專(zhuān)利名稱(chēng)：：香柏總黃酮及其制備方法與醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及香柏總黃酮及其制備方法與醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：黃酮類(lèi)化合物是廣泛存在于植物中的一類(lèi)黃色素，其呈現(xiàn)的生理功能多種多樣，包括心血管功能、抗氧化功能、抗心律失常功能、抗腫瘤抗癌功能、鎮(zhèn)咳平喘功能等，在食品和醫(yī)藥工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。香柏[5b6/wa//"g//(1ChengexFerre)ChengdW.T.Wangva"Wilsonii(Rehd.)ChengdL.K.Fu]為柏科圓柏屬植物，富含黃酮類(lèi)化學(xué)成分，但至今為止，尚未見(jiàn)到有關(guān)香柏總黃酮化學(xué)成分制備方法及其醫(yī)藥用途的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)未能制備香柏總黃酮的不足，為人們提供一種香柏總黃酮及其制備方法與醫(yī)藥用途，具體地說(shuō)是從香柏中提取總黃酮類(lèi)成分的方法，以及所得產(chǎn)品在抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒(如流感病毒、肝炎病毒、包括HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒等)、降壓、降脂、抗血栓中的用途。本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明所述的香柏總黃酮的制備方法，是以鮮品或干品香柏枝葉為藥材原料，不經(jīng)粉碎或粉碎為1060目粒度，經(jīng)10倍20倍藥材重量的水和/或醇提取，提取液經(jīng)過(guò)濾濃縮，濃縮液用溶劑法處理得到香柏總黃酮成品或濃縮液經(jīng)大孔樹(shù)脂分離后，濃縮洗脫液、干燥而得到香柏總黃酮成品，以及將香柏總黃酮成品與藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑一起制備成各種藥物劑型，其單位劑型中香柏總黃酮提取物的含量為51000mg，較好為10100mg。其工藝流程如下大孔柳旨贅濃縮、干燥提取濃縮-洗脫液^^~1^香柏枝葉~~提取液一"濃縮液_.一成品溶劑法上述方案中，所述香柏總黃酮成品包含但不限于柏黃酮、hypolaetin-O-卩-xylopyranoside(8-羥基木犀草素-0-(3-D-吡喃木糖苷)、Hypolaetin-0-p-glycoside(8-羥基木犀草素-0-P-D-吡喃葡萄糖苷)。結(jié)構(gòu)式如下:丄人肚腦hypolaetin—0畫(huà)(3腸xylopyranosideHypolaetin—(9-P一glycoside豐白胃s問(wèn)上述方案中，所述香柏總黃酮成品含量為30%以上。上述方案中，提取時(shí)所用醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丁醇、乙二醇、碳鏈小于32垸醇、碳鏈小于32烯醇，或它們的混合物。上述方案中，提取時(shí)所用方法包括但不限于加熱回流、滲漉、超聲、微波提取。上述方案中，所述濃縮液用溶劑法處理包括但不限于正丁醇萃取濃縮液，從正丁醇部位得到香柏總黃酮成品；或采用醇沉方法，即向濃縮液添加乙醇至濃度以重量計(jì)達(dá)80%左右，靜置冷藏后除去沉淀，得到香柏總黃酮成品。上述香柏總黃酮成品也可稱(chēng)為香柏總黃酮提取物。上述方案中，濃縮液經(jīng)大孔樹(shù)脂分離時(shí)，所述大孔樹(shù)脂包括但不限于各種非極性、弱極性、中極性或極性的大孔吸附樹(shù)脂。上述方案中，濃縮液經(jīng)大孔樹(shù)脂分離時(shí)，大孔樹(shù)脂洗脫所用溶劑包括但不限于以體積計(jì)的3~5:1的甲醇或乙醇水溶液，或不同比例的乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇、丙酮的混合物。上述方案中，所述劑型包括片劑、膠囊、注射劑等各種常規(guī)劑型。上述方案中，其制劑劑型為片劑，每片所含的香柏總黃酮提取物為10100mg。上述方案中，其制劑劑型為膠囊劑，每粒膠囊所含的香柏總黃酮提取物的含量為10100mg。上述方案中，其制劑劑型為注射劑，每單位劑型中所含的香柏總黃酮提取物的含量為10100mg。本發(fā)明所述香柏總黃酮的醫(yī)藥用途，是指香柏總黃酮可用于抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗流感病毒、抗肝炎病毒、抗包括HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒、降壓、降脂、抗血栓，或在與這些疾病相關(guān)的產(chǎn)品中應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了可期待用于抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒(如流感病毒、肝炎病毒、包括HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒等)、降壓、降脂、抗血栓用途的香柏總黃酮及其制劑的制備方法，其成本低，工藝穩(wěn)定，藥理活性顯著。