專利名稱：一個小分子非編碼RNA基因hsa-miR-101及其抗腫瘤用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個與原發(fā)性肝癌相關(guān)的小分子非編碼RNA基因hsa-miR-101，以及該基因在 輔助診斷與治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌方面的用途。該發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。技術(shù)背景原發(fā)性肝細(xì)胞癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的主要發(fā)生地，肝癌 的發(fā)生率高達(dá)十萬分子三十五。近年來肝癌發(fā)病率有明顯上升的趨勢，嚴(yán)重危害人類的健康 與生命安全。微小RNA (microRNA)是廣泛存在于各種生物物種內(nèi)的一類小分子非編碼的核糖核酸， 其長度約為20-22個堿基。它不編碼蛋白質(zhì)或多肽，而是通過與靶基因的mRNA(信使RNA) 的3'UTR (3'端非翻譯區(qū))的特異性結(jié)合，促進(jìn)其降解或抑制其翻譯過程來實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá) 的調(diào)控。許多證據(jù)表明，microRNA參與了細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，其自身調(diào)控的異常直接 影響著惡性腫瘤的發(fā)病及惡化。由于microRNA與腫瘤發(fā)生的密切關(guān)系，它們在腫瘤診斷和 治療中可能具有極為廣闊的應(yīng)用前景。我們首先利用cDNA芯片技術(shù)高通量檢測了 HCC與對照標(biāo)本中存在的miRNA表達(dá)改 變。通過比較癌與非癌肝組織中miRNA表達(dá)譜的差異，我們鑒定了41個在肝癌中表達(dá)發(fā)生 顯著改變的miRNA，并選取了其中的hsa-miR-101進(jìn)行較深入的功能探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn) hsa-miR-101在70%以上的HCC病例中以及所有肝癌細(xì)胞株中均低表達(dá)，提示hsa-miR-101 可能具有抑癌基因活性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)hsa-miR-101可提高腫瘤細(xì)胞對血 清饑餓和多種化療藥物包括curcumin、 etoposide和doxorubicin的敏感性。我們還發(fā)現(xiàn)， hsa-miR-101可有效抑制腫瘤細(xì)胞體外的集落形成能力以及體內(nèi)的成瘤能力。這些結(jié)果表明 hsa-miR-101不僅可作為臨床上肝癌診斷的輔助指標(biāo)，而且在肝癌治療中有著非常廣闊的應(yīng) 用前景。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，至今未見有關(guān)hsa-miR-101與原發(fā)性肝癌的研究報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種能有效抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的小分子RNA基因 hsa-miR-101，及其在原發(fā)性肝癌診斷和治療方面的用途。該基因成熟體序列有以下核苷酸組成5， -AUGUCAUUUAAUUACUUAAGC-3，首先，本發(fā)明的小分子RNA基因hsa-miR-101在大多數(shù)肝癌組織中下調(diào)明顯，因此在肝 癌的臨床診斷及預(yù)后判斷方面，有重要的參考意義；其次，本發(fā)明的小分子RNA基因可以有效降低肝癌細(xì)胞的增殖及成瘤能力，可有效促進(jìn) 肝癌細(xì)胞對血清饑餓及各種化療藥物的敏感性，因此是一種全新作用機(jī)制的抗腫瘤藥物，在 肝癌治療中有極為重要的應(yīng)用前景。


圖I: Northern blot檢測hsa-miR-l 01的表達(dá)水平。A, hsa-miR-101在不同細(xì)胞株，人非肝癌組織(N699) 以及成年小鼠正常肝(mLiv)中的表達(dá)水平；B， hsa-miR-101在成對的肝癌(T)與癌旁(P)組織中表 達(dá)水平的比較。圖2: hsa-iniR-101能提高細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性。A，在血清饑餓環(huán)境下，過表達(dá)hsa-miR-101促進(jìn) HepG2細(xì)胞的凋亡；B，過表達(dá)hsa-miR-101后HepG2在血清饑餓時的細(xì)胞活力明顯下降；C，在血清饑 餓環(huán)境下，過表達(dá)hsa-miR-101導(dǎo)致HepG2細(xì)胞caspase-3/7活性提高，此作用可被hsa-miR-101的抑制 劑回復(fù)，D， hsa-miR-101導(dǎo)致不同肝癌細(xì)胞株對血清饑餓誘導(dǎo)的凋亡敏感；E， hsa-miR-101促進(jìn)HepG2 細(xì)胞在不同化療藥物刺激下的凋亡，其中用etoposide, curcumin及doxorubicin的處理濃度和時間分別為 1.5ng/ml, 48 hrs; 12.5nM， 48hrs; 0.2嗎/ml， 36hrs。