專利名稱：：一種枇杷葉總?cè)扑岬闹苽浞椒捌浣笛枪δ艿闹谱鞣椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從中藥枇杷葉中提取制備總?cè)扑岬姆椒?，以及該提取物在降血糖方面的?yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，在中醫(yī)學(xué)中屬消渴癥范疇，是繼心血管疾病及癌癥之后危害人類健康的第三大疾患。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告全球范圍內(nèi)糖尿病患者高達(dá)1.25億，預(yù)計(jì)這一數(shù)字到2025年將增加到2.99億。由于人口基數(shù)大，現(xiàn)在我國(guó)的糖尿病患者約3000萬(wàn)以上，絕對(duì)患病人數(shù)居世界首位。由丁-糖尿病具有患病率、致殘率及并發(fā)癥高的特點(diǎn)，因此己成為醫(yī)學(xué)界頗為重視的一種疾病。在糖尿病的治療中，主要是通過(guò)藥物控制血糖升高和防治并發(fā)癥。在治疔糖尿病的藥物中，西藥在降血糖方面表現(xiàn)突出，中藥在治療并發(fā)癥方面獨(dú)具特色，二者各有所長(zhǎng)。從目前臨床所用藥物來(lái)看，西藥都有一定的局限性和不良反應(yīng)，甚至是很嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如導(dǎo)致低血糖、乳酸中毒等。因此，國(guó)內(nèi)外一直很S視從大然產(chǎn)物尤其是藥用植物(中草藥)中發(fā)掘和開(kāi)發(fā)降血糖效果好、副作用小、對(duì)并發(fā)癥有效的藥物制劑。枇杷葉是薔薇科枇杷屬植物枇杷En'oto^7aJa;w"/ca(Thunb.)Lindl.的干燥葉，是一味常用中藥，收載于歷版中國(guó)藥典供中醫(yī)臨床使用。枇杷葉歸肺、胃經(jīng)，貝-清肺止咳、降逆止嘔作用，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘氣、宵熱嘔逆、煩熱口渴，癥狀。新近的研究發(fā)現(xiàn)從枇杷葉中分離得到的二萜酸類化學(xué)成分具有顯著的降血糖活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種枇杷葉總?cè)扑岬闹苽浞椒?，該制備方法不僅工藝簡(jiǎn)單，得率高，而且使各三萜酸組分的得率提高。本發(fā)明的另一目的在于提供一種治療糖尿病的植物藥物制劑。1.枇杷葉總?cè)扑岬闹苽浞椒?1)將枇杷葉干燥粉碎。(2)用30-95%乙醇或30-95%甲醇浸漬提取，料液比h310，提取兩次，每次1530天；或加熱回流提取，料液比l:3~10,提取兩次，每次1至5小時(shí)。(3)合并提取液，減壓濃縮至含醇量《50%的低醇度濃縮液。(4)低醇度濃縮液在1500-5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下離心沉降10-30分鐘，得沉淀。(5)向沉淀部分加入2-10倍量乙醇，加熱使之溶解后，加入0.5-3倍量硅藻土加熱回流脫色，趁熱過(guò)濾，濾液減壓濃縮干燥；或向沉淀部分加入2-10倍量乙醇加熱溶解后加入0.5-3倍量硅藻土拌樣，過(guò)硅藻土柱，拌樣硅藻土與空白硅藻土比為1:1~5，乙醇洗脫，乙醇洗脫液減壓濃縮干燥，得枇杷葉總?cè)h酸提取物。2.枇杷葉總?cè)扑岬馁|(zhì)量控制方法用本發(fā)明的制備方法所得枇杷葉總?cè)扑岬闹饕行С煞譃樾芄?ursolicacid)、齊墩果酸(oleanolicacid)、馬斯里酸(maslinicacid)、科羅索酸(corosolicacid)、委陵菜酸(tormenticacid)。采用高效液相色譜方法(HPLC)檢測(cè)各有效成分的含量，色譜條件為色譜柱固定相碳十八烷基硅膠，流動(dòng)相甲醇-0.04%磷酸溶液(88:12)，流速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208tim。