專利名稱：負載重組人hsp70多肽復合物的樹突狀細胞疫苗、制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥領域，更具體涉及到將抗原多肽與重組人熱休克蛋白70 (rhHSP70)形成復合物，再將復合物負載于樹突狀細胞(DC)制備出樹突狀細 胞多肽疫苗，用于腫瘤及感染性疾病的治療。
背景技術：
1.惡性腫瘤與感染性疾病發(fā)病及治療現(xiàn)狀
(1)腫瘤發(fā)病與治療進展
腫瘤與傳染性疾病為全球公認的嚴重威脅人類生命與健康的重大疾病。在第
18屆國際抗癌癥聯(lián)盟大會上，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項研究報告表明，全球癌癥狀 況將日益嚴重，今后20年新患者人數(shù)將由目前的每年1000萬增加到1500萬，因 癌癥而死亡的人數(shù)也將由每年600萬增至1000萬。我國流行病學調査表明，2003 年我國城市居民惡性腫瘤致死率為94. 71/10萬，癌癥成為第一位致死疾??；農(nóng)村居 民惡性腫瘤患者病死率更高，為104. 01/10萬，居全部死亡疾病之首。
腫瘤已成為人類的第一號"殺手"?，F(xiàn)行治療腫瘤的常規(guī)方法(手術、放療與化 療)雖在一定程度上緩解癥狀，但近80%的腫瘤患者在經(jīng)受手術、放療與化療的痛苦 之后仍因腫瘤的復發(fā)與轉移而死亡。因此，開發(fā)新型抗腫瘤方法與藥物必須而且緊 迫。
現(xiàn)在認為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與宿主免疫狀態(tài)有著密切關系。因此，以通過提高腫 瘤組織對宿主的免疫原性和增強機體對腫瘤細胞免疫應答能力的方式來抑制或消除 腫瘤的免疫治療是抗腫瘤治療的重要方法。以免疫治療為主體的腫瘤生物治療已被 公認為繼手術、放療和化療后腫瘤治療的"第四模式"，其療效已在多種腫瘤的治 療中得到驗證?；跈C體細胞免疫機制的抗腫瘤細胞免疫治療與治療性疫苗的研發(fā) (如DC疫苗)已成為研究與開發(fā)熱點。
6(2)重大傳染病發(fā)病與治療現(xiàn)狀 近年來隨著預防性疫苗的使用與普及，常見多發(fā)傳染病得到有效控制，發(fā)病率 大幅度下降，但部分重大傳染性疾病的危害仍很嚴重。
結核病(Tuberculosis, TB) —直是人們關注的一個全球性健康問題，盡管大 多數(shù)人(約90%)在感染結核桿菌(MTB)后體內啟動了保護性的有效的細胞免疫反應 來阻止其發(fā)展成為活動性結核病，但伴隨近年來耐藥結核桿菌的流行，以及結核桿菌 與人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIVs)的雙重感染，導致 TB的發(fā)病率與死亡率大幅度上升，TB已成為傳染病中的頭號殺手。
WHO最新統(tǒng)計表明全球人口的1/3 (約20億)感染過MTB，每年超過200萬人 死于結核病。我國每年新發(fā)生的耐藥結核病患者數(shù)約占全世界的1/4， 2002年報告 新發(fā)肺結核患者58多萬例，80%在農(nóng)村。由于經(jīng)濟和管理等方面原因，導致治療不 徹底或服藥不規(guī)律，造成耐藥結核病患者逐年增多?？ń槊?Bacillus Calmette Guerin,BCG)是目前唯一獲準用于預防結核病的疫苗，主要用于預防兒童結核的發(fā) 病，對成人結核發(fā)病預防作用從0-80%不等。鑒于BCG自身的不足(BCG變異、BCG 制備過程中丟失部分與免疫記憶及保護性相關蛋白等)以及耐藥MTB的流行，研制 新型疫苗是控制結核病的重要途徑。
乙型肝炎病毒(冊V)感染則是又一種全球重大的公共衛(wèi)生問題。預計全世界 有3億慢性HBV攜帶者，我國約占1. 3億。其中50-75%為有活動性病毒復制的慢性 HBV攜帶者，他們中30%可能發(fā)展為肝硬化，5-10%可能發(fā)展為肝細胞癌。估計全球 每年死于與HBV感染有關的慢性肝病人數(shù)約100萬人。
盡管a-干擾素與拉米夫定等新藥使得慢性乙型肝炎的治療得到改善，但由于 朋V在肝內復制過程的復雜性，對復制過程中形成的cccDNA至今尚未找到有效的抗 病毒藥加以清除。大量研究表明慢性HBV感染者免疫應答水平低下或缺失，病毒 特異性T細胞數(shù)量和功能都降低，HBV特異性的CTL和Th細胞介導的免疫反應微弱， 甚至檢測不到針對HBV的特異性CTL反應，這種免疫耐受狀態(tài)是導致朋V慢性持續(xù) 感染的根源。因此，打破免疫耐受，重建慢性冊V感染病人特異性細胞免疫應答可 能是慢性HBV感染得到根治的最新方法。2.特異性T細胞免疫反應在抗腫瘤、抗感染性疾病中的重要作用 (1)人體免疫系統(tǒng)的作用機制
人體免疫系統(tǒng)的主要功能之一是識別并清除異已(抗原)，如體內變異細胞(如 腫瘤細胞)，感染病原體的宿主細胞(如感染HBV的肝細胞等)，及外來入侵的細菌(如 TB)、病毒與寄生蟲等。
人體免疫系統(tǒng)能夠識別這些異已抗原，激活機體天然免疫與特異性免疫反應(B 淋巴細胞介導的體液免疫與T淋巴細胞介導的細胞免疫)，共同清除這些抗原，后者 可同時產(chǎn)生免疫記憶，對人體進行長期保護。清除腫瘤、胞內感染病毒(如冊V)或 胞內細菌(如TB)主要通過特異性T細胞免疫反應。
特異性T細胞免疫反應大致由四個階段組成(1)抗原識別人體抗原遞呈細 胞(Antigen Presenting Cell, APC)通過表面受體識別并吞噬異已細胞；(2)抗原 遞呈內吞的細胞被APC消化、裂解成多肽，后者與APC胞內豐富的MHC-I類或II 類分子結合分別形成MHC-I-多肽或MHC-I1-多肽復合物，并被轉運至APC表面；(3) T細胞激活攜帶MHC-多肽復合物的APC遷移至淋巴結與T細胞相遇，T細胞通過表 面受體(T Cell Rec印tor, TCRs與APC表面的MHC-多肽復合物相互識別后被激活， 成為有抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL); (4)特異殺傷被激活的CTL循環(huán) 至抗原所在部位，通過CTL表面的TCR特異識別抗原表達細胞后進行殺傷；可見，正 是依靠人體自身強大的免疫防御系統(tǒng)，體內變異的細胞、外部入侵的細菌、病毒等才 得以不斷清除，保持機體自身穩(wěn)定與平衡。APC作為特異性免疫應答的啟動者發(fā)揮重 要作用。
