專利名稱：：具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02及其制備方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是功能性乳酸菌的分離株及應(yīng)用。技術(shù)背景對(duì)由酒精引起的肝損傷的保護(hù)研究，西歐國(guó)家側(cè)重在酒精急性中毒或酒精肝病的治療，以被動(dòng)治療方法為主；東南亞國(guó)家包括我國(guó)，大部分研究出發(fā)點(diǎn)以解酒、醒酒為目的，而忽視了預(yù)防、調(diào)節(jié)這一重要環(huán)節(jié)。并且進(jìn)入體內(nèi)的藥物大多數(shù)要經(jīng)過(guò)肝臟的轉(zhuǎn)化。肝病患者肝功能減退，許多藥物進(jìn)入體內(nèi)，勢(shì)必增加肝臟負(fù)擔(dān)。這些物質(zhì)在肝中代謝又會(huì)進(jìn)一步損傷肝臟，形成累積損傷過(guò)程，反而會(huì)進(jìn)一步損害肝臟。乳酸菌具有調(diào)節(jié)生理活性，預(yù)防疾病發(fā)生以及安全性極高的特點(diǎn)。乳酸菌的酒精性肝損傷保護(hù)作用在于其具有抗氧化活性，預(yù)防肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，有效清除肝損傷產(chǎn)生的有害自由基；具有抗大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等有害菌的生長(zhǎng)，維持腸道菌群平衡，減少內(nèi)毒素生成和吸收，有效預(yù)防肝損傷時(shí)細(xì)菌易位和降低內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。發(fā)酵乳制品的肝損傷保護(hù)作用的強(qiáng)弱與其所使用的乳酸菌的種類密切相關(guān)。從眾多乳酸菌種篩選出適合生產(chǎn)肝損傷保護(hù)的菌種具有重要的意義。如將具有肝損傷保護(hù)作用的乳酸菌開(kāi)發(fā)成保健食品，長(zhǎng)期服用可預(yù)防、緩解和輔助治療肝損傷，這種方式必將為人們所接受。在食品向天然型和功能型發(fā)展的今天，生產(chǎn)功能性酸乳這種產(chǎn)品是乳酸菌制品發(fā)展的方向之一，酒精性肝損傷保護(hù)功能性乳酸菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)有較廣闊的前景，頗具有市場(chǎng)潛力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于為了克服前述和其它缺點(diǎn)，發(fā)明一種具有酒精性肝損傷保護(hù)作用的乳酸菌——嗜熱鏈球菌grx02。本發(fā)明保藏于2008年5月28日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏號(hào)為CGMCCNo:2525。經(jīng)試驗(yàn)本發(fā)明是一種功能性乳酸菌，特別在肝損傷保護(hù)方面具有功能特性，如將本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx02開(kāi)發(fā)成保健食品，長(zhǎng)期服用可預(yù)防、緩解和輔助治療肝損傷。本發(fā)明的另一目的在于發(fā)明上述嗜熱鏈球菌grx02的制備方法包括以下步驟1)采用培養(yǎng)基從新疆民族傳統(tǒng)乳制品中分離獲得乳酸菌；2)篩選出具有抗氧化活性、抗致病菌特性和破壞內(nèi)毒素能力的乳酸菌;3)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較從經(jīng)步驟2)篩選出的乳酸菌中篩選出對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)功能的乳酸菌，即為嗜熱鏈球菌grx02。經(jīng)過(guò)以上方法獲得的乳酸菌通過(guò)法國(guó)梅埃里公司API系列試劑條和16SrDNA序列測(cè)定所進(jìn)行的鑒定，確定該菌株為嗜熱鏈球菌(&r印tococc^Aemwp//^)，鑒定準(zhǔn)確率均超過(guò)99%。本發(fā)明的第三目的是發(fā)明所述嗜熱鏈球菌grx02的應(yīng)用可用于制備具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的食物。還可用于制備具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的發(fā)酵乳。本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵的各種產(chǎn)物可起到保護(hù)酒精性肝損傷的作用，該菌株發(fā)酵的牛奶，獲得的經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的各種發(fā)酵乳產(chǎn)品、乳酸菌飲料產(chǎn)品等，都獲得了具有不同程度的保護(hù)酒精性肝損傷的特性。