關(guān)于實(shí)驗(yàn)組組間差異的比較，除圖中用"門"明 確標(biāo)識的比較組別外，其余均是對hsa-miR-101與平行的細(xì)胞組或NC進(jìn)行的比較。數(shù)據(jù)來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001。圖3:過表達(dá)hsa-miR-101顯著抑制了H鄰G2細(xì)胞在裸鼠的皮下成瘤能力，圖示4周后腫瘤的形成情況 代表圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，來進(jìn)一步說明本發(fā)明。需要注意的是，以下實(shí)施例只用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述的hsa-miR-101可以采用常規(guī)的化學(xué)合成方式 合成。實(shí)施例1: hsa-miR-101在肝癌組織標(biāo)本中表達(dá)水平的檢測從肝癌及非癌肝組織中提取總RNA， RNA樣品與RNA上樣緩沖液按3:1比例混合后， 80'C變性10min，然后置于冰上5min;用微量加熱器迅速上樣后，在10W的電功率下，用15% 的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行約40min電泳分離；電泳完成后凝膠切角做好標(biāo)記，將凝膠和膜 按順序組裝到半干轉(zhuǎn)印槽里，恒流8mA/cii^轉(zhuǎn)膜l小時；取下HybondN+尼龍膜并切角做好 標(biāo)記，70,00(HJ/cmSuV交聯(lián)，再真空8(TC干烤2h;用2X SSC潤濕尼龍膜后，平鋪到雜交管 內(nèi)壁，并趕走膜與管壁間的氣泡，加入預(yù)雜交液，放入雜交箱，37'C最低速旋轉(zhuǎn)過夜；然后 加入50ul標(biāo)記好的探針( lX107cpm/ml)雜交過夜；雜交完畢后用洗膜液洗膜三次，每次 5min，對于microRNA的檢測要用非嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南茨ひ?，對于U6的檢測則用嚴(yán)謹(jǐn)洗膜液；用保鮮 膜把洗完的膜包好，壓磷屏和掃描。各樣品中目的條帶的強(qiáng)度用GeneTools software (version3.03, SynGene, Cambridge, UK)進(jìn)行分析。通過Northemblot方法我們檢測了多種肝癌細(xì)胞株及肝癌組織標(biāo)本中hsa-miR-101的表達(dá) 情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種肝癌組織及肝癌細(xì)胞株中，hsa-miR-101的表達(dá)均明顯降低(附圖1)。實(shí)施例2: hsa-miR-101過表達(dá)把hsa-miR-101的小分子RNA導(dǎo)入細(xì)胞是通過釆用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine RNAi MAX來進(jìn)行反轉(zhuǎn)而實(shí)現(xiàn)的，以24孔板為例，其他孔板可根據(jù)孔的大小 按比例放大或者縮小胰蛋白酶消化細(xì)胞，重懸于含有10%FBS的無雙抗DMEM培養(yǎng)基中， 使得細(xì)胞密度為3Xl(^個細(xì)胞/ml;將小分子RNA稀釋于lOOpl opti-MEM中，輕敲管壁混 勻；每管加入lpl Lipofectamine RNAi MAX,輕敲管壁混勻，室溫放置15min;將RNAi MAX/siRNA稀釋液加入24孔板中，然后再加入50(^1細(xì)胞稀釋液(使細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染24h 后大約為30-50%匯合)，混勻后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后進(jìn)行相關(guān)功能檢測。實(shí)施例3:細(xì)胞凋亡檢測按需要處理細(xì)胞后吸去培養(yǎng)上清，用4X多聚甲醛室溫固定15min后，用lpg/ml (終濃 度)的DAPI染液室溫染色5min，再于萊卡熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。染色質(zhì)固縮和 DNA發(fā)生斷裂的細(xì)胞均認(rèn)為是發(fā)生凋亡的細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率按以下的方法計算細(xì)胞凋亡率(％)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)(總細(xì)胞數(shù)2500個)我們檢測了在血清饑餓及化療藥物處理?xiàng)l件下hsa-miR-101對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞(美國ATCC)中過表達(dá)hsa-miR-101實(shí)驗(yàn)組在血清饑餓48h后凋亡率是 陰性對照(NC)組或平行的HepG2組的 2倍，而饑餓72h后凋亡率差異進(jìn)一步上升，過 表達(dá)hsa-miR-101使得細(xì)胞凋亡率提高了接近3倍(圖2A)。結(jié)果提示hsa-miR-101可增加HepG2細(xì)胞對血清饑餓誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)的敏感性。