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明不僅限于所述實(shí)施例。實(shí)施例一香柏總黃酮的制備:以鮮品香柏枝葉為藥材原料，取香柏藥材1kg粉碎成10目粉，加10倍藥材重量的水，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮，回收溶劑，至lg生藥/mL。將濃縮液逐漸加入乙醇至80%重量乙醇濃度，靜置冷藏后除去沉淀，減壓干燥得黃褐色香柏總黃酮粉末58.4g，含有包括柏黃酮、hypolaetin-O卩扁xylopyranoside、Hypolaetin-O畫(huà)P-glycoside在內(nèi)的總黃酮43%。實(shí)施例二香柏總黃酮的制備以干品香柏枝葉為藥材原料，取香柏藥材1kg粉碎成60目粉，以20倍藥材重量的50%乙醇水溶液滲漉提取，提取液減壓濃縮，回收溶劑，至lg生藥/mL。將濃縮液通過(guò)經(jīng)活化處理好的D141型(弱極性)大孔樹(shù)脂柱，使?jié)饪s液中的黃酮類(lèi)成分被樹(shù)脂柱吸附，并棄去流出液，用3倍柱體積的蒸餾水沖洗，棄去流出液，繼用以體積計(jì)5:i的乙醇水溶液(乙醇水=5:i)洗脫樹(shù)脂柱，直至吸附于上的黃酮類(lèi)成分被完全洗脫為止，并收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得黃褐色香柏總黃酮粉末55.7g，含有包括柏黃酮、hypolaetin-(9畫(huà)P醫(yī)xylopyranoside、Hypolaetin畫(huà)(9一卩國(guó)glycoside等在內(nèi)的,g、黃酮51%。實(shí)施例三香柏總黃酮的制備以干品香柏枝葉為藥材原料，取香柏藥材1kg粉碎成40目粉末，加10倍藥材重量的甲醇，超聲提取3次，每次20min，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮，回收溶劑，并加水稀釋至lg生藥/mL。將濃縮液通過(guò)正丁醇萃取3次，每次100ml，合并正丁醇部位，減壓干燥得香柏總黃酮黃褐色粉末40.3§，其總黃酮含量為56%。實(shí)施例四香柏總黃酮的制備以干品香柏枝葉為藥材原料，取lcm左右小6段的香柏藥材lkg，加10倍藥材重量的60%乙醇，微波提取3次，每次30min，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮，回收溶劑，至lg生藥/mL。將濃縮液通過(guò)經(jīng)活化處理好的D101型(非極性)大孔樹(shù)脂柱，使?jié)饪s液中的黃酮類(lèi)成分被樹(shù)脂柱吸附，并棄去流出液，用3倍柱體積的蒸餾水沖洗，棄去流出液，繼用以體積計(jì)3:1的乙醇水溶液(乙醇水=4:i)洗脫樹(shù)脂柱，直至吸附于上的黃酮類(lèi)成分被完全洗脫為止，并收集洗脫液，減壓濃縮、干燥得黃褐色香柏總黃酮粉末56.4g。實(shí)施例五含香柏總黃酮提取物的片劑制備處方成分?jǐn)?shù)量香柏提取物(實(shí)施例1)60g淀粉50g糊精60g蔗糖10g硬脂酸鎂2g制成1000片制法上述處方成分按照常規(guī)制劑方法進(jìn)行混合、制粒并壓制成片劑。實(shí)施例六含香柏總黃酮提取物的膠囊劑制備處方成分?jǐn)?shù)量香柏總黃酮提取物(實(shí)施例1)60g乳糖60g糊精15g淀粉45gHMPC適量制成1000粒制法上述處方成分按照常規(guī)制劑方法進(jìn)行混合、制粒并裝2號(hào)膠:實(shí)施例七含香柏總黃酮提取物的注射劑制備處方7成分?jǐn)?shù)量香柏總黃酮提取物(實(shí)施例1)25g吐溫80L5gNaCl3g硫柳汞0.01g羧甲基纖維素鈉5g注射用水加至1000ml制法上述處方成分按照常規(guī)制劑方法進(jìn)行混合、搖勻、過(guò)濾并分裝為5ml/支，滅菌即得。實(shí)施例八香柏總黃酮抗炎作用一對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型的影響8.1實(shí)驗(yàn)方法采用SPF級(jí)KM種雄性小鼠50只，體重24g士2g，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林組100mg/kg)以及受試藥(50、25、10mg/kg)組，每天給藥一次，連續(xù)3天。末次給藥后l小時(shí)，二甲苯涂布右耳，20^1/只。左耳作對(duì)照，30分鐘后脫臼處死，用9mm打孔器在左右耳部相同部位打下耳片，用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)重，計(jì)算耳廓腫脹度、腫脹率及腫脹抑制率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。8.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果—表8.1香柏總黃酮對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(n=10，X±S，mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與模型組比較，*P<0.01。