利用本發(fā)明菌株發(fā)酵脫脂牛乳或其它食品原料，經(jīng)過(guò)干燥等加工處理，具有較好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，還是用于制備具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的藥物組合物的較好選擇。長(zhǎng)期服用可預(yù)防、緩解和輔助治療肝損傷，特別適合長(zhǎng)期大量飲酒人員，用無(wú)任何毒副作用。圖1為嗜熱鏈球菌grx02革蘭氏染色顯微觀察圖。圖2為嗜熱鏈球菌grx02DNA的熒光圖譜。圖3為嗜熱鏈球菌grx0216SrDNA-PCR產(chǎn)物的熒光圖譜。圖4為對(duì)照組小鼠的肝切片的HE染色圖片(200倍)。圖5為模型組小鼠的肝切片的HE染色圖片(200倍)。圖6為藥物組小鼠的肝切片的HE染色圖片(200倍)。圖7為乳酸菌對(duì)照C8M組小鼠的肝切片的HE染色圖片(200倍)。圖8為嗜熱鏈球菌grx02組小鼠的肝切片的HE染色圖片(200倍)。具體實(shí)施方式本發(fā)明者試圖獲得新的嗜熱鏈球菌菌株。該菌株可以發(fā)酵牛乳表現(xiàn)出具有肝損傷保護(hù)的功能特性——抗氧化活性、抗致病菌特性、破壞內(nèi)毒素能力。發(fā)明通過(guò)從新疆傳統(tǒng)乳制品中分離獲得的大量乳酸菌中利用研究抗氧化活性、抗致病菌特性的乳酸菌菌株。再通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和培養(yǎng)特征，并通過(guò)法國(guó)梅埃里公司API系列試劑條、菌株16SrDNA基因部分類聚序列進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明的菌株是嗜熱鏈球菌grx02。1.樣品來(lái)源本發(fā)明菌株來(lái)源于我國(guó)新疆民族傳統(tǒng)乳制品一酸馬奶。酸馬奶(Koumiss)是以新鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然發(fā)酵形成的酸性低酒精含量乳飲料。2.樣品采集將樣品采集后放入事先準(zhǔn)備好的緩沖溶液中，冷藏，2天之內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行分離。3.乳酸菌分離將新疆民族傳統(tǒng)乳制品酸馬奶樣品采用PTYG培養(yǎng)物于37"C培養(yǎng)24小時(shí)后。將該培養(yǎng)物涂布在PTYG瓊脂平板上，然后在37。C培養(yǎng)3天，挑取單菌落，并進(jìn)一步純化，檢測(cè)細(xì)菌特征，如下文所述的革蘭氏染色如圖l所示。將分離獲得的菌株用含11%脫脂乳的培養(yǎng)物培養(yǎng)后，加入保護(hù)劑，凍干、保存在-18"C，然后用于各種檢測(cè)細(xì)菌特征的試驗(yàn)。4.菌株的鑒定在生理生化基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行API鑒定及16SrDNA序列測(cè)定進(jìn)行鑒定，上述細(xì)菌是嗜熱鏈球菌grx02。(1)使用法國(guó)梅埃里公司API系列鑒定試劑條進(jìn)行糖發(fā)酵分析。在37°C，在厭氧條件下將嗜熱鏈球菌grx02在MRS瓊脂平板上培養(yǎng)48小時(shí)，然后用懸浮培養(yǎng)基將所得培養(yǎng)物懸浮，懸浮液的濁度與McFarland2的相同。然后，將該培養(yǎng)細(xì)胞接種到API50CHL試劑條中，在其上層覆蓋一層無(wú)菌石蠟，以便檢測(cè)對(duì)49種糖的發(fā)酵能力。使用API識(shí)別軟件程序分析了糖發(fā)酵能力。結(jié)果顯示，該菌株的糖發(fā)酵能力與嗜熱鏈球菌類似(表l)，符合率為96.3%。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(2)菌株16SrDNA序列鑒定。采用細(xì)菌基因組DNA小量抽提試劑盒，按照說(shuō)明進(jìn)行操作，所提嗜熱鏈球菌grx02基因組DNA電泳條帶清晰，說(shuō)明基因組DNA完整性較好可用于PCR等分子生物學(xué)操作(如圖2所示)。以基因組DNA作為模板，采用50pl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中模板DNA5|il(大約100ng)，2.5mMdNTP4^1，10xbuffer5^1，10pmol上下游引物各1.5^1，Taq酶1.5U，Mg2+3^1，以ddH20補(bǔ)至50W。PCR循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min;94。C變性lmin，64。C退火45s，72。C延伸lmin，循環(huán)35次；72°C延伸8min。