(2) DCs在特異性T細胞免疫反應中的重要地位
樹突狀細胞(Dendritic Cell, DC)是至今為止發(fā)現(xiàn)的體內功能最為強大的專職 性抗原遞呈細胞(APC)，表達豐富的抗原捕獲分子(如謹R， DEC205， FcRs， TLRs)、 抗原遞呈分子(如MHC-I， MHC-II， CD1)及免疫共刺激分子(如CD40， CD54, CD80， CD83,CD86等)；捕獲抗原的DCs遷移至淋巴結，將加工、處理后的抗原信息遞呈給T 淋巴細胞(提供T淋巴細胞激活的第一信號)，其表達的免疫共刺激分子提供激活T 淋巴細胞的第二信號，T細胞經(jīng)激活分化為具有特異性殺傷功能的CTL。同時，經(jīng)抗 原刺激的DC分泌產(chǎn)生大量炎性因子(如IL-2， TNFa, IL-12， IFN y等)增強機體 天然免疫應答，故DC又有"天然免疫佐劑"的美稱。鑒于DC強大的抗原捕獲、加工、遞呈與激活T細胞的功能，基于DC開發(fā)抗腫 瘤、抗感染性疾病治療性疫苗的研究成為全球熱點。體外用抗原負載DC，將攜帶抗 原信號的DC回輸體內，激發(fā)機體主動特異性T細胞免疫應答，清除抗原表達細胞，同 時在體內誘異免疫記憶。這種攜帶特定抗原信號，啟動/激發(fā)機體特異性細胞免疫反 應的功能性樹突狀細胞統(tǒng)稱為"DC疫苗"(DC Vaccine),該免疫治療方法被認為是 當今最先進、最有希望的細胞免疫治療手段之一。
3. DC疫苗在抗腫瘤領域的應用進展
用人工合成的已知抗原多肽、重組抗原蛋白、編碼抗原RNA/DNA質粒、細胞裂 解液、細胞提取物、凋亡細胞等不同形式的抗原體外負載DC的研究與應用均有大量 報道。美國Dendreon公司用前列腺酸性磷酸酶(PAP)與GM-CSF融合蛋白作為抗原 負載DC治療性DC疫苗產(chǎn)品Provenge""(APC8015)己于2007年完成III期臨床研究， 并通過FDA專家評審(/w;/77aJ 0/a^7icW tocWogy， 2006, 24(19) : 3089-3094)。 Barrou等用重組人PSA蛋白(前列腺癌相關抗原)體外沖擊自體DC，對24例前列 腺癌患者進行回輸治療，6例循環(huán)前列腺癌細胞陽性的患者在治療6個月后轉陰， 12個月后檢測仍為陰性；11例患者PSA水平下降，18例患者出現(xiàn)針對PSA的免疫 反應(Barrou B， Benoit G. Cancer Immunol I咖unother， 2004, 53: 453-460)。
Nesselhut T等用乳腺癌患者自體腫瘤細胞裂解物或合成多肽(Her2ieu)負 載自體DC，經(jīng)皮內注射或靜脈回輸給患者。結果顯示143例患者中37%產(chǎn)生了臨 床效應。其中7人完全緩解，14人部分緩解，33人病情穩(wěn)定，3人綜合應答，總生 存期延長(Nesselhut T， Matthes C， Marx D, et al. 2005 ASC0 Annual Meeting)。
4. DC疫苗在抗感染性疾病中的應用進展
抗傳染性病原體的理想疫苗不僅能產(chǎn)生持久性免疫，而且能產(chǎn)生合適的免疫應 答以清除感染。結核桿菌為胞內寄生菌，欲達此目的主要依靠細胞介導免疫應答， 而不是抗體應答。Dillon SM等研究發(fā)現(xiàn)小鼠單次接種結核桿菌純蛋白衍生物(PPD) 致敏的DC能誘發(fā)強烈的T細胞免疫應答并產(chǎn)生IFNY 。結核桿菌H37Rv株Hsp65具有免 疫優(yōu)勢抗原的特性，能誘導和增強機體的抗結核免疫應答，并可激活Y5 T細胞。 同時Hsp65具有載體分子效應和分子伴侶的特性，能輔助與其融合的蛋白片段，在M①或DC中以MHC2I類分子的途徑呈遞，并可活化DC使之成為初始型CTL的有效刺激 劑。武漢大學醫(yī)學院魏雅稚等用hsp65與pEGFP2Cl融合基因載體轉染DC,體外實驗 表明其能誘導未致敏的脾細胞增殖，證實轉染的融合基因能在DC中表達目的蛋白， 并能被DC有效地呈遞。
Fazle Akbar等用重組HBsAg負載自體DC后回輸給5名HBsAg陰性的健康志 愿者，2名志愿者回輸后第二周出現(xiàn)抗-HBsAg抗體；6名志愿者在第一次回輸后檢 測無免疫應答者給予第二次回輸， 一個月內相繼出現(xiàn)抗-HBsAg抗體(J H印atology， 2007,47(1) :60-66)。 Chen等以HBsAg沖擊的DC經(jīng)皮下免疫19例CHB患者，觀察 到11/19例患者出現(xiàn)臨床應答，其中10例患者HBeAg轉陰，5例出現(xiàn)HBeAg血清學 轉換(World J Gastroenterol, 2005, 11 (12) : 1806-1808)。解放軍302醫(yī)院王福生 教授利用HBsAg和HBcAg兩種抗原聯(lián)合負載DC，該疫苗能誘導針對sl81-193表位 及cl8-27表位的多克隆CTL (發(fā)明專利號200610078028.2);
5.熱休克蛋白在免疫應答中的作用
(1)熱休克蛋白(HSPs)的生物學活性
熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是一組在生物進化過程中高度保守 的蛋白質分子家族，該家族成員根據(jù)分子量大小可分為HSP100 、 HSP90 、 HSP70 、 HSP60 、 HSP28等幾大類。HSPs作為分子伴侶(Chaperons)在蛋白質合成后的折疊、 轉運，變性蛋白質的復性等過程中發(fā)揮重要作用。