小鼠耳廓涂抹二甲苯后30min，涂抹部位出現(xiàn)明顯的紅腫等急性炎癥反應(yīng)，從上表可以看出，其耳廓腫脹率高達(dá)172.9%。香柏總黃酮50mg/kg、25mg/kg劑量能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，其腫脹度、腫脹率與模型組比較有顯著性差異(PO.Ol)。8.3小結(jié)香柏總黃酮能明顯抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹，提示香柏總黃酮對(duì)急性炎癥具有明顯的抑制作用。實(shí)施例九香柏總黃酮解熱作用一對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素致家兔發(fā)熱的解熱作用9.1實(shí)驗(yàn)方法未做過(guò)任何試驗(yàn)的成年健康家兔，一級(jí)，體重2.0kg2.5kg，雌雄兼用。在實(shí)驗(yàn)前，每天測(cè)動(dòng)物體溫一次，連續(xù)三天。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，測(cè)定動(dòng)物體溫2次，間隔0.5小時(shí)以上，取2次體溫在38.6°C39.5'C之間，且2次體溫不超過(guò)0.3t:者進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)(兩次體溫平均值為基礎(chǔ)體溫)。將篩選合格動(dòng)物40只按基礎(chǔ)體溫隨機(jī)分為5組，每次8只，雌雄兼用，分別為模型組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林100mg/kg)以及受試藥組(200、100、50mg/kg)，各組灌胃給藥后l小時(shí)，按250ng/kg劑量耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素，分別測(cè)定注射后lh、2h、3h、4h以及6h體溫。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。9.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表9.1香柏總黃酮對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素所致家兔發(fā)熱的影響(n=8，7±S，°C)組別劑量基礎(chǔ)注射大腸桿菌內(nèi)毒素后不同時(shí)點(diǎn)體溫變化值mg/kg體溫lh2h3h4h6h模型組一38.96±0.91±1.27±1.39±1.38±1.03±0.240.240.190.330.290.32陽(yáng)性對(duì)照組200(阿司匹棘)38.77±0.180.71±0.26*0.78±承承0.310.96±承0.220.93±承0.270.63±承承0.31高劑量組20038.81±0.42±0.54±0.71±0.69±0.31±0.11承*0.11承承0.27承*0.19*承0.22承承0.20中劑量組10038.93±0.63±0.76±0.89±1.01±0.75±0.190.34*承0.12糸承0.270.160.24低劑量組5038.79±0.81±1.16±1.24±1.26±0.87±0.260.270.200.360.29承0.21注與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。從上表可以看出，注射大腸桿菌內(nèi)毒素后家兔體溫即幵始上升，維持3-4小時(shí)。香柏總黃酮200mg/kg、100mg/kg能明顯抑制家兔體溫9的升高，在測(cè)定的各時(shí)點(diǎn)，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.05或PO.Ol)。9.3小結(jié)香柏總黃酮對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素所引起的家兔發(fā)熱有明顯的解熱作用，提示本品具有解熱退燒的作用。實(shí)施例十香柏總黃酮鎮(zhèn)痛作用一醋酸扭體實(shí)驗(yàn)10.1實(shí)驗(yàn)方法采用SPF級(jí)KM種小鼠50只，雌雄各半，體重20g士2g，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林組100mg/kg)以及受試藥(200、100、50mg/kg)組，每天給藥一次，連續(xù)3天。末次給藥后l小時(shí)，各組動(dòng)物腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml/只。觀察注射醋酸溶液后30min內(nèi)各組出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間(扭體潛伏期)和扭體反應(yīng)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。10.