專利名稱：：重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的基因克隆、基因重組、外源基因在真核細(xì)胞中的分泌表達(dá)，特別涉及用基因工程制備融合蛋白腫瘤抑素-腫瘤壞死因子的方法，其中包括融合蛋白的分泌型真核表達(dá)載體，含該載體的宿主細(xì)胞，以及該融合蛋白的一些生物活性研究。二、
背景技術(shù)：
化療、放療及生物治療等傳統(tǒng)治療都是針對腫瘤細(xì)胞本身。然而，實體瘤不同于血液系統(tǒng)腫瘤，必須通過血管從宿主獲取營養(yǎng)。實體腫瘤的生成依賴于腫瘤本身新生血管的形成，腫瘤血管的再生受到眾多血管刺激及抑制因子的調(diào)控。隨著腫瘤血管再生理論和相應(yīng)基礎(chǔ)臨床研究的快速進(jìn)展，抗腫瘤血管生成治療己成為腫瘤綜合治療中的一項重要內(nèi)容。人工已能提取血管抑素、腫瘤抑素等血管生長抑制因子用于臨床治療研究。20世紀(jì)70年代，美國學(xué)者Folkman提出了腫瘤生長是依賴血管的。這為靶向血管的抗腫瘤研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。實體瘤的發(fā)展分為無血管期和血管期，絕大多數(shù)人體腫瘤位于原發(fā)部位數(shù)月到數(shù)年處于無血管狀態(tài)，在無血管階段，腫瘤組織極少超過23ram。腫瘤組織內(nèi)一旦某亞群細(xì)胞轉(zhuǎn)化到促血管生成表型，就開始血管形成。血管形成過程是復(fù)雜的，它需要內(nèi)皮組織、有絲分裂、管道形成和基底膜的形成。血管形成過程受到血管形成因子和抑制因子的調(diào)節(jié)。血管形成狀態(tài)則表明血管形成因子和抑制因子二者的平衡狀態(tài)被打破。實體腫瘤生長必須依賴持續(xù)和廣泛的血管生成(Angiogenesis)，腫瘤細(xì)胞聚集團(tuán)從宿主基質(zhì)中建立自身的血液供應(yīng)系統(tǒng)，己長成的瘤體從宿主中獲取新的血管成分亦屬同樣的過程。正常生理狀態(tài)下，血管的生成和抑制因子對血管內(nèi)皮新生的調(diào)節(jié)處于一種動態(tài)的平衡，血管生成機(jī)制處于"關(guān)閉"狀態(tài)。病理狀態(tài)下，血管的生成和抑制因子的共同作用處于失平衡狀態(tài)。腫瘤從血管前期的靜止?fàn)顟B(tài)發(fā)展到伴隨腫瘤血管新生的浸潤狀態(tài)，需要突破這些刺激因子和抑制因子作用的平衡。當(dāng)腫瘤組織內(nèi)的血管生成剌激因子作用處于上調(diào)狀態(tài)，血管生成抑制因子作用處于下調(diào)狀態(tài)，血管生成作用機(jī)制則處于"開啟"狀態(tài)，即出現(xiàn)腫瘤血管新生。這就是所謂的血管形成的開關(guān)平衡假說。病理狀態(tài)下新生的血管是混亂無序排列的，新生血管壁不完整，存在大量裂隙。這是因為平滑肌、外膜細(xì)胞不能完整形成和排列所致。血管再生影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移特性。這是因為新生血管是提供病理組織養(yǎng)分保證其生長增殖的基礎(chǔ)，同時，腫瘤新生的血管使得腫瘤細(xì)胞與個體的血管循環(huán)系統(tǒng)直接相通，這也是惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移播散的必要條件，腫瘤血管的新生數(shù)量可以用以判斷腫瘤患者的預(yù)后。抗血管生成方法，既然腫瘤血管形成與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移關(guān)系如此密切，抗腫瘤血管生成的方法自然可以起到抗癌的作用。這一方法已被越來越多的實驗證明是可行的，抗血管的生成的可以在5個不同的水平起作用①阻止腫瘤細(xì)胞分泌腫瘤血管生成因子(Tumorangiogenesisfactors,TAFs);②阻斷TAFs的效應(yīng)，即通過抗TAFs抗體或抗TAFs受體的抗體來中和或阻斷其生物學(xué)效應(yīng)；③抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷徙；④干擾內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)的相互作用，阻止血管網(wǎng)的形成；⑤抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長。有關(guān)抗TAFs抗體中和作用抗血管生成的研究較多，Gross等利用人結(jié)腸癌裸鼠體內(nèi)移植模型研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用bFGF可使腫瘤生長加快，血管密度增加，若同時使用抗bFGF單抗則可阻止腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長,抗VEGF抗體亦有同樣的效果。這一方法的問題在于，腫瘤細(xì)胞可以分泌一系列TAFs，僅僅抑制個別因子可能難以達(dá)到理想的抗癌效果?？寡苌傻牧硪粋€途徑是抗內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷徙，血小板因子-4，煙曲霉素和人泌乳素16kD片段均可抗生長因子刺激的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，凝血栓蛋白(Thrombospondin)、魚精蛋白和硫酸甲殼素均有抗內(nèi)皮細(xì)胞移動的作用。體外實驗證明了這一點(diǎn)。抑制血管生長的藥物種類l.抗體類中和VEGF的單克隆抗體、抗新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的單克隆抗體及其基因工程抗體、抗整合素抗體等導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞新生血管的形成，使腫瘤消退和預(yù)防轉(zhuǎn)移，特別對晚期患者，己在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌及黑色素瘤中得到證實。2.基因重組類血管抑制素、內(nèi)皮抑制素、重組IL-12、干擾素-a2a等。3.化學(xué)合成或提取類防止基底膜降解的Marimastat與Bartimastat合成的非蛋白制劑、煙曲霉素及其衍生物、戊聚糖(pps)、蘇拉明、、甲基吡啶酸(picolimicacid)等。目前，僅美國就有36種血管生成抑制劑進(jìn)入腫瘤治療的Im期臨床試驗。2004年2月世界首個抑制腫瘤血管藥物Avastin經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市(Folkman，2004)。近年來，我國的科研工作者也開始進(jìn)行血管生成抑制劑的尋找和研究工作，取得了一些進(jìn)展。2005年9月12日重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(商品名恩度)，被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為生物制品一類新藥，這是世界上首例血管內(nèi)皮抑制素抗癌新藥，預(yù)示血管生成抑制劑的研究有著光明的前景。但是，從總體上說，我國對血管生成抑制劑的研究剛剛起步，與發(fā)達(dá)國家相比，無論在基礎(chǔ)研究還是在應(yīng)用開發(fā)方面皆有較大距離。因此，研制開發(fā)有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤血管藥物具有重要意義。tumstatin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的血管生成抑制劑，Tumstatin是最新發(fā)現(xiàn)的人基底膜來源膠原IV型腫瘤血管生成抑制因子，它抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并引起內(nèi)皮細(xì)胞特異性凋亡。Tumstatin以非RGD序列結(jié)合于整合素dve3受體并影響其活性，結(jié)合整合素a^3受體對tumstatin發(fā)揮抗新生血管活性至關(guān)重要。膠原IV是血管基底膜的主要大分子，促進(jìn)細(xì)胞的粘附，遷移，分化和生長。組成膠原的核苷酸編碼6條不同的ci鏈，即ala6，并以不同或相同的a鏈組成三聚體，如(al)2a2，(a3)2a4,(a3)3，(a4)4，進(jìn)一步形成網(wǎng)絡(luò)為其它大分子提供支架。膠原IV的每條a鏈由3個部分組成:N-端的7S區(qū)域，中間的3股螺旋區(qū)域，C-端的非膠原區(qū)域l(NC1)。Tumstatin由膠原IVa3鏈的中間3股螺旋區(qū)域C-端12氨基酸和非膠原區(qū)域1(NC1)共244氨基酸組成。Tumstatin的相對分子量約28kD，核苷酸序列(738bp)。Tumstatin的作用機(jī)制及其作用途徑，Tumstatin的作用是并不改變細(xì)胞的蛋白mRNA表達(dá)水平，是在蛋白質(zhì)水平整體上抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，而且該作用是特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。tumstatin以非RGD序列結(jié)合于整合素cive3，然后再通過抑制局部粘附激酶(focaladhesionkinase,簡寫為FAK)活性途徑、通過抑制磷脂酰肌糖3(PI3)激酶活性途徑、通過抑制絲/蘇氨酸蛋白激酶(PKB/Akt)活性和哺乳動物雷帕酶素靶體(mT0R)活性途徑，最終通過阻斷真核翻譯起始因子真核翻譯起始因子(elF4E)和它的結(jié)合蛋白的解離來介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特異性的mRNA帽子依賴性的蛋白質(zhì)合成，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的血管新生和抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Tumstatin作用特點(diǎn)和生物效應(yīng)，Tumstatin以非依賴RGD方式結(jié)合于整合素aJ3，并通過兩個不同位點(diǎn)與其發(fā)生相互作用，一個位點(diǎn)是tumstatin54-132殘基，參與抗新生血管形成；而另一位點(diǎn)是tumstatin197-215氨基酸殘基，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。tumstatin發(fā)揮生物效應(yīng)區(qū)位于25個氨基酸殘基內(nèi)(74-98)。大量的動物試驗表明腫瘤壞死因子(TNF)具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，但臨床效果不理想，原因是毒副作用太大。TNF抗腫瘤活性依賴多種效應(yīng)，它可觸發(fā)腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞造成相關(guān)血管的破壞和損傷、激活炎癥和免疫反應(yīng)以及引起腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死。特別是在介導(dǎo)腫瘤血管損傷方面，受TNF影響的多種細(xì)胞中內(nèi)皮細(xì)胞最為重要。腫瘤血管損傷是TNF對內(nèi)皮細(xì)胞直接的細(xì)胞毒作用和造成內(nèi)皮細(xì)胞凝血活性改變(抗凝轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌?的結(jié)果。但是，正常血管內(nèi)皮細(xì)胞也受TNF的影響，這很可能就是低血壓和TNF毒性而導(dǎo)致劑量限制的原因。在血管修復(fù)和新生血管形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)多種細(xì)胞表面分子，他們可促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖，a』3就是其中之一，它在體內(nèi)新生血管形成過程中對內(nèi)皮細(xì)胞的生存起著至關(guān)重要的作用。因此，我們選擇運(yùn)用血管靶向策略以增加TNF對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性。三、
