目120目。使用混合器等時(shí)，為了防止產(chǎn)生過量的熱，優(yōu)選添加生理鹽水等進(jìn)行。而且，為了防止混入雜質(zhì)，幼蟲優(yōu)選在制備體組織懸浮物之前，在冷凍保存時(shí)在保存之前，預(yù)先用生理鹽水等洗滌。為了制備本發(fā)明的RJ分解酶含有物，首先，作為工序(a)，通過在6。C以下對(duì)蜂王幼蟲的體組織懸浮物進(jìn)行離心處理，分離為白色固體的上層、黃白色混濁溶液的中層、含有白色到稍褐色的沉淀的下層三層。進(jìn)行離心處理前，優(yōu)選使用中性且低濃度的緩沖液等進(jìn)行稀釋，從而適當(dāng)對(duì)體組織懸浮物的粘度或濃度進(jìn)行調(diào)整。這是由于體組織懸浮物的粘性或濃度高時(shí)，有可能降低RJ分解酶的提取效率、使操作性惡化。作為上述緩沖液，例如有磷酸緩沖液(50mM、pH7.0)或生理鹽水等。而且，推定上述上層為脂質(zhì)成分、上述下層為體組織的不溶性成分。對(duì)于上述離心處理的條件若可以將體組織懸浮物離心分離為三層則不特別限定，但是優(yōu)選在8000-12000xg、6。C以下進(jìn)行5分鐘以上的離心處理。特別優(yōu)選在10000xg、5。C下進(jìn)行IO分鐘的離心處理。離心速度低的情況或者離心時(shí)間短的情況下，有可能不能順利地分離為三層。然后，作為工序(b)，將三層中的中層作為蜂王膠分解酶含有物進(jìn)行回收，從而可以制備本發(fā)明的RJ分解酶含有物。上述回收方法可以通過常規(guī)方法進(jìn)行。為了提高提取精度，優(yōu)選在與工序(a)相同的條件下對(duì)上述中層再次進(jìn)行離心處理。在工序(b)之后，為了除去混入到上述中層中的不溶性的組織片等不溶物，優(yōu)選對(duì)上述中層進(jìn)行過濾。由于可以防止因微生物所導(dǎo)致的污染，優(yōu)選在上述過濾中使用0.2lim的過濾器等。含有物中，幼蟲體液提取物中所含有的酶有可能失去活性，離心處理優(yōu)選在36。C下進(jìn)行。此外，其它的操作優(yōu)選在水冷卻下進(jìn)行。本發(fā)明的RJ分解物可以通過本發(fā)明的RJ的分解方法、即使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物來制備。上述RJ可以為新鮮的RJ或?qū)⒏稍锓勰㏑J還原得到的RJ。此外，上述RJ可以為任意產(chǎn)地的RJ，可以為任意蜂種產(chǎn)生的RJ。進(jìn)一步地，上述RJ也可以為通過常規(guī)方法由RJ通過常規(guī)方法分離得到的蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選為RJ的水溶性蛋白質(zhì)。這是由于可以期待含有大量的具有生理活性的物質(zhì)。RJ的水溶性蛋白質(zhì)的分離若為可以分離水溶性蛋白質(zhì)和疏水性蛋白質(zhì)的方法則可以使用任意方法。作為上述方法，例如有用乙酸乙酯或丁醇等有機(jī)溶劑對(duì)混合有水溶性溶劑和RJ的懸浮液進(jìn)行分配處理而萃取純化的方法、通過將上述懸浮液靜置后進(jìn)行離心處理得到上清液的方法等。例如，可以通過向RJ或RJ的水溶性蛋白質(zhì)中添加本發(fā)明的RJ分解酶含有物進(jìn)行培養(yǎng)的方法制備RJ分解物。RJ等也可以預(yù)先使用磷酸緩沖液等進(jìn)行稀釋。此外，也可以使用用磷酸緩沖液等調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度或粘度的RJ分解酶含有物。上述培養(yǎng)的溫度或時(shí)間，若為不抑制本發(fā)明的RJ分解酶含有物的RJ分解活性的條件則不特別限定，但是反應(yīng)溫度條件優(yōu)選為30~40°C、特別優(yōu)選為34~38°C。此外，pH優(yōu)選為6.5-10,pH特別優(yōu)選為7-9.5。在pH為7~7.5的反應(yīng)條件下進(jìn)行時(shí)，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中，約51kDa的位置上以帶的形式表示的蛋白質(zhì)主要被分解，在pH為8.5~9的反應(yīng)條件下進(jìn)行時(shí)，在SDS-PAGE中，約46kDa的位置上以帶的形式表示的蛋白質(zhì)主要被分解。以下對(duì)本發(fā)明的RJ的分解方法進(jìn)行更具體的說明。首先，使用Lowry法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)通過后述實(shí)施例1中記載的方法制備的RJ分解酶含有物的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定后，使用pH7的50mM磷酸緩沖液進(jìn)行稀釋，由此制備6mg/mL的含有RJ分解酶的溶液。接著，向8mL的緩沖液中添加lmL的通過后述參考例2中記載的方法制備的RJ蛋白質(zhì)溶液(30mg/mL)和lmL的上述含有RJ分解酶的溶液(6mg/mL),進(jìn)行混合制備酶反應(yīng)液。使上述酶反應(yīng)液在37°C下反應(yīng)，冰冷卻、停止反應(yīng)后，通過SDS-PAGE確認(rèn)RJ蛋白質(zhì)的變化。對(duì)于分離的RJ蛋白質(zhì)使用CBBR-250染色。緩沖液分別使用pH為4、5和5.5的50mM的乙酸緩沖液，pH為6、6.5、7和7.5的50mM的磷酸緩沖液，pH8和pH9的50mM的Tri-HCl緩沖液。圖1為按照pH表示SDS-PAGE的結(jié)果的圖。圖lA中pH為4、圖1B中pH為5、圖1C中pH為6、圖1D中pH為6.5、圖1E中pH為7、圖1F中pH為7.5、圖lG中pH為8、以及圖1H中pH為9。各圖的泳道上的數(shù)字表示各自的反應(yīng)時(shí)間。此外，M表示分子量標(biāo)記。若將通過后述參考例2中記載的方法制備的RJ蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行SDS-PAGE，在約51kDa和約46kDa的位置上檢測出較強(qiáng)的帶。箭頭a表示約51kDa的帶，箭頭b表示約46kDa的帶。結(jié)果可知，在pH6~9下RJ蛋白質(zhì)通過由含有RJ分解酶的溶液進(jìn)行的處理而減少，以及隨著pH的增大分解速度加快。特別是，確認(rèn)了在pH77.5的反應(yīng)條件下，約51kDa的蛋白質(zhì)主要被分解，在pH8.5~9的反應(yīng)條件下，約46kDa的蛋白質(zhì)主要被分解。即，由圖1的結(jié)果可知，通過后述實(shí)施例1中記載的方法制備的RJ分解酶含有物中，含有分解RJ蛋白質(zhì)的酶。解的圖案不同，因此上述RJ分解酶含有物中至少含有兩種分解酶。即，上述RJ分解酶含有物中含有酶活性的最佳pH為6.5~7.5、優(yōu)選pH為7~7.5、更優(yōu)選pH為7的RJ分解酶和酶活性的最佳pH為8~9、優(yōu)選pH為9的RJ分解酶。通過使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物，在pH9下對(duì)RJ優(yōu)選進(jìn)行2小時(shí)以上、更優(yōu)選4小時(shí)以上、更進(jìn)一步優(yōu)選4小時(shí)~30小時(shí)、特別優(yōu)選4小時(shí)~24小時(shí)的酶處理而得到的RJ分解物具有各種生理活性。上述生理活性，與未進(jìn)行酶處理的RJ水溶性餾分所具有的生理活性相比，具有幾個(gè)特征。例如，上述RJ分解物，對(duì)于由淀粉樣蛋白所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的RJ水溶性餾分相等，但是對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的非特異性的細(xì)胞變性作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比降低。