吸取PCR產(chǎn)物5^1與l^ilLoadingbuffer混合，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為80V。電泳結(jié)束后用溴化乙錠(EB)染色20-30min，拍照。可見(jiàn)約1500bp的條帶即為目標(biāo)條帶(如圖3所示)。測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果嗜熱鏈球菌grx02的16SrDNA序列長(zhǎng)度為1456bp。與Genbank中發(fā)表的序列比對(duì)，本發(fā)明菌株以同源性高達(dá)99.65%被證實(shí)屬于嗜熱鏈球菌。API鑒定與16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果一致，本發(fā)明菌株為嗜熱鏈球菌".f/ze/TwopMws)grx02。5.耐酸特性在肉湯培養(yǎng)基中，按1:1與11%脫脂乳培養(yǎng)基混合，用10mol/L的HC1調(diào)節(jié)pH值，pH值分別調(diào)整為l.O、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5。然后接種3%嗜熱鏈球菌grx02培養(yǎng)液，37'C厭氧培養(yǎng)2天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌grx02在pH值2.0時(shí)37i:培養(yǎng)48h活菌數(shù)量為10"cfli/mL。表2本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx02的耐酸特性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6.耐膽鹽特性具體是，為了研究菌株的抗膽汁能力，在100mL、11%的脫脂乳中加入豬膽鹽，使膽汁的濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0°/。、3.5°/。和4.0%,然后將lmL(109cfU/mL左右)的嗜熱鏈球菌grx02培養(yǎng)物接種于這些脫脂乳中，分別厭氧培養(yǎng)2天。然后用保存在4'C的MRS肉湯培養(yǎng)物以10倍逐級(jí)稀釋培養(yǎng)液，之后將稀釋液涂布到平扳上厭氧培養(yǎng)，檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)。表3本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx02的耐膽汁特性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>膽汁濃度分別為1.0%2.5%的脫脂乳中細(xì)菌37-C培養(yǎng)2天時(shí)活菌數(shù)量均在105-8cfU/mL的范圍內(nèi)；膽汁濃度為3.0%和3.5%的脫脂乳中細(xì)菌的數(shù)量均為103—5cfU/mL;膽汁濃度為4.0%的脫脂乳中經(jīng)過(guò)2天培養(yǎng)活菌的數(shù)量仍能超過(guò)102cfu/mL，證明本發(fā)明菌株對(duì)膽汁具有抗性。7.抗氧化特性(1)SOD活性具體是，經(jīng)三次活化的嗜熱鏈球菌grx02按3。/。的接種量接種于15mL，11%脫脂乳中，在37'C進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵液在4'C，3500rpm條件下離心20min。取上清液，調(diào)pH到6.0后，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性。從新疆共分離獲得的26株乳酸菌中，SOD活性大于25U/mL的菌株數(shù)占15.38%，小于20U/mL的菌株數(shù)占38.46%，嗜熱鏈球菌grx02的SOD活性明顯高于其它菌株，其活性含量能達(dá)到28.77U/mL。(2)清除DPPH自由基能力具體是，經(jīng)三次活化的嗜熱鏈球菌grx02按3%的接種量接種于15mL，11%脫脂乳中，在37"C進(jìn)行培養(yǎng)，菌株發(fā)酵液在4-C，3500rpm條件下離心20min后，取上清液，與95%的乙醇按體積比稀釋成不同百分濃度，將不同稀釋濃度的菌株發(fā)酵上清液及等體積濃度為30mg/LDPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻，30min后用95%乙醇作參比測(cè)定其吸光度，計(jì)算清除率。發(fā)酵液上清清除DPPH'能力均隨著濃度的升高其清除能力增強(qiáng)，發(fā)酵液濃度與DPPH-清除率呈線性關(guān)系。從新疆共分離獲得的26株乳酸菌中，清除50。/。DPPH-時(shí)，所需消耗的發(fā)酵液濃度小于3.40%的菌株數(shù)占11.54%，所需消耗的發(fā)酵液濃度大于3.60%的菌株數(shù)占61.54%。