專利名稱：：合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份，本發(fā)明還涉及所述活性成份的制備方法和應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
血管生成(angi'ogenesis)指的是組織利用既存血管產(chǎn)生新的血管的過程。正常成年人的血管內(nèi)皮細胞一般處于相對靜止狀態(tài)，生理情況下內(nèi)皮細胞平均每數(shù)年分裂一次，僅發(fā)生于創(chuàng)傷修復(fù)或月經(jīng)周期的卵巢和子宮內(nèi)膜，但許多疾病如腫瘤，可出現(xiàn)組織中的新生血管內(nèi)皮細胞快速增生，其增生周期相當于骨髓的生發(fā)細胞或腸道上皮細胞1、TimdrJ，D5meB，F(xiàn)azekasK,Ja麗icsA,PakuS.Angiogenesis-dependentdiseasesandangiogenesistherapy.尸3t力cL/2001，7(2):85-94.2、FolkmanJ.Angiogenesisincancer,rheumatoidanddisease.#W1995,1:27-31.，絕大多數(shù)惡性實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是血管依賴的，即腫瘤組織在其生長過程中會誘導(dǎo)新的血管生成，以提供腫瘤生長所需的營養(yǎng)和氧氣，同時通過血管向其他組織輸送轉(zhuǎn)移細胞，并在機體的其他部位繼續(xù)生長和誘導(dǎo)血管形成，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移3、D'AmatoRJ，AdamisAP.Angiogenesisinhibitioninage-relatedmaculardegeneration.(9/7力t/37777oA^7.1995，102(9):1261-1262.4、ArbiserJL.Angiogenesisandtheskin:aprimer./Z/z^cadZfe27z7ato丄1996，34(3):486—497.5、O'BrienKD，McDonaldT0，ChaitA，AllenMD，AlpersCE.NeovascularexpressionofE-selectin，intercellularadhesionmolecule—1，andvascularcelladhesionmolecule—1inhumanatherosclerosisandtheirrelationtointimalLeukocytecontent.6Yrci/Ja"肌1996，93(4):672-82.6、HanahanD，F(xiàn)olkmanJ.Patternsandemergingmechanismsoftheangiogenicswitchduringtumorigenesis.1996，86(3):353-364.。目前認為，癌細胞能分泌大量促進血管生長的許多血管生長因子，使腫瘤形成新的血管而快速生長，而血管內(nèi)皮細胞也可分泌血管生長因子促使管內(nèi)皮細胞自身乃至腫瘤細胞的增殖7、Folkman，Cotran.Relationofvascularproliferationtotumorgrowth./""er&p/Mo,1976,16:207-248.8、VeikkolaT，AlitaloK.VEGFs，receptorsandangiogenesis.5e啦VC朋cer歷》丄1999，90211-220.總而言之，血管生成與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。抑制新生血管的生成已經(jīng)成為腫瘤防治中的一個新域。1998年美國Folkman研究組報道血管抑素(Angiostatin)和內(nèi)皮抑素(Endostatin)合用，對荷大腸瘤、前列腺瘤、乳腺瘤及腦瘤的小鼠有顯著療效，且對內(nèi)皮抑素不產(chǎn)生抗藥性，從而引起科學(xué)界的廣泛關(guān)注，使抗血管生成治療腫瘤成為一大熱點。以抑制血管生成為耙點，從而達到抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移的目的，這一新觀點克服了以往的治療腫瘤的弊端，不易產(chǎn)生耐藥性。藥物的作用不會對正常的細胞產(chǎn)生毒性。世界各國以腫瘤血管生成作為靶點經(jīng)過廣泛研究，目前開發(fā)出許多血管生成抑制劑在進行ini期臨床試驗研究，例如血管生成抑素(Angiostatin)、內(nèi)皮抑素(Endostatin)、煙曲霉素類似物及金屬蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素一12、血小板因子、Bufotanine等20多種。上述血管生成抑制劑，具有特異性強，作用快，劑量小，療效高，副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。此類藥物不但可用于大多數(shù)實體腫瘤的治療，還可用于癌的預(yù)防和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，同時對其他與血管生成有關(guān)的疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變、風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等的預(yù)防與治療，都具有重要的理論及現(xiàn)實意義。合歡皮屬合歡屬Albizzia系豆科含羞草亞科植物，廣泛分布于世界各地。我國有16種，大部分產(chǎn)于南部和西南部，其中最常見的有合歡^&'zw'a/〃h./n's^i/Durazz，楹樹"^z'zzisc力i/e/757.s1(Osb.)Merr.，大葉合歡爿7&>^'<3Lebbeck(L.)Benth禾口白格A/Z^'zziaProcera(L.)Benth等。合歡屬植物樹皮、莖皮、葉、花、種子的主要的化學(xué)成分有三萜及其苷類化合物、黃酮及其苷類化合物、生物堿、有機酸、甾醇類化合物、木脂素、鞣質(zhì)及揮發(fā)性成分等?