更具體地說，蛋白質(zhì)濃度為30~125嗎/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉樣蛋白肽共存時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞存活率，與相同蛋白質(zhì)濃度的未進(jìn)行酶處理的RJ水溶性餾分和2mg/ml的淀粉樣蛋白肽共存時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞存活率大致相同，即兩者之比(RJ分解物/未進(jìn)行酶處理的RJ水溶性餾分)為1左右，優(yōu)選為0.9-1.1。另一方面，蛋白質(zhì)濃度為60~1000ixg/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉樣蛋白肽共存時(shí)，與相同蛋白質(zhì)濃度的未進(jìn)行酶處理的RJ水溶性餾分和2mg/ml的淀粉樣蛋白肽共存時(shí)相比，減少呈現(xiàn)出細(xì)胞變形的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目。此外，上述RJ分解物對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比增大。更具體地說，蛋白質(zhì)濃度為60-1000嗎/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉樣蛋白肽共存時(shí)，與相同蛋白質(zhì)濃度的未進(jìn)行酶處理的RJ水溶性餾分和2mg/ml的淀粉樣蛋白肽共存時(shí)相比，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加。此外，上述RJ分解物對(duì)于人輪狀病毒感染的感染抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比增大。更具體地說，在人輪狀病毒和上述RJ分解物的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，與在人輪狀病毒和未進(jìn)行酶處理的RJ水溶性餾分存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)相比，輪狀病毒感染細(xì)胞數(shù)目減少。通過使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物，在pH9下對(duì)RJ進(jìn)行優(yōu)選2小時(shí)以上、更優(yōu)選4小時(shí)以上、更進(jìn)一步優(yōu)選4小時(shí)~30小時(shí)、特別優(yōu)選4小時(shí)~24小時(shí)的酶處理而得到的RJ分解物也具有抗氧化活性。因此，上述RJ分解物可以用作抗氧化劑。例如，上述RJ分解物通過其抗氧化活性可以抑制由于一氧化氯(CIO.)等自由基所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分解。RJ由于自古以來為攝食的食品，所以上述RJ分解物也非常安全，與抗壞血酸等同樣地，可以期待用作添加到々欠食品中的抗氧化劑或者以保護(hù)生物體不受氧化應(yīng)激為目的而攝食的增補(bǔ)劑的有效成分等。通過使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物，在pH9下對(duì)RJ進(jìn)行優(yōu)選2小時(shí)以上、更優(yōu)選4小時(shí)以上、更進(jìn)一步優(yōu)選4小時(shí)~30小時(shí)、特別優(yōu)選4小時(shí)~24小時(shí)的酶處理而得到的RJ分解物由于具有上述生理活性，所以可以作為抗氧化劑、細(xì)胞增殖劑、(病毒)感染抑制劑、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡抑制劑等的有效成分而存在。上述細(xì)胞增殖劑中的上述RJ分解酶含有物的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選為0.5mg/ml~lmg/ml。這些生理活性劑可以作為增補(bǔ)劑等々欠食品單獨(dú)攝食，也可以與其它的飲食用組合物或藥用組合物同樣地用作飲食品或藥品中的添加劑。將上述RJ分解物作為有效成分的這些生理活性劑的制備方法若為不抑制上述RJ分解物的生理活性的方法則不特別限定，通?？梢允褂弥苽浜蠷J或RJ分解物的飲食用組合物或藥用組合物時(shí)所使用的方法進(jìn)行制備。對(duì)這些生理活性劑的劑型不特別限定，但是優(yōu)選為適于口服劑的劑型。例如，可以為軟膠嚢劑、硬膠嚢劑、片劑或糖漿劑等。此外，這些生理活性劑中所含有的上述RJ分解物量若為上述RJ分解物的生理活性可以發(fā)揮作用效果的量則不特別限定，可以考慮作為原料的RJ的種類、所需的上述RJ分解物的生理活性、劑型等來適當(dāng)決定。分解物的生理活性可以發(fā)揮作用效果的量則不特別限定，可以根據(jù)攝取的人或動(dòng)物的體重、年齡、性別等來適當(dāng)決定。例如，優(yōu)選每天l次或分成數(shù)次攝取300mg~3g。實(shí)施例以下舉出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但是本發(fā)明并不限定于以下實(shí)施例。[參考例1]幼蟲懸浮物的制備采集約15g的3日齡西方蜜蜂的蜂王幼蟲后，用冰冷卻的生理鹽水洗滌。然后，通過使用聚酯制的平均ioo目的布("r卜口y"、東k社制)過濾蜂王幼蟲，破壞幼蟲的表皮，榨出體液和內(nèi)臟。由此制備乳白色的幼蟲懸浮物。[參考例2]RJ蛋白質(zhì)溶液的制備向RJ(中國產(chǎn)浙江省江山恒亮蜂產(chǎn)品有限公司制)10ml中加入pH7.0的50mM磷酸緩沖液20mL進(jìn)行混合，制備RJ稀釋溶液。將上述RJ稀釋溶液在25000xg、5'C下離心20分鐘后，除去不溶性成分，回收上清液。然后，用pH7.0的50mM磷酸緩沖液稀釋上述上清液，制備30mg/mL的RJ蛋白質(zhì)溶液。[實(shí)施例1]1.RJ分解酶含有物的制備將通過參考例1中記載的方法制備的幼蟲懸浮物用pH7的50mM磷酸緩沖液稀釋2倍后，在10000xg、5。C下離心10分鐘。通過上述離心處理，分離為白色固體的上層、黃白色混濁溶液的中層、含有白色到稍褐色的沉淀的下層三層。推定上述上層為脂質(zhì)成分、上述下層為不溶性的體組織等?；厥丈鲜鲋袑雍螅M(jìn)一步在10000xg、5。C下離心IO分鐘分離成三層，回收中層作為RJ分解酶含有物。對(duì)于上述RJ分解酶含有物，為了除去未除盡的不溶性組織片且進(jìn)行滅菌，使用0.2pm的纖維素乙酸酯類過濾器(DISMIC-25CS、ADVANTEC公司制)進(jìn)行過濾。由此，得到黃色透明的RJ分解酶含有物。2.RJ蛋白質(zhì)的分解使用Lowry法以BSA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)上述RJ分解酶含有物的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定，使用pH7的50mM磷酸緩沖液制備3mg/mL的含有RJ分解酶的溶液。向8mL的緩沖液中添加lmL的通過上述參考例2中記載的方法制備的RJ蛋白質(zhì)溶液(30mg/mL)和通過上述實(shí)施例1中記載的方法制備的lmL的含有RJ分解酶的溶液(6mg/mL)，進(jìn)行混合制備酶反應(yīng)液。上述緩沖液使用pH7的50mM的磷酸緩沖液或者pH9的50mM的Tri-HCl緩沖液。使上述酶反應(yīng)液在37。C下反應(yīng)，冰冷卻、停止反應(yīng)后，通過SDS-PAGE分離RJ蛋白質(zhì)。干燥使用CBBR-250染色的凝膠后，使用熒光掃描儀Typhoon9400(Tt〉Y厶A4才廿J工>只社制)得到染色像。圖2為按照pH表示SDS-PAGE的結(jié)果的圖。圖2A為pH7的染色像、圖2B為pH9的染色像。各圖的泳道上的數(shù)字表示各自的反應(yīng)時(shí)間、M表示分子量標(biāo)記。