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種通過抑制血管生成以抗腫瘤的藥物，所要解決的技術(shù)問題是用全長tumstatin基因與人TNF-a基因融合。構(gòu)建分泌型重組pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表達(dá)載體，用高保真的PrimeSTARTMHSDNA聚合酶重疊PCR(SOEing)，以及將VI型膠源a3鏈N端信號肽(sig)加在各目的基因前面，同時在tumstatin和TNF之間增加了連接臂基因片段，以期在將來表達(dá)蛋白時能保證融合蛋白中tumstatin和TNF兩者的空間構(gòu)象和分子活性。具體地說本發(fā)明的一個目的是提供一種新的具有tumstatin和TNF兩者生物活性的藥物，它是tumstatin和TNF的融合蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含DNA序列的載體及含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第一方面，提供一種tumstatin和TNF的分泌型融合基因，采用的技術(shù)方案是，以人胚腎293細(xì)胞為材料，提取總RNA，用RT-PCR方法合成人tumstatincDNA，將該cDNA克隆到pGEM-T載體獲得重組質(zhì)粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR從pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF載體中分別擴(kuò)增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段，并將其融合得至Usig-tumstatin-linker-TNF。本發(fā)明的第二方面，提供了一種tumstatin和TNF融合基因之間的連接臂基因片段1inker。本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發(fā)明上述的分泌型融合蛋白。本發(fā)明的第四方面，提供了含有上述DNA分子的載體和含有上述載體的宿主細(xì)胞。sig-tumstatin-linker-TNF片段經(jīng)酶切后，插入經(jīng)同樣酶切pIRESneo3的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliDH5ct，抽提質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞，分泌表達(dá)了融合蛋白本發(fā)明的第五方面，提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明融合蛋白的方法，它包括步聚在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的融合蛋白。本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明融合蛋白的用途，即在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明成功構(gòu)建了表達(dá)成型融合蛋白tumstatin-TNF并可以使tumstatin-TNF融合蛋白在真核分泌表達(dá)，便以提取和分離，克服了原核表達(dá)中融合蛋白均的包涵體形式，融合蛋白tumstatin-TNF中的連接臂片段能保證融合蛋白中tumstatin和TNF兩者的空間構(gòu)象和分子活性。本融合蛋白的靶向能力是利用配體tumstatin和受體a,03之間高度特異的相互作用，特異地殺傷腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞抑制了腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時引起腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死有較好的作用。四圖1是RT-PCR克隆人tumstatin基因片段(738bp)。圖2是pGEM-T/tumstatin重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增和酶切片段鑒定，其中1泳道是擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，第2泳道是酶切產(chǎn)物電泳圖。圖3是PCR是擴(kuò)增sig-tumstatin-基因片段產(chǎn)物電泳圖。圖4是PCR是擴(kuò)增sig-tumstatin-linker基因片段產(chǎn)物電泳圖。圖5是重疊區(qū)擴(kuò)增拼接法(SOEing)擴(kuò)增sig-tumstatin-linker-TNF基因片段產(chǎn)物電泳圖。圖6是pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增和酶切片段產(chǎn)物電泳圖，其中M為Mark(1Kb)，1泳道是pIRESneo3/sig-TNF重組質(zhì)粒用NheI/BamHI酶切片段，2泳道是PCR擴(kuò)增sig-TNF基因片段，3泳道是PCR擴(kuò)增linker-TNF基因片段，4泳道是PCR擴(kuò)增sig-tumstatin-linker基因片段，5泳道是PCR擴(kuò)增sig-tumstatin-linker-TNF基因片段，6泳道是pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF重組質(zhì)粒用NheI/BamHI酶切片段。圖7是PCR擴(kuò)增sig-TNF基因片段產(chǎn)物電泳圖，其中M為Mark,第1、2、3泳道為sig-TNF片段，第4泳道為TNF+片段，第5泳道為sig+片段。圖8是pIRESneo3/sig-tumstatin與pIRESneo3/sig-TNF重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增和酶切片段產(chǎn)物電泳圖，其中M為Mark(1Kb)，第2泳道為pIRESneo3/sig-tumstatin雙酶切片段，第3泳道為pIRESneo3/sig-tumstatinPCR擴(kuò)增片段，第5泳道為重組pIRESneo3/sig-TNF質(zhì)粒雙酶切片段，第6泳道為重組pIRESneo3/sig-TNF質(zhì)粒PCR擴(kuò)增片段。圖9是PCR擴(kuò)增sig、sig-tumstatin基因片段產(chǎn)物電泳圖，其中M為Mark,第1、3泳道為約820bpsig-tumstatin片段，第6泳道為約100bpsig片段。圖10是PCR擴(kuò)增sig-EGFP、sig-tumstatin-linker-EGFP基因片段產(chǎn)物電泳圖，其中M為Mark,1泳道為sig-tumstatin-linker-EGFP片段，2泳道為sig-EGFP片段，圖11是pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-EGFP重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增和酶切片段產(chǎn)物電泳圖，其中M為Mark,2泳道為重組質(zhì)粒雙酶切(NheI+BamHI)片段，3泳道為sig-tumstatin-linker-EGFPPCR擴(kuò)增片段(約1500bp)，4泳道為sig-tumstatin-linkerPCR擴(kuò)增片段，5泳道為EGFP的PCR擴(kuò)增片段。圖12是pIRESneo3/sig-EGFP重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增和酶切片段產(chǎn)物電泳圖，其中M為Mark,2泳道為重組質(zhì)粒雙酶切(NheI+BamHI)，3泳道為sig-EGFPPCR擴(kuò)增片段，4泳道為sigPCR擴(kuò)增片段，5泳道為EGFPPCR擴(kuò)增片段，圖13是轉(zhuǎn)染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF重組質(zhì)粒的CHO細(xì)胞RT-PCR鑒定產(chǎn)物電泳圖，其中1泳道可見預(yù)期大小的DNA片段(約1300bp)，M為Mark,圖14是tumstatin-linker-TNF與sig國TNF蛋白的Westernblot鑒定，其中1、3帶為sig-TNF，2、4帶為tumstatin-linker-TNF。圖15是tumstatin、tumstatin-TNF、TNF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其中黑色線為PBS為空白對照，紅色線為tumstatin誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，綠色線為TNF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，藍(lán)色線為tumstatin-TNF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。圖16是tumstatin-linker-TNF內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成試驗，A為5"g/mlBSA內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成試驗，B為tumstatin-linker-TNF內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成試驗。