，F(xiàn)代藥理實驗表明，合歡屬植物具有廣泛的抗癌、鎮(zhèn)靜、抗生育、PAF受體拮抗和抗炎等作用。例如，被中國藥典一部收錄的合歡屬植物中的合歡皮是一味常用中藥，為豆科植物合歡^"^^yWi力/^^i/7Durazz.的干燥樹皮，具有解郁安神，活血消腫的功能，用于心神不安，憂郁失眠，肺癰瘡腫，跌撲傷痛等癥。合歡皮提取物具有廣泛的體內(nèi)、體外抑制腫瘤細胞增殖的活性，但由于其抗癌作用機制還不明確，限制了其抗癌作用的臨床應(yīng)用9、TsuyoshiIkeda，TetsuyaKajimoto，ToshihiroNohara，Jun-eiKinjo，Chi-HueyWong.Preparationofaneoglycolipidcarryingtheoligosaccharidecomponentofsaponinfrom"Ziz^z.3j'〃7i力W5157./7.7fetra力eo(ro/7Ze"e_ns.1995，36(9):1509-1510.10、KimZou，.YuyingZhao，Gu肌gzhongTu，JingrongCui,ZhonghuaJiaandRuyiZhang.Twodiastereomericsaponinswithcytotoxicactivityfrom^76j'w'sy〃2j'力77'515^/7.Can6o力yc/i^e/fesearc力.2000，324(3):182-188.11、KunZou，YuyingZhao，GuangzhongTu，JunhuaZheng,RuyiZhang.ANewIsomerofJulibrosideJ2from"6iziaJw_/j'6j"j'ssi/7./Asi朋A^〃ra7/^oi/〃cz^Tfesearc力.1998，1(1):59-66.12、鄒坤，趙玉英，李德宇，徐鋒，鄭俊華，張如意.合歡皮的脂溶性成分.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999,31(1):32-34.合歡屬Albizzia系豆科含羞草亞科植物，廣泛分布于世界各地。我國有16種，大部分產(chǎn)于南部和西南部，其中最常見的有合歡爿7iW^z'3JWiZ7".s5^./Durazz，楹樹"Zu'^z'sc力i/e/757.51(Osb.)Merr.，大葉合歡^6/MJ'aZe6ZecA(L.)Benth和白格A/Wzzj'a/^ocera(L.)Benth等。合歡屬植物樹皮、莖皮、葉、花、種子的主要的化學(xué)成分有三萜及其苷類化合物、黃酮及其苷類化合物、生物堿、有機酸、甾醇類化合物、木脂素、鞣質(zhì)及揮發(fā)性成分等?，F(xiàn)代藥理實驗表明，合歡屬植物具有廣泛的抗癌、鎮(zhèn)靜、抗生育、PAF受體拮抗和抗炎等作用。例如，被中國藥典一部收錄的合歡屬植物中的合歡皮是一味常用中藥，為豆科植物合歡y^&'w'aj》h'力i^sw7Durazz.的干燥樹皮，具有解郁安神，活血消腫的功能，用于心神不安，憂郁失眠，肺癰瘡腫，跌撲傷痛等癥。合歡皮提取物具有廣泛的體內(nèi)、體外抑制腫瘤細胞增殖的活性，但由于其抗癌作用機制還不明確，限制了其抗癌作用的臨床應(yīng)用13、TsuyoshiIkeda，TetsuyaKajimoto，ToshihiroNohara，Jun-eiKinjo，Chi-HueyWong.Preparationofaneoglycolipidcarryingtheoligosaccharidecomponentofsaponinfromj^7j7r7.5^i化7e^ra力eo^0/7Ze"er51.1995，36(9):1509-1510.14、KunZou，YuyingZhao,GuangzhongTu，JingrongCui，ZhonghuaJiaandRuyiZhang.Twodiastereomericsaponinswithcytotoxicactivityfrom力7Zj'27'3J〃7i6i^'5"5"i/3.Canbo力j^rajaearc力.2000，324(3):182-188.15、KunZou，YuyingZhao,GuangzhongTu，JunhuaZheng,RuyiZhang.ANewIsomerofJ"ulibrosideJ2fromZ7Ziz/sJw7iZr/s^//7./Asi朋yVaz^ra〗尸2^/〃cz^yesearc力.1998，1(1):59—66.16、芻卩坤，趙玉英，李德宇，徐鋒，鄭俊華，張如意.合歡皮的脂溶性成分.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999,31(1):32-34.多成分、多靶點、多途徑"是中藥治療疾病的特點，發(fā)揮祖國醫(yī)學(xué)特色，從多途徑、多層次、多環(huán)節(jié)，研究中藥直接地或間接地影響血管新生，有著重要的臨床意義和應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容針對上述問題，本發(fā)明提供了合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份其同樣可以用于抑制腫瘤血管及其它與血管生成，本發(fā)明還提供了所述活性成份的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份為皂甙類化合物。所述皂甙類化合物其中含有化合物A和/或化合物B，所述化合物A的分子結(jié)構(gòu)的特征為(I)其中R1:CH3R2:NHACR3:OHC-6:R化合物A的分子式為C1MH165049N，分子量為2211，熔點為202204°C，化學(xué)名為3-0-[^>吡喃木糖基-(1—2)-p-D-吡喃呋糖基-(1—6)^-D-2-去氧-2-乙酰胺基葡萄糖基]-21-o-K6s)-2-反式-2-羥甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-p-D-吡喃雞納糖基-2，7-辛二烯酸基)-p-D-吡喃雞納糖基]-2，7-辛二烯酸基L金合歡酸-28-o-P-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酯；所述化合物B的分子結(jié)構(gòu)的特征為(II)其中R1:CH3R2:OHC-6:S化合物B的分子式為C啦H股049,分子量為2170，熔點為204~206°C;化學(xué)名3-o--21-0-{(6s)-2-反式-2-羥甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-(e-D-吡喃雞納糖基)-2，7-辛二烯酸基)-D-吡喃雞納糖基]-2，7-辛二烯酸基}-金合歡酸-28-o-e-D-吡喃葡萄-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-5-D-吡喃葡萄糖基酯。