HSP70是分子量在70 KD左右的熱休克蛋白，是熱休克蛋白家族中最重要的一 員，被稱為主要熱休克蛋白。HSP70蛋白由兩部分組成，即ATP酶區(qū)(ATPase domain) 和底物識別區(qū)或叫多肽結合區(qū)(P印tide - binding domain) 。 HSP70的ATP酶活性區(qū) 是位于HSP70蛋白氨基端385個氨基酸殘基；分離這一約44KD的氨基端片段，可以 得到一個非多肽依賴性的ATP酶。多肽與HSP70分子結合和釋放是一個依賴ATP的過 程。HSP70蛋白的多肽結合區(qū)是羧基端的約27 KD的氨基酸片段，能結合細胞內 5-25mer的多肽(包括腫瘤或病毒特異性抗原多肽)形成HSP-多肽復合物，參與多肽 在胞槳網(wǎng)膜系統(tǒng)內的轉運。
熱休克蛋白被稱為是連接天然免疫與特異免疫反應的橋梁。研究發(fā)現(xiàn)HSPs通過 與DC表面HSP受體如CD91， CD40， L0X1， TLR2/4等結合刺激DC上調表達多種免疫共刺激分子(CD83, CD80， MHC-1)和免疫活性因子(MIP, TNF a ， IL-12與IP-10等)，繼 而活化自然殺傷細胞(NK)， NKT細胞等增強機體非特異性免疫應答，故HSPs有"天 然免疫佐劑"的作用(SrivastavaPK. Curr Oncol Rep. 2005 Mar;7(2): 104-8)。
Srivastava發(fā)現(xiàn)HSPs能夠介導外源性抗原多肽向MHC-I類與MHC-II類分子 的遞呈。從腫瘤細胞或病毒感染細胞中提取的HSP-抗原多肽復合物免疫動物后能引 起針對該腫瘤或病毒的特異性T淋巴細胞免疫應答，而僅免疫多肽或僅免疫HSP則不 能誘導特異性免疫應答(Binder RJ， Vatner R, Srivastava P. Tissue Antigens. 2004 Oct;64(4):442-51.)。
基于這一發(fā)現(xiàn)，美國Antigenics公司(W驛，antigenics. com)將從患者腫瘤組 織或腫瘤細胞中提取的gp96及HSP70-多肽復合物免疫腫瘤患者，相應產(chǎn)品 (Oncophage 和AG-858)已獲FDA批準進入I-II期臨床試驗。
我國曹雪濤院士等提取熱處理后腫瘤細胞的外排體體外沖擊樹突狀細胞，實 驗結果顯示能激活樹突狀細胞和T淋巴細胞，有效誘導抗原特異性和非特異性的免 疫反應，增強機體免疫功能(專利申請?zhí)?02145022.6，名稱 一種新型高效非細胞 性疫苗的制備及其用途)。
6.現(xiàn)行DC疫苗的不足
在DC疫苗設計中抗原的抗原性(Antigenicity),免疫原性(I誦unogenicity)、 抗原負載體系(Antigen Delivery System)及佐劑(Adjuvents)是影響疫苗功效的重 要參數(shù)。上述單純抗原多肽負載DC的疫苗，或單純HSP70抗原多肽復合物疫苗均存 在不足。前者多肽自身的穩(wěn)定性、多肽與DC表面MHC分子結合的親和力及穩(wěn)定性等 是影響DC多肽疫苗的重要因素；后者免疫機體后需要通過體內APC (如DC)對結合 于HSP70的抗原多肽進行重新遞呈，方能啟動特異性免疫應答，而腫瘤組織常分泌 多種免疫抑制因子如IL-10， TGFP等抑制DC的功能，從而影響特異性免疫應答的 激發(fā)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是為了克服上述多肽DC疫苗的缺陷，提高多肽DC疫苗的 功效，提供一種流程簡捷、高效的負載重組人HSP70抗原多肽復合物的DC疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供負載重組人HSP70抗原多肽復合物的DC疫苗的 制備方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供負載重組人HSP70抗原多肽復合物的DC疫苗在 制備抗腫瘤藥物中的應用；
本發(fā)明還有一個目的是提供負載重組人HSP70抗原多肽復合物的DC疫苗在 制備抗感染性疾病藥物中的應用。
本發(fā)明技術方案的理論基礎
(1) HSP70具有結合多肽的天然生物學特性(稱之為分子伴侶)，使多肽不 易降解，從而能保持多肽的穩(wěn)定性(抗原的穩(wěn)定)；
(2) HSP70具有協(xié)助多肽在細胞內漿網(wǎng)轉運的功能，已證明HSP70能將其結 合的多肽轉運至MHC-I類分子，形成MHC-I-多肽復合物(T細胞激活的第一信號)， 激發(fā)特異性T細胞免疫應答；
(3) DC是公認的功能最強的專職抗原遞呈細胞，既作為抗原負載，抗原遞 呈的載體，同時因其表達豐富的免疫共刺激分子(T細胞激活的第二信號)，又 具有"天然免疫佐劑"的作用；
(4) DC表達HSP70受體，HSP70多肽復合物可通過HSP受體介導的高效內 吞機制，快速進入DC胞內，將抗原多肽遞呈至MHC-1類分子，從而提高抗原遞 呈效率；
(5) HSP70在發(fā)揮分子伴侶作用的同時，具有促進DC免疫共刺激分子(如 CD80， CD83, CD86等)的上調表達與細胞因子(IL_12， TNF a等)分泌的功能， 從而提高DC疫苗的激發(fā)能力，具有"天然免疫佐劑"功效；
本發(fā)明的目的是通過下列措施實現(xiàn)的
一種負載重組人HSP70多肽復合物的樹突狀細胞疫苗，其中包括下列步驟 1)重組人HSP70蛋白(rhHSP70)，如來源于加拿大Stressgen公司，產(chǎn)品 目錄號ESP—555，純度〉90%;2) 抗原多肽的設計與合成，純度〉90%，吉爾生化上海有限公司合成；
3) 重組人HSP70抗原多肽復合物的制備；
4) 體外誘導樹突狀細胞；
5) 抗原負載將按上述方法制備的重組人HSP70抗原多肽復合物與樹突狀細胞混合，共同培育一定時間，制備成樹突狀細胞疫苗；