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表IO.I香柏總黃酮對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(n=107X±_§^2_組別劑量mg/kg扭體潛伏期(s)扭體次數(shù)(次)模型組_陽(yáng)性對(duì)照組200受試藥200畫(huà)50209.11±83.6126.941±6.99587.68±188.57**14.11±10.67**666.38±117.69**16.25±10.36*387,47±111.11*16.75±9.49*255.69±123.3220.36±15.97注與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。從上表可以看出，香柏總黃酮200mg/kg、100mg/kg給小鼠灌胃，每天一次，連續(xù)3天，能明顯延長(zhǎng)醋酸所致的扭體潛伏期以及降低扭體次數(shù)，與模型組比較具有顯著性差異(PO.05或P〈0.01)。10.3小結(jié)香柏總黃酮能明顯延長(zhǎng)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的扭體潛伏期以及降低扭體次數(shù)，提示香柏總黃酮具有一定的鎮(zhèn)痛作用。實(shí)施例H"^—香柏總黃酮?dú)鏏型感冒病毒的試驗(yàn)11.1實(shí)驗(yàn)方法香柏總黃酮素與A型感冒病毒(TCID50二1.02xl0Vml)共孵育1小時(shí)后，用Katara的InfluenzaAVirusEIAKit(Precoated)試劑盒測(cè)定感冒病毒抗原的量，從而推算出A型感冒病毒的量。殺滅率(%)=100x[l-(樣品測(cè)定的OD值-培養(yǎng)液對(duì)照的OD值)/(感冒病毒液對(duì)照的OD值-培養(yǎng)液對(duì)照的OD值)]。11.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表11.1抗原檢測(cè)法檢測(cè)香柏總黃酮樣3對(duì)A型感冒病毒的殺滅作用試驗(yàn)藥物濃度(mg/ml)測(cè)定的OD值殺滅率(％)香柏總黃酮0.800.07996.180.200.14792.860.100.21189.735%"84"消毒液0.00299.95A型感冒病毒液對(duì)照2.045培養(yǎng)液對(duì)照0週試劑盒陽(yáng)性對(duì)照1.1589試劑盒陰性0.01211.3小結(jié)香柏總黃酮對(duì)A型感冒病毒有直接殺滅的作用，在濃度為0.10mg/ml時(shí)，對(duì)fflV病毒的直接殺滅率達(dá)到了89%以上。實(shí)施例十二香柏總黃酮的體外抗乙肝的活性12.1實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)表達(dá)乙肝病毒抗原的2.2丄5細(xì)胞，在細(xì)胞上清液中加入香柏總黃酮，繼續(xù)培養(yǎng)，四天后，換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)三天，然后用乙肝表面抗原和e抗原測(cè)定試劑盒測(cè)定抗原的表達(dá)情況。抑制率(％)=100x[l-(樣品測(cè)定的OD值-培養(yǎng)液的OD值)/(2.2丄5細(xì)胞對(duì)照的OD值-培養(yǎng)液的OD值)]，細(xì)胞存活率(％)=100x(樣品測(cè)定的OD值-培養(yǎng)液的OD值)/(2.2丄5細(xì)胞對(duì)照的OD值-培養(yǎng)液的OD值)。體外檢測(cè)香柏總黃酮對(duì)乙肝抗原表達(dá)細(xì)胞2.2.1.5的作用。12.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表12.1香柏總黃酮體外對(duì)2.2丄5細(xì)胞的表面抗原表達(dá)抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果受試藥物濃度(fig/ml)HBsAg的OD值抑制率香柏總黃酮4000.000.57479.842000.000.58779.391000.000.69975.44500.000細(xì)64.49250.000.93467.1611125.001.20457.6561.251.59943.73培養(yǎng)液對(duì)照0搬2.2丄5細(xì)胞2.840試劑盒陽(yáng)性對(duì)照3.050試劑盒陰性對(duì)照0.015表12.2香柏總黃酮體外對(duì)2.2丄5細(xì)胞的e抗原表達(dá)抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果受試藥物濃度(ug/ml)HBeAg的OD值抑制率香柏總黃酮■0.000.46884.772000.000.52382.971000.000.54582.25500.000.78674.35250.000.85772.03125.001.16761.8761.251.24859.22培養(yǎng)液對(duì)照0扁2.2.1.5細(xì)胞3.056試劑盒陽(yáng)性對(duì)照3.179試劑盒陰性對(duì)照0.002表12.3香柏總黃酮體外對(duì)2.2.1.5細(xì)胞的毒性作用的試驗(yàn)結(jié)果受試藥物濃度(嗎/ml)樣品的OD值細(xì)胞存活率香柏總黃酮4000.000.34927.692000.000扁53.901000.000.73459.33500.000.75661.13250.000.80465.08125.000.92374.8661.251.09789.15培養(yǎng)液對(duì)照0.01212<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>12.3小結(jié)香柏總黃酮可以抑制2.2.1.5細(xì)胞的表面抗原和e抗原的表達(dá)。