箭頭a表示約51kDa的帶、箭頭b表示約46kDa的帶、箭頭c表示約33kDa的帶、以及箭頭d表示約25kDa的帶。其結(jié)果，確認(rèn)了在pH7和pH9兩者下，約51kDa和約46kDa的蛋白質(zhì)^皮分解。特別是可知，在pH9下，在反應(yīng)開始后4小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)，約46kDa的蛋白質(zhì)^皮分解成無法4企測出的程度。此外，在pH7下，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，檢測出約33kDa和約25kDa的蛋白質(zhì)。使用圖像分析軟件ImageQuant(GE、/k只少7,'<才廿<工:x^社制)，對(duì)圖2的染色像的各帶的帶強(qiáng)度進(jìn)行定量。圖3以反應(yīng)開始時(shí)間0下的帶強(qiáng)度為1，表示了隨著反應(yīng)時(shí)間的推移帶強(qiáng)度的變化。圖3A表示約51kDa的帶的強(qiáng)度比，圖3B表示約46kDa的帶的強(qiáng)度比，圖3C表示約33kDa和約25kDa的帶的強(qiáng)度比。圖3A和圖3B中的表示pH7的帶，〇表示pH9的帶。此外，圖3C中的a表示pH7下約33kDa的帶，A表示pH7下約25kDa的帶。如圖3A和圖3B所示，可以定量地確認(rèn)在pH7和pH9兩者下，約51kDa和約46kDa的蛋白質(zhì)凈皮分解。此外，由圖3C的結(jié)果確認(rèn)了在pH7下，直至反應(yīng)開始后16小時(shí)，約33kDa和約25kDa的蛋白質(zhì)增加。該結(jié)果暗示了約33kDa和約25kDa的蛋白質(zhì)有可能是約51kDa或約46kDa的蛋白質(zhì)通過含有RJ分解酶的溶液中所含有的RJ分解酶分解得到的分解物。[實(shí)施例2]除了使反應(yīng)時(shí)間為60分鐘之外，全部與實(shí)施例1的pH9條件下的反應(yīng)同樣地操作，分解RJ蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE分離RJ蛋白質(zhì)，對(duì)各帶的強(qiáng)度進(jìn)行定量。圖4A表示凝膠的染色像、圖4B表示約46kDa的帶的強(qiáng)度比。圖中的泳道上的數(shù)字表示各自的反應(yīng)時(shí)間、M表示分子量標(biāo)記。此外，箭頭a表示約51kDa、箭頭b表示約46kDa。結(jié)果確認(rèn)了約46kDa的蛋白質(zhì)通過含有RJ分解酶的溶液中所含有的RJ分解酶，在反應(yīng)開始后1小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)分解大約80°/。。而且，由圖4B可知，在反應(yīng)開始后5分鐘的時(shí)刻得到了幾乎未產(chǎn)生分解的結(jié)果，但是推測這是因?yàn)樵陂_始由RJ分解酶進(jìn)行酶反應(yīng)之前，在37。C下不預(yù)先培養(yǎng)RJ蛋白質(zhì)溶液，因此直至開始酶反應(yīng)發(fā)生了時(shí)間滯后。[實(shí)施例3]除了使反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)之外，全部與實(shí)施例1的pH7條件下的反應(yīng)同樣地操作，分解RJ蛋白質(zhì)。然后，對(duì)水冷卻、停止反應(yīng)的酶反應(yīng)液使用Superdex200HR10/30(77少7社制)實(shí)施凝膠滲透色鐠法，分離上述酶反應(yīng)溶液中所含有的蛋白質(zhì)。凝膠滲透色語，使用含有0.15M氯化鈉的50mM的磷酸緩沖液(pH7)作為洗脫液，在流速0.5mL/min，5。C的條件下進(jìn)行。為了檢測分離的蛋白質(zhì)，使用UV檢測器測定280nm的吸光度。圖5為表示實(shí)施例3中測定的280nm的吸光度結(jié)果的圖。圖5A為反應(yīng)開始前的結(jié)果、圖5B為反應(yīng)開始后8小時(shí)的結(jié)果、圖5C為反應(yīng)開始后16小時(shí)的結(jié)果、以及圖5D為反應(yīng)開始后24小時(shí)的結(jié)果。此外，圖中的箭頭a表示約350kDa的蛋白質(zhì)的餾分、箭頭b表示約60kDa的蛋白質(zhì)的餾分、箭頭c表示約5kDa的蛋白質(zhì)的餾分、箭頭d表示約3kDa的蛋白質(zhì)的餾分、以及范圍e表示數(shù)百Da的蛋白質(zhì)的餾分。由圖5的結(jié)果可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，約350kDa和約60kDa的蛋白質(zhì)減少的同時(shí)，約5kDa、約3kDa以及數(shù)百Da的蛋白質(zhì)增加。由此推測增加的約5kDa等的蛋白質(zhì)為約350kDa等的蛋白質(zhì)的分解物。換而言之，由通過凝膠滲透色譜分離的結(jié)果可以確認(rèn)，通過本發(fā)明的RJ分解酶含有物，RJ的高分子蛋白質(zhì)被分解。[實(shí)施例4]與參考例2同樣地制備RJ蛋白質(zhì)溶液(30mg/mL)。此外，除了使稀釋后的濃度為3mg/mL之外全部與實(shí)施例1同樣地操作制備了含有RJ分解酶的溶液(3mg/mL)。向8mL的緩沖液中添加lmL的上述RJ蛋白質(zhì)溶液(30mg/mL)和lmL的上述含有RJ分解酶的溶液(3mg/mL),進(jìn)行混合制備了酶反應(yīng)液。上述緩沖液使用pH7的50mM的磷酸緩沖液或者pH9的50mM的Tri-HCl緩沖液。使上述反應(yīng)液分別在4、20、37以及50。C下反應(yīng)，冰冷卻、停止反應(yīng)。將在各溫度的恒溫槽中混合上述酶反應(yīng)液的時(shí)刻作為反應(yīng)開始時(shí)刻，使反應(yīng)時(shí)間為4、16、24小時(shí)。通過對(duì)冰冷卻后的上述酶反應(yīng)液與實(shí)施例1同樣地分離RJ蛋白質(zhì)，觀察反應(yīng)溫度的影響。其結(jié)果，在37。C下與實(shí)施例2同樣地，在pH7和pH9兩者下，觀察到約51kDa和約46kDa的蛋白質(zhì)的分解。特別是在pH9下，在反應(yīng)開始4小時(shí)的時(shí)刻約46kDa的蛋白質(zhì)被分解至檢測限以下，約51kDa的蛋白質(zhì)在反應(yīng)開始16小時(shí)的時(shí)刻也,皮分解至^r測限以下。與此相對(duì)地，4。C下、在pH7和pH9兩者下，幾乎未觀察到約51kDa和約46kDa的蛋白質(zhì)的分解。2(TC下與37。C的情況相比，雖然分解反應(yīng)進(jìn)行緩慢，但是觀察到約51kDa和約46kDa的蛋白質(zhì)的分解。另一方面，50。C下，與37。C相比分解反應(yīng)進(jìn)一步加快，在pH7和pH9兩者下，確認(rèn)了在反應(yīng)開始4小時(shí)的時(shí)刻大部分的蛋白質(zhì)被分解?？傊芍?，在2050。C的溫度范圍內(nèi)，本發(fā)明的RJ分解酶含有物可以分解RJ，以及在上述溫度范圍內(nèi)，溫度越高則通過本發(fā)明的RJ分解酶含有物進(jìn)行的RJ的分解反應(yīng)越快。但是，通常在5(TC下，有可能引起RJ的發(fā)褐或RJ蛋白質(zhì)的變性等。因此，通過本發(fā)明的RJ分解酶含有物分解RJ時(shí)，優(yōu)選在37°C附近溫度下進(jìn)行。[實(shí)施例5]研究了使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物得到的RJ分解物所具有的針對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的生理活性。具體地說，研究了針對(duì)初代培養(yǎng)的小鼠胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞的、由淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的RJ分解物的影響。