按此方法檢測(cè)，委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸的保留時(shí)間分別為4.4min、8.9min、9.6min、15.8min、16.7min(見(jiàn)附圖)，以重量百分比計(jì)算，枇杷葉總?cè)扑嶂形鍌€(gè)指標(biāo)成分的總含量大于50%,其中委陵菜酸的含量應(yīng)達(dá)到10-30%,馬斯里酸的含量應(yīng)達(dá)到4-20%，科羅索酸的含量應(yīng)達(dá)到5-20%,齊墩果酸的含量應(yīng)達(dá)到1-10%,熊果酸的含量應(yīng)達(dá)到5-20%。3.枇杷葉總?cè)h酸的降血糖活性對(duì)正常小鼠、四氧嘧啶和鏈脲佐菌素所致的糖尿病小鼠的藥效研究結(jié)果表明，本發(fā)明中的枇杷葉總二萜酸能極顯著地降低正常小鼠、四氧嘧啶和鏈脲佐菌素糖尿病小鼠的血糖水平，提高血清胰島素水平，提示其可用于治療糖尿病。實(shí)驗(yàn)一、枇杷葉總?cè)扑釋?duì)正常小鼠空腹血糖的影響實(shí)驗(yàn)方法取正常雄性ICR小鼠(18~22g)90只，隨機(jī)分為9組，分別按10ml/kg體重經(jīng)口給予枇杷葉總二萜酸300mg/kg、格列齊特50mg/kg、參芪降糖顆粒2000mg/kg以及等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，每天給藥1次，連續(xù)7d。末次給藥時(shí)，各組禁食4h后給藥，再繼續(xù)禁食2h。小鼠眼眶后靜脈叢取血，分離血清，以葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖。結(jié)果如表1所示，與正常組相比，枇杷葉總?cè)扑?00mg/kg和格列齊特50mg/kg均極顯著地降低了正常小鼠的空腹血糖(PO.Ol)，參芪降糖顆粒2000mg/kg對(duì)正常小鼠的空腹血糖無(wú)明顯影響。表lEJ-1正常小鼠空腹血糖的影響(X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>"P<O.01vs正常組實(shí)驗(yàn)二、枇杷葉總?cè)扑釋?duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖和血清胰島素的影響實(shí)驗(yàn)方法隨機(jī)取正常雄性ICR小鼠(18~22g)IO只作為正常組，其余小鼠禁食16-17h后，尾靜脈注射四氧嘧啶65mg/kg,注射后72小時(shí)眼眶后靜脈叢取血，分離血清，預(yù)測(cè)血糖，選空腹血糖M2mmol/L的小鼠90只，隨機(jī)分為9組，分別按10ml/kg體重經(jīng)口給予枇杷葉總?cè)扑?00mg/kg、格列齊特50mg/kg、參芪降糖顆粒2000mg/kg以及等體積的0.5%CMC-Na，每日1次，連續(xù)給藥I4天。其中，第7次給藥前各組禁食4h，給藥后繼續(xù)禁食2h，然后小鼠眼眶后靜脈叢取血，分離血清，測(cè)定血糖。末次給藥前禁食4h,給藥后2h,小鼠摘眼球取血，分離血清，以試劑盒方法測(cè)定血糖和血清胰島素。結(jié)果如表2所示，與正常組相比，四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖水平極顯著升高，血清胰島素水平極顯著降低(PO.Ol)。與模型組相比，枇杷葉總?cè)扑?00mg/kg在給藥后第7天和第14天分別顯著(PO.05)和極顯著(PO.01)地降低了糖尿病小鼠的空腹血糖，極顯著(PO.Ol)地升高了糖尿病小鼠的血.清胰島素水平。