并且，香柏總黃酮在一定濃度內(nèi)對(duì)2.2丄5細(xì)胞的毒性不大，比如，香柏總黃酮樣l在25(Hig/ml時(shí)，對(duì)2.2丄5細(xì)胞的表面抗原的表達(dá)抑制率為67.16%，對(duì)2.2丄5細(xì)胞的e抗原的表達(dá)抑制率為72.03%，在這個(gè)藥物濃度下，2.2丄5細(xì)胞的MTT結(jié)果為0.804，而正常2.2丄5細(xì)胞的MTT結(jié)果為1.229，細(xì)胞存活率達(dá)到65.08%。實(shí)施例十三香柏總黃酮?dú)鏗IV的試驗(yàn)13.1實(shí)驗(yàn)方法香柏總黃酮素與fflV病毒(TCID50=1.78xl05)共孵育1小時(shí)后，用Biomerieux的HIV-1P24試劑盒測(cè)定抗原P24的量，從而推算出HIV病毒的量。殺滅率(％)=100x[l-(樣品測(cè)定的OD值-培養(yǎng)液對(duì)照的OD值)/(HIV病毒液對(duì)照的OD值-培養(yǎng)液對(duì)照的OD值)]。13.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表13.1fflV-lP24抗原檢測(cè)法檢測(cè)香柏總黃酮對(duì)HIV的殺滅作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>13.3小結(jié)香柏總黃酮對(duì)HIV病毒有直接殺滅的作用，在濃度為0.10mg/ml時(shí)，對(duì)fflV病毒的直接殺滅率達(dá)到了80%以上。實(shí)施例十四香柏總黃酮體外抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶的活性14.1實(shí)驗(yàn)方法在有藥物的溶液中加入反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)液，然后用Innovagen公司的Retrosys逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)試試劑盒進(jìn)行測(cè)定。抑制率(％)=100x[l-(樣品測(cè)定的OD值-培養(yǎng)液對(duì)照的OD值)/(反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)照的OD值-培養(yǎng)液對(duì)照的OD值)]。14.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表14.1香柏總黃酮體外對(duì)HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果濃度(mg/mi;)測(cè)定的OD值抑制率(％)0.800.22987.540.200.33881.520.100.47873.32培養(yǎng)液對(duì)照0.001反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)照1.78914.3小結(jié)香柏總黃酮對(duì)HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用，在濃度為0.10mg/ml時(shí)，對(duì)HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用達(dá)到了73%以上。實(shí)施例十五香柏總黃酮對(duì)受HIV感染的細(xì)胞的保護(hù)作用15.1實(shí)驗(yàn)方法用HIV病毒感染MT4細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入香柏總黃酮，繼續(xù)培養(yǎng)，四天后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞的數(shù)量，與不加香柏總黃酮的HIV感染的MT4細(xì)胞對(duì)比，從而計(jì)算出香柏總黃酮對(duì)受HIV感染的細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞被保護(hù)率(％)=100x(細(xì)胞+111￥+藥液-細(xì)胞+HIV)/(細(xì)胞對(duì)照-細(xì)胞+HIV)。15.