而且，小鼠胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞是在37°C、5。/。C02氣氛下，將通過常規(guī)方法從小鼠胚胎中采取的海馬神經(jīng)細(xì)胞以4.0x104cells/well接種在培養(yǎng)了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的96孔多孔板上，從而進(jìn)行培養(yǎng)。作為細(xì)胞培養(yǎng)液，使用含有B27增補(bǔ)劑的二-一口戸一廿^乂r<々厶(《7'3社制)。實(shí)驗(yàn)中使用培養(yǎng)后經(jīng)過一周后的細(xì)月包。首先，向RJ(中國產(chǎn)浙江省江山恒亮蜂產(chǎn)品有限公司制)5mL中加入pH7.0的50mM磷酸緩沖液15mL進(jìn)行混合，制備RJ稀釋溶液。將上述Rj稀釋溶液在25000xg、5。C下離心20分鐘后，除去不溶性成分，回收上清液。然后，通過將上述上清液冷凍干燥，得到RJ水溶性粗餾分。使用pH7.0的50mM磷酸緩沖液稀釋上述RJ水溶性粗餾分，制備30mg/mL的RJ水溶性4且餾分溶液。然后除了使用上述RJ水溶性粗餾分溶液來替代通過上述參考例2中記載的方法制備的RJ蛋白質(zhì)溶液、以及使反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)之外，全部與實(shí)施例1同樣地操作，分解上述RJ水溶性粗餾分溶液中所含有的RJ蛋白質(zhì)，得到RJ分解物。向培養(yǎng)小鼠胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞的96孔多孔板中添加淀粉樣蛋白肽(、7°f"卜'研究所制)和RJ水溶性粗餾分溶液或RJ分解物后，培養(yǎng)48小時(shí)。淀粉樣蛋白肽以2mg/mL的濃度在37。C下保溫48小時(shí)后，添加成最終濃度為20jig/mL。此外，RJ水溶性粗餾分溶液、pH7下分解得到的RJ分解物、或者pH9下分解得到的RJ分解物添加成各蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)液中的最終濃度分別為0、31.25、62.5、125、250、500或1000嗎/mL。作為對(duì)照使用不添加淀粉樣蛋白肽和RJ分解物等的任意一種、添加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液而得到樣品。然后，通過使用了抗Map2抗體(Sigma公司制、CatNo.B2261)的免疫染色或赫希斯特(Hoechst)33342色素(Sigma公司制、CatNo.M4403)染色識(shí)別死亡細(xì)胞，分別對(duì)各培養(yǎng)皿中的小鼠胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)目、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活數(shù)目進(jìn)行測定。進(jìn)一步地，通過顯微鏡觀察對(duì)觀察到細(xì)胞變形的小鼠胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行測定。而且，細(xì)胞變形是指神經(jīng)細(xì)胞從具有樹突的細(xì)胞體和軸突構(gòu)成的神經(jīng)細(xì)胞特有的形態(tài)發(fā)生變化。上述變化中，例如有，形成突起、軸突的萎縮、多軸突化、神經(jīng)細(xì)胞之間的凝聚、神經(jīng)細(xì)胞的死亡等。[表l]蛋<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表1表示小鼠胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目等的測定結(jié)果。存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目和變性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目以對(duì)照樣品的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目為100%表示，此外，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目以對(duì)照樣品的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為100%表示。若向初代培養(yǎng)的小鼠胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞中添加淀粉樣蛋白肽，則約60%的神經(jīng)細(xì)胞死亡，存活率約為40%。若同時(shí)添加淀4分樣蛋白肽和RJ水溶性粗餾分溶液，則RJ水溶性粗餾分溶液容量依賴性地抑制由淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。最大存活率恢復(fù)至60~70%。RJ水溶性粗餾分溶液帶來的上述效果在62.5~250嗎/mL的低濃度下也被認(rèn)可。但是，若添加1000嗎/mL以上的RJ水溶性粗餾分溶液，則觀察到非特異性的神經(jīng)細(xì)胞變形作用。添加在pH7下分解得到的RJ分解物時(shí)，觀察到與添加RJ水溶性粗餾分溶液時(shí)大致相同的效果。另一方面，添加在pH9下分解得到的RJ分解物時(shí)，也與RJ水溶性粗餾分溶液同樣地觀察到由淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的抑制效果。進(jìn)一步地，與RJ水溶性粗餾分溶液等相比，降低非特異性的神經(jīng)細(xì)胞變形作用，提高對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖作用。推測這是因?yàn)榇龠M(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的增殖的結(jié)果，更好地發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效果，因此降低RJ水溶性粗餾分溶液所具有的非特異性神經(jīng)細(xì)胞變形作用。由表l的結(jié)果可知，使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物、在pH9下進(jìn)行4小時(shí)以上的酶處理而得到的RJ分解物具有下述特征對(duì)于由淀粉樣蛋白所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分大致相同；對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的非特異性的細(xì)胞變性作用，與未進(jìn)^f亍酶處理的蟲奪王膠水溶性餾分相比顯著降低；且對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比提高。為了研究使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物得到的RJ分解物所具有的、針對(duì)人輪狀病毒感染的感染抑制活性，進(jìn)行中和活性試驗(yàn)。具體地說，通過以下記載的方法，向來自恒河猴胚胎腎臟的MA104細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)添加人輪狀病毒和RJ或RJ分解物，由此觀察RJ分解物對(duì)于人輪狀病毒感染的影響。作為上述RJ，使用與實(shí)施例4同樣地操作制備的RJ水溶性粗餾分溶液。作為上述RJ分解物，使用除了使反應(yīng)溫度為37°C、反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)之外，全部與實(shí)施例4同樣地操作，在pH7下分解得到的RJ分解物、或者在pH9下分解得到的RJ分解物。