合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制備方法，其特征在于用有機溶劑、含水有機溶劑或水提取合歡皮的干燥樹皮、莖皮、葉、花、種子、豆莢或根，并將提取液過濾、濃縮成浸膏；所得的浸膏采用D-101型大孔樹脂洗脫分離，收集有效組份進行硅膠層析柱洗脫分離，再收集有效組份進行反相苯乙烯色譜柱分離，得有效組份，回收溶劑成浸膏，冷凍干燥制成干粉。其進一步特征在于將所述反相苯乙烯色譜柱分離得有效組份進行反相C18色譜柱洗脫分離后得皂甙類化合物A和皂甙類化合物B。合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，其特征是所述皂甙類化合物有抗腫瘤血管生成及其它與血管生成有關(guān)疾病治療、預(yù)防的用途；或在抑制血管生成的藥物中使用；或者用作常規(guī)藥用載體和/或賦形劑；或者在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng)用；或者在制備抑制血管生成的化妝品中的應(yīng)用。其進一步特征是在制成所述抑制血管生成藥物時，可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體；所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑，賦形劑、填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等；在制成所述抑制血管生成藥物時，可以按常規(guī)的制劑工藝，單獨使用或與其它藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，例如注射液、片劑、粉齊U、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜劑或乳劑等多種形式；制成的所述抑制血管生成藥物用于預(yù)防和/或治療至少一種選自下述之一的疾病癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變，早熟視阿膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆粒性結(jié)膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性及風濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，毛細管擴張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動脈粥樣硬化，脂溢性皮炎和痤瘡；制成的所述抑制血管生成藥物用于腫瘤化療和/或輔助化療的用途。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次明確合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份為皂甙類化合物，并將其作為用于腫瘤血管生成及其它與血管生成有關(guān)的疾病預(yù)防、治療的藥物，從多成分、多靶點、多途徑、多層次、多環(huán)節(jié)方面直接地或間接地影響血管新生，具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景，以血管生成理論為研究背景，為今后闡述中藥的作用機制，發(fā)展中醫(yī)藥理論新的方向，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點提供重要的科學(xué)依據(jù)。圖1:298-J--D-G-R的反相Resource柱色譜2:298-J-D-G-R2-A、298-J_D-G-R2-B(化合物A、化合物B)的反相C^液相色譜3:合歡皮的有效組份、化合物A、化合物B的分離純化圖框架圖圖4:化合物A的液相色譜圖圖5:化合物B的液相色譜圖圖6:298-J-D-G的質(zhì)譜圖圖7:298-J--D-G-R的質(zhì)譜8:化合物B對人血管內(nèi)皮細胞遷移能力的抑制作用圖圖9:化合物B對體內(nèi)Matrigeltube法血管的抑制作用10:化合物B抑制雞胚尿囊膜血管生成圖(CAM實驗)圖lh化合物A的質(zhì)譜12:化合物A的碳譜13:化合物A的氫譜14:化合物A的紅外譜15:化合物B的質(zhì)譜16:化合物B的碳譜17:化合物B的氫譜18-化合物B的紅外譜圖具體實施方式合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份為皂甙類化合物。所述皂甙類化合物其中含有化合物A和/或化合物B，所述化合物A的分子結(jié)構(gòu)的特征為(I)其中R1:CH3R2:NHACOHC-6:R化合物A的分子式為C鵬H服049N，分子量為2211，熔點為202~204°C，化學(xué)名為3-0-[|3-0-吡喃木糖基-(1—2)-(3-0-吡喃呋糖基-(1—6)-卩-0-2-去氧-2-乙酰B安基葡萄糖基]-21-o-{(6s)-2-反式-24圣甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式誦2,6-二甲基-6-o-P-D-吡喃雞納糖基-2，7-辛二烯酸基)-(3-D-吡喃雞納糖基]國2，7-辛二烯酸基)-金合歡酸-28-o-(3-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-(3。