(6)樹突狀細胞疫苗的質量檢測；
所述的樹突狀細胞疫苗，其中重組人HSP70蛋白來源于加拿大Stressgen公司，產(chǎn)品目錄號ESP-555，純度〉90%;
所述的樹突狀細胞疫苗，其中抗原多肽的設計依據(jù)已知的具有免疫原性的腫瘤特異抗原(TSA)、腫瘤相關抗原(TAA)或病原體抗原(如朋V或TB)表位進行人工合成，抗原多肽的長度為9至15個氨基酸序列或更長些如9-25個氨基酸序列，純度為90%以上。其中所述的腫瘤抗原為黑色素瘤抗原MART1、肝癌相關抗原AFP、前列腺癌相關抗原PSA、胃癌相關抗原CEA或乳腺癌相關抗原Her2-neu，包括但不局限于上述腫瘤抗原。其中所述的病原體抗原為乙型肝炎病毒朋V、丙型肝炎病毒HCV、艾滋病毒HIV抗原或TB抗原，包括但不局限于上述病原體。
所述的樹突狀細胞疫苗，其中重組人HSP70抗原多肽復合物是將一定量(10-100 pM) HSP70蛋白與一定量(50-300nM)抗原多肽，在20°C-25°C溫度下與含ATP、 KC1、 MgCl2的PBS緩沖液中共同反應40min,再加入ADP共同反應40min后，透析法除去游離多肽后制備而成；
所述的樹突狀細胞疫苗，其中體外誘導樹突狀細胞是通過獲取單個核細胞培養(yǎng)一定時間后，洗去未貼壁細胞，加入含GM-CSF和IL-4的細胞因子組合、GM-CSF和IL-15的細胞因子組合、GM-CSF和IFNa的細胞因子組合、或者GM-CSF和TNFa的細胞因子組合的培養(yǎng)基誘導成單核細胞來源的樹突狀細胞；或取0034+前體造血干細胞，加入含GM-CSF， TNFa和Flt3_L細胞因子的培養(yǎng)基誘導成CD34-DCs。
所述的樹突狀細胞疫苗，其中HSP70多肽復合物與樹突狀細胞共育的用量基準是10 y M HSP70多肽復合物與l(f個樹突狀細胞共育，共育溫度為27°C-30°C;共育時間為4-6小時，收獲并洗滌除去未結合的HSP70及HSP70多肽復合物，制備成樹突狀細胞疫苗。
所述的樹突狀細胞疫苗，其中細胞純度(CDllc+HLADR+)大于80%且細胞存活率大于90。/。;疫苗制劑內毒素含量小于5IU/ml;革蘭氏菌檢測陰性；支原體檢測陰性；無菌檢測合格；樹突狀細胞表面共刺激分子表達水平要求CD80大于80%，CD83大于50%， CD86大于80%， CD40大于90%, CCR7大于50%;
本發(fā)明的有益效果
1.與利用生物化學法從組織中提取HSP70多肽復合物作為免疫原方法、或與通過構建目的抗原與HSP70融合蛋白表達質粒轉染DC法比較，利用重組人HSP70蛋白與抗原多肽在體外形成復合物負載DC作為免疫原，具有抗原明確、設計靈活、抗原來源方便、安全性與疫苗活性高等諸多優(yōu)點
1) 可根據(jù)已知腫瘤相關抗原或已知感染的病原體有針對性地設計并合成抗原多肽(9-25氨基酸)，氨基酸序列明確，合成工藝簡捷。如前列腺相關抗原多肽(PSA:CLAAGITYV );肝癌相關抗原多肽(AFP: GVALQTMKQ);黑色素瘤抗原
多肽(MAGE3 : FLWGPRALV);乳腺癌相關抗原多肽(Her2-neu: KIFGSLAFL);HBV抗原多肽(HBsAg: FLLTRILTI; HBcAg: FLPSDFFPSV)等。生物化學法從組織中提取HSP70多肽復合物作為免疫原，操作過程相對復雜，復合物中HSP70結合的多肽序列不明確等缺陷；
2) 用生化法提取的HSP70多肽復合物作為免疫原，免疫后仍需通過人體APC (如DC)攝取、抗原多肽遞呈等復雜過程，方能激發(fā)特異性T細胞免疫應答，此過程中APC的數(shù)量與質量將是影響免疫效果的關鍵因素之一。而用HSP70多肽復合物負載的樹突狀細胞作為免疫原，則利用樹突狀細胞專職且功能強大抗原攝取與遞呈功能，在體外模擬并完成抗原負載與遞呈過程，同時樹突狀細胞又具有"天然免疫佐劑"的功能，將明顯提高疫苗的功效；
3) 重組人HSP70蛋白容易獲取(如加拿大Stressgen公司，美國Sigma公司等)，HSP70多肽復合物在體外可批量制備。而生物化學法易受組織來源、數(shù)量與質量的多因素影響，通常不能批量制備；
4) HSP70具有結合多肽的生物特性，可制備出多種多肽與HSP70的復合物，根據(jù)需要有機組合后同時負載DC，免疫后激發(fā)識別多種抗原表位的T細胞克隆，產(chǎn)生多效價、穩(wěn)固的免疫應答。如黑色素瘤表達多種腫瘤抗原(GP100，MART1，MAGE3)，可用HSP70分別與這三種抗原肽(GP100: IMDQVPFSV， MARTI: AAGIGILTV; MAGE3:FLWGPRALV)形成復合物，再負載樹突狀細胞；
5)重組質粒轉染DC法易受轉染效率、目的蛋白表達效率、融合蛋白表達后在DC胞漿內抗原的遞呈效率等諸多環(huán)節(jié)的影響，且外源性質粒載體的安全性至今仍難以控制。
2. HSP70-多肽復合物負載的DC免疫學活性明顯提高
1) HSP70-多肽復合物負載的DC激活特異性CD8T克隆的能力明顯提高
體外以GM-CSF與IL-4， IFNaa， IL-15，或TNFa因子組合誘導HLA-A201+健康志愿者外周單核細胞為樹突狀細胞。分別用10u gMARTl多肽(AAGIGILTV)， lOu gMART1多肽負載的DC， 10 u g HSP70-MART1 (MART1多肽與HSP70形成的復合物)反復刺激自體CD8T淋巴細胞二次，每周一次。收集刺激的T淋巴細胞(CTL)，用流式細胞術檢測特異識別MART1多肽的CD8T克隆的頻率(Tetramer染色法)。實驗結果來自三個獨立健康志愿者，結果見圖一所示。
CTL1為單獨MART1多肽致敏的CD8T細胞，CTL2為MART1多肽負載DC致敏的CD8T細胞，CTL3為HSP70-MART1多肽復合物負載DC致敏的CD8T細胞；
結果表明以HSP70-多肽負載DC刺激HLA-A20rMARTl+CD8T克隆增殖的能力最強，平均分別是單獨MART1多肽、MART1多肽負載DC的107倍和10倍。