圖17是tumstatin、tumstatin-TNF體內(nèi)抑瘤試驗。五具體實施方式(一)實驗材料1.1菌株、細(xì)胞與質(zhì)粒大腸桿菌DH5a,PBV220-TNF質(zhì)粒載體、人胚腎細(xì)胞株293細(xì)胞均為本室保存，pGEM-T購自Promega公司，質(zhì)粒pIRESneo3購自Clontech公司，人胚腎細(xì)胞株293細(xì)胞以含10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)，CH0-Kl細(xì)胞以含l(m胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，蛋白電泳儀(PhamarciaHoeferBiotech.Ltd.)。1.2主要試劑小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、細(xì)胞總RNA抽提試劑盒購自華舜生物工程公司；RT-PCR試劑盒、PCR試劑盒、各種限制酶、DNAmark及連接酶購自TaKaRa公司。Trizol、SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶、G418和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineT"2000購自Invitrogen公司。引物由上海Sangon公司合成。胎牛血清購自四季青公司。(二)方法l新鮮感受態(tài)細(xì)菌的制備(1)將凍存的E.coliDH5a種植在LB固體培養(yǎng)基上，37'C培養(yǎng)過夜；(2)挑取單個克隆接種于4mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；(3)次日將菌液按1:100轉(zhuǎn)接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37°C250rpm振蕩培養(yǎng)2-4h，使0D,值達(dá)到0.4;(4)冰浴10min,使培養(yǎng)物冷卻到(TC;(5)將菌液1.5mL移入預(yù)冷的Eppendorf管中，4100rpm，4。C離心5min;(6)棄上清，將Eppendorf管倒置于濾紙上lmin后，將細(xì)菌重新懸浮于lmL冰預(yù)冷的0.lmoL/LCaCl2中，輕輕混勻后，冰浴30min;(7)4100rpm，4。C離心5min(8)棄上清，將Eppendorf管倒置于濾紙上lmin后，每管中加入100yl冰預(yù)冷的O.lmoL/LCaCl2，重懸細(xì)菌，冰浴中保存?zhèn)溆谩?引物設(shè)計根據(jù)GenBank中的人tumstatin編碼序列，設(shè)計兩條引物。3.1RT-PCR克隆人tumstatin全長編碼基因?qū)⑷伺吣I細(xì)胞株293細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，計數(shù)、離心收集細(xì)胞提取總RNA(按RNA抽提試劑盒說明書操作)。以01igo(dT)為引物合成cDNA第一鏈，取2Ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用引物pl和引物p2進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增tumstatin基因。10XTaqbuffer+KC112mMdNTPs5ix1pl(20mM)1.5u1p2(20mM)1.5u1Taq酶(5.0U/u1)1.25u125mMMgCl24u1tumstatincDNA2u1ddH2029,75u1總計50y1反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，94°C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94°C，50s(變性)；55°C，50s(退火)；72°C，60s(擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于72。C延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期大小的DNA片段(約738bp)圖l。3,2pGEM-T/tumstatin的構(gòu)建Tumstatin基因克隆到pGEM-T載體。連接酶Buffer5ulpGEM-T載體1u1PCR擴(kuò)增tumstatincDNA產(chǎn)物3u1T4DNA連接酶_In1總計lOiU充分混勻，16'C連接反應(yīng)過夜3.2.1pGEM-T/tumstatin轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5a:(1)在每管100yl感受態(tài)細(xì)菌中加入10ul上述連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min;(2)將管放入42。C的循環(huán)水浴中，熱休克90s;(3)快速將管轉(zhuǎn)移入冰浴中1-2min;(4)每管加入37。CLB液體培養(yǎng)基500u1，37°C150rpm振蕩培養(yǎng)30min;(5)4100rpm離心5min;(6)棄上清，加入200ixl新鮮LB液體培養(yǎng)基，并涂布于LB氨芐青霉素選擇性固體培養(yǎng)基，靜置IOmin;(7)倒置平皿于37。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h;3.2.2pGEM-T/tumstatin重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增鑒定菌液裂解方式挑取LB氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上單個克隆接種于4mLLB氨芐青霉素抗性選擇性液體培養(yǎng)基中，37°C180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取菌液30wl，12000rpm離心lmin,棄上清，加入10ulddH20，99°C10min。PCR擴(kuò)增鑒定，方法同上。圖2中的1泳道。3.2.3pGEM-T/tumstatin重組質(zhì)粒BamHI+HindIII雙酶切鑒定挑取PCR擴(kuò)增陽性菌接種于4mLLB氨芐青霉素抗性選擇性液體培養(yǎng)基中，37°C180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。抽提質(zhì)粒(按試劑盒操作說明書操作)。陽性菌質(zhì)粒進(jìn)一雙酶切鑒定BamHIBuffer5u1100XBSA0.5iUBamHI1H1pGEM-T/tumstatin10ulddH20_33.5u1總計50ixl37。C水浴40min，再加入Hin孤Buffer5ulHindIII1u137'C水浴40min，酶切產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，圖2中的2泳道。。4重組pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF質(zhì)粒的構(gòu)建4.1PCR擴(kuò)增sig-tumstatin-linker基因片段用p3和p5引物以pGEM-T/tumstatin為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10XTaqbuffer+KC15u12mMdNTPs5y1p3(20mM)1.5ulp5(20mM)1.1Taq酶(5.0U/u1)1.25ul25mMMgCl24ulpGEM-T/tumstatin1.25y1ddH20_31.1總計50ul反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，95°C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94°C，30s(變性)；55°C，30s(退火)；72°C，60s(擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于72'C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期大小的DNA片段(約740bp)圖3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒回收(按操作說明書操作)作為模板，再以p4和p6為引物，行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即為攜帶Nhel+BamHl酶切位點(diǎn)的sig-tumstatin-linker。lOXTaqbuffer+KC112mMdNTPs5u1p4(20mM)1.5u1p6(20mM)1.5ulTaq酶(5.0U/u1)1.25ul25mMMgCl24u1第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.25y1ddH20_31.5u1總計50nl反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，95°C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為:94°C，30s(變性);55°C，30s(退火)；72°C，60s(擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于72。C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期大小的DNA片段(約840bp)圖4。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒回收(按操作說明書操作)。4.2PCR擴(kuò)增1inker-TNF片段用p7和p8引物以PBV220-TNF為模板擴(kuò)增帶接頭的linker-TNF片段lOXTaqbuffer+KC15u12mMd野s5u1p7(20mM)1.5u1p8(20mM)1.1Taq酶(5.OU/p1)1.25ul25mMMgCl24u1PBV220-TNF1.25ylddH20_31.5n1總計50u1反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，95°C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94°C，30s(變性)；55°C，30s(退火)；72°C，60s(擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于72。C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，圖6中的3泳道。。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒回收(按操作說明書操作)。