專(zhuān)利名稱(chēng)：一全人源重組抗-IgE抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一新的全人源重組抗-IgE抗體， 及其用途。
技術(shù)背景一般來(lái)講，在正常情況下人體免疫系統(tǒng)能夠通過(guò)分泌特異性抗體抵御外來(lái)分子、病 毒和有機(jī)體的侵入，從而維護(hù)人的身體健康。然而，分泌的免疫球蛋白有時(shí)也會(huì)對(duì)抗人 體本身，從而引發(fā)一種稱(chēng)為變態(tài)(過(guò)敏)反應(yīng)的疾病。變態(tài)反應(yīng)根據(jù)引發(fā)的過(guò)程不同通 常分為I-IV四種類(lèi)型。I型變態(tài)反應(yīng)是一種典型的變態(tài)反應(yīng)，是由免疫球蛋白E(IgE) 介導(dǎo)，其致病機(jī)理IgE分子通過(guò)其Fc區(qū)與組織中的肥大細(xì)胞或血液中的嗜堿細(xì)胞上的 Fc受體(FcsRl)結(jié)合，刺激這些細(xì)胞釋放出組胺、白三烯等各種生物活性介質(zhì)，從而 引起機(jī)體產(chǎn)生多種過(guò)敏反應(yīng)，如哮喘、水腫等。I型變態(tài)反應(yīng)幾乎占了全球變態(tài)反應(yīng)的 25% 。變態(tài)反應(yīng)機(jī)理的研究表明如果阻斷IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合就 可能預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)疾病。例如，采用一種攜帶毒素的抗-IgE抗體可以選擇性地清 除IgE分泌細(xì)胞(Japanese Un-examined Patent Publication No. 102032 (1989)).另有報(bào)道應(yīng) 用一種單克隆抗體與Fc受體結(jié)合(Japanese Un-examined Patent Publication Nos. 289100 (1986) and 127977 (1991))或采用一種抗體與IgE抗體自身的Fc區(qū)結(jié)合也可以抑制IgE 抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的結(jié)合.(T. W. Chang et al., BIO/TECHNOLOGY, vol. 8， 122-126,(1990》.自IgE抗體和FcsRI受體的鑒定和特性描述報(bào)道以來(lái)，相當(dāng)多的研究集中在對(duì)兩者 間的相互作用結(jié)構(gòu)域的研究，特別是對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的研究以希望通過(guò)阻斷IgE與其Fc 受體的結(jié)合，找到一種通用的治療變態(tài)反應(yīng)疾病的方法。這些治療方案包括對(duì)重組蛋白 質(zhì)/多肽和核酸的篩選、設(shè)計(jì)和化學(xué)合成多肽、開(kāi)發(fā)人源化抗-IgE抗體以及誘導(dǎo)自身抗 體應(yīng)答從而對(duì)抗IgE的受體結(jié)合位點(diǎn)。雖然迄今已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多分子，但是最新研究表 明抗-IgE抗體是阻斷IgE- FcsRI相互作用的有效途徑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一全人源重組抗IgE抗體，以克服現(xiàn)有技術(shù) 的不足。本發(fā)明需要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種編碼上述全人源重組抗IgE抗體的 DNA分子。本發(fā)明需要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種上述抗體在制備治療變態(tài)反應(yīng)疾病 的藥物中的用途。本發(fā)明還需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種藥物組合物，含有上述抗體和藥學(xué)上可接 受的載體。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明一全人源重組抗-IgE抗體，其特征在于，所述抗體的 重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的CDR的氨基酸序列 SEQ ID NO:5所示的CDR1 ， SEQ ID NO:6所示的CDR2， SEQ ID NO:7所示的CDR3，該抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一全人源重組抗-IgE抗體，其特征在于，所述抗體的輕鏈可變區(qū)的 互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的CDR的氨基酸序列 SEQ ID NO:8所示的CDR1 ， SEQ ID NO:9所示的CDR2， SEQ ID NO: 10所示的CDR3，該抗體的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一全人源重組抗-IgE抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)鏈和輕鏈可變區(qū)鏈分別具有SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如單鏈抗體片段 (scFv)， Fab,Fab'或F(ab')2片段，抗體重鏈，抗體輕鏈。本發(fā)明提供的抗體還包括該抗體融合其他蛋白質(zhì)，多肽或有小分子標(biāo)記所形成的產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了編碼上述抗體或其片段的DNA分子。本發(fā)明的抗體的核苷酸酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量的獲得有關(guān)的序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)的方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA 序列，然后將該DNA序列引入本領(lǐng)域已知的各種現(xiàn)有DNA分子(或者如載體)和細(xì) 胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使能夠表達(dá)蛋白。