2) HSP70多肽復合物負載的DC致敏的CTL具有較強殺傷耙細胞的能力DC誘導、抗原多肽負載與CD8T細胞致敏實驗步驟同上，二次刺激后收集刺激的
T淋巴細胞(CTL)，用經(jīng)典的4小時5'Cr釋放試驗檢測CTL殺傷活性，耙細胞為負載MART1多肽的HLA-A201+的T2細胞株。CTL1為MART1多肽直接刺激的CD8T淋巴細胞，CTL2為用負載MART1多肽樹突狀細胞所刺激的CD8T淋巴細胞，CTL3為用負載HSP70-MART1復合物樹突狀細胞所刺激的CD8T淋巴細胞。實驗結果來自三個獨立健康志愿者，以均值+/-標準差表示，結果見圖二。
結果表明以HSP70-多肽負載DC刺激的CTL特異殺傷靶細胞的能力最強
(CTL3)，與CTL2和CTL1相比，均有顯著統(tǒng)計學差異(P值分別為0.05與0.07);
3. HSP70-多肽復合物負載的DC疫苗設計中含有雙重"天然免疫佐劑"，將會明顯提高疫苗功效。
15HSP70的一個作用是穩(wěn)定多肽；第二個作用是通過DC表面HSP70受體介導 HSP70多肽復合物的高效捕獲；第三個作用是將其結合的多肽轉運至MHC-I分子； 第四個作用是促進DC表面免疫共刺激分子的上調表達及細胞因子的分泌；HSP70 是連接天然免疫與特異性免疫的橋梁，且不存在個體多肽性(Polymorphism)， 是公認的天然免疫佐劑；
樹突狀細胞表達豐富的免疫共刺激分子是T細胞活化不可或缺的刺激信號， 亦有"天然免疫佐劑"的美稱。以活細胞作為抗原載體，能保持其共刺激分子的 天然結構，易于T細胞受體(TCR)識別與激活。雙佐劑的共同作用既可增加疫 苗的抗原性，又能提高疫苗的免疫原性，綜合提高DC疫苗的功效。
4. HSP70能上調樹突狀細胞免疫共刺激分子的表達
于DC誘導第五天分別加入0. 1 u g/mL, 1. 0 y g /mL, 10 y g /mL rhHSP70或 100ng/mL LPS共同培育48小時，收獲DC，進行表面標志物檢測(CD80， CD83， CD86); 圖三為一例健康志愿者DC流式細胞檢測結果。
結果顯示HSP70可上調DC CD83、 CD80、 CD86的表達水平，從而提高DC 疫苗的免疫活性。
5.制備簡便、安全、無毒在本疫苗制備體系中，無外源質粒、載體、化 學佐劑的摻入與污染；HSP70蛋白與DC細胞對個體自身均不具有抗原性，發(fā)生自 身免疫疾病的可能性極小。


圖一 是MARTI抗原多肽以三種不同負載形式刺激特異性CD8T克隆增殖的比較 圖二是MARTI抗原多肽以三種不同負載形式所致敏的CD8T淋巴細胞殺傷試驗
體外以GM-CSF與IFNa因子組合誘導HLA-A201+健康志愿者外周單核細胞為樹 突狀細胞；同時從外周血中純化出自體CD8T淋巴細胞(試劑盒由德國Miltenyi Biotech公司提供，操作步驟按說明書進行)。用流式細胞術檢測CD8T純度，達95% 以上；分別用10 y g MARTI多肽(AAGIGILTV) ， lOy g MARTI多肽與HSP70復合 物(HSP70-MART1)負載樹突狀細胞作為致敏原；分別用10 u g MARTI多肽，10 y g MARTI多肽負載的DC， 10 u g HSP70-MARTI多肽負載的DC反復刺激自體CD8T淋巴細胞二次，每周一次。收集剌激后的T淋巴細胞(CTL)，用經(jīng)典的4小時，r釋放 試驗檢測CTL殺傷活性，靶細胞為負載MART1多肽的HLA-A201+的T2細胞株。CTL1 為MART1多肽直接刺激的CD8T淋巴細胞，CTL2為用負載MART1多肽樹突狀細胞所 刺激的CD8T淋巴細胞，CTL3為用負載HSP70-MART1復合物樹突狀細胞所刺激的CD8T 淋巴細胞。實驗結果來自三個獨立健康志愿者，以均值+/_標準差表示。 圖三不同濃度rhHSP70對樹突狀細胞表面共刺激分子表達水平的影響
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步闡述 實施例1:負載四種HSP70-黑色素瘤抗原多肽復合物的樹突狀細胞疫苗
1. 黑色素瘤抗原多肽與rhHSP70蛋白的準備
人工合成已知的HLA-A201限制性黑色素瘤抗原多肽片段，名稱與序列為GP100: IMDQVPFSV; MARTI: AAGIGILTV; MAGE3: FLWGPRALV禾口 Try: YMDGTMSQV。以DMSO 充分溶解，多肽濃度為5mg/mL; rhHSP70以PBS溶解，濃度為0. 1 u g/mL。
2. rhHSP70-多肽復合物制備
分別取5ug(5ul)多肽與10ug (100 p 1)rhHSP70多肽于1. 5mL EP管內， 加入400u 1含10nM ATP， lmM KC1， 2mMMgCl2的PBS緩沖液中，混勻后于20°C共
育40分鐘，加入100nM ADP后繼續(xù)于20"C孵育40分鐘。將溶液移至0. 5mL微型透
析管內(內含14kD分子量超濾膜)過夜，除去未結合多肽，分別制備出rhHSP70-GPIOO， rhHSP70-MARTl， rhHSP70-MAGE3和rhHSP70-Tyr復合物；
3. 體外誘導樹突狀細胞
采集新鮮肝素抗凝的黑色素瘤患者(HLA-A201+)外周血或HLA-A201+正常健康 人外周血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法后獲得外周單個核細胞(PBMCs)，將PBMCs懸
浮于含2。/。(v/v)滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為2、3Xl(f個細胞