嗜熱鏈球菌grx02的清除DPPH，能力明顯高于其它菌株，所需消耗的grx02發(fā)酵液濃度為3.34%。(3)總抗氧化能力具體是，經(jīng)三次活化的嗜熱鏈球菌grx02按3%的接種量接種于15mL，11%脫脂乳中，在37。C進(jìn)行培養(yǎng)，菌株發(fā)酵液在4'C，3500rpm條件下離心20min后，取上清液，調(diào)pH在6.0。按試劑盒說(shuō)明書(shū)(南京建成生物工程有限公司)測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)。從新疆共分離獲得的26株乳酸菌中，總抗氧化能力大于15U/mL的菌株數(shù)占15.38%，小于10U/mL的菌株數(shù)占69.23%，嗜熱鏈球菌grx02總抗氧化能力明顯高于其它菌株，其抗氧能力能達(dá)到17.35U/mL。綜上所述，本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx02具有較高的抗氧化活性。8.對(duì)致病菌的抑制特性(1)對(duì)大腸桿菌抑制能力采用單層瓊脂平板擴(kuò)散法。將埃希氏大腸桿菌接種于液體LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)4h后，平板計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)，4"C冷藏，備用。通過(guò)稀釋控制大腸桿菌活菌數(shù)在106cfli/mL，此濃度易致病。分別吸取大腸桿菌菌液O.lmL于固體LB培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌涂抹棒涂布均勻，于超凈工作臺(tái)內(nèi)通無(wú)菌空氣，放置lh待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直徑10mm，孔深3mm，將菌株樣液0.2mL(108cfo/mL)注入孔內(nèi)，于37'C培養(yǎng)8h觀察結(jié)果、測(cè)定抑菌圈直徑。每個(gè)平板三個(gè)孔，做兩個(gè)平板平行，用于分析。從新疆共分離獲得的26株乳酸菌中，抑菌直徑大于22mm的菌株數(shù)占26.92%，小于20mm的菌株數(shù)占46.15%，嗜熱鏈球菌grx02抑制大腸桿菌能力比較好，抑菌直徑在23mm左右。(2)對(duì)沙門(mén)氏菌抑制能力將傷寒沙門(mén)氏菌接種于液體LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)6h后，平板計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)，4'C冷藏，備用。操作步驟同上。從新疆共分離獲得的26株乳酸菌中，抑菌直徑大于24mm的菌株數(shù)占30.77%，小于22mm的菌株數(shù)占46.15%，嗜熱鏈球菌grx02抑制沙門(mén)氏菌能力比較好，抑菌直徑在26mm左右。綜上所述，本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx02具有較強(qiáng)的抗致病菌能力。9.在共培養(yǎng)時(shí)破壞內(nèi)毒素特性將0.2mL濃度為10eu/mL的內(nèi)毒素與O.lmL(108cfh/mL)菌液一起接于MRS培養(yǎng)液中，使內(nèi)毒素終濃度在leu/mL，將leu/mL的內(nèi)毒素與乳酸菌在37。C共培養(yǎng)，在6h、12h、24h時(shí)利用鱟試劑盒(上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所)測(cè)定內(nèi)毒素含量，觀察乳酸菌不同培養(yǎng)時(shí)間破壞內(nèi)毒素能力。與內(nèi)毒素共培養(yǎng)條件下，從新疆共分離獲得的26株乳酸菌中，相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照OD值0.86左右，菌株破壞內(nèi)毒素至OD值下降到0.30的菌株數(shù)占19.23%，嗜熱鏈球菌grx02可明顯破壞內(nèi)毒素，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)破壞內(nèi)毒素的能力有不同程度的提高，OD值能下降到0.19。說(shuō)明本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx02具有較強(qiáng)的破壞內(nèi)毒素能力。10.保護(hù)酒精肝損傷特性獲得的經(jīng)該菌株發(fā)酵的乳產(chǎn)品，經(jīng)小鼠急性酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)，獲得了保護(hù)肝損傷的特性。昆明種小鼠卯只，雌雄各半，體重2224g，購(gòu)自南京江寧湯山青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；合格證SCXK(蘇)2002-0018。