上述MA104細(xì)胞在37°C、5。/。C02氣氛下培養(yǎng)。繼代后3天期間，作為細(xì)胞增殖用培養(yǎng)液，使用向含有10%FCS(胎牛血清SIGMA公司制)和10%TPB(胰蛋白磷酸鹽肉湯DIFCO公司制)的Eagle'sMEM培養(yǎng)基(日水制藥社制)中添加若干量的抗生素等得到的培養(yǎng)液。繼代第3天以后，除了將10。/。FCS替代為2。/。FCS之外，使用與上述細(xì)胞增殖用培養(yǎng)液相同組成的培養(yǎng)液作為細(xì)胞維持用培養(yǎng)液。作為上述若干量的抗生素等，使用1%青霉素鏈霉素(使用將100萬單位/瓶的青霉素G鉀(萬有制藥抹式會(huì)社制)1瓶和lg(效價(jià))/1瓶的硫酸鏈霉素(明治制菓株式會(huì)社制)1瓶用滅菌PBS(-)定量至100ml后，用過濾器滅菌過濾得到的青霉素鏈霉素)和1%兩性霉素B(三共抹式會(huì)社制)。中和活性試驗(yàn)首先，在24cm2TC培養(yǎng)瓶中以5.0x105cells/flask接種，并在37。C下培養(yǎng)5天得到單層的MA104細(xì)胞，用添加有0.025%EDTA的0.125%胰蛋白酶溶液將上述MA104細(xì)胞剝離，進(jìn)行離心分離后，除去上清液，以2x105cells/ml加入細(xì)胞增殖用培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸浮液。向該細(xì)胞懸浮液中添加人輪狀病毒溶液(宮城縣癌癥中心、海老名卓三郎氏受讓的人輪狀病毒M04朱(血清型3):保持在-80。C下直至使用時(shí))和RJ水溶性粗餾分溶液或RJ分解物。然后，在24孔載玻片上分別各注入20pl，37。C下培養(yǎng)22小時(shí)。對(duì)于上述人輪狀病毒溶液，通過預(yù)先用胰蛋白酶溶液在37。C下進(jìn)行30分鐘預(yù)培養(yǎng)使其活化，添加至最終濃度為6.5xl04FCFU/mL。此外，對(duì)于上述RJ水溶性粗餾分溶液和上述RJ分解物(pH7下分解得到的RJ分解物或pH9下分解得到的RJ分解物)，分別在37°C下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，分別添加至各蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)液中的最終濃度為表2記載的濃度。作為對(duì)照使用添加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液來替代上述RJ分解物等的樣品。然后用抽吸器除去培養(yǎng)液，向各孔中各加入20^1的已滅菌的去離子蒸餾水，對(duì)殘留在載波片上的鹽類進(jìn)行洗滌、風(fēng)干后，在冷丙酮中浸漬20分鐘進(jìn)行固定，再次進(jìn)行風(fēng)干，保持在-30。C下直至測定。然后，作為一次抗體，將特異性地識(shí)別鴿輪狀病毒林PO-13的VP6的P3-l(歧阜大學(xué)應(yīng)用生物科學(xué)部獸醫(yī)學(xué)科獸醫(yī)公眾衛(wèi)生講座受讓的抗體)稀釋成5000倍得到的樣品放置在固定的細(xì)胞上，在暗濕潤箱中37。C下使其致敏45分鐘后，用PBS(-)振蕩洗滌3、5和7分鐘。然后，作為二次抗體，放置FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(AmericanQualex公司制)，37。C下使其致敏45分鐘。接著，與一次抗體致敏后同樣地用PBS(-)洗滌細(xì)胞后，在載波片上滴數(shù)滴甘油緩沖液，用蓋玻片封固，通過焚光顯孩H竟對(duì)感染鴒輪狀病毒的MA104細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行測定。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表2表示人輪狀病毒的中和活性試驗(yàn)的結(jié)果。感染細(xì)胞數(shù)目以對(duì)照樣品的感染細(xì)胞數(shù)目作為100%表示。添加RJ水溶性粗餾分溶液時(shí)，觀察到在約300jig/mL以上的濃度下促進(jìn)病毒感染，在約300pg/mL以下的濃度下抑制病毒感染。換而言之，暗示了有可能具有高濃度下促進(jìn)感染、低濃度下抑制感染的作用兩面性。另一方面，觀察到在pH7下分解得到的RJ分解物具有在37>ig/mL以上的濃度下促進(jìn)病毒感染，在18.5jxg/mL以下的濃度下抑制病毒感染的趨勢。換而言之，在pH7下分解得到的RJ分解物與RJ水溶性粗餾分溶液同樣地，高濃度下促進(jìn)感染、低濃度下抑制感染，但是從抑制感染向促進(jìn)感染轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)濃度偏向低濃度側(cè)。與此相對(duì)地，添加40嗎/mL以下濃度的在pH9下分解得到的RJ分解物時(shí)，與添加RJ水溶性粗餾分溶液時(shí)相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的感染抑制效果。特別是在pH9下分解得到的RJ分解物在16.5pg/mL以下的濃度表現(xiàn)出蛋白質(zhì)濃度依賴性的感染抑制效果。此外，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)以上時(shí)，反應(yīng)時(shí)間越長的RJ分解物在低濃度下的感染抑制效果的濃度依賴性越顯著。由表2的結(jié)果可知，使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物、在pH9下進(jìn)行4小時(shí)以上的酶處理而得到的RJ分解物具有下述特征對(duì)于人輪狀病毒感染的感染抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比增大。[實(shí)施例7]為了研究使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物得到的RJ分解物所具有的細(xì)胞增殖活性，使用來自大鼠小腸的IEC-6細(xì)胞實(shí)施WST-1法。WST-1法是通過測定細(xì)胞酶的代謝活性測定活細(xì)胞數(shù)目的方法?；罴?xì)胞進(jìn)行呼吸運(yùn)動(dòng)時(shí)，通過脫氫酶的作用乳酸、琥珀酸成為丙酮酸、富馬酸，此時(shí)NAD+成為NADH。WST-1法中，向細(xì)胞中加入0.2mM的l-MethoxyPMS和WST-1試劑作為基質(zhì)。1-MethoxyPMS轉(zhuǎn)換成1-MethoxyPMS還原型、(NADH成為NAD+)l-MethoxyPMS還原型形成l-MethoxyPMS時(shí)，通過WST-1試劑產(chǎn)生黃色的曱簪(formazane)。對(duì)產(chǎn)生的甲簪用微讀板器測定其吸光度。WST-1法i)試劑的制備WST-1試劑向WST-1(和光純藥工業(yè)抹式會(huì)社、CellCountingKit.No.345-06463)16.3mg和HEPES23.8mg中加入l-MethoxyPMS(0.2mM)5ml，用孔徑0.22pm的過濾器(MILLEX-GV、已滅菌、Millipore公司制)過濾滅菌。ii)試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備將RJ分解物溶解在DMEM(含有1%FCS)中，用孔徑0.22pm的過濾器(MILLEX-GV、已滅菌、Millipore公司制)過濾滅菌。iii)實(shí)驗(yàn)操作IEC-6細(xì)胞是對(duì)10cm培養(yǎng)皿中形成鋪滿培養(yǎng)物(confluent)進(jìn)行胰蛋白酶處理，并懸浮在DMEM(含有1%FCS)10ml中。以lOOOrpm離心5分鐘吸引除去上清液后，以2.0xl05cells/ml懸浮在DMEM(含有10%FCS)培養(yǎng)基中，每100nl接種在96孔板上。