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞，或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真菌細(xì)胞如酵母； CHO、 COS7或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法 處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方 法.-磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)的方法培養(yǎng)，獲得本發(fā)明基因編碼的多肽。根據(jù)所用的宿 主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培 養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘 導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其他特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。 這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。包括但不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑 處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方 法的結(jié)合。本發(fā)明提供了一種藥物組合物，含有所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可 接受的載體應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的抗體相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低藥 物組合物的效果，藥物制劑與給藥方式相匹配。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑 給藥，其中包括但不限于肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或局部給藥?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是鹽水、緩沖液，糖類(lèi)， 如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基 纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；麥芽、明膠；滑石；固體潤(rùn)滑劑，如硬脂酸和硬 脂酸鎂；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如 丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇，海藻酸；乳化劑，如Tweem潤(rùn)濕劑， 如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無(wú)熱原水；等滲鹽溶 液；和磷酸鹽緩沖液等。本發(fā)明所提供的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型并可由醫(yī)師根據(jù)患者年齡、體重和 大致疾病狀況，給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用，本發(fā)明的抗體還可以 與其他治療劑一起使用。本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明的抗體具有很高的親和力且是全人源的抗體，在臨 床上具有很重要的價(jià)值。


圖1:采用濾紙粘附克隆顯色法鑒定的15個(gè)克隆菌株的ELISA篩選結(jié)果 圖2: pEX-Fc-6抗體與Fc區(qū)結(jié)合的稀釋曲線。 圖3:抗體親和力的檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"和"免疫球蛋白"是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓 的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈((H)組成。每條輕鏈通過(guò)一 個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條 重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒 定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè) 恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可 變區(qū)之間形成界面。本文所用的術(shù)語(yǔ)"可變"表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗 體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片 段中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)((FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四 個(gè)FR區(qū)，它們大致上呈p—折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)CDR相連，在某些情況下 可形成部分p折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的CDR通過(guò)FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR 一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見(jiàn)Kabat等，NIH Publ. No. 91-3242,巻I， 647-669頁(yè) (1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如 參與抗體依賴于細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。