表2枇杷葉總?cè)扑釋?duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖和血清胰島素的影響(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)驗(yàn)三、枇杷葉總?cè)h酸對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病小鼠血糖和血清胰島素的影響實(shí)驗(yàn)方法隨機(jī)取出正常雄性ICR小鼠(18~22g)10只作為正常組，其余小鼠禁食16-17h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌素160mg/kg，注射后72小時(shí)眼眶后靜脈叢取血，分離血清，預(yù)測(cè)空腹血糖，選空腹血糖〉12mmol/L的小鼠90只，隨機(jī)分為9組，分別按10ml/kg體重經(jīng)口給予枇杷葉總?cè)扑?00mg/kg、格列齊特50mg/kg、參芪降糖顆粒2000mg/kg以及等體積的0.5Q/。CMC-Na,每日1次，連續(xù)給藥14天。其中，第7次給藥前各組禁食4h,給藥后繼續(xù)禁食2h，然后小鼠眼眶后靜脈叢取血，分離血清，測(cè)定血糖。末次給藥前禁食4h，給藥后2h，小鼠摘眼球取血，分離血清，以試劑盒方法測(cè)定血糖、血清胰島素。結(jié)果如表3所示，與正常組相比，鏈脲佐菌素糖尿病小鼠的空腹血糖水平極顯著升高，血清胰島素水平極顯著降低(PO.Ol)。與模型組相比，枇杷葉總?cè)扑?00mg/kg在給藥后第7和14天均極顯著地降低了糖尿病小鼠的空腹血糖(PO.Ol)，極顯著(PO.01灘升高了糖尿病小鼠的血清胰島素水平。表3枇杷葉總?cè)扑釋?duì)鏈脲佐菌素糖尿病小鼠血糖和血清胰島素的影響(X±SD)組別劑量給藥動(dòng)物數(shù)空腹血糖(mmol/L)胰島素(mg/kg)途徑(只)第7天第14天(HlU/mL)正常組p.o106.75±0.866.60±0.7929.68±9.47模型組p.o1022.76±4.21##21.96±4,82##10.05±6.23##枇杷葉總?cè)扑?00p.o1013.44±3.39**11.47士3.65"18.51±2.35**參芪降糖顆粒20000p.o1018.16±5.8116.29土5.32'16.54±6.75*格列齊特50p.o916.72士5.88'15"0±4.46*15.11±3.56*尸<0.01ra正常組；'PO.05,"iM).Olw模型組附圖為本發(fā)明方法制備的枇杷葉總?cè)扑針悠返腍PLC圖，其中保留時(shí)間為4.4min、8.9min、9.6min、15.8min、16.7min對(duì)應(yīng)的組分分別為委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:干燥枇杷葉l.Okg粉碎成粗粉，依次用80。/q乙醇8L，6L冷浸兩次，每次15天，合并浸漬液合并，減壓濃縮至醇度約30%的濃縮液，冷卻，置離心機(jī)沉降離心(轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，得沉淀46g，加入95。/。乙醇230ml加熱溶解，再加92g硅藻十拌樣，取92g硅藻土裝柱，上樣后，以95%乙醇2000ml洗脫，洗脫液合并，減壓回收乙醇，蒸干，得淡黃色粉末35g，即為枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铩ｈ凌巳~總n萜酸提取物經(jīng)HPLC分析，委陵菜酸2].7%，馬斯里酸10.5%，科羅索酸13.6%，齊墩果酸3.1%，熊果酸10.6%。實(shí)施例2:干燥枇杷葉l.Okg粉碎成粗粉，依次用80。/。乙醇6L，4L加熱回流提取2次，合并提取液，減壓濃縮至醇度約20%的濃縮液，冷卻，置離心機(jī)沉降離心(轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，得沉淀41g，加入95。/。乙醇205ml加熱溶解，再加41g硅藻土拌樣，取82g硅藻土裝柱，上樣后，以95%乙醇2000ml洗脫，洗脫液合并，減壓回收乙醇，蒸干，得淡黃色粉末32g,即為枇杷葉總?cè)扑崽崛∥?。