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表15.1香柏總黃酮對(duì)受HIV感染的細(xì)胞的保護(hù)作用的試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)藥物濃度細(xì)胞+藥細(xì)胞+藥+mv對(duì)細(xì)胞的保護(hù)率香柏總黃酮0.30mg/ml0.3890.32842.430.20mg/ml0.5040.48375.480.10mg/ml0.5940.56492.750.05mg/ml0.5930.39653.930.03mg/ml0.5860.32140.94齊多夫定0.82pg/ml0.5880.57895.740.41嗎/ml0.5820.57295.460.21pg/ml0.5970.50880.81培養(yǎng)液對(duì)照0.011細(xì)胞+HIV對(duì)照0.129細(xì)胞對(duì)照0.5981415.3小結(jié)香柏總黃酮對(duì)受fflV感染的細(xì)胞有較好的保護(hù)率，在濃度為0.10mg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)率達(dá)到了92.75%。實(shí)施例十六香柏總黃酮對(duì)受HIV感染的細(xì)胞中的HIV的抑制作用16.1實(shí)驗(yàn)方法用HIV病毒感染MT4細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入香柏總黃酮，繼續(xù)培養(yǎng)，四天后，換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)三天,用Biomerieux的HIV-1P24試劑盒測(cè)定各混合培養(yǎng)物上清液中的抗原P24的量，從而推算出HIV病毒的量。抑制率(％)=100x[l-(樣品測(cè)定的OD值-細(xì)胞對(duì)照的OD值)/(細(xì)胞+HIV對(duì)照的OD值-細(xì)胞對(duì)照的OD值)]。16.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表16.1香柏總黃酮對(duì)受HIV感染的細(xì)胞中的HIV的抑制作用'<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>16.3小結(jié)香柏總黃酮對(duì)受fflV感染的細(xì)胞中的fflV有抑制作用，在濃度為0.10mg/ml時(shí)，對(duì)HIV病毒的抑制率達(dá)到了76%以上。實(shí)施例十七香柏總黃酮對(duì)受HIV感染的細(xì)胞的上清液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用17.1實(shí)驗(yàn)方法用HIV病毒感染MT4細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入香柏總黃酮，繼續(xù)培養(yǎng)，四天后，換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)三天，用I皿ovagen的Retrosys逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)試試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。抑制率(％)=100x[l-(樣品測(cè)定的OD值-細(xì)胞對(duì)照的OD值)/(細(xì)胞+HIV對(duì)照的OD值-細(xì)胞對(duì)照的OD值)]。17.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表17.1香柏總黃酮對(duì)受fflV感染的細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用試驗(yàn)藥物濃度細(xì)胞+藥+HIV對(duì)HIV的抑制率香柏總黃酮0.30mg/ml0.15693.400.20mg/ml0.18791.800.10mg/ml0.21990.150.05mg/ml0.42986.490.03mg/mlO細(xì)57.09齊多夫定0.82嗎/ml0.08996.850.41|ig/ml0.13094.740.21pg/ml0.23089.58培養(yǎng)液對(duì)照O遍細(xì)胞+fflV對(duì)照1.967細(xì)胞對(duì)照O駕試劑盒陽(yáng)性1.256試劑盒陰性O(shè)駕17.3小結(jié)香柏總黃酮對(duì)受HIV感染的細(xì)胞的上清液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性有抑制作用，在濃度為0.10mg/ml時(shí)，對(duì)HIV病毒的抑制率達(dá)到了卯％以上。實(shí)施例十八香柏總黃酮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠降壓活性18.1實(shí)驗(yàn)方法16周齡SHR(自發(fā)性高血壓)大鼠共40只，全雄。利用RM6200生物信號(hào)采集系統(tǒng)以無(wú)創(chuàng)尾壓法測(cè)定各動(dòng)物初始血壓，按血壓隨機(jī)分為四組。分別為模型組(生理鹽水)；陽(yáng)性對(duì)照組(托普利10mg/kg);香柏總黃酮低劑量組(200mg/kg)及香柏總黃酮高劑量組(400mg/kg)。連續(xù)口服給藥4周后，再次用無(wú)創(chuàng)尾壓法測(cè)定血壓。