-吡喃葡萄糖基酯；所述化合物B的分子結(jié)構(gòu)的特征為(II)其中R1:CH3R2:OHC-6:S化合物B的分子式為(^凡62049，分子量為2170，熔點為204206°C;化學(xué)名3-o-[P-D-吡喃木糖基-(1—2)-D-吡喃呋糖基-(1—6)-D-吡喃葡萄糖基]-2l-o-{(6s)-2-反式-2-羥甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-(e-D-敗喃雞納糖基)-2，7-辛二烯酸基)-P-D-吡喃雞納糖基]-2，7-辛二烯酸基}-金合歡酸-28-0-D-吡喃葡萄-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)D-吡喃葡萄糖基酯。合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，所述皂甙類化合物有抗腫瘤血管生成及其它與血管生成有關(guān)疾病治療、預(yù)防的用途；或在抑制血管生成的藥物中使用；或者用作常規(guī)藥用載體和/或賦形劑；或者在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng)用；或者在制備抑制血管生成的化妝品中的應(yīng)用。在制成所述抑制血管生成藥物時，可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體；所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑，賦形劑、填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等；在制成所述抑制血管生成藥物時，可以按常規(guī)的制劑工藝，單獨使用或與其它藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，例如注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜劑或乳劑等多種形式；制成的所述抑制血管生成藥物用于預(yù)防和/或治療至少一種選自下述之一的疾病癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變，早熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆粒性結(jié)膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性及風濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，毛細管擴張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動脈粥樣硬化，脂溢性皮炎和痤瘡；制成的所述抑制血管生成藥物用于腫瘤化療和/或輔助化療的用途。下面將結(jié)合具體實施例及實驗，對本發(fā)明作進一步說明，文中所述有效部位為包含有皂甙類化合物的混合物，有效單體為化合物A或化合物B。實施例1:合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制備方法1.1將lkg合歡皮分別用IOL、8L759&乙醇(水或不同濃度的甲醇或丙酮溶液)100'C回流提取兩次，每次2小時，過濾，去渣。合并濾液，減壓回收乙醇，得浸膏，此有效部位編號為298-J。將所得浸膏298-J經(jīng)D101型大孔樹脂吸附，再用水，30%乙醇，80%乙醇，各洗脫3個柱體積，收集各相，回收80%乙醇相得浸膏，此有效部位編號為298-J-D。將所得298-J-D用100~200目的硅膠常壓分離，用體積比氯仿甲醇水為9丄0,16.5:3.5:1梯度洗脫，等體積收集，將第33~44瓶合并，回收溶劑得浸膏，此有效部位編號298-J-D-G。將所得298-J-D-G用反相苯乙烯柱中壓分離，用30%~50%乙腈梯度洗脫，按體積收集(70ml150ml，150ml300ml，300ml600ml)如圖1所示，回收各相溶劑得浸膏，此有效部位分別編號為298-J-D-G-Rl，298-J-D-G-R2，298-J-D-G-R3。將所得298-J-D-G-R2用反相C18色譜柱中壓分離，用70%的甲醇水溶液洗脫，結(jié)果見圖2，按色譜單峰收集，回收溶劑，冷凍干燥得有效單體298-J-D-G-R2-A(化合物A)，298-J-D-G-R2-B(化合物B)?？偟姆蛛x純化路線見圖3。1.2化合物A與化合物B的HPLC分析將所得白色粉末298-J-D-G-R2-A，298-J-D-G-R2-B經(jīng)HPLCAgilent1100分析采用XDBC-18柱(4.6mmX150mm,填料cj)5um)，流動相采用65%甲醇(V/V,甲醇水=65:35)。柱溫25。C,215nm檢測，進樣量5uL。AgilentChemstation軟件采集、分析數(shù)據(jù)。298-J-D-G-R2-A的含量為90%298-J-D-G-R2-B的含量為92.50%。298-J-D-G-R2-A的液相分析結(jié)果見圖4，298-J-D-G-R2-B液相分析結(jié)果見圖5。1.3:合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份理化鑒定所述有效組份298-J,298-J-D,298-J-D-Q298-J-D-G-R1，298-J-D-G-R2，298-J-D-G-R3的Molish反應(yīng)呈紫紅色，Libermann-Buchard反應(yīng)呈紫紅色，三氯化銻顯色為紅色。有效組份298-J-D-G的MALDI-TOF-MS顯示準分子離子峰m/z在800-2400。這與有關(guān)合歡的文獻報道的皂甙類成分的分子量相一致，結(jié)果見圖6;以上結(jié)果說明這有效組份均含有至少一種以上皂甙類化合物；有效組份298-J-D-G-R2的MALDI-T0F-MS顯示準分子離子峰m/z如圖7所示。有效組份298-J-D-G-R2進行反相C18色譜柱洗脫分離后得化合物A/化合物B，化合物A/化合物B，Molish反應(yīng)呈紫紅色，Libermann-Buchard反應(yīng)呈紫紅色，三氯化銻顯色為紅色。1.4:合歡皮中提取的有效組份的活性鑒定1.4.1有效組份對人微血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用將人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1，法國國家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究所惠贈)置于含lmmol谷氨酰胺，Wg/mL氫化可的松，10ng/mL表皮生長因子(EGF)和15%小牛血清的MCDB-131培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37°C、5%C02、95%濕度)。