4.3重疊區(qū)擴(kuò)增拼接法(SOEing)擴(kuò)增sig-tumstatin-linker-TNF:再用高保真的PrimeSTARTMHSDNA聚合酶p4和p8引物以sig-tumstatin-linker片段和linker-TNF片段為模板重疊區(qū)擴(kuò)增拼接法(SOEing)擴(kuò)增。5XPrimeSTARbuffer+MgCl210ul2.5mMd,s4u1p4(20mM)0.5ulp8(20mM)0.5n1sig-tumstatin-linker片段1H1linker-TNF片段1U1高保真的PrimeSTARTMHSDNA聚合酶(2.5U/u1)0.5u1ddH20_32.1總計50yl反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，98°C反應(yīng)2min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為98°C，10s(變性)；68°C，4min(退火、擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于64。C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期大小的DNA片段(約1300bp)圖5，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒回收(按操作說明書操作)。4.4sig-tumstatin-linker-TNF和pIRESneo3雙酶切Buffer25u1100XBSA0.5lUNheI1ix1sig-turastatin-linker-TNF片段(或pIRESneo3)15"1ddH20_28.5y1總計50ul37"C水浴40min，再加入BamHIBuffer5P1BamHI1P137'C水浴40min，酶切產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收相應(yīng)產(chǎn)物sig-tumstatin-linker-TNF片段和pIRESneo3。4.5重組pIRESneo3/sig-turastatin-linker-TNF質(zhì)粒的構(gòu)建酶切片段sig-tumstatin-linker-TNF和pIRES訓(xùn)3連接反應(yīng)。連接酶Buffer1u1酶切sig-tumstatin-linker-TNF片段3ul酶切pIRESneo31u1T4DNA連接酶1u1ddH20_4y1總計10P1充分混勻，16。C連接反應(yīng)過夜。4.6酶切片段sig-tumstatin-1inker-TNF和pIRESneo3連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5a:(1)在每管100nl感受態(tài)細(xì)菌中加入10ul上述連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min;(2)將管放入42'C的循環(huán)水浴中，熱休克90s;(3)快速將管轉(zhuǎn)移入冰浴中l(wèi)-2min;(4)每管加入37。CLB液體培養(yǎng)基500u1,37°C150rpra振蕩培養(yǎng)30min;(5)4100rpm離心5min;(6)棄上清，加入200iil新鮮LB液體培養(yǎng)基，并涂布于LB卡那霉素抗性選擇性固體培養(yǎng)基，靜置IOmin;(7)倒置平皿于37。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h;4.7E.coliDH5a重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNFPCR擴(kuò)增鑒定菌液裂解方式挑取LB卡那霉素抗性選擇性固體培養(yǎng)基上單個克隆接種于4mLLB氨芐青霉素抗性選擇性液體培養(yǎng)基中，37°C180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取菌液30!U，12000rpm離心lmin，棄上清，加入14.7ulddH20，99°C10min。5XPrimeSTARbuffer+MgCl25wl2mMdNTPs2u1p4(20mM)0.5u1p8(20mM)0.5u1高保真的PrimeSTAirHSDNA聚合酶(2.5U/u1)0.3u125raMMgCl22n1上述細(xì)菌裂解液_14.7til總計25P1反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，98°C反應(yīng)2min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為98°C，10s(變性)；68°C，4min(退火、擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于64'C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，陽性菌可見預(yù)期大小的DNA片段(約1300bp)圖6。挑取陽性菌接種于4mLLB氨節(jié)青霉素抗性選擇性液體培養(yǎng)基中，37°C180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。抽提質(zhì)粒(按試劑盒操作說明書操作)。陽性菌質(zhì)粒進(jìn)一雙酶切鑒定，方法同上，圖6。M為Mark(1Kb)，l泳道為重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-TNF雙酶切(NheI十BamHI)產(chǎn)物，2泳道為sig-TNFPCR擴(kuò)增片段，3泳道為linker-TNFPCR擴(kuò)增片段，4泳道為sig-tumstatin-linkerPCR，5泳道為sig-tumstatin-linker-TNFPCR擴(kuò)增片段。6泳道為重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF雙酶切(NheI+BamHI)產(chǎn)物。5pIRESneo3/sig-TNF質(zhì)粒的構(gòu)建5.l用p9和plO引物以pGEM-1731經(jīng)-1咖513"『11:11^1~為模板擴(kuò)增與1即帶重疊區(qū)的518+片段，10XTaqbuffer+KC15p12mMdNTPs5u1p9(20mM)1.5p1p10(20rnM)1.5y1Taq酶(5.0U/u1)1.25yl25mMMgCl24w1pGEM_T/sig-tumstatin-linker1.25u1ddH20_30.1總計50ul反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，95°C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94°C，30s(變性)；55°C，30s(退火)；72°C，60s(擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于72。C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒回收(按操作說明書操作)。5.2用pll和p8引物以PBV220-TNF為模板擴(kuò)增與sig帶重疊區(qū)的TNF+片段方法同上。5.3用p9和p8為引物，以sig+片段和TNF+片段為模板重疊區(qū)擴(kuò)增拼接法(SOEing)擴(kuò)增得到sig-TNF:lOXTaqbuffer+KC15y12mMd證s5u1p9(20mM)1.5u1p8(20mM)1.5ulTaq酶(5.OU/u1)1.25ul25mMMgCl23.75u1Sig+片段2ylTNF+片段1.25ulddH20_28.75tU總計50ixl反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，95。C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94°C，30s(變性)；55°C，30s(退火)；72°C，60s(擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于72。C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒回收(按操作說明書操作)。結(jié)果見圖7，第l，2，3泳道為sig-TNF片段；第4泳道為TNF+片段；第5泳道為sig+片段;第6泳道為Mark。5.4重組pIRESneo3/sig-TNF質(zhì)粒的構(gòu)建sig-TNF經(jīng)NheI+BamHI雙酶切，同樣酶切pIRESneo3質(zhì)粒，方法同上。利用T4DNA連接酶將酶切sig-TNF片段與酶切pIRESneo3質(zhì)粒載體連接，連接方法同上。5.5E.coliDH5a重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，用TaqDNA聚合酶及sig-TNF引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選取幾個經(jīng)克隆PCR和NheI+BamHI雙酶切檢測陽性的菌落，小量制備質(zhì)粒。方法同上。結(jié)果見圖8。第4為Mark;第5泳道為重組pIRESneo3/sig-TNF質(zhì)粒雙酶切片段；第6泳道為重組pIRESneo3/sig-TNF質(zhì)粒PCR擴(kuò)增片段。6.1sig-tumstatin片段PCR擴(kuò)增用p9和pl2為引物，以pGEM-T/sig-tumstatin-linker為模板擴(kuò)增，10XTaqbuffer+KC15u12raMdNTPs5y1p9(20raM)1.5u1p12(20mM)1.5ulTaq酶(5.0U/u1)1.25ul25mMMgCl24u1pGEM_T/sig-tumstatin-linker1.25u1ddH20_31.5^1總計50p1反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，95°C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94°C，30s(變性)；55°C，30s(退火)；72°C，60s(擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于72。C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收試劑盒回收(按操作說明書操作)，可見預(yù)期大小的DNA片段結(jié)果見圖9。第l、3泳道為約820bpsig-tumstatin片段；第5泳道為Mark;第6泳道為約100bpsig片段。6.2重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-tumstatin的構(gòu)建sig-t咖statin經(jīng)NheI+BamHI雙酶切，同樣酶切pIRESneo3質(zhì)粒，方法同上。