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。18.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表18.1香柏總黃酮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓的影響(n=10，X16±S，mmHg)劑量mg/kg給藥前收縮壓給藥后收縮壓ramHgmmHg模型組一192.54±20.14200.12±18.69陽(yáng)性對(duì)照組IO(卡托普187.21±19.35151.48±14.39**利)低劑量組200195.87±21.48180.21±19.78*高劑量組400186.35士17.41168.21±18.47*注林表示和模型組相比P〈0.01;*表示和模型組相比P〈0.05。18.3小結(jié)香柏總黃酮各劑量組均具有明顯降壓活性。實(shí)施例十九香柏總黃酮降脂活性19.1實(shí)驗(yàn)方法受試動(dòng)物采用SD大鼠。共50只，雌雄各半，體重120—160g。受試大鼠眼內(nèi)眥取血測(cè)定各項(xiàng)血脂觀察指標(biāo)正常值。根據(jù)TC水平將大鼠分為5組l個(gè)基礎(chǔ)飼料對(duì)照組；l個(gè)高脂模型對(duì)照組(高脂組)及香柏總黃酮三個(gè)劑量組(100mg/kg;200mg/kg;400mg/kg)。每組10只。開(kāi)始試驗(yàn)后，除基礎(chǔ)飼料對(duì)照組外，其余各組均用高脂飼料喂飼(78.8%基礎(chǔ)詞料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油和0.2%豬膽鹽)。各試驗(yàn)組大鼠經(jīng)口灌胃給予受試溶液，兩個(gè)對(duì)照組灌胃給予生理鹽水，灌胃量均為1.0ml/100g每天一次，連續(xù)30d，每周秤重--次，并根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。試驗(yàn)至終末時(shí)禁食16h后采血測(cè)定血清TC(總膽固醇)、TG(甘油三脂)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSSll.O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。19.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表19.1香柏總黃酮對(duì)高脂肥胖大鼠TC及TG的影響(n=10，X±S，組別劑量mg/kgTCTG初始值給藥后初始值給藥后正常組一1.70±0.311.84±0.210.88±0.210.92±0.18模型組一1.73±0.249.27±1.190.92±0.331.23±0.31高劑量組4001.62±0.116.54±1,27**0.87±0.190.92±0.27"中劑量組2001.63±0.246.76±1.12**0.89±0.270.98±0.24*低劑量組1001.81±0.277.06±1.20**0.91±0.361.14±0.2117注**表示和模型組相比PO.01^表示和模型組相比P<0.05。19.3小結(jié)試驗(yàn)結(jié)果表明香柏總黃酮能有效降低高脂肥胖大鼠體內(nèi)的TC、TG水平。實(shí)施例二十香柏總黃酮活血化瘀作用一對(duì)膠原蛋白_腎上腺素誘發(fā)小鼠體內(nèi)血栓形成的抑制作用20.1實(shí)驗(yàn)方法采用SPF級(jí)NIH種小鼠50只，雄性，體重24g士2g，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林組20mg/kg)以及受試藥(50、25、10mg/kg)組，每天給藥一次，連續(xù)3天。末次給藥后l小時(shí)，小鼠尾靜脈注射膠原蛋白(225pg/只)與腎上腺素(9pg/只)的混合誘導(dǎo)劑，觀察15min內(nèi)小鼠偏癱的恢復(fù)數(shù)，計(jì)算藥物對(duì)小鼠腦血栓保護(hù)率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方分析。20.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表20.1香柏總黃酮對(duì)膠原蛋白一腎上腺素誘發(fā)小鼠體內(nèi)血栓形成的影響組別劑量mg/kg動(dòng)物數(shù)(只)15min內(nèi)恢復(fù)數(shù)(只)恢復(fù)率(%)模型組_10110陽(yáng)性對(duì)照組20107氺70高劑量組501090中劑量組25107氺70低劑量組1010440注與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。從上表可以看出，香柏總黃酮50mg/kg、25mg/kg給小鼠灌胃，每天一次，連續(xù)3天，能明顯提高膠原蛋白一腎上腺素誘發(fā)小鼠腦偏癱的恢復(fù)率，與模型組比較具有顯著性差異(PO.05或PO.01)。20.3小結(jié)香柏總黃酮能明顯提高膠原蛋白一腎上腺素誘發(fā)小鼠腦偏癱的恢復(fù)率，提示香柏總黃酮具有抗血栓作用。18權(quán)利要求1.