取對數(shù)生長期細胞，以1(fcell/mL細胞接種于96孔板，100叱/孔，每組設(shè)4個平行孔，放置于37。C、5%濕化0)2的培養(yǎng)箱過夜。加不同濃度以上提取分離的298-J(l~100ng/mL)，298-J-D(150jug/mL),298-J國D誦G(110pg/mL),298-J-D國G-Rl(卜10pg/mL)，298曙J畫D-G-R2(卜10jig/mL)，298-J-D華G-R3(l~10pg/mL)，298-J-D-G-R2-A(化合物A)(0.050.5|ig/mL)，298-J-D-G-R2-B(化合物B)(l5)ig/mL)，水為陰性對照，培養(yǎng)72小時后，去掉上清液，每孔輕輕地加入10%三氯醋酸IOO叱固定，靜置5min后移到4。C放置lh后倒掉固定液，用去離子水洗5次，空氣干燥。每孔加入0.4。/o磺酰羅丹明B(SRB)IOO叱37。C培養(yǎng)箱放置30min，用1%醋酸液洗5次，空氣干燥。加100叱10MmTris堿液(pH10.5)溶解，自動分光光度儀在515nm波長處測定每個小孔的吸光度值(A)。上述實驗重復(fù)3次。抑制率(％)計算如下對照組A值一藥物組A值抑制率(％)=-Xioo%對照組A值一空白組A值根據(jù)所得的結(jié)果計算其半數(shù)抑制量(IC5Q)，結(jié)果表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>以上結(jié)果說明隨著提取分離的步驟的推進，我們所得的有效部位的ICs。值也在降低，也就表明有效部位的純度得到逐步提高。1.4.2對人血管內(nèi)皮細胞遷移能力的抑制作用。取對數(shù)生長期細胞，以105cell/mL細胞接種于24孔板，lmL/孔，每組設(shè)4個平行孔，細胞貼壁后，沿孔中線劃去細胞，培養(yǎng)基洗滌，去除死細胞，分別加水陰性對照組和298-J(30.0^ig/mL)，298-J-D(10.0ng/mL)，298-J-D-G(2.8pg/mL)，298國J-D-G-Rl(1.8ng/mL)，298-J-D-G-R2(1.5|ig/mL)，298國J-D-G-R3(1.5ng/mL)，298-J曙D-G-R2-A(0.2pg/mL)，298曙J-D-G-R2誦B(1.2|ig/mL)，分別在0h，6h,12h,24h,拍照，量取中間空白帶的寬度，記錄。陰性對照組細胞的空白帶的寬度較小，說明細胞遷移數(shù)量較高，而加入藥物加以干預(yù)后，細胞遷移數(shù)明顯減少?；衔顱結(jié)果見圖8所示，其它6個有效部位的結(jié)果與和化合物A/B相似，數(shù)據(jù)未給出。以上結(jié)果說明有效部位、有效單體均有抑制內(nèi)皮細胞遷移的作用。他們可能通過抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移而抑制新生血管的生成。1.4.3體外Matrigeltube法血管抑制試驗。體外小管形成試驗參照文獻[17、ThaloorD，SinghAK，SidhuGS，"a丄Inhibitionofangiogenicdifferenti-ationofhumanumbilicalveinendothelialcellsbycurcumin[J].6W臉o時/釘《1998，9:305_312.]的方法進行。于4。C下在96孔培養(yǎng)板的底部，加入50yL生長減少型Matrigel,鋪平后于37。C孵育4h。分別將不同濃度的298-Kl~100pg/mL)，298-J-D(l~50ng/mL)，298-J-D-G(l~10pg/mL)，298-J-D-G-Rl(l~10ng/mL)，298-J-D-G-R2(l~10|ig/mL)，298-J-D-G-R3(卜10pg/mL)，298-J畫D-G畫R2國A(0.050.5嗎/mL)，298-J-D-G-R2-B(l~5pg/mL)，與含150mL/L小牛血清的MCDB-131培養(yǎng)液和HMEC-1(4X104細胞/孔，每孔體積為0.25mL)混勻后加入到培養(yǎng)板中，以培養(yǎng)基為陰性對照，于37'C、50mL/LC02條件下培養(yǎng)24h后，在倒置顯微鏡下，觀察以上各樣品對內(nèi)皮細胞體外血管樣形成的影響。結(jié)果顯示以上各樣品對HMEC-1體外Matrigel小管的形成均有明顯的抑制作用。以化合物B為例，當濃度為lyg/ml時，對HMEC-l小管形成即有影響，小管的數(shù)目減少；濃度為2yg/ml時，HMEC-1貼壁后幾乎無移動，基本無小管形成；在3"g/ml濃度下，細胞貼壁困難?；衔顱的濃度為1yg/ml、1.5Ug/ml、2ug/ml和3yg/ml時，4個實驗組形成管腔的面積與對照組相比較有明顯差異(結(jié)果見圖9所示)其它樣品的結(jié)果與化合物A/3相似，未給出。以上結(jié)果說明有效部位、有效單體有著明顯的體外抑制血管生成作用。1.4.4合歡屬植物提取物抑制雞胚尿囊膜血管生成(CAM實驗)白皮種蛋，參考張樹成的方法18、張樹成，吳志奎，王蕾，等.研究中藥血管生成活性和作用的雞胚絨毛尿囊膜試驗?zāi)Ｐ偷膽?yīng)用.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，5:16-19.制備雞胚尿囊膜。用打孔器制備直徑為6mm的微孔濾膜圓片，濕熱高壓消毒。設(shè)298-J組，298-J-D組，298-J-D-G組，298-J--D-G-R1組，298-J-D-G-R2組，298-J-D-G-R3組，298-J_D-G-R2-A組，298-J-D-G-R2-B組及生理鹽水陰性對照組。將藥物滴于濾紙上，制成藥膜，吹干備用。雞胚培養(yǎng)3d后分組，將藥膜貼于CAM的部位。加藥48h后，觀察藥膜周圍的血管數(shù)，并攝影記錄?；衔顱的結(jié)果見圖10。生理鹽水陰性對照組CAM血管生成非常明顯，整體呈鮮紅色，血管在藥膜下呈放射狀生長，血管粗大，血液充盈，血管分支較多，毛細血管密度大。