/ml;按每孔3ml接種細胞于6孔細胞培養(yǎng)板內，f5%(v/v)C02， 37°C細胞培養(yǎng)箱 內放置90min使單核細胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁細胞； 于每孔加入3ml含5% (v/v)滅活人AB血清，100ng/ml rhGM-CSF和300ng/ml IFNa的RPMI1640培養(yǎng)基(DC誘導培養(yǎng)基1)。于誘導第3天，每孔輕輕吸去ImL培養(yǎng) 上清，加入lml新鮮的DC誘導培養(yǎng)基I繼續(xù)誘導；于第5天收獲DCs,用PBS進行 洗滌并懸浮于PBS溶液中，濃度為2xl06個細胞/ml;
4. HSP70-多肽復合物負載DCs
分別取250ul上述已制備的四種rhHSP70-多肽復合物，加入至ImL誘導的DCs 中，混勻后于27°C-30QC培育4-6小時。
5. DC疫苗收獲收集上述細胞，用PBS洗滌二次后懸浮于含2y。(g/100ml)人白 蛋白(HA)的生理鹽水中，濃度為2xl(/個細胞/ni1，即為黑色素瘤樹突狀細胞多肽 疫苗。
6. 疫苗質量控制標準與檢測方法
(1) 內毒素檢測小于5IU/ml;按照《中國藥典》三部附錄XII E細菌內毒素 檢查法檢測；
(2) 革蘭氏菌檢測陰性；革蘭氏染色法
(3) 無菌檢測合格；按照《中國藥典》三部附錄XII A無菌檢查法檢測；
(4) 支原體檢測陰性；PCR擴增法；
(5) 樹突狀細胞純度CDllc+HLA-DR+細胞〉80。/。；流式細胞術；
(6) 樹突狀細胞存活率〉90%;苔盼藍染色法；
(7) 樹突狀細胞表面標記檢測:CD80〉80%， CD83>50%， CD86>80%， CD40〉90%， CCR7〉50%;流式細胞術；
實施例2:負載二種HSP70-肝癌抗原多肽復合物的肝癌樹突狀細胞疫苗
1. 抗原多肽合成大多數(shù)原發(fā)性肝癌患者高表達甲胎蛋白(AFP)，合并HBV 慢性持續(xù)感染，針對這一類肝癌患者可以AFP與HBV作為耙抗原如AFP: GVALQTMKQ; HBsAg: FLLTRILTI;多肽溶解與濃度同實施例1;
2. rhHSP70-多肽復合物制備操作步驟同實施1，制備成HSP70-AFP禾口 HSP70-HBsAg 二種復合物；
3. 體外誘導樹突狀細胞
采集新鮮肝素抗凝的原發(fā)性肝癌患者(HLA-A201+)外周血或HLA-A201+正常健康人員外周血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法后獲得外周單個核細胞(PBMCs)，將PBMCs 懸浮于含2。/。(v/v)滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為2-3 X 106個細
胞/ml;按每孔3ml接種細胞于6孔細胞培養(yǎng)板內，于5%"八)0)2， 37°(]細胞培養(yǎng)
箱內放置90分鐘使單核細胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁細胞； 于每孔加入3ml含5%(v/v)滅活人AB血清，100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml IL-4 的RPMI1640培養(yǎng)基(DC誘導培養(yǎng)基11)。于誘導第3天，每孔輕輕吸去lml培養(yǎng)上 清，加入lml新鮮的DC誘導培養(yǎng)基II繼續(xù)誘導；于第5天收獲DCs,用PBS進行洗 滌并懸浮于PBS溶液中，細胞濃度為2xl()6個細胞/ml;
4. HSP70-多肽復合物負載DCs
分別取250 U 1上述已制備的二種rhHSP70-多肽復合物，加入至lml誘導的DCs 中，混勻后于27。C-3(A:培育4-6小時;
5. DC疫苗收獲收集上述細胞，用PBS洗滌二次后懸浮于含2呢(g/100ml)人白 蛋白(HA)的生理鹽水中，濃度為2xl06個細胞/ml，即為肝癌樹突狀細胞多肽疫苗。
6. 疫苗質量控制標準與檢測方法同實施例l。
實施例3:負載二種HSP70-乳腺癌抗原多肽復合物的樹突狀細胞疫苗
1.抗原多肽合成大多數(shù)乳腺癌患者高表達MUC1和Her2-neu相關抗原；針 對這一類乳腺癌患者可以此作為靶抗原合成多肽，如MUC1: SLADPAHGV; Her2-neu: KIFGSLAFL;多肽溶解與濃度同實施例1;
2. rhHSP70-多肽復合物制備操作步驟同實施1，制備成HSP70-MUC1和 HSP70-Her2-neu 二種復合物；
3. 體外誘導CD34-DCs
HLA-201+乳腺癌患者經(jīng)GM-CSF造血動員，用細胞采集儀采集單個核細胞 (PBMCs)，加入CD34單抗磁珠分離純化得到CD34+造血前體細胞(純度>90%)，將其 懸浮于含5。/。(v/v)混合人AB滅活血清的X-VIVO培養(yǎng)基中。于培養(yǎng)基中加入GM-CSF (50ng/ml)、 ，a (10ng/ml)和Flt3_L(100ng/ml)。培養(yǎng)第5天補充新鮮培養(yǎng)基與細 胞因子，觀察并及時調整細胞密度。收集誘導第9天的CD34-DCs，用PBS進行洗滌 并懸浮于PBS溶液中，濃度為2xlQ6個細胞/ml;4. HSP70-多肽復合物負載DCs
分別取250y 1上述已制備的二種rhHSP70-多肽復合物，加入至ltnl誘導的DCs 中，混勻后于27。C-30。C培育4-6小時;
5. DC疫苗收獲收集上述細胞，用PBS洗滌二次后懸浮于含2。/。(g/100ml)人白 蛋白(HA)的生理鹽水中，濃度為2xKf個細胞/ml，即為乳腺癌樹突狀細胞多肽疫苗。
6. 疫苗質量檢測參數(shù)同實施例l。
實施例4:負載二種HSP70-HBV抗原多肽復合物的乙肝樹突狀細胞多肽疫苗
1. HBV抗原多肽合成以HBV表面抗原多肽(HBsAg:FLLTRILTI)禾卩HBV 核心抗原多肽(HBcAg:FLPSDFFPSV)為靶抗原；多肽溶解與濃度同實施例1;
2. rhHSP70-多肽復合物制備操作步驟同實施1，制備成HSP70-HBsAg和 HSP70-HBcAg 二種復合物；
3. 體外誘導樹突狀細胞