枇杷葉總?cè)扑崽崛∥锝?jīng)HPLC分析，委陵菜酸20.9%,馬斯里酸10.1%，科羅索酸14.2%，齊墩果酸3.0%，熊果酸8.9%。實(shí)施例3:干燥枇杷葉l.Okg粉碎成粗粉，依次用80。/。乙醇6L，4L加熱回流提取2次，合并提取液，減壓濃縮至醇度約20%的濃縮液，冷卻，置離心機(jī)沉降離心(轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，得沉淀43g，加入95。/。乙醇2]5ml加熱溶解，再加43g硅藻土拌樣，加熱回流脫色，趁熱過(guò)濾，減壓回收乙醇，蒸干，得淡黃色粉末34g，即為枇杷葉總?cè)扑崽崛∥?。枇杷葉總二萜酸提取物經(jīng)HPLC分析，委陵菜酸18.3%,馬斯里酸10.4%，科羅索酸14.7%,齊墩果酸2.6%，熊果酸8.9%。權(quán)利要求1.一種從枇杷葉中提取和制備總?cè)扑岬姆椒?，根?jù)該方法所制備的總?cè)扑峋哂酗@著的降血糖功能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枇杷葉總?cè)扑岬闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟诎ㄒ韵虏襟E枇杷葉經(jīng)30-95%乙醇或30-95%甲醇浸漬提取或加熱回流提取，除醇后得到低醇度濃縮液，濃縮液經(jīng)高速離心，分離，得沉淀，沉淀經(jīng)乙醇溶解、硅藻土回流或拌樣后柱層析脫色，得枇杷葉總?cè)扑崽崛∥铩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枇杷葉總?cè)扑?，其特征在于按重量百分比?jì)算，五個(gè)指標(biāo)成分熊果酸(ursolicacid)、齊墩果酸(oleanolicacid)、馬斯里酸(maslinicacid)、科羅索酸(corosolicacid)、委陵菜酸(tormenticacid)的總含量大于50%，其中委陵菜酸的含量應(yīng)達(dá)到10-30%，馬斯里酸的含量應(yīng)達(dá)到4-20%，科羅索酸的含量應(yīng)達(dá)到5-20%,齊墩果酸的含量應(yīng)達(dá)到1-10%，熊果酸的含量應(yīng)達(dá)到5-20%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枇杷葉總?cè)扑峋哂酗@著的降血糖功能，可以直接i^用^"治療糖尿病或作為治療糖尿病藥物制劑的原料。全文摘要本發(fā)明涉及一種枇杷葉總?cè)扑岬闹苽浞椒捌浣笛枪δ?，制備方法包括將干燥枇杷葉經(jīng)一定濃度乙醇或甲醇提取后，回收至低濃度醇沉降，離心，沉淀用硅藻土回流脫色，或經(jīng)硅藻土柱層析、乙醇洗脫后減壓回收，干燥得到總?cè)扑帷Ｔ摽側(cè)扑嶂行芄?ursolicacid)、齊墩果酸(oleanolicacid)、馬斯里酸(maslinicacid)、科羅索酸(corosolicacid)、委陵菜酸(tormenticacid)的總含量達(dá)50％(以重量計(jì))以上，其中委陵菜酸的含量應(yīng)達(dá)到10-30％，馬斯里酸的含量應(yīng)達(dá)到4-20％，科羅索酸的含量應(yīng)達(dá)到5-20％，齊墩果酸的含量應(yīng)達(dá)到1-10％，熊果酸的含量應(yīng)達(dá)到5-20％。本發(fā)明方法制備的枇杷葉總?cè)扑幔蓱?yīng)用于治療糖尿病或制備治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物制劑。文檔編號(hào)A61K36/73GK101224246SQ200810018820公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年1月25日優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日發(fā)明者寒呂,李維林,劍陳申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所