化合物B給藥組則明顯抑制了血管生成，放射狀生長的血管數(shù)目大為減少，血管主要以零星、雜亂、葉脈樣等表現(xiàn)形式存在，血管細小，稀疏，血管分支少，血管色淡淺黃，在藥膜片下及周圍局部鮮有血管區(qū)，或者血管斷裂或消失。其它樣品的結(jié)果與化合物A/B相似，數(shù)據(jù)未給出。以上結(jié)果說明有效部位、有效單體有著明顯的體內(nèi)抑制血管生成作用。1.4.5:合歡皮有效單體(化合物A，化合物B)的分子結(jié)構(gòu)鑒定。1.4.5.1化合物A為白色粉末，易溶于水，熔點為204~204°C，Molish反應(yīng)呈紫紅色，Libermann-Buchard反應(yīng)呈紫紅色，三氯化銻顯色為紅色說明化合物A為皂甙類化合物。其MALDI-TOF-MS顯示準分子離子峰m/z2236[M+Na+2]+。結(jié)果見圖11"H-NMR(500Hz，C3D60，Sppm)顯示有7個甲基單峰質(zhì)子信號0.93，1.02，1.02，1.08，1.15，1.18,1.88,l個寬單峰烯氫質(zhì)子信號5.58,3個相對低場的含氧碳上質(zhì)子信號3.56，5.21和6.31，2個烯碳信號143.5，123.0，和1個酯羰基碳信號174.6，根據(jù)生源關(guān)系以及碳氫數(shù)據(jù)確定化合物A的甙元為齊墩果酸型三萜皂甙元，比較其碳譜數(shù)據(jù)與文獻報道的julibrosideIII(19.Tsuyoshilkeda，SatokoFujiwara，KaoruAraki，etal.CytotoxicglycosidesfromAlbiziajulibrissin[J].J.Nat.Prod，1997，60(2):102)中苷元金合歡酸的碳譜數(shù)據(jù),完全一致結(jié)果見表2。表2甙元金合歡酸的"C麗R數(shù)據(jù)(py-ds)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>有9個糖基質(zhì)子信號4.934.87(lH,d,J=8.0Hz,glcH-l),5.02(lH,d，J=8.5Hz，fUcH-l)，5.06(lH,d，J=6.5Hz，xylH-l，6.03(lH,d,J=8.0Hz，glc，H-l)，5.88(1H，brs,rhaH畫l)，6.28(1H，s,arafH-l)，5.37(lH,d,J=8.5Hz,glc，H-l)，4.82(lH，d,J=6.5Hz，quiH誦l)，4.83(lH,d，J=7.5Hz,qui，H-l)，4個去氧糖上甲基質(zhì)子雙峰信號1.76(3H，d，J=5.5Hz,rha6-C，1.58(3H,d，J=5.0Hz,qui，6-CH3)，l,34(3H，d,J=6.0Hz，qui6-CH3)，1.46(3H，d，J=6.0Hz,fiic6-CH3);1H-NMR13C-NMR(500Hz,C3D6O，S卯m):中有9個糖端基碳信號595.6，99.2，99.4，101.8，103.2,104.5，105.6，106.7和111.0和4個去氧糖上甲基碳信號17.3，18.6，18.8和18.9?；衔顰氫譜顯示一典型的乙酰甲基質(zhì)子信號8.49(lH，d，J二8.5Hz);碳譜有氨基碳信號S58.1以及1個乙基羰基碳信號S170.1。說明化合物A分子中有9個單糖，其中4個是6-去氧單糖，l個為氨基糖。除rha和araf糖為a-構(gòu)型外，其他糖均為e構(gòu)型，與文獻化合物JulibrosideIII(Jin)糖部分碳譜數(shù)據(jù)對照，完全一致，說明化合物A與JulibrosideIII糖的取代種類，數(shù)目以及聯(lián)接方式一樣。結(jié)果見表3表3化合物A糖部分的13CNMR和^NMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>除苷元和糖信號外，碳譜多出20個碳信號，分析其氫譜及碳譜信號特征，推測其可能含有兩個單萜結(jié)構(gòu)?；衔顰碳譜中有S145.4，133.6的烯碳和56.2羥甲基信號，說明內(nèi)側(cè)的單萜9位是羥甲基取代，氫譜中7.0附近能見到兩組三重鋒7.09，7.03，碳譜在40.8和38.7各有一個5位碳信號，說明外側(cè)的MT'中C-6是R構(gòu)型。比較其氫譜及碳譜與文獻報道Julibrosideni(jni)的化合物的單萜部分數(shù)據(jù)完全一致。結(jié)果見表4?；衔顰的13C-NMR見圖12，iH-NMR見圖13。表4.單萜酸(MT)的"C匿<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>IR(KBr)cm-l:3413，2928，1692，1631,1384,1071，結(jié)果見圖14。綜上所述，鑒定化合物A為3-0-[卩-0-吡喃木糖基-(1—2)-卩-D-吡喃呋糖基_6)+0-2-去氧-2-乙酰胺基葡萄糖基]-21-0-{(63)-2-反式-2-羥甲基-6曙甲基—6-0-[4-0-((611)-2-反式-2，6-二甲基-6-0-卩-D-吡喃雞納糖基-2，7-辛二烯酸基)-P-D-吡喃雞納糖基]-2，7-辛二烯酸基卜金合歡酸-28-o-P-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)--a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-p-D-吡喃葡萄糖基酯即(3畫o畫(3-D-xylopyranosyl隱(1—2)-卩-D國fUcopyranosyl-(1—6)-(3-D-2-deoxy-2-acetamidogluco-pyranosyl]-21-o-{(6s)-2trans-2-hydroxymethyl-6-methyl-6-o-[4-o-((6R)-2-trans-2，6-dimethyl-6-o-P-D-quinovopyranosyl)-2,7-octadienoyl)-|3-D-quinovopyranosyl]-2,7-oGtadienoyl}-acadcaGid-28-o-P一D曙glucopyranosyl一(1—3)一[a-L-arabinofUranosyl-(l—4)〗-a-L-rhamnopyranosyl-(l—2)畫卩-D-glucopyranosyl6ster1.5.2化合物B為白色粉末，易溶于水，熔點為204206匸Molish反應(yīng)呈紫紅色，Libermann-Buchard反應(yīng)呈紫紅色。