25在C02培養(yǎng)箱(5%C02、37°C)中培養(yǎng)24小時(shí)前，確認(rèn)細(xì)胞粘合后，將DMEM(含有10%FCS)培養(yǎng)基吸引除去后，轉(zhuǎn)移到100|il的試-瞼培養(yǎng)基中。在C02培養(yǎng)箱中進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)后，吸引除去試驗(yàn)培養(yǎng)基，分別在各孔中加入DMEM(含有10%FCS)培養(yǎng)基lOOpl、WST-1試劑10^1，37。C下在5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。然后，向各孔中各加入100^1的HC1,通過孩i讀板器在450nm(參照波長600nm)下測定吸光度。作為上述RJ分解物，除了使反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)之外全部與實(shí)施例4同樣地操作，分別使用pH7下分解得到的RJ分解物、或者pH9下分解得到的RJ分解物。IEC-6細(xì)胞的培養(yǎng)通過常規(guī)方法進(jìn)行。所得到的結(jié)果如圖12A和圖12B所示。其結(jié)果，確認(rèn)了對(duì)于pH7下分解得到的RJ分解物，RJ分解物的濃度為lmg/mL以下、具體地說為0.1~lmg/ml以下時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，超過lmg/mL時(shí)抑制細(xì)胞增殖。此外，確認(rèn)了對(duì)于pH9下分解得到的RJ分解物、特別是RJ分解物濃度為0.5~lmg/ml時(shí)有意義地促進(jìn)細(xì)胞增殖。由實(shí)施例6和7的結(jié)果推測出，作為在實(shí)施例6中觀察到RJ蛋白質(zhì)的濃度依賴性地促進(jìn)以及抑制病毒感染的兩面性的理由之一，可能是由于RJ蛋白質(zhì)的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果。換而言之，暗示了作為控制細(xì)胞增殖的原因之一，可能是RJ蛋白質(zhì)及其肽片段表現(xiàn)出控制人輪狀病毒感染的作用。[實(shí)施例8]為了更具體地對(duì)使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物而得到的RJ分解物所具有的細(xì)胞增殖活性進(jìn)行分析，研究了對(duì)RJ分解物進(jìn)行脫鹽處理后的細(xì)胞增殖活性。1.脫鹽處理首先，除了使反應(yīng)溫度為37°C、反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)之外全部與實(shí)施例4同樣地操作，使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物，分別制備了pH7下進(jìn)行酶處理而得到的RJ分解物(以下有時(shí)稱為RJ分解物(pH7)。)、和pH9下進(jìn)行酶處理而得到的RJ分解物(以下有時(shí)稱為RJ分解物(pH9)。)。使用HiTrapDesalting色語柱(GE、》義少7*,'4才廿4工7只社制)、通過下述方法分別對(duì)得到的RJ分解物(pH7)和RJ分解物(pH9)進(jìn)行尺寸分離。i)樣品的制備使用Millipore公司制"MILLI-Q(注冊(cè)商標(biāo))，，凈化的水(下文簡稱為";、卩Q水")中溶解各樣品至100~150mg/mL后，在1500rpm下離心分離5分鐘，用過濾器(MILLEX、孔徑0.45pm、Millipore公司制)過濾上清液。ii)緩沖液的制備使用用超聲波洗滌器脫氣的S!iQ水。iii)操作方法將色譜柱連接到AKTAexplorerSystem(GE少7乂《寸才廿行工7^社制)，以10ml/min的流速流動(dòng)20%乙醇進(jìn)行洗滌。然后，以10ml/min的流速流動(dòng)已脫氣的、；yq水進(jìn)行平衡。將imi樣品填充到色譜柱上后，以10ml/min的流速進(jìn)行洗脫，在安裝于餾分收集器上的試驗(yàn)管中各回收0.5ml。根據(jù)280nm下測定吸光度(mAU)和傳導(dǎo)率(ms/cm)得到的洗脫圖案，分別取出脫鹽的餾分(以下稱為餾分Dl)和含有鹽的餾分(下文稱為餾分D2)兩種餾分。圖6為在使用HiTrapDesalting色譜柱的柱色語中，測定吸光度(280nm)和傳導(dǎo)率的結(jié)果得到的圖。實(shí)線表示RJ分解物(pH9)的吸光度、虛線表示RJ分解物(pH7)的吸光度、雙點(diǎn)劃線表示RJ分解物(pH9)的傳導(dǎo)率、點(diǎn)劃線表示RJ分解物(pH7)的傳導(dǎo)率。圖中，"D1"為作為餾分Dl取出的餾分，"D2"為作為餾分D2取出的餾分。2.細(xì)胞增殖活性的測定除了細(xì)胞的培養(yǎng)液使用在不含有FCS等增殖因子的培養(yǎng)液(對(duì)照培養(yǎng)液)中含有RJ分解物(pH9)的餾分D1(餾分D1(pH9))的培養(yǎng)液、或者在對(duì)照培養(yǎng)液中含有RJ分解物(pH7)的餾分D1(餾分D1(pH7))的培養(yǎng)液之外，與實(shí)施例7同樣地操作，對(duì)使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量進(jìn)行測定。作為陽性對(duì)照使用含有10。/。FCS的培養(yǎng)液、作為陰性對(duì)照使用對(duì)照培養(yǎng)液。使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量以添加各培養(yǎng)液時(shí)產(chǎn)生的曱,產(chǎn)物量相對(duì)添加對(duì)照培養(yǎng)液時(shí)產(chǎn)生的曱腦產(chǎn)物量的比例表示。圖7為表示使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量的圖。圖7A為使用含有餾分D1(pH9)的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果，圖7B為使用含有餾分D1(pH7)的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果。圖中，"NC"表示對(duì)照培養(yǎng)液、"PC"表示含有10%FCS的培養(yǎng)液。此外，各濃度表示各培養(yǎng)液中的來自餾分D1的蛋白質(zhì)濃度。如圖7A的結(jié)果所示可知，培養(yǎng)液中的餾分D1(pH9)濃度依賴性地增大細(xì)胞增殖量。特別是使用餾分D1(pH9)濃度為50.5嗎/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，與使用含有10%FCS的培養(yǎng)液時(shí)的促進(jìn)細(xì)胞增殖程度大致相同。但是，在餾分D1(pH9)濃度為84.2嗎/mL以上的培養(yǎng)液時(shí)，觀察到細(xì)胞增殖量濃度依賴性地減少，所以暗示了通過餾分D1(pH9)所實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果(細(xì)胞增殖活性)存在最佳濃度。另一方面，如圖7B的結(jié)果所示可知，在培養(yǎng)液中含有餾分D1(pH7)時(shí)細(xì)胞增殖量幾乎沒有變化，餾分D1(pH7)不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖有顯著影響。即，由實(shí)施例8的結(jié)果可知，使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物、在pH9下進(jìn)行酶處理而得到的RJ分解物具有細(xì)胞增殖活性。[實(shí)施例9]'l明的RJ分解酶含有砵勿而4尋到有的細(xì)胞增殖活性進(jìn)行分析，研究了對(duì)RJ分解物進(jìn)行粗純化后的細(xì)胞增殖活性。l.