利用T4DNA連接酶將酶切sig-tumstatin片段與酶切pIRESneo3質(zhì)粒載體連接，連接方法同上。6.3重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-tumstatin的E.coliDH5a轉(zhuǎn)化及PCR擴(kuò)增鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，用TaqDNA聚合酶及sig-tumstatin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選取幾個經(jīng)克隆PCR和Nhel+BamHl雙酶切檢測陽性的菌落，小量制備質(zhì)粒。方法同上。結(jié)果見圖8。第l為Mark，第2泳道為pIRESneo3/sig-tumstatin雙酶切片段；第3泳道為pIRESneo3/sig-tumstatinPCR擴(kuò)增片段。7sig-tumstatin-linker-EGFP和sig-EGFP片段。7.1與EGFP有重疊區(qū)的sig-tumstatin-linker片段擴(kuò)增。用p9和pl3為引物，pGEM-T/sig-tumstatin-linker為模板，產(chǎn)物命名為a。7.2與sig-t咖statin-linker有重疊區(qū)的EGFP片段擴(kuò)增。用pl4和pl5為引物，pEGFP-G為模板，產(chǎn)物命名為b。7.3與EGFP有重疊區(qū)的sig片段擴(kuò)增。用p9和p16為引物，pGEM_T/sig-tumstatin-linker為模板，產(chǎn)物命名為c。7.4與sig有重疊區(qū)的EGFP片段擴(kuò)增。用pl7和pl5為引物，pEGFP-G為模板，產(chǎn)物命名為d。5XPrimeSTARbuffer+MgCl210ul2.5mMdNTPs4u1上游引物(20raM)0.5ul下游引物(20rnM)0.5u1PrimeSTARHSDNA聚合酶(2.5U/y1)0.5u1模板1U1ddH20_33.5ul總計50ii1反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，98°C反應(yīng)2min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為98°C，10s(變性)；68°C，2min(退火、擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于68'C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收相應(yīng)產(chǎn)物a、b、c、d。7.5sig-tumstatin-linker-EGFP片段擴(kuò)增(即ab片段)，用p9和pl5為引物，a和b片段為模板。sig-EGFP片段擴(kuò)增(即cd片段)，用p9和pl5為引物，c和d片段為模板。5Xprimerbuffer2.5函dNTPsp9(20raM)p15(20mM)PrimeSTARTMHSDNA聚合酶(2.5U/n1)模板x模板yddH2^_10n14y10.5u10.5y10.5y1lulliil32.5y1總計50u1反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，98°C反應(yīng)2min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為98°C，10s(變性)；68°C，5min(退火、擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于68'C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期大小的DNA片段，結(jié)果見圖IO。第一泳道為sig-tumstatin-linker-EGFP，第二泳道為sig-EGFP，第三泳道為Mark。割膠回收相應(yīng)產(chǎn)物ab、cd片段。7.6sig-tumstatin-linker-EGFP(即ab片段)和sig-EGFP片段(即cd片段)雙酶切。Buffer2100XBSANheIab(或cd、pIRESneo3)片段ddH25_10.5u1lu110u133.5p1總計37。C水浴40min，再加入BamHIBufferBamHI50u1ly137'C水浴40min，酶切產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收相應(yīng)產(chǎn)物ab、cd片段和pIRESneo3。7.7酶切片段ab、cd和pIRESneo3連接反應(yīng)。連接酶Buffer1u1酶切ab(或cd)片段3u1酶切pIRESneo31ix1<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>充分混勻，16'C連接反應(yīng)過夜。7.8酶切片段ab、cd和pIRESneo3連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5a(1)在每管100yl感受態(tài)細(xì)菌中加入10pl上述連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min;(2)將管放入42r的循環(huán)水浴中，熱休克90s;(3)快速將管轉(zhuǎn)移入冰浴中l(wèi)-2min;(4)每管加入37。CLB液體培養(yǎng)基500ix1，37°C150rpm振蕩培養(yǎng)30min;(5)4100rpm離心5min;(6)棄上清，加入200ul新鮮LB液體培養(yǎng)基，并涂布于LB卡那霉素抗性選擇性固體培養(yǎng)基，靜置IOmin;(7)倒置平皿于37。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h;7.9E.coliDH5a重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增鑒定菌液裂解方式挑取LB卡那霉素抗性選擇性固體培養(yǎng)基上單個克隆接種于4mLLB氨芐青霉素抗性選擇性液體培養(yǎng)基中，37°C180卬m振蕩培養(yǎng)過夜；取菌液30iU，12000rpm離心lmin，棄上清，加入16.4ulddH20，99°C10min。lOXTaqbuffer+KC12.5ix12mMd,s2.5ix1p9(20mM)0.5ulp15(20mM)0.5u1Taq酶(5.0U/n1)0.6ul25mMMgCl22n1上述細(xì)菌裂解液_16.4p1總計25yl反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，94°C反應(yīng)5min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94°C，30s(變性)；55°C，30s(退火)；72°C，lmin(擴(kuò)增)；行30個循環(huán)，再于72"C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳。7.10E.coliDH5a重組質(zhì)粒雙酶切鑒定(NheI+BamHI)選取PCR擴(kuò)增陽性細(xì)菌抽提質(zhì)粒(方法同上)，雙酶切(Nhel+BamHI)(方法同上)。雙酶切產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳。pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-EGFP重組質(zhì)粒鑒定圖(圖ll)。第一泳道為Mark，第二泳道為重組質(zhì)粒雙酶切(NheI+BamHI)，第三泳道為sig-tumstatin-linker-EGFPPCR擴(kuò)增片段(約1500bp)，第四泳道為sig-tumstatin-linkerPCR擴(kuò)增片段，第五泳道為EGFPPCR擴(kuò)增片段，第六泳道為Mark。pIRESneo3/sig-EGFP重組質(zhì)粒鑒定圖(圖12)。第一泳道為Mark，第二泳道為重組質(zhì)粒雙酶切(Nhel+BamHI)，第三泳道為sig-EGFPPCR擴(kuò)增片段，第四泳道為sigPCR擴(kuò)增片段，第五泳道為EGFPPCR擴(kuò)增片段，第六泳道為M虹k。并小量抽提質(zhì)粒，方法同上。8.1G418配制300mgG418中，加入3ml去離子H20溶液，濃度為100mg/ral完全溶解后，0.22um過濾，-20度保存。8.2CH0的G418最佳藥敏濃度將細(xì)胞稀釋至1000cell/mL，每孔500uL加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0，300，400，500，600，700，800，900ug/mL等8個級別。各濃度3復(fù)孔，隔2d換液，培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。CHO的G418最佳藥敏濃度濃度為600mg/L。8.3CH0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染8.3.1轉(zhuǎn)染前一天，24孔培養(yǎng)皿，每孔500ul培養(yǎng)基0.52Xl()5細(xì)胞(計數(shù)l4X107mL)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天，加入脂質(zhì)體/DNA混合物之前的短時間內(nèi)，DMEM洗一次，更換500ul新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。8.3.2轉(zhuǎn)染復(fù)合物①.0.8wgDNA+50ul無血清DMEM稀釋，輕輕混勻。②lipofectamineTM2000(用前輕輕混勻)，2ul+50ul無血清DMEM稀釋，輕輕混勻，室溫5miru③稀釋的DNA50ul+稀釋的lipofectamine2000(50ul)，輕輕混勻,室溫20min。8.3.3不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100yl脂質(zhì)體/DNA混合物(從培養(yǎng)孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。8.3.437°CC02孵育6hr。6hr后換培養(yǎng)基，加入500ul新鮮生長培養(yǎng)基。8.3.5轉(zhuǎn)染24hr稀釋細(xì)胞(1:10)后施加篩選壓力，改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。8.3.6G418篩選在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。