脊椎動(dòng)物抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不 同的兩類(lèi)(稱(chēng)為k和入).)中的一類(lèi)。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分 為不同的種類(lèi)。主要有5類(lèi)免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步 分成亞類(lèi)(同種型)，如IgGI, IgG2， IgG3， IgG4， IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類(lèi)免疫球蛋白的 重鏈恒定區(qū)分別稱(chēng)為a、 p、 s、 |a、 Y。不同類(lèi)免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾 所周知的。下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是 為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)施例1來(lái)源于兩例自身免疫疾病患者的人源單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建人源單鏈抗體(scFv)庫(kù)的構(gòu)建是采用He等人(He et al. Methods Mol Biol 2004, 248:177-189)報(bào)道的PCR引物從兩例患有自身免疫疾病患者的外周血液中制備而來(lái)。 一個(gè)(His)6標(biāo)簽也被組裝到結(jié)構(gòu)的C-末端以便于對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。人源免疫球蛋白E的Fc區(qū)域的制備方法采用40。/。飽和(NH4)2 S04溶液在pH7.0室 溫下沉淀IgE抗體，然后應(yīng)用木瓜蛋白酶水解IgE抗體，再經(jīng)離子交換等層析法分離制 備而來(lái)。采用如下所示的引物，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR方法制備抗體重鏈和輕鏈庫(kù)。 重鏈引物(1) HuVH/B: 5,-CAG GT(c/g) CAG CTG G(t/a)G (c/g)AG TC(t/c) GG-3(2) HuJH/F: 5，-TGA GGA GAC GGT GAC CA(t/g) GGT CCC-3連接序列引物(3) Linker/B: 5，陽(yáng)GGGACC (a/c)TGGTC ACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCTCTGG-3(4) Linker/F: 5'-TTGCCACCGCCAGAACC-3K-輕鏈引物(5) HuVk/B: 5，-GGT TCT GGC GGT GGC AAA GA(a/c) AT(c/t) (g/a)TG (a/c)TG AC(c/g/t) CAG TCT CC-3(6) HuCk/F: 5，-CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT-3;n鏈引物(7) HuWB: 5，-GGT TCT GGC GGT GGC AAA CAG卿CT GTG CTG ACT CAG CC(g/c) CC-3(8) HuC入/F: 5'陽(yáng)AGA TTC TGT AGG GGC CAC TGT C-3通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR方法制備抗體重鏈和輕鏈庫(kù)。然后應(yīng)用PCR組裝技術(shù)，借助一 種與重鏈和輕鏈有重復(fù)交差的(GGGS)4蛋白連接序列將抗體重鏈和輕鏈組裝在一起。為 了將scFv基因庫(kù)克隆到含PelB信號(hào)肽序列和His標(biāo)簽的修飾質(zhì)粒中表達(dá)，通過(guò)設(shè)計(jì)特 定的引物在scFv中引入了 Xhol和XbaI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。scFv的PCR文庫(kù)與 設(shè)計(jì)的表達(dá)載體分別經(jīng)Xhol和Xbal兩個(gè)限制性內(nèi)切酶消化后，在體外通過(guò)T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)入五.co/f Xl-blue的感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后的細(xì)胞涂布 于含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)平板上。經(jīng)37'C過(guò)夜培養(yǎng)后大約挑選5000個(gè)克隆，然后通 過(guò)如下描述的濾紙粘附克隆顯藍(lán)反應(yīng)法(colony filter lift method)對(duì)克隆子進(jìn)行功能篩 選。實(shí)施例2:應(yīng)用濾紙粘附克隆顯藍(lán)反應(yīng)法篩選抗人IgE (Fc)的抗體濾紙粘附克隆顯藍(lán)反應(yīng)法的具體步驟為待瓊脂平板上生長(zhǎng)出￡.co/Z菌落后，將一 張PVDF膜(Millipore type GVWP， pore size 0.22um)輕輕地鋪蓋在菌落表層，使菌落被 轉(zhuǎn)移到膜上。用10ug/ml的Fc抗原包被第二張PVDF膜(Immobilon-P, Millipore Corp)， 并用含3% BSA的PBS溶液封閉該P(yáng)VDF膜，然后將含有轉(zhuǎn)移菌落的第一張PVDF膜 置于第二張PVDF膜上，其菌落面向上。隨后將含有菌落的雙膜平鋪于含ImMIPTG和 lOOug/ml of ampicillin的新鮮瓊脂平板上并將鋪墊雙層膜后的平板置于25-30。