用Alamar Blue檢測血清饑餓后HepG2的 生長狀況發(fā)現(xiàn)在血清饑餓下hsa-miR-101組的生長活力大幅度下降(圖2B),提示了 hsa-miR-101具有使細(xì)胞對血清饑餓更敏感的作用。通過檢測caspase-3/7的活性也可以進(jìn)一 步說明我們結(jié)果的可靠性(圖2C)。對其他肝癌細(xì)胞株QGY-7703(美國ATCC)和 SMMC-7721(美國ATCC)進(jìn)行血清饑餓的處理，同樣也觀察到了 hsa-miR-101的促凋亡效呆 (圖2D)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-101過表達(dá)可顯著提高HepG2細(xì)胞對etoposide、 M curcumin和doxorubicin等化療藥物的敏感性(圖2E)，提示hsa-miR-101可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞 對某些化療藥物的耐藥性，可以作為未來腫瘤治療的潛在藥物。實(shí)施例4:裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)利用RNAiMAX反轉(zhuǎn)50nM的hsa-miR-101或NC到HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)48h后用胰酶消 化并計數(shù)后按lXl()S個/ml的濃度用PBS懸浮。選用9只5周齡的BALB/c裸鼠，在其兩只 后腿部分別皮下注射1 X 105或5X 104過表達(dá)hsa-miR-101或NC的H印G2細(xì)胞。連續(xù)觀察 并測量腫瘤的生長及大小至1個月以上。小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)hsa-miR-101可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能 力，提示hsa-miR-101具有類似腫瘤抑癌因子的基因活性(圖3和4)。由此可見，本發(fā)明中的hsa-miR-101不僅在體外實(shí)驗(yàn)中可有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，逆轉(zhuǎn) 肝癌細(xì)胞的耐藥，而且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也可有效抑制肝癌腫瘤的形成。因此hsa-miR-101可以 作為未來腫瘤治療的潛在藥物。本發(fā)明具有實(shí)用性的例證(1) 本發(fā)明所提供的小分子RNA基因hsa-miR-101可用于肝癌患者，特別是耐藥肝癌患 者的輔助治療；(2) 可以利用本發(fā)明所介紹的研究該類小分子非編碼RNA基因功能的方法，篩選鑒定其 它腫瘤相關(guān)miRNA基因，促進(jìn)新的抗肝癌藥物的發(fā)現(xiàn)；(3) 可以篩選鑒定有效調(diào)控hsa-miR-101的藥物，尋找具有調(diào)節(jié)hsa-miR-101分子加工表 達(dá)的活性分子藥物；(4) hsa-miR-101分子很可能還參與了其他類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。因此，本發(fā)明對今 后深入研究hsa-miR-101分子與其他腫瘤的關(guān)系提供了經(jīng)驗(yàn)和應(yīng)用基礎(chǔ)。序列表<110>中山大學(xué)<120> —個小分子非編碼RNA基因hsa-miR-101及其抗腫瘤用途<160> 1<210> 1 <211> 11 <212> RNA<400> 1augucauuua auuacuuaag c
權(quán)利要求
1.一種分離核酸，具有SEQ ID NO1所示的序列。
2. 權(quán)利要求l所述的核酸作為治療腫瘤的藥物的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸作為治療腫瘤的藥物的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為原發(fā) 性肝細(xì)胞癌。
4. 權(quán)利要求1所述的核酸作為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的核酸作為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與原發(fā)性肝細(xì)胞癌相關(guān)的小分子RNA基因hsa-miR-101及其應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種分析小分子RNA基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的方法，以及小分子RNA基因hsa-miR-101在原發(fā)性肝癌治療方面的用途。本發(fā)明的目的是提供小分子RNA基因hsa-miR-101作為腫瘤治療性藥物的應(yīng)用，本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK101333524SQ20081002901
公開日2008年12月31日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者莊詩美, 楊建榮, 楊金娥, 程家森, 杭 蘇 申請人:中山大學(xué)