重組質(zhì)粒pIRES腦3/sig-t,tatin-linker-EGFP、pIRESneo3/sig-t畫tatin、pIRESneo3/sig-TNF、pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF按以上方法進(jìn)行CH0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-EGFP轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞顯示有綠色熒光，說明分泌表達(dá)成功。所有重組質(zhì)粒挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。9.l轉(zhuǎn)染sig-t咖statin-linker-TNF基因的CHO細(xì)胞RT-PCR鑒定將轉(zhuǎn)染sig-tumstatin-linker-TNF基因的CHO細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，計數(shù)、離心收集細(xì)胞提取總RNA(按RNA抽提試劑盒說明書操作)。以01igo(dT)為引物合成cDNA第一鏈，取2ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，，用引物p4和引物p8迸行常規(guī)PCR擴(kuò)增sig-tumstatin-linker-TNF基因。5XPrimeSTARbuffer+MgCl210ul2.5mMdNTPs4y1p4(20mM)0.5ulp8(20mM)0.5nlcDNA2u1高保真的PrimeSTAlTHSDNA聚合酶(2.5U/u1)0.5u1ddH20_32.5ti1總計50y1反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過程中，先加水，模板DNA及其它反應(yīng)組分，98°C反應(yīng)2min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為98°C,10s(變性)；68°C,4min(退火、擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于64。C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，第一泳道可見預(yù)期大小的DNA片段(約1300bp)圖13。9.2tumstatin-linker-TNF重組蛋白的Westernblot檢測經(jīng)PCR擴(kuò)增陽性的CHO細(xì)胞單克隆培養(yǎng)，4'C離心，1000rpm,取上清，經(jīng)SDS-PAGE采用Laemrali方法，分離膠濃度12%，電泳后凝膠染色采用考馬斯亮蘭R-250法。免疫印跡反應(yīng)SDS-PAGE結(jié)束后，按Bio-Rad產(chǎn)品說明，凝膠靠近陰極一側(cè)，硝酸纖維膜(NC膜)靠近陽極一側(cè)，轉(zhuǎn)移緩沖液(25咖ol/LTris、192誦1/LGlycine、20%甲醇)，100V恒壓lh，將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至NC膜上，電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，用洗滌液(含0.02mol/L，pH7.4TBS、0.4%Tween20)室溫洗3次，浸入封閉液(含2%BSA的TBST)中37°C1h,洗滌液(TBST)室溫洗3次，加入抗-TNFa單克隆抗體為一抗，37°C孵育lh，TBST室溫洗3次，辣根過氧化酶標(biāo)記抗IgG為二抗，37°C孵育1h，TBST室溫洗3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入顯色液中，室溫避光顯色5min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染sig-tumstatin-linker-TNF基因的CHO細(xì)胞表達(dá)蛋白在約45ku(tumstatin-linker-TNF)處呈現(xiàn)強(qiáng)的特異反應(yīng)。根據(jù)我們的設(shè)計成熟的人TNF分子量約為17ku,人tumstatin分子量約為28ku，融合蛋白的分子量則應(yīng)約為45ku，Western檢測的結(jié)果(45ku)與預(yù)期一致，表明我們獲得了人tumstatin-linker-TNF融合蛋白，圖14中的2、4帶。10sig-TNF重組蛋白的Westernblot檢測，方法同上。Western檢測的結(jié)果在約17ku處呈現(xiàn)強(qiáng)的特異反應(yīng)，圖14中的1、3帶。11重組蛋白含量測定采用Lowry法。12.l細(xì)胞增殖抑制試驗96孔培養(yǎng)板每孔加100ul含5Xl(fECV304細(xì)胞的培養(yǎng)液(DMEM+0.5%FCS)，置37°C，5%C02，24h后，在培養(yǎng)箱過夜，棄去培養(yǎng)液，每孔加100ul含不同濃度t咖statin-linker-TNF或tumstatin或TNFa+DMEM+20%FCS樣品液，同時，以50wg/ml的endostatin作為陽性對照，PBS為空白對照，每個處理設(shè)三個平行重復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，在培養(yǎng)板中加入20PlMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4一6h，棄上清，每孔加IOOulDMSO至完全溶解后用酶標(biāo)儀檢測，波長為50nm。計算抑制率(％)=(A加對照—A實驗組)/A扣對照X100%或細(xì)胞生存率(％)-A實驗組ZA加，X100%。。結(jié)果表明tumstatin-linker-TNF融合蛋白顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖并呈劑量依賴性，EDs。約為5yg/ml。Tumstatin也抑制ECV304細(xì)胞增殖，其EDs。約為12yg/ml,比tumstatin-linker-TNF融合蛋白高2.4倍，TNF對ECV304增殖沒有明顯的抑制作用。12.2體外細(xì)胞殺傷試驗將小鼠成纖維細(xì)胞L929或ECV304細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用含1(^胎牛血清(FBS)的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為5X10Vml，鋪96孔平底塑料微量培養(yǎng)板中，每孔100ul，37°C，5%C02培養(yǎng)過夜，然后加入放線菌素D(50ul/孔，終濃度2ug/ml)和TNFa或tumstatin-linker-TNF融合蛋白溶液(50w1/孔，終濃度0.003-3ng/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品TNFa(5X107ug/fflg)按以105111起作1:IO稀釋作平行對照，37°C，5%0)2培養(yǎng)2011，在培養(yǎng)板中加入20ulMTT溶液定量。以能使50%細(xì)胞死亡的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)即為其活性單位。turastatin-linker-TNF融合蛋白和對照TNFa在放線菌素D的存在下與靶細(xì)胞孵育20h，兩者對ECV304細(xì)胞的殺傷活性相似，分別為3.4X106IU/mg和4.4X106IU/mg，對L929細(xì)胞的殺傷活性t咖statin-linker-TNF融合蛋白比TNFa低10倍，分別為4.6X106IU/mg和4.4X107IU/mg。12.3ECV304細(xì)胞粘附試驗將不同濃度的tumstatin-linker-TNF和TNFa包被96L板，每孔50ul(150mmol/LNaCl，50mmol/LNa3P04，pH7.3)，4°C過夜，用0.9。ANaCl洗滌后，加2WBSA+DEME液封閉，37°C放置45min，再用O.9WNaCl洗3次備用。收集對數(shù)生長期ECV304細(xì)胞，生理鹽水洗滌三次，DEME液懸浮ECV304細(xì)胞，每孔100P1ECV304細(xì)胞(3X1(/個細(xì)胞)加到上述tumstatin-linker-TNF和TNF包被的96孔板上，37°C，5%(:02孵育1~1.5h，用DEME洗去游離的細(xì)胞，然后用3%甲醛(pH7.3，2%蔗糖，PBS)固定，0.5%結(jié)晶紫染色，酶標(biāo)儀540nm波長讀取吸光度A值。結(jié)果表明，15Pg/mltumstatin-linker-TNF包被的板孔中有內(nèi)皮細(xì)胞，而TNFa包被的板孔中則很少或無內(nèi)皮細(xì)胞。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示融合蛋白tumstatin-linker-TNF的tumstatin部分正確折疊并結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附受體。12.4AnnexinV-FITC結(jié)合試驗5X1()6ECV304細(xì)胞的培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS)加入6孔培養(yǎng)板，置37°C，5%[02培養(yǎng)過夜，次日更換新鮮的DMEM+10%FBS并加入5wg/mltumstatin或100ng/mlt咖statin-linker-TNF或80ng/mlTNFa，對照加入相同量的PBS，18h后，收集細(xì)胞，3,000Xg離心，細(xì)胞用PBS洗滌后，按試劑盒說明書標(biāo)記AnnexinV-FITC和PI，標(biāo)記的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀計數(shù)，每個樣品計數(shù)15000個細(xì)胞，數(shù)據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)的CellQuest軟件分析。單純的AnnexinV-FITC陽性者為早、中期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI均陽性者為晚期凋亡或死亡細(xì)胞。結(jié)果表明tumstatin-linker-TNF(100ng/ml)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡的能力比t咖statin(5ug/ml)強(qiáng)50倍(圖15)。12.5管狀結(jié)構(gòu)形成試驗50ul稀釋的ECMatrixT"(C服MICON)加入96孔培養(yǎng)板，37°C孵育lh待ECMatrixTM凝固，將150iil不含抗生素的ECV304細(xì)胞接種到上述包被ECMatrixTM的培養(yǎng)板中，每孔含細(xì)胞數(shù)量為5X1()51X104個，然后加入不同濃度的t咖statin-linker-TNF或tumstatin或TNF。對照加入相同量的BSA。試驗重復(fù)三次。