C過(guò)夜培 養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，移去第一張含菌落的PDVF膜并將該膜重新置于新的瓊脂平板上，于 4。C保存供下一步后選菌落的回收。接著從平板上輕輕地移出第二張膜，立刻用含0.05% Tween 20的PBS緩沖液洗滌3次，共10分鐘。檢測(cè)是采用抗-His HRP抗體偶聯(lián)物(Sigma公司產(chǎn)品)完成，其中偶聯(lián)物需預(yù)先用含1%牛血清蛋白(BSA)的PBS溶液按1:4000 比例稀釋?zhuān)悸?lián)物與膜孵育1小時(shí)。室溫用含0.05% Tween 20的PBS緩沖液洗滌3次， 再用化學(xué)發(fā)光試劑(如Piece公司試劑)對(duì)膜進(jìn)行暴光、檢測(cè)和分析。約100個(gè)克隆菌落在抗-(His)6偶聯(lián)物的檢測(cè)背景中顯出陽(yáng)性信號(hào)。這些陽(yáng)性克隆被 挑選出來(lái)并置于瓊脂平板中再培養(yǎng)。采用濾紙粘附克隆顯藍(lán)反應(yīng)法重復(fù)三次篩選，大約 15個(gè)克隆菌落連續(xù)顯示陽(yáng)性信號(hào)。這些克隆菌落被挑取出供進(jìn)一步的ELISA分析。實(shí)施例3:采用ELISA法分析克隆菌落功能 用100ul的10ug/ml IgE (Fc)抗原包被ELISA檢測(cè)孔，并將該板于4'C過(guò)夜放置。 從￡ co7/外周質(zhì)分離提取抗-IgE單鏈抗體(ScFv)，然后將該單鏈抗體加入到上述 抗原包被的孔中。陰性對(duì)照采用沒(méi)有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的￡ "7i外周質(zhì)提取液。室溫孵育ELISA 檢測(cè)板1小時(shí)后，用含0. 05% TVeen 20的PBS洗滌緩沖液洗漆板孔3次，然后加入1: 4000 比例稀釋后的抗-His冊(cè)P抗體偶聯(lián)物(Sig脇公司產(chǎn)品)于室溫進(jìn)一步孵育1小時(shí)。再用 含0. 05% Tween 20的PBS洗滌緩沖液洗滌孔板3次，向孔內(nèi)加入Sigma等公司的ELISA 顯影試劑顯色，然后通過(guò)加入100ul IN HC1終止顯色反應(yīng)，用ELISA酶標(biāo)儀于4S0nm 波長(zhǎng)讀數(shù)。從15個(gè)克隆菌中挑選出對(duì)IgE (Fc)顯示最強(qiáng)結(jié)合的pEX-Fc-6陽(yáng)性克隆菌 供進(jìn)一步的深入研究，結(jié)果見(jiàn)圖1。然后通過(guò)稀釋法檢測(cè)其對(duì)Fc區(qū)的結(jié)合相關(guān)性，結(jié) 果見(jiàn)圖2。供親和力檢測(cè)的pEX-Fc-6抗體被表達(dá)并應(yīng)用Ni-柱親和層析等方法進(jìn)行純化。采用 P正CE公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)分析試劑定量檢測(cè)純化后的pEX-Fc-6產(chǎn)物和Fc片段。 使用Friguet報(bào)道的方法[Friguet, et al., (1985) J. Immunol. Methods. 77， 305-319]，在平衡 狀態(tài)下通過(guò)對(duì)溶液中結(jié)合與非結(jié)合pEX-Fc-6產(chǎn)物的分析來(lái)檢測(cè)抗體的親和力。親和力 檢測(cè)方法的基本操作，將純化后的pEX-Fc-6產(chǎn)物與含有不同濃度的IgE Fc抗原溶液進(jìn) 行孵育，直至兩者的結(jié)合達(dá)到平衡狀態(tài)。然后移出溶液中含非結(jié)合抗體的溶液，并通過(guò) 上述經(jīng)典的ELISA方法檢測(cè)移出溶液中的抗體含量。圖3中為pEX-Fc-6抗體的檢測(cè)結(jié) 果，其親和力達(dá)到1(T7M-1(TSM。實(shí)施例4: DNA序列檢測(cè)從pEX-Fc-6克隆菌中提取質(zhì)粒DNA并完成DNA序列的檢測(cè)。序列分析結(jié)果表明 VH片段來(lái)自人VH1區(qū)家族，而Vk片段人來(lái)自VK1區(qū)家族。在CDRs區(qū)上也檢測(cè)出 許多點(diǎn)突變。根據(jù)系譜，結(jié)果如下SEQ ID N0:4顯示了其輕鏈可變區(qū)基因序列(5'到3' )312bp，其氨基酸序列顯示在SEQ ID NO:2中；SEQ ID N0:3顯示了重鏈可變區(qū)基因 序列((5'到3')399 bp)，其氨基酸序列顯示在SEQIDNO:l中。以下是測(cè)定的核酸序列 和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列-重鏈可變區(qū)
MEVGIiEESGAEVKKPGASVK
VSCKASEYTFT G Y Y M H WV R Q
CDR1
APGQGLEWMG WINPTSGGPV
300
YM E
S R
R S
DTAVYYCAR
V
ILFGRAFD IWGQGTMVTVSS CDR3
GGGAGUGCGUCCGCCCCAACCCUUUUCCCCCUCGUCUCC GSASAPTLFPLVS
輕鏈可變區(qū)
MTQSPSSVSASVGDRVT工TC
120
RA S G G
S S W Ii VWY Q Q
K
P G K ACDR1
P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S
CDR2
GGGSGTDFT!jT工SSLGPEDF
A T Y Y C Q Q A I T F P R T F G Q G T K
CDR3
GUGGAGAUCAAAC 312 VE I K
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即 在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。序列表
<110>中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所 <120> —人源重組抗-IgE抗體 <160> 10
<170> Patentln version 3.1
<210> 1 <2U>
<212> PRT <213>人工序列
<220>
<221 > misc—feature