一種香柏總黃酮的制備方法，其特征在于是以鮮品或干品香柏枝葉為藥材原料，不經(jīng)粉碎或粉碎為10～60目粒度，經(jīng)10倍～20倍藥材重量的水和/或醇提取，提取液經(jīng)過(guò)濾濃縮，濃縮液用溶劑法處理得到香柏總黃酮成品或濃縮液經(jīng)大孔樹(shù)脂分離后，濃縮洗脫液、干燥而得到香柏總黃酮成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香柏總黃酮的制備方法，其特征在于是將所述香柏總黃酮成品與藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑制備成各種藥物劑型，其單位劑型中香柏總黃酮提取物的含量為51000mg，所述劑型包括片劑、膠囊、注射劑。3根據(jù)權(quán)利要求1所述的香柏總黃酮的制備方法，其特征在于所述醇是指甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丁醇、乙二醇、碳鏈小于32烷醇、碳鏈小于32烯醇之一種或它們的混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香柏總黃酮的制備方法，其特征在于所述提取方法是加熱回流、滲漉、超聲、微波提取。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香柏總黃酮的制備方法，其特征在于所述濃縮液用溶劑法處理是指正丁醇萃取濃縮液，從正丁醇部位得到香柏總黃酮成品；或采用醇沉方法，即向濃縮液添加乙醇至濃度以重量計(jì)達(dá)80%左右，靜置冷藏后除去沉淀，得到香柏總黃酮成品。6根據(jù)權(quán)利要求1所述的香柏總黃酮的制備方法，其特征在于所述大孔樹(shù)脂是指各種非極性、弱極性、中極性或極性的大孔吸附樹(shù)脂。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香柏總黃酮的制備方法，其特征在于所述濃縮液經(jīng)大孔樹(shù)脂分離時(shí)，大孔樹(shù)脂洗脫所用溶劑是以體積計(jì)的35:1的甲醇或乙醇水溶液，或不同比例的乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇、丙酮的混合物。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香柏總黃酮的制備方法，其特征在于是將所述香柏總黃酮成品與藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑制備成各種藥物劑型，其單位劑型中香柏總黃酮成品的含量為10100mg。9.一種香柏總黃酮成品，其特征在于所述香柏總黃酮成品中包含但不限于柏黃酮、hypolaetin-Op-xylopyranoside(8-羥基木犀草素-O-P-D-卩比喃木糖苷)、Hypolaetin-O-P-glycoside(8-^基木犀草素-O-P-D-吡喃葡萄糖苷)，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>柏黃酮、所述香柏總黃酮成品中香柏總黃酮含量為30%以上。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的香柏總黃酮成品的醫(yī)藥用途，其特征在于是指香柏總黃酮成品在抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗流感病毒、抗肝炎病毒、抗包括HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒、降壓、降脂、抗血栓，以及與這些疾病相關(guān)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及香柏總黃酮及其制備方法與用途，該方法是以鮮品或干品香柏枝葉為藥材原料，不經(jīng)粉碎或粉碎為10～60目粒度，經(jīng)10倍～20倍藥材重量的水和/或醇提取，提取液經(jīng)過(guò)濾濃縮，濃縮液用溶劑法處理得到香柏總黃酮成品或濃縮液經(jīng)大孔樹(shù)脂分離后，濃縮洗脫液、干燥而得到香柏總黃酮成品，以及將香柏總黃酮成品與藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑一起制備成各種藥物劑型，其單位劑型中香柏總黃酮提取物的含量為5～1000mg，香柏總黃酮成品包含柏黃酮、8-羥基木犀草素-O-β-D-吡喃木糖苷、8-羥基木犀草素-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等，香柏總黃酮成品在抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗流感病毒、抗肝炎病毒、抗包括HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒、降壓、降脂、抗血栓，或在與這些疾病相關(guān)的產(chǎn)品中可獲得廣泛應(yīng)用。文檔編號(hào)A61P9/12GK101502536SQ200810009998公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2008年2月10日優(yōu)先權(quán)日2008年2月10日發(fā)明者薛永新申請(qǐng)人:薛永新