細(xì)胞在37°C，5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在l、2、4、8、12h時間點(diǎn)觀察不同處理組之間內(nèi)皮細(xì)胞管狀排列情況、單位面積內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量和完整程度的差異。具體過程和判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)InVitroAngiogenesisAssayKit說明書。與對照組比較，tumstatin-linker-TNF融合蛋白顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成并呈劑量依賴性效應(yīng)。5yg/mlBSA組管狀結(jié)構(gòu)形成百分率為23.0土3.1%，tumstatin-linker-TNF融合蛋白組為3.2±1.6%(P<0.01)(圖16)。tumstatin對內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的抑制能力不如tumstatin-linker-TNF，TNFa處理組對內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成沒有明顯影響12.6體內(nèi)抑瘤試驗無菌操作在BALB/c小鼠背部皮下以2X106接種H印G2細(xì)胞，等腫瘤長至60咖3隨機(jī)分成5組(每組5只)。腹腔注射tumstatin(5mg/kg/day)、t謹(jǐn)tatin-linker-TNF(lmg/kg/day或0.5mg/kg/day)或TNFa(0.3mg/kg/day)，PBS作對照，連續(xù)注射12d，試驗結(jié)束后處死小鼠，剝離瘤體，腫瘤稱重。小鼠體積。腫瘤體積根據(jù)下列公式計算腫瘤體積(mm3)=(長x寬2)/2。體重變化率=(治療后體重-治療前體重均值)/對照前體重均值xy。。從圖17可見，tumstatin處理組(5mg/kg/day)和高劑量turastatin-linker-TNF融合蛋白處理組(lmg/kg/day)的腫瘤體積相似，分別為230士11.6咖3和208±15.1mm3。然而，低劑量tumstatin-linker-TNF融合蛋白處理組(0.5mg/kg/day)表現(xiàn)出最好的抑瘤效果，其平均腫瘤體積是對照組的1/3(118±16.6mm3vs375±24.5mm3)。核苷酸和氨基酸序列表引物(人工序列)pl:5'-gccggatccccaggtttgaaaggaaaacgt-3'p2:5'-cggaagctttcagtgtcttttcttcat-3'p3:5，-gctgccgctcctgctggtgctcctggcggcggcgcccgcagccagcccaggtttgaaaggaaaac-3，p4:5'-attgctagcatgagcgcccggaccgcccccaggccgcaggtgctcctgctgccgctcctgctggtg-3,p5:5，-gatggatccaccagatccacctgagccaccaccgtgtcttttcttcatgcac-3，p6:5'-agatccacctgagccaccaccgtgtcttttcttcatgcac-3'p7:5'-ggtggctcaggtggatctggtgtcagatcatcttctcg-3'p8:5'-gatggatcctcacagggcaatgatcccaaagtag-3，p9:5'-attgctagcatgagcgcccggaccgccccc-3'P10:5，-tcgagaagatgatctgacgctggctgcgggcgccgc-3,pll:5，-gcggcgcccgcagccagcgtcagatcatcttctcg-3'pl2:5'-gcaggatcctcagtgtcttttcttcatgcac-3'pl3:5'-ctcgcccttgctcaccataccagatccacctgagcc-3'pl4:5,-ggctcaggtggatctggtatggtgagcaagggcgag-3.pl5:5，-aatggatcctcacttgtacagctcgtccatgcc-3，pl6:5'-ctcgcccttgctcaccatgctggctgcgggcgccgc-3'pl7:5，-gcggcgcccgcagccagcatggtgagcaagggcgag-3，Sig-tumstatin-linker-TNF核苷酸序列atgagcgcccggaccgcccccaggccgcaggtgctcctgctgccgctcctgctggtgctcctggcggcggcgcccgcagccagcccaggtttgaaaggaaaacgtggagacagtggatcacctgcaacctggacaacgagaggctttgtcttcacccgacacagtcaaaccacagcaattccttcatgtccagaggggacagtgccactctacagtgggttttcttttctttttgtacaaggaaatcaacgagcccacggacaagaccttggaactcttggcagctgcctgcagcgatttaccacaatgccattcttattctgcaatgtcaatg已tgtatgtaattttgc已tctcgaaatgattattcatactggctgtcaacaccagctctgatgccaatgaacatggctcccattactggcagagcccttgagccttatatsagcagatgcactgtttgtgaaggtcctgcgatcgccatagccgttcacagccaaaccactgacattcctccatgtcctcacggctggatttctctctggaaaggattttcattcatcatgttcacaagtgcaggttctgagggcaccgggcaagcactggcctcccctggctcctgcctggaagaattccgagccagcccatttctagaatgtcatggaagaggaacgtgcaactactattcaaattcctacagtttctggctggcttcatta犯cccagaaagEiEitgttcag^agcctattccEitc犯ctgtgaaagctggggaeitt3ga8L￡i￡i￡iataataagtcgctgtcaggtgtgcatgaagaaaagscactgaggtggtggctcaggtggatctggtgtcagatcatcttctcgaaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgcc已tcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccstctatctgggaggggtcttccagctgg卿agggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtgatumstatin-linker-TNF融合蛋白氨基酸序列ProGlyLeuLysGlyLysArgGlyAspSerGlySerProAlaThrTrpThrThrArgGlyPheValPheThrArgHisSerGinThrThrAlalieProSerCysProGluGlyThrValProLeuTyrSerGlyPheSerPheLeuPheValGinGlyAsnGinArgAlaHisGlyGinAspLeuGlyThrLeuGlySerCysLeuGinArgPheThrThrMetProPheLeuPheCysAsnValAsnAspValCysAsnPheAlaSerArgAsnAspTyrSerTyrTrpLeuSerThrProAlaLeuMetProMetAsnMetAlaProlieThrGlyArgAlaLeuGluProTyrlieSerArgCysThrValCysGluGlyProAlalieAlalieAlaValHisSerGinThrThrAsplieProProCysProHisGlyTrplieSerLeuTrpLysGlyPheSerPhelieMetPheThrSerAlaGlySerGluGlyThrGlyGinAlaLeuAlaSerProGlySerCysLeuGluGluPheArgAlaSerProPheLeuGluCysHisGlyArgGlyThrCysAsnTyrTyrSerAsnSerTyrSerPheTrpLeuAlaSerLeuAsnProGluArgMetPheArgLysProlieProSerThrValLysAlaGlyGluLeuGluLyslielieSerArgCysGinValCysMetLysLysArgHisGlyGlyGlySerGlyGlySerGlyValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHisValValAlaAsnProGinAlaGluGlyGinLeuGinTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGlyValGluLeuArgAspAsnGinLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeulieTyrSerGinValLeuPheLysGlyGinGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThrlieSerArglieAlaValSerTyrGinThrLysValAsnLeuLeuSerAlalieLysSerProCysGinArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProlieTyrLeuGlyGlyValPheGinLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAlaGlulieAsnArgProAspTyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGinValTyrPheGlylielieAlaLeuLinker連接臂核苷酸序列g(shù)gtggtggctcaggtggatctggtLinker連接臂氨基酸序列GlyGlyGlySerGlyGlySerGly權(quán)利要求1.