標(biāo)準(zhǔn)配方桿狀飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。小鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在本校醫(yī)學(xué)院清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行。將90只小鼠隨機(jī)分為9組空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物組、乳酸菌對(duì)照組C8M、嗜熱鏈球菌grx02組，乳酸菌組分高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只?？瞻讓?duì)照組自由進(jìn)食；模型組采用蒸餾水10mL/kg連續(xù)灌胃10d，與末次灌胃lh后灌50%酒精12mL/kg;陽(yáng)性藥物組采用東寶肝泰10mL/kg(含東寶肝泰0.08g/mL)灌胃，連續(xù)10d與末次灌胃lh后灌50%酒精12mL/kg;乳酸菌高、中、低劑量三組釆用乳酸菌10.0mL/kg(108、107、106cfU/mL)連續(xù)灌胃10d，與末次灌胃lh后灌50。/。酒精12mL/kg。灌酒后，動(dòng)物造模后出現(xiàn)腸道受損，二便失常，毛發(fā)漸干枯無(wú)光澤，精神萎靡不振等表現(xiàn)，各乳酸菌組的上述一般狀況較模型組明顯改善，可能與乳酸菌具有保護(hù)腸道作用有關(guān)。禁食12h后，摘眼球取血，解剖取肝臟測(cè)定各指標(biāo)。結(jié)果如表4，表5。表4嗜熱鏈球菌grx02對(duì)小鼠血清中ALT、AST、TG、ALB、TP的影響(n=10，f±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注與正?？瞻捉M比較AP<0.05，AAPO.01;與酒精模型組比較*P<0.05，**P<0.01表5嗜熱鏈球菌grx02對(duì)小鼠肝臟中MDA、GSH、SOD、ADH的影響(n=10，7±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注同表4。由表4、5可看出模型組與空白組的各指標(biāo)比較，具有顯著性差異(P<0.05)說(shuō)明模型建立成功。酒精刺激將使肝細(xì)胞受到一定程度的損傷，ALT、AST含量明顯上升，而嗜熱鏈球菌gnc02有效地降低了肝細(xì)胞的損傷(P<0.05)，并且，效果明顯優(yōu)于乳酸菌對(duì)照組C8M。嗜熱鏈球菌grx02的總蛋白含量、白蛋白含量明顯高于模型組(P<0.05)，但劑量關(guān)系不明確。嗜熱鏈球菌grx02拮抗了酒精所致抗氧化酶活性的降低，抑制了自由基的產(chǎn)生，SOD活性明顯高于模型組(P<0.01)，MDA含量明顯低于模型組(P<0.01)，減少了酒精所致肝臟GSH的耗竭，GSH活性明顯高于模型組(P<0.01)與藥物組無(wú)顯著差異。并且，效果明顯優(yōu)于乳酸菌對(duì)照組CsM。取各組小鼠肝臟左葉同一位置評(píng)價(jià)乳酸菌在體內(nèi)的護(hù)肝效果，小鼠病理切片如圖4至8所示空白對(duì)照組中央靜脈位于肝小葉中，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完整，呈放射狀，肝細(xì)胞胞質(zhì)半滿，無(wú)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，核仁清晰，雙核細(xì)胞較多，無(wú)炎性浸潤(rùn)。酒精模型組肝小葉界限不清，肝血竇模糊變窄，肝細(xì)胞胞質(zhì)渾濁，肝細(xì)胞腫脹變形，有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)度不清晰，少數(shù)核固縮，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物組較模型組為好，輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，核固縮輕微。乳酸菌對(duì)照組C8M較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少數(shù)肝細(xì)胞腫脹，輕度損傷。嗜熱鏈球菌grx02組基本接近正常，雙核細(xì)胞較多。ll.菌株保藏將本發(fā)明菌株于2008年5月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏號(hào)為CGMCCNo:2525。應(yīng)用示例1、含嗜熱鏈球菌grx02的酸乳的制作方法將鮮乳加熱到50'C以上，加入6%的白砂糖攪拌至完全溶解，預(yù)熱到6065°C，20Mpa壓力均質(zhì)，9(TC左右殺菌5-8分鐘，冷卻至4245°C，接種嗜熱鏈球菌grx02。接種數(shù)量為2~3%。