粗純化使用Cosmosil(注冊(cè)商標(biāo))5C18-AR色i普柱(大力，4fX夕社制)，通過下述方法對(duì)實(shí)施例8中制備的RJ分解物(pH9)的餾分D2(餾分D2(pH9))和RJ分解物(pH7)的餾分D2(餾分D2(pH7))進(jìn)行粗純化。i)樣品的制備分別將上述餾分D2(pH9)和餾分D2(pH7)用過濾器(MILLEX、孔徑0.45fim、Millipore乂>司制)過濾，力口入TFA至0.05%濃度。ii)緩沖液的制備a)吸附緩沖液0.05。/。TFA溶液使用超聲波洗滌器對(duì)S卩Q水進(jìn)行脫氣后，加入TFA至0.05%濃度。b)洗脫緩沖液0.05。/。TFA/90。/。乙腈分別量取乙腈(和光純藥工業(yè))450mL、；、卩Q水50mL進(jìn)行混合。用過濾器(RC-Vliesverstarkt、孔徑0.22(im、SartoriusAG)過濾，通過超聲波洗滌器脫氣。然后，向90。/o乙腈溶液中加入TFA至0.05%。iii)梯:4乍方法將色譜柱(容量0.83mL)連接到AKTAexplorerSystem(GE"少T戸才廿<工乂義社制)，設(shè)定流速為lml/min，用已脫氣的(卩Q水洗滌。然后，用0.05%TFA溶液進(jìn)行平衡。將5ml樣品填充到色i普柱上后，以lml/min的流速洗脫，在安裝于餾分收集器上的試驗(yàn)管中各回收2ml。根據(jù)^5nm以及280nm下測定吸光度(mAU)和傳導(dǎo)率(ms/cm)得到的洗脫圖案，分別取出非吸附餾分(以下稱為餾分Cl)和吸附餾分(以下稱為餾分C2)兩種餾分。圖8為在使用Cosmosil(注冊(cè)商標(biāo))5C18-AR色譜柱的柱色i普中，測定吸光度(215nm)和傳導(dǎo)率的結(jié)果得到的圖。實(shí)線表示餾分D2(pH9)的吸光度、虛線表示餾分D2(pH7)的吸光度、雙點(diǎn)劃線表示餾分D2(pH9)的傳導(dǎo)率、點(diǎn)劃線表示餾分D2(pH7)的傳導(dǎo)率。圖中，"C1(pH7)"為作為餾分C1(pH7)取出的餾分、"C1(pH9)"為作為餾分C1(pH9)取出的餾分、"C2(pH7)"為作為餾分C2(pH7)取出的餾分、"C2(pH9)"為作為餾分C2(pH9)取出的餾分。2.餾分C1的細(xì)胞增殖活性的測定除了細(xì)胞的培養(yǎng)液使用稀釋了餾分D2(pH9)的餾分Cl(餾分Cl(pH9))的培養(yǎng)液或者稀釋了餾分D2(pH7)的餾分C1(餾分C1(pH7))的培養(yǎng)液之外，與實(shí)施例7同樣地操作，對(duì)使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量進(jìn)行測定。而且，稀釋餾分C1(pH9)或餾分C1(pH7)時(shí)4吏用了對(duì)照培養(yǎng)液。圖9為表示使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量的圖。圖9A為使用含有餾分C1(pH9)的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果，圖9B為使用含有餾分C1(pH7)的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果。圖中，"NC"表示對(duì)照培養(yǎng)液、"PC"表示含有10%FCS的培養(yǎng)液。如圖9A和圖9B的結(jié)果所示，在含有餾分C1(pH9)和餾分C1(pH7)的任意一種餾分的培養(yǎng)液都促進(jìn)了細(xì)胞增殖。若將兩者進(jìn)行比較，則觀察到與含有餾分Cl(pH7)時(shí)相比，含有餾分Cl(pH9)時(shí)存在細(xì)胞增殖促進(jìn)效果好的趨勢。3.餾分C2的細(xì)胞增殖活性的測定除了細(xì)胞的培養(yǎng)液使用在對(duì)照培養(yǎng)液中含有餾分D2(pH9)的餾分C2(餾分C2(pH9))的培養(yǎng)液、或者在對(duì)照培養(yǎng)液中含有餾分D2(pH7)的餾分C2(餾分C2(pH7))的培養(yǎng)液之外，與實(shí)施例7同樣地操作，對(duì)使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量進(jìn)4亍測定。圖10為表示使用各培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞增殖量的圖。圖IOA為使用含有餾分C2(pH9)的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果，圖10B為使用含有餾分C2(pH7)的培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果。圖中，"NC"表示對(duì)照培養(yǎng)液。此外，各濃度表示各培養(yǎng)液中的來自餾分C2的蛋白質(zhì)濃度。其結(jié)果，觀察到在培養(yǎng)液中含有餾分C2(pH9)時(shí)，培養(yǎng)液中的濃度為3.42jig/mL以下時(shí)存在濃度依賴性地增大細(xì)胞增殖量的趨勢，超過3.42嗎/mL時(shí)存在濃度依賴性地降低細(xì)胞增殖量的趨勢。另一方面，觀察到在培養(yǎng)液中含有餾分C2(pH7)時(shí)，培養(yǎng)液中的濃度為4.67嗎/mL以下時(shí)存在濃度依賴性地增大細(xì)胞增殖量的趨勢，超過4.67嗎/mL時(shí)存在濃度依賴性地降低細(xì)胞增殖量的趨勢。此外，若將兩者進(jìn)行比較，則觀察到與含有餾分C2(pH7)時(shí)相比，含有餾分C2(pH9)時(shí)存在細(xì)胞增殖促進(jìn)效果好的趨勢。因此，由實(shí)施例9的結(jié)果可知，使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物進(jìn)行酶處理而得到的RJ分解物具有細(xì)胞增殖活性，以及與在pH7的反應(yīng)條件下進(jìn)行酶處理而得到的RJ分解物相比，在pH9的反應(yīng)條件下進(jìn)行酶處理而得到的RJ分解物具有更高的細(xì)胞增殖活性。[實(shí)施例10]對(duì)使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物而得到的RJ分解物所具有的抗氧化活性進(jìn)行研究。1.RJ分解物的制備向RJ(中國產(chǎn)浙江省江山恒亮蜂產(chǎn)品有限公司制)中加入純水得到懸浮物，使用孔徑10kD的透析膜，在純水中對(duì)該懸浮物透析72小時(shí)。回收透析膜內(nèi)液體，進(jìn)行冷凍干燥后，再次懸浮在純水中，制備了30mg/mL的RJ蛋白質(zhì)溶液。向lmL的上述RJ蛋白質(zhì)溶液中加入lmL的RJ分解酶含有物(3mg/mL)、8mL的Tris-HCl緩沖液(pH9.0)，37°C下培養(yǎng)24小時(shí)。然后，使用孔徑500Da的透析膜，在純水中透析5天。回收透析膜內(nèi)液體，進(jìn)行冷凍干燥，將冷凍干燥物作為RJ分解物。而且，RJ分解酶含有物使用與實(shí)施例1同樣地操作制備的分解酶含有物。2.抗氧化活性測定對(duì)于RJ分解物的抗氧化活性，根據(jù)柳內(nèi)等(日本食品科學(xué)工學(xué)會(huì)志、第51巻第5號(hào)、第238-246頁、2004年)的方法，通過研究RJ分解物對(duì)由于一氧化氯(CIO)所引起的BSA分解的影響來進(jìn)行測定。具體地說，首先，通過向含有BSA的PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)中添加使用PBS稀釋的RJ分解物，制備含有BSA(最終濃度40pg/mL)和RJ分解物(最終濃度0、0.3、0.5、1.0或2.0pg/mL)的PBS樣品溶液。向上述PBS樣品溶液中以最終濃度為1.7mM加入次氯酸鈉，37。C下培養(yǎng)30分鐘。然后，通過SDS-PAGE分離PBS試樣溶液中的蛋白質(zhì)，通過CBB染色進(jìn)行檢測。通過掃描儀獲得CBB染色像后，對(duì)相當(dāng)于BSA的帶的濃度進(jìn)行分析。