采集新鮮肝素抗凝的慢性乙型肝炎患者(HLA-A201+)外周血或HLA-A201+正常 健康人員外周血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法后獲得外周單個核細胞(PBMCs)，將 PBMCs懸浮于含2%(v/v)滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為2-3X 106
個細胞/ml;按每孔3ml接種細胞于6孔細胞培養(yǎng)板內，于5。/。(v/v)C02， 37°C細胞
培養(yǎng)箱內放置90分鐘使單核細胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁 細胞；于每孔加入3ml含5%(v/v)滅活人AB血清，150ng/ml rhGM-CSF和100ng/ml IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基(DC誘導培養(yǎng)基in)。于誘導第3天，每孔輕輕吸去lml 培養(yǎng)上清，加入lml新鮮的DC誘導培養(yǎng)基III繼續(xù)誘導；于第5天收獲DCs,用PBS 進行洗滌并懸浮于PBS溶液中，濃度為2xl06個細胞/ml;
4. HSP70-多肽復合物負載DCs
分別取250 " 1上述已制備的二種rhHSP70-多肽復合物，加入至lml誘導的DCs 中，混勻后于27nC-30°C培育4-6小時；
5. DC疫苗收獲收集上述細胞，用PBS洗滌二次后懸浮于含2。/。(g/100ml)人白 蛋白(HA)的生理鹽水中，濃度為2xl()6個細胞/ml，即為乙肝樹突狀細胞多肽疫苗。
6. 疫苗質量檢測參數(shù)同實施例1。
權利要求
1、一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗，其特征在于將抗原多肽與重組人熱休克蛋白70形成復合物，再將復合物負載于樹突狀細胞而制備出負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞疫苗。
2、 權利要求1所述的一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗，其中所述的抗原多肽是依據(jù)已知的具有免疫原性的腫瘤特異抗原、腫瘤相關抗原或病原體抗原表位進行人工合成，抗原多肽的長度為9-25個氨基酸序列，純度為90%以上。
3、 權利要求2所述的一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗，其中所述的腫瘤抗原為黑色素瘤抗原MART1、肝癌相關抗原AFP、前列腺癌相關抗原PSA、胃癌相關抗原CEA或乳腺癌相關抗原Her2-neu，包括但不局限于上述腫瘤抗原。
4、 權利要求2所述的一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗，其中所述的病原體抗原為乙型肝炎病毒HBV、丙型肝炎病毒HCV、艾滋病毒HIV抗原或TB抗原，包括但不局限于上述病原體。
5、 權利要求2所述的一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗，其中所述的抗原多肽的長度為9-25個氨基酸序列，純度為90%以上。
6、 權利要求1或2所述的一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗，其中所述的抗原多肽為GP100: IM叫VPFSV、 MART1: AAGIGILTV、 Try: YMDGTMSQV、 MAGE3:FLWGPRALV、 MUC1: SLADPAHGV、 Her2-neu: KIFGSLAFL、 AFP: GVALQTMKQ、 HBsAg:FLLTRILTI、或HBcAg : FLPSDFFPSV，包括但不局限于上述多肽。
7、 權利要求1-6任意一項所述的一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗的制備方法，其中包括下列步驟1) 重組人HSP70蛋白(rhHSP70)的獲??；2) 抗原多肽的設計與合成；3) 重組人HSP70抗原多肽復合物的制備；4) 體外誘導樹突狀細胞；5) 抗原負載將按上述方法制備的重組人HSP70抗原多肽復合物與樹突狀細胞混合，共同培育一定時間，制備成樹突狀細胞疫苗；(6)樹突狀細胞疫苗的質量檢測。
8、 權利要求7所述的制備方法，其特征在于其中抗原多肽的設計依據(jù)已知的具有免疫原性的腫瘤特異抗原(TSA)、腫瘤相關抗原(TAA)或病原體抗原表位進行人工合成，抗原多肽的長度為9-25個氨基酸序列，純度為90%以上;其中重組人HSP70抗原多肽復合物是將10-100nM的HSP70蛋白與50-300nM抗原多肽，在20°C-25°C溫度下在含10-20nM ATP、 lmM KC1、 2nM MgCl2的PBS緩沖液中共同反應20-60min，再加入100-200nM ADP共同反應20-40min后，透析法除去游離多肽后制備而成；其中體外誘導樹突狀細胞是通過獲取單個核細胞培養(yǎng)一定時間后，洗去未貼壁細胞，加入含GM-CSF和IL-4的細胞因子組合、GM-CSF和IL-15的細胞因子組合、GM-CSF和IFNa的細胞因子組合、或者GM-CSF和TNFa的細胞因子組合的培養(yǎng)基誘導成單核細胞來源的樹突狀細胞；或取0034+前體造血干細胞，加入含GM-CSF、 TNF a和Flt3-L細胞因子的培養(yǎng)基誘導成CD34-DCs;其中HSP70多肽復合物與樹突狀細胞共育比例為lOii g HSP70多肽復合物與l(f個樹突狀細胞共育，共育溫度為27°C-30°C;共育時間為4-6小時，收獲并洗滌除去未結合的HSP70及HSP70-多肽復合物，制備成樹突狀細胞疫苗；所述的樹突狀細胞疫苗，其中細胞純度(CDllc+HLADR+)大于80%且細胞存活率大于90%;疫苗制劑內毒素含量小于5IU/ml;革蘭氏菌檢測陰性；支原體檢測陰性；無菌檢測合格；樹突狀細胞表面共刺激分子表達水平要求CD80大于80。/。， CD83大于50%, CD86大于80%， CD40大于90%， CCR7大于50%。