MALDI—T0F—MS顯示準分子離子峰m/z2196[M+Na+2]+。結(jié)果見圖15'H-NMR(500Hz，C3D60,5ppm)顯示9個甲基質(zhì)子單峰信0.96，1.03，1.05，1.10，1.16,1.31和1.88:碳譜顯示2個烯碳信號143.7，123.4,和一個酯碳基信號174.6，根據(jù)生源關(guān)系以及碳氫數(shù)據(jù)確定化合物B的甙元為齊墩果烷型三萜皂甙元，比較其碳譜數(shù)據(jù)與文獻報到的JulibrosideII(JII)(20.Tsuyoshilkeda，SatokoFujiwara，KaoruAraki,etal.CytotoxicglycosidesfromAlbiziajulibRissi[J].J.Nat.Prod,1997，60(2):102)中式元金合歡酸的碳譜數(shù)據(jù)(見表5)，完全一致。表5甙元的。C麗R數(shù)據(jù)(py-d5)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>有九個糖的端基質(zhì)子信4.87(lH，d,J二7.0Hz,quiH-l)4.82(lH，d,^8.0Hz:qui，H-l),4.96(lH，d，J=8.0Hz,glcH-l),5.01(lH,d,J=7.5Hz，fucH-l)5.09(lH,d，J=7.0Hz,xylH-l)5.34(lH,d，J=8.0Hz,glcH，-l)，5.90(lH,brs,rhaH,-l),6.07(lH，d,J=8.0Hz，glc'H-l)，6.26(lH,brs，arafH-l)，4個6-去氧糖甲基質(zhì)子雙峰信號1.34(3H，d,J=6.0Hz，qui6-CH3)1.58(3H,d，J=5.0Hz，qui，6-CH3)1.48(3H,d，J=6.0Hz,6-CH3),1.75(3H，d,J=6.0Hz,6-CH3)。13C-NMR(500Hz,C3D6O，S卯m):中觀察到9個糖端基碳信號95.5，99.0，99.4，101.4，103.2，105.4，106.5，106.5，107.0和110.7，4個去氧糖上甲基碳信號17.2，18.7，18.89和18.9。說明分子中有9個單糖，其中4個是6-去氧糖，將化合物B糖部分碳譜數(shù)據(jù)與文獻報到的皂甙JulibrosideII(JII)糖部分的碳譜數(shù)據(jù)(表6)進行比較，完全一致。表6化合物B糖部分的"CNMRHNMR數(shù)據(jù)(py-ds)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>除苷元和糖信號外，碳譜也多出20個碳信號，分析其氫譜及碳譜信號特征，推測其可能含有兩個單萜結(jié)構(gòu)。化合物B碳譜中有3144.8，133.5的烯碳和56.06羥甲基信號，說明內(nèi)側(cè)的單萜9位是羥甲基取代，氫譜中7.0附近能見到兩組三重鋒7.09，7.03，碳譜在40.8和40.8各有一個5位碳信號，說明外側(cè)的MT'中C-6是S構(gòu)型。比較其氫譜及碳譜與文獻報道Julibrosidein(JIII)的化合物的單萜部分數(shù)據(jù)完全一致。結(jié)果見表7，化合物B的13C-NMR圖見圖16，'H-NMR圖的結(jié)果見圖17。表7.單路酸(MT和MTT)的"C醒R、'HNMR<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>IR(KBr)cm-l:3413，2926，1694，1644,1374，1076結(jié)果見圖18綜上所述鑒定化合物B為化學(xué)名3-o-[e-D-吡喃木糖基-(1—2)-3-D-吡喃呋糖基-(1—6)-日-D-吡喃葡萄糖基]-21-0-{(6s)-2-反式-2-羥甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2，6-二甲基-6-o-(e-D-吡喃雞納糖基)-2，7-辛二烯酸基)-P_D-吡喃雞納糖基]-2，7-辛二烯酸基}-金合歡酸-28-o-D-吡喃葡萄-(1—3)-[(i-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酉旨艮卩3-o-[P-D-xylopyranosyl-(l—2)-(3-D-fucopyranosyl-(l—6)-p-D-gluCopyranosyl]—21陽o-{(6s)_2-trans-2-hydroxymethyl—6-methyl—6-0—[4-o—((6R)-2-trans—2，G-dimethyl畫6-o-卩-D-quinovopyranosyl)畫2,7-octadienoyl)陽j3-D-quinovopyranosyl]-2,7-oGtadienoyl}-acacicaGid-28國o-卩-D-glucopyranosyl-(1—3)—[a-L-arabinofuranosy1-(l—4)]-a-L-rhamnopyranosyI-(l—2)-(3-D-glucopyranosylester。本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能領(lǐng)會在公開的實施例中作許多改變也可獲得相同或類似的結(jié)果，而不超出本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更具體地說，顯然有些化學(xué)和生理性的相關(guān)試劑可替代本文所公開的試劑而得到相同或類似的結(jié)果。所有類似的取代和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然都認為是本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思及權(quán)利要求范圍內(nèi)的，即所有上述這些等價形式都同樣落于本發(fā)明的權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1、合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份為皂甙類化合物。