對(duì)于各PBS試樣溶液的BSA濃度，以未添加次氯酸鈉的PBS試樣溶液作為空白溶液，研究空白溶液的BSA濃度為1時(shí)的相對(duì)濃度。而且，帶的濃度分析使用美國國立衛(wèi)生研究所(NationalInstitutesofHealth)提供的分析軟件ImageJ進(jìn)行。此外，對(duì)添加^^知的抗氧化劑抗壞血酸(最終濃度0、3.0、4.0、5.0或7.5mM)或肌肽(最終濃度0、2.5、5.0、7.5或10.0mM)來替代RJ分解物而得到的PBS試樣溶液，同樣地研究了BSA濃度。圖11為表示各PBS試樣溶液的BSA濃度的結(jié)果的圖。圖IIA為添加RJ分解物時(shí)的結(jié)果、圖11B為添加抗壞血酸時(shí)的結(jié)果、圖11C為添加肌肽時(shí)的結(jié)果。其結(jié)果，在未添加RJ分解物時(shí)，BSA通過CBB染色未檢出帶，幾乎全部的BSA被分解。與此相對(duì)地，添加了RJ分解物時(shí)，與抗壞血酸或月幾肽同樣地，對(duì)PBS樣品溶液的添加量依賴性地增大BSA的相對(duì)濃度。推測這是因?yàn)橛纱温人徕c產(chǎn)生的一氧化氯所引起的BSA的分解受到RJ分解物的抑制。此外，基于圖ll的結(jié)果，算出將由一氧化氯所引起的BSA分解抑制至50%的濃度時(shí)，在RJ分解物中為0.92±0.24mg/mL、抗壞血酸中為0.67±0.01mg/mL(3.83±0.08mg/mM)、肌肽中為0.84±0.10mg/mL(3.65±0.32mg/mM)。即，確認(rèn)了對(duì)于由一氧化氯所引起的BSA分解的抗氧化力，盡管RJ分解物為混合物，但具有與公知的抗氧化劑抗壞血酸或肌肽相匹敵的抗氧化力。由實(shí)施例IO的結(jié)果可知，使用本發(fā)明的RJ分解酶含有物、在pH9下進(jìn)行酶處理而得到的RJ分解物具有抗氧化活性。[實(shí)施例11]除了使反應(yīng)時(shí)間為1-3小時(shí)、反應(yīng)溫度為37。C或55。C之外，全部與實(shí)施例1的在pH9條件下的反應(yīng)同樣地操作，分解RJ蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE分離RJ分解物。圖13表示凝膠的染色像。圖中，"std"表示分子量標(biāo)記，"9-0"表示對(duì)反應(yīng)時(shí)間0(pH9)的樣品進(jìn)行電泳的結(jié)果。此外，箭頭a表示約55kDa、箭頭b表示約46kDa。其結(jié)果，確認(rèn)了使RJ蛋白質(zhì)與RJ分解酶含有液在55。C下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，在反應(yīng)開始后1小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)，約51kDa和約46kDa的蛋白質(zhì)都基本上被分解。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的RJ分解酶含有物含有蜂王幼蟲所具有的、以RJ為本來基質(zhì)的RJ分解酶，最適于分解RJ,所以可以用于RJ的生理活性研究、使用RJ的藥品和/或食品的開發(fā)等領(lǐng)域中。權(quán)利要求1、一種蜂王膠分解酶含有物，其特征在于，通過包括下述工序的方法由西方蜜蜂的2～3日齡蜂王幼蟲制備(a)在6℃以下對(duì)所述蜂王幼蟲的體組織懸浮物進(jìn)行離心處理，從而分離為三層，即固體上層、溶液中層、沉淀下層的工序；(b)回收所述中層作為蜂王膠分解酶含有物的工序。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂王膠分解酶含有物，其特征在于，所述離心處理為8000~12000xg、5分4f以上的離心處理。3、一種蜂王膠分解酶含有物，其特征在于，通過包括下述工序的方法由西方蜜蜂的23日齡蜂王幼蟲制備(a，)將所述蜂王幼蟲用冰冷卻生理鹽水洗滌后過濾，從而制備體組織懸浮物的工序；(b，)使用pH7的50mM》岸酸緩沖液稀釋所述體組織懸浮物后，在10000xg、5"C下進(jìn)行10分鐘的離心處理，從而分離為三層，即固體上層、懸浮溶液中層、沉淀下層的工序；(c，)回收所述中層作為蜂王膠分解酶含有物的工序。4、一種蜂王膠分解物，其特征在于，使用權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物制備。5、一種蜂王膠分解物，其特征在于，通過使用權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到，并且，其具有下述特點(diǎn)(1)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的非特異性的細(xì)胞變性作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比降低；(2)對(duì)由淀粉樣蛋白所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相等；(3)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比增大；(4)對(duì)人輪狀病毒感染的感染抑制作用，與未進(jìn)行酶處理的蜂王膠水溶性餾分相比增大。6、一種抗氧化劑，其特征在于，將通過使用權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。7、一種細(xì)胞增殖劑，其特征在于，將通過使用權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。8、一種感染抑制劑，其特征在于，將通過使用權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。9、一種神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)抑制劑，其特征在于，將通過使用權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物，在pH9下對(duì)蜂王膠進(jìn)行酶處理而得到的蜂王膠分解物作為有效成分。10、一種蜂王膠的分解方法，其特征在于，使用權(quán)利要求13任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物。11、一種蜂王膠分解酶，其特征在于，包含在權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的蜂王膠分解酶含有物中。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的蜂王膠分解酶，其特征在于，酶活性的最佳pH為7或9。13、一種蜂王膠分解物，其特征在于，使用權(quán)利要求11所述的蜂王膠分解酶制備。14、一種蜂王膠的分解方法，其特征在于，使用權(quán)利要求ll所述的蜂王膠分解酶。全文摘要本發(fā)明涉及蜂王膠分解酶含有物、蜂王膠分解酶、蜂王膠分解物和蜂王膠的分解方法。所述蜂王膠分解酶含有物通過包括下述工序的方法由西方蜜蜂(Apismellifera)的2～3日齡蜂王幼蟲制備(a)在6℃以下對(duì)所述蜂王幼蟲的體組織懸浮物進(jìn)行離心處理，從而分離為三層，即白色固體上層、溶液中層、沉淀下層的工序；以及(b)回收所述中層作為蜂王膠分解酶含有物的工序。所述蜂王膠分解酶的特征在于，包含在所述蜂王膠分解酶含有物中。所述蜂王膠分解物使用所述蜂王膠分解酶含有物或所述蜂王膠分解酶制備。所述蜂王膠的分解方法的特征在于，使用所述蜂王膠分解酶含有物或所述蜂王膠分解酶。文檔編號(hào)A61P25/00GK101250508SQ20081000798公開日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年2月22日優(yōu)先權(quán)日2007年2月23日發(fā)明者三嶋智之,中村正,川島拓司,松岡拓磨,林要喜知,渡邊鈴代,稻垣瑞穗,金丸義敬,鈴木壽申請(qǐng)人:株式會(huì)社秋田屋本店