4042'C發(fā)酵至pH值為4.24.5，冷卻、冷藏，即制成凝固型酸乳。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)攪拌，添加果醬果汁等，冷藏，即制成含活性嗜熱^l球菌grx02酸乳。2、含嗜熱鏈球菌grx02乳酸菌飲料的制作方法按應(yīng)用實(shí)施例1制備好酸乳，將酸乳用殺菌并冷卻的水、糖漿、乳化穩(wěn)定劑等混合物稀釋3_4倍左右，制成可直接飲用的含活性嗜熱鏈球菌grx02的乳酸菌飲料。3、含嗜熱鏈球菌grx02冰淇淋的制作方法按應(yīng)用實(shí)施例1制備好酸乳，冰淇淋原料配比如表5所示。表51000kg冰淇淋配方<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>將除酸乳以外的其它物料混合，預(yù)熱到6065。C，采用20Mpa30Mpa進(jìn)行均質(zhì)，然后在80°C/20s殺菌，冷卻到4050°C，與酸乳混合，采用20Mpa30Mpa進(jìn)行均質(zhì)，在2'C4"C時(shí)，老化時(shí)間6h，經(jīng)凝凍后經(jīng)過(guò)硬化的為硬質(zhì)冰淇淋，不經(jīng)硬化的為軟質(zhì)冰淇淋。4、含嗜熱鏈球菌grx02粉末狀食品的制作方法將嗜熱鏈球菌grx02酸乳冷凍至-40°C-60°C，經(jīng)干燥，至含水量為3%-5%，壓碎成粉末狀，可將粉末狀產(chǎn)品加入奶粉、低聚糖、麥芽糊精、風(fēng)味劑等制成粉末狀或片塊狀產(chǎn)品，用于日常食用。以上本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵的各種產(chǎn)物可起到保護(hù)酒精性肝損傷的作用，該菌株發(fā)酵的牛奶，獲得的經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的各種發(fā)酵乳產(chǎn)品、乳酸菌飲料產(chǎn)品等，都獲得了具有不同程度的保護(hù)酒精性肝損傷的特性。5、含嗜熱鏈球菌grx02藥物組合物的制作方法及病例防治示例原料配比如表6所示。表6原料配料表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>按照比例將脫脂奶粉、乳糖、酵母粉、蛋白胨以純凈水混合均勻，預(yù)熱到6065°C，20Mpa壓力均質(zhì)，90。C左右殺菌2030分鐘，冷卻至4243。C，接種3。/。嗜熱鏈球菌grx02發(fā)酵齊IJ，42。C發(fā)酵至pH值為4.14.5，離心，冷凍干燥至水份含量小于3%。即制備成嗜熱鏈球菌grx02冷凍干燥物，將冷凍干燥物與麥芽糊精等量混合后裝入膠囊中，即制成含嗜熱鏈球菌grx02的藥物組合該產(chǎn)品長(zhǎng)期服用可預(yù)防、緩解和輔助治療肝損傷，特別是長(zhǎng)期大量飲酒人員。長(zhǎng)期服用無(wú)任何毒副作用，每天服用1—2次，每次至少含本發(fā)明活菌數(shù)量超過(guò)107個(gè)。<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02及其制備方法、應(yīng)用<160>1<210>1<211>1456<212>DNA<213>乳酸菌<220><223>從新疆民族傳統(tǒng)乳制品中分離<400>1gggattggcgcgtgctatacatgcaagtagaacgctgaagagaggagcttgctcttcttg60gatgagttgcgaacgggtgagtaacgcgtaggtaacctgccttgtagcgggggataacta120ttggaaacgatagctaataccgcataacaatggatg狄acatgtcatttatttgaaaggg180gcaattgttccactacaagatggacctgcgttgtattagctagtaggtgaggtaatggct240cacctaggcgacgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagac300acggcccagaetcctecgggaggcagcagtagggaatcttcggc幼tgggggcaaccctg360accgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtaagtca420agaacgggtgtgagagtggaaagttcacactgtgacggtagc"accagaaagggacggc480taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggatttattgg540gcgtaaagcgagcgcaggcggtttgataagtctgaagttaaaggctgtggctcaaccata600gttcgctttggaaactgtcaaacttgagtgcag肌ggggagagtggaattccatgtgtag660cggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggtctgta720actgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccac780gccgtaaacgatgagtgctaggtgttggatcctttccgggattcagtgccgcagct肌cg840cattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggg900ggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcg肌gaaccttaccag960gtcttgacatcccgatgctatttctagagatagaaagttacttcggtacatcggtgacag1020gtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtt肌gtcecgcaacgagc1080gcaacccctattgttagttgccatcattcagttgggcactctagcgagactgccggtaat1140aaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacac1200acgtgctacaatggttggtacaacgagttgcgagtcggtgacggcgagctaatctcttaa1260agccaatctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagt1320aatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtca1380ccccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccta1440aggtggacagatttgg權(quán)利要求1、具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02，其特征在于，保藏號(hào)為CGMCCNo2525。2、如權(quán)利要求1所述具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)采用培養(yǎng)基從新疆民族傳統(tǒng)乳制品中分離獲得乳酸菌；2)篩選出具有抗氧化活性、抗致病菌特性和破壞內(nèi)毒素能力的乳酸菌;3)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較從經(jīng)步驟2)篩選出的乳酸菌中篩選出對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)功能的乳酸菌，即為嗜熱鏈球菌grx02。3、如權(quán)利要求1所述具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02用于制備具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的食物。4、如權(quán)利要求1所述具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02用于制備具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的發(fā)酵乳。5、如權(quán)利要求1所述具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02用于制備具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的藥物組合物。全文摘要具有酒精性肝損傷保護(hù)功能的嗜熱鏈球菌grx02及其制備方法、用途，涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是功能性乳酸菌的分離株及應(yīng)用。先采用培養(yǎng)基從新疆民族傳統(tǒng)乳制品中分離獲得乳酸菌；再篩選出具有抗氧化活性、抗致病菌特性和破壞內(nèi)毒素能力的乳酸菌；再通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較從篩選出的乳酸菌中篩選出對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)功能的乳酸菌，即為嗜熱鏈球菌grx02。本發(fā)明是一種功能性乳酸菌，特別在肝損傷保護(hù)方面具有功能特性，如將本發(fā)明嗜熱鏈球菌grx02開(kāi)發(fā)成保健食品，長(zhǎng)期服用可預(yù)防、緩解和輔助治療肝損傷。文檔編號(hào)A61P1/16GK101328469SQ20081002301公開(kāi)日2008年12月24日申請(qǐng)日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日發(fā)明者張宜鳳,朱小紅,楊振泉,王慧晶,顧瑞霞申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)