9、權利要求8所述的制備方法，其中包括下列步驟(a) 、以DMSO充分溶解抗原多肽，抗原多肽濃度為5mg/ml;重組人熱休克蛋白70以PBS溶解，濃度為0. 1 u g/ml;(b) 、 rhHSP70多肽復合物制備，其中步驟為分別取5 u g抗原多肽與10 u g rhHSP70多肽于1. 5ml EP管內，加入400 y 1含10nM ATP，lmM KC1， 2mM MgCl2的PBS緩沖液中，混勻后于20°C共育40分鐘，加入100nM ADP后繼續(xù)于20°C孵育40分鐘，將溶液移至0. 5ml內含14kD分子量超濾膜的微型透析管內過夜，除去未結合多肽，制備出rhHSP70-多肽復合物；(c) 、體外誘導樹突狀細胞，其中步驟為采集新鮮肝素抗凝的患者HLA-A201+外周血或HLA-A201+正常健康人員外周血，經(jīng)Fico11密度梯度離心法后獲得外周單個核細胞PBMCs，將PBMCs懸浮于含2% (v/v)滅活混合人AB血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，濃度為2-3X 106個細胞/ml;按每孔3 ml接種細胞于6孔細胞培養(yǎng)板內，于5% (v/v) C02， 37"C細胞培養(yǎng)箱內放置90min使單核細胞貼壁，用PBS緩沖液輕輕洗滌培養(yǎng)孔以除去未貼壁細胞；于每孔加入3ml DC誘導培養(yǎng)基，于誘導第3天，每孔輕輕吸去lml培養(yǎng)上清，加入lml新鮮的DC誘導培養(yǎng)基繼續(xù)誘導；于第5天收獲DC,用PBS進行洗滌并懸浮于PBS溶液中，濃度為2xl0e個細胞/ml;(d) 、 HSP70-多肽復合物負載DC，其中步驟為分別取250 u 1上述已制備的多肽復合物，加入至lml誘導的DC中，混勻后于27a(:-3(fc培育4-6小時；(e) 、 DC疫苗收獲收集上述細胞，用PBS洗滌二次后懸浮于含2。/。(g/100ml)人白蛋白HA的生理鹽水中，濃度為2xl()6個細胞/ml，即為樹突狀細胞多肽疫苗。
10、 權利要求7所述的制備方法，其中所述的DC誘導培養(yǎng)基為下列任意一種含5% (v/v)滅活人AB血清、100ng/ml rhGM-CSF和300ng/ml IFNa的RPMI1640培養(yǎng)基；含5%(v/v)滅活人AB血清、100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml IL-4的RPMI1640培養(yǎng)基或含5%(v/v)滅活人AB血清、150ng/ml rhGM-CSF和lOOng/ml IL-15的RPMI1640培養(yǎng)基。
11、 權利要求8所述的制備方法，其中包括下列步驟(a) 、以DMSO充分溶解抗原多肽，抗原多肽濃度為5mg/ml;重組人熱休克蛋白70以PBS溶解，濃度為O. l"g/ml;(b) 、 rhHSP70-多肽復合物制備，其中步驟為分別取5 u g抗原多肽與10 u g rhHSP70多肽于1. 5ml EP管內，加入400 u 1含10nM ATP，ImM KC1， 2mM MgCh的PBS緩沖液中，混勻后于20GC共育40分鐘，加入lOOnM ADP后繼續(xù)于20°C孵育40分鐘，將溶液移至0. 5ml內含14kD分子量超濾膜的微型透析管內過夜，除去未結合多肽，制備出rhHSP70-多肽復合物；(c)、體外誘導CD34-DCs，其中步驟為HLA-201+患者或正常人經(jīng)GM-CSF造血動員，用細胞采集儀采集單個核細胞PBMCs，加入CD34單抗磁珠分離純化得到純度>90%的CD34+造血前體細胞，將其懸浮于含5%(v/v)混合人AB滅活血清的X-VIVO培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)基中加入50ng/mL的GM-CSF、 lOng/ml的TNF a和lOOng/ml的Flt3-L，培養(yǎng)第5天補充新鮮培養(yǎng)基與細胞因子，觀察并及時調整細胞密度，收集誘導第9天的CD34-DCs,用PBS進行洗滌并懸浮于PBS溶液中，濃度為2xl06個細胞/ml;(d)、 HSP70-多肽復合物負載DCs，其中步驟為取250ul上述已制備的多肽復合物，加入至lml誘導的DC中，混勻后于27°C-30°C培育4-6小時；(e)、 DC疫苗收獲收集上述細胞，用PBS洗滌二次后懸浮于含2y。(g/100ml)人白蛋白HA的生理鹽水中，濃度為2xl(f個細胞/ml，即為樹突狀細胞多肽疫苗。
12、 權利要求1-6任意一項所述的負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。
13、 權利要求1-6任意一項所述的負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞多肽疫苗在制備抗感染性疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種負載重組人熱休克蛋白70多肽復合物的樹突狀細胞疫苗、制備方法與應用。該疫苗通過設計、合成抗原多肽，將抗原多肽與重組人熱休克蛋白70(rhHSP70)形成復合物，制備樹突狀細胞，再將復合物負載于樹突狀細胞(DC)而得到。該疫苗具有多靶點、雙佐劑、高功效優(yōu)勢，可用于抗腫瘤及感染性疾病等的治療。該制備工藝簡單、快速、成本低。
文檔編號A61K39/39GK101461942SQ20081002189
公開日2009年6月24日 申請日期2008年8月27日 優(yōu)先權日2008年8月27日
發(fā)明者時宏珍 申請人:時宏珍