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份，其特征是所述皂甙類化合物其中含有化合物A和/或化合物B,所述化合物A的分子結(jié)構(gòu)的特征為-(I)其中R1:CH3R2:NHACR3:OHC畫6:R化合物A的分子式為C1()4H165049N，分子量為2211，熔點為202~204°C,化學(xué)名為3-o-[p-D-吡喃木糖基-(1—2)-P-D-吡喃呋糖基-(1—6)-(3-0-2-去氧-2-乙酰胺基葡萄糖基]-21-o-K6s)-2-反式-2-羥甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2,6-二甲基-6-0-(3-D-吡喃雞納糖基-2，7-辛二烯酸基)-卩-D-吡喃雞納糖基]-2，7-辛二烯酸基)-金合歡酸-28-o-P-D-吡喃葡萄糖基-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酯所述化合物B的分子結(jié)構(gòu)的特征為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)其中R1:CH3R2:OHC-6:S化合物B的分子式為C1()2H162049，分子量為2170，熔點為204~206°C;化學(xué)名3-o-[e-D-吡喃木糖基-(1—2)-P-D-吡喃呋糖基-(1—6)-3-D-吡喃葡萄糖基]-21-0-{(6s)-2-反式-2-羥甲基-6-甲基-6-o-[4-o-((6R)-2-反式-2,6-二甲基-6_0-(e-D-吡喃雞納糖基)-2，7-辛二烯酸基)-e_D-吡喃雞納糖基]-2,7-辛二烯酸基}-金合歡酸-28-o-P-D-吡喃葡萄-(1—3)-[a-L-呋喃阿拉伯糖基-(1—4)]-a-L-吡喃鼠李糖基-(1—2)-P-D-吡喃葡萄糖基酯。3、合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制備方法，其特征在于用有機溶劑、含水有機溶劑或水提取合歡皮的干燥樹皮、莖皮、葉、花、種子、豆莢或根，并將提取液過濾、濃縮成浸膏；所得的浸膏采用D-101型大孔樹脂洗脫分離，收集有效組份進行硅膠層析柱洗脫分離，再收集有效組份進行反相苯乙烯色譜柱分離，得有效組份，回收溶劑成浸膏，冷凍干燥制成干粉。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的制備方法，其特征在于將所述反相苯乙烯色譜柱分離得有效組份進行反相C18色譜柱洗脫分離后得皂甙類化合物A和皂甙類化合物B。5、合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，其特征是所述皂甙類化合物有抗腫瘤血管生成及其它與血管生成有關(guān)疾病治療、預(yù)防的用途；或在抑制血管生成的藥物中使用；或者用作常規(guī)藥用載體和/或賦形劑；或者在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng)用；或者在制備抑制血管生成的化妝品中的應(yīng)用。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，其特征是在制成所述抑制血管生成藥物時，可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，其特征是:所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑，賦形劑、填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，其特征是:在制成所述抑制血管生成藥物時，可以按常規(guī)的制劑工藝，單獨使用或與其它藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，例如注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏齊U、霜劑或乳劑等多種形式。9、根據(jù)權(quán)利要求6所述合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，其特征是:制成的所述抑制血管生成藥物用于預(yù)防和/或治療至少一種選自下述之一的疾病癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變，早熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆粒性結(jié)膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性及風濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，毛細管擴張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動脈粥樣硬化，脂溢性皮炎和痤瘡。10、根據(jù)權(quán)利要求4所述合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份的應(yīng)用，其特征是:制成的所述抑制血管生成藥物用于腫瘤化療和/或輔助化療的用途。全文摘要本發(fā)明涉及合歡皮中具有抑制血管生成作用的活性成份。所述活性成份為皂甙類化合物。其有抗腫瘤血管生成及其它與血管生成有關(guān)疾病治療、預(yù)防的用途；其可以在抑制血管生成的藥物中使用；或者用作常規(guī)藥用載體和/或賦形劑；或者在制備抑制血管生成的保健食品中的應(yīng)用；或者在制備抑制血管生成的化妝品中的應(yīng)用，為此，本發(fā)明還提供了所述活性成份的制備方法，用有機溶劑、含水有機溶劑或水提取合歡皮的干燥樹皮、莖皮、葉、花、種子、豆莢或根，并將提取液過濾、濃縮成浸膏；所得的浸膏采用D-101型大孔樹脂洗脫分離，收集有效組份進行硅膠層析柱洗脫分離，再收集有效組份進行反相苯乙烯色譜柱分離，得有效組份，回收溶劑成浸膏，冷凍干燥制成干粉。文檔編號A61K36/48GK101239093SQ20081002049公開日2008年8月13日申請日期2008年3月10日優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日發(fā)明者磊馮,張蓮芬,紅李,慧花,堅金,核陸申請人:江南大學(xué)