一種重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體，是分泌型重組pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表達(dá)載體，其特征在于sig-tumstatin-linker-TNF融合基因序列atgagcgcccggaccgcccccaggccgcaggtgctcctgctgccgctcctgctggtgctcctggcggcggcgcccgcagccagcccaggtttgaaaggaaaacgtggagacagtggatcacctgcaacctggacaacgagaggctttgtcttcacccgacacagtcaaaccacagcaattccttcatgtccagaggggacagtgccactctacagtgggttttcttttctttttgtacaaggaaatcaacgagcccacggacaagaccttggaactcttggcagctgcctgcagcgatttaccacaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgaaatgattattcatactggctgtcaacaccagctctgatgccaatgaacatggctcccattactggcagagcccttgagccttatataagcagatgcactgtttgtgaaggtcctgcgatcgccatagccgttcacagccaaaccactgacattcctccatgtcctcacggctggatttctctctggaaaggattttcattcatcatgttcacaagtgcaggttctgagggcaccgggcaagcactggcctcccctggctcctgcctggaagaattccgagccagcccatttctagaatgtcatggaagaggaacgtgcaactactattcaaattcctacagtttctggctggcttcattaaacccagaaagaatgttcagaaagcctattccatcaactgtgaaagctggggaattagaaaaaataataagtcgctgtcaggtgtgcatgaagaaaagacactgaggtggtggctcaggtggatctggtgtcagatcatcttctcgaaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtga。2、一種重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體的制備方法，用VI型膠原a3鏈N端的信號肽序列基因克隆到腫瘤抑素和腫瘤壞死因子基因上，通過基因克隆在腫瘤抑素和腫瘤壞死因子之間加連接臂序列，構(gòu)成信號肽-腫瘤抑素-連接臂-腫瘤壞死因子融合基因序列，其特征在于具體步驟如下(1)克隆人tumstatin①RT-PCR克隆人tmnstatin全長編碼基因，人胚腎細(xì)胞株293細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，計數(shù)、離心收集細(xì)胞提取總RNA，Oligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈，取2y1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，上游引物P1，下游引物P2，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增tumstatin基因；②PCR擴(kuò)增tumstatincDNA產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接到pGEM-T載體，pGEM-T/tumstatin轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5a，小量抽提質(zhì)粒；(2)重組融合蛋白sig-tumstatin-linker-TNFPCR克?、貾CR擴(kuò)增sig-tumstatin-linker基因片段，上游引物P3，下游引物P5，以pGEM-T/tumstatin為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)純化回收試劑盒回收作為模板，再以上游引物P4，下游引物P6，行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即為攜帶NheI+BamHI酶切位點(diǎn)的sig-tumstatin-linker;②PCR擴(kuò)增linker-TNF片段，上游引物P7，下游引物P8，以PBV220-TNF為模板擴(kuò)增帶接頭的linker-TNF片段；③重疊區(qū)擴(kuò)增拼接法擴(kuò)增sig-tumstatin-linker-TNF，用高保真的PrimeSTARTMHSDNA聚合酶上游引物P4和下游引物P8，以sig-tumstatin-linker片段和linker-TNF片段為模板重疊區(qū)擴(kuò)增拼接法擴(kuò)增；(3)sig-TNF基因克隆用上游引物P9，下游引物PIO，pGEM-T/sig-tumstatin-linker為模板擴(kuò)增與TNF帶重疊區(qū)的sig+片段；②用上游引物P11，下游引物P8，以PBV220-TNF為模板擴(kuò)增與sig帶重疊區(qū)的TNF+片段；(D用上游引物P9和下游引物P8以sig+片段和TNF+片段為模板重疊區(qū)擴(kuò)增拼接法擴(kuò)增得到sig-TNF;(4)sig-tumstatin片段PCR擴(kuò)增，上游引物P9和下游引物P12，pGEM-T/sig-tumstatin-linker為模板擴(kuò)增；(5)sig-tumstatin-linker-EGFP和sig-EGFP片段PCR擴(kuò)增①與EGFP有重疊區(qū)的sig-tumstatin-linker片段擴(kuò)增，上游引物P9和下游引物P13，pGEM-T/sig-tumstatin-linker為模板，產(chǎn)物命名為a;②與sig-tumstatin-linker有重疊區(qū)的EGFP片段擴(kuò)增，用上游引物P14，下游引物P15，pEGFP-C2為模板，產(chǎn)物命名為b;③與EGFP有重疊區(qū)的sig片段擴(kuò)增，用上游引物P9,下游引物P16,pGEM-T/sig-tumstatin-linker為模板，產(chǎn)物命名為c;與sig有重疊區(qū)的EGFP片段擴(kuò)增，用上游引物P17和下游引物P15，pEGFP-C2為模板，產(chǎn)物命名為d;⑤sig-t腿tatin-linker-EGFP片段擴(kuò)增(即ab片段)，用P9和P15為引物，a和b片段為模板，sig-EGFP片段擴(kuò)增(即cd片段)，用P9和P15為引物，c和d片段為模板；98°C，10s(變性)；68°C，5min(退火、擴(kuò)增)，進(jìn)行30個循環(huán)，再于68。C延伸5min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行0.87。瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收相應(yīng)產(chǎn)物ab、cd片段。3、根據(jù)權(quán)利要求2用VI型膠源a3鏈N端的信號肽序列基因克隆到腫瘤抑素和腫瘤壞死因子基因上的的制備方法，其特征是重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子融合蛋白的PCR反應(yīng)管組成為5XPrimeSTARbuffer+MgC1210iU2.5mMdNTPs4u1P4(20mM)0.5"P8(20mM)0.5Ulsig-tumstatin-linker片段1tiIlinker-TNF片段1U1高保真的PrimeSTARTMHSDNA聚合酶(2.5U/u1)0.5w1ddH2032.5u1總計50yl。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體及其制備方法和用途，其特征是重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-EGFP、pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-EGFP、pIRESneo3/sig隱tumstatin、pIRESneo3/sig-TNF、pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的構(gòu)建；克隆的基因片段sig-EGFP、sig曙tumstatin隱linker-EGFP、sig隱tumstatin、sig-TNF、sig-tumstatin-linker-TNF經(jīng)NheI十BamHI雙酶切，同樣酶切pIRESneo3質(zhì)粒，利用T4DNA連接酶將酶切的基因片段與酶切的pIRESneo3質(zhì)粒載體連接連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，小量制備重組質(zhì)粒。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體及其制備方法和用途，其特征是重組質(zhì)粒pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-EGFP、pIRESneo3/sig-tumstatin、pIRESneo3/sig-TNF、pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，重組質(zhì)粒用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)G418最佳藥敏濃度濃度為600mg/L的篩選，轉(zhuǎn)染pIRESneo3/sig-EGFP、IRESneo3/sig-tumstatin-linker-EGFP的單克隆CHO細(xì)胞顯示有綠色熒光，說明分泌表達(dá)成功，分別挑取單克隆純培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染pIRESneo3/sig-TNF、pIRESneo3/sig-tumstatin-Unker-TNF基因的CHO細(xì)胞RT-PCR和培養(yǎng)上清液經(jīng)Westernblot檢測鑒定，陽性細(xì)胞挑取單克隆純培養(yǎng)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體及其制備方法和用途，其特征是linker連接臂，其具有g(shù)gtggtggctcaggtggatctggt的DNA序列，其表達(dá)具有GlyGlyGlySerGlyGlySerGly的氨基酸序列，相應(yīng)的融合基因有tumstatin-linker、sig-tumstatin國linker、-inker-TNF。7、一種重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體的用途，其特征在于重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要一種重組腫瘤抑素-腫瘤壞死因子分泌型真核表達(dá)載體及其制備方法和用途公開了腫瘤抑素(tumstatin)與人腫瘤壞死因子(TNF-α)分泌型真核表達(dá)載體及融合蛋白制備方法，tumstatin-TNF分別能與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面α_vβ₃受體和腫瘤細(xì)胞死亡受體高度特異的相互作用。采用分步克隆法構(gòu)建分泌型腫瘤抑素與人腫瘤壞死因子融合基因載體并在真核細(xì)胞中表達(dá)。通過腫瘤抑素與腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面α_vβ₃受體結(jié)合，特異地殺傷腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤和抑制腫瘤血管的作用。文檔編號A61P35/00GK101265482SQ20081002504公開日2008年9月17日申請日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者姚麗娟,羅以勤,亮趙申請人:羅以勤;趙亮;姚麗娟