<222> (1)…(133)
<223>重鏈可變區(qū)氨基酸序列
<400> 1
Met Glu Val Gin Leu Glu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Glu Tyr Thr Phe Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Trp lie Asn Pro Thr Ser Gly Gly Pro Val Tyr Ala Gin Lys
50 55 60
Phe Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Met Asp Thr Ser Phe Thr Thr Ala 65 70 75 80Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Ie Leu Phe Gly Arg Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu
115 120 125
Phe Pro Leu Val Ser 130
<210>2 <211> <212>PRT <213>人工序列
<220>
<221 > misc一featoe
<222> (1)…(104)
<223>輕鏈可變區(qū)氨基酸序列
<400> 2
Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
5 10 15
Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Val Trp
20 25 30
Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser 50 55 60Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala lie Thr Phe Pro Arg Thr Phe Gly
85 90 95
Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
<210> 3 <211>
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221 > misc—feature
<222> (1)...(399)
<223>重鏈可變區(qū)核苷酸序列
<400> 3
AUGGA GGUGC AGCUC GAGGA GUCUG GAGCU GAGGU GAAGA AGCCU GGGGC CUCAG UGAAG 60
GUCUC CUGCA AGGCU UCUGA AUACA CCUUC ACCGG CUACU AUAUG CACUG GGUGC GACAG 120
GCCCC UGGAC AAGGG CUUGA AUGGA UGGGA UGGAU CAACC CUACC AGUGG UGGCC CAGUC 180
UAUGC ACAGA AGUUU CAGGG CAGGG UCACC AUGAC CAUGG ACACG UCCUU CACCA CAGCC 240UACAU GGAGC UGAGC AGGCU GAGAU CUGAC GACAC GGCCG UGUAU UACUG UGCGA GAGUG 300
AUUCU GUUUG GCCGG GCUUU UGAUA UCUGG GGCCA AGGGA CAAUG GUCAC CGUCU CUUCA 360
GGGAG UGCGU CCGCC CCAAC CCUUU UCCCC CUCGU CUCC 399
<210> 4 <211>
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221 > misc—feature
<222> (1)...(313)
<223>輕鏈可變區(qū)核苷酸序列
<400> 4
AUGAC CCAGU CUCCA UCUUC UGUGU CUGCA UCUGU AGGAG ACAGA GUCAC CAUCA CUUGU 60
CGGGC GAGUC AGGGU AUUAG CAGCU GGUUA GUUUG GUAUC AGCAG AAACC AGGCA AAGCC 120
CCUAA GCUCC UGAUC UAUGC UGCAU CCAGU UUACA AAGUG GGGUC CCUUC AAGGU UCAGC 180
GGCGG UGGAU CUGGG ACCGA UUUCA CUCUC ACUAU CAGCA GCCUU CAGCC UGAAG AUUUU 240GCUAC薩CU AU訓(xùn)CAACA GGCUA UCACU UUCCC UCGGA CGUUC GGCCA AGGGA CCAAG 300GUGGAGAUCAAAC<210>5 <211> <212>PRT <213>人工序列<220><221 > misc—feature<222> G)...(5)<223>重鏈可變區(qū)CDRl<400> 5Gly Tyr Tyr Met His<210>6 <211> <212>PRT <213>人工序列<220><221> misc—feature312<222> (1),.,(17)<223>重鏈可變區(qū)CDR2<400> 6Tip lie Asn Pro Thr Ser Gly Gly Pro Val Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly5 10 15<210> 7 <211> <212>PRT <213>人工序列<220><221 > misc—feature<222> (1)…(1(0<223>重鏈可變區(qū)CDR3<400> 7Val He Leu Phe Gly Arg Ala Phe Asp5 10<210>8 <2I1> <212> PRT <213>人工序列<220><221> misc_feature<222> (l)...(ll)<223>輕鏈可變區(qū)CDR1<400> 8Arg Aa Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Val5 10<210>9 <211> <212>PRT <213>人工序列<220><221 > misc一feature<222> (1)…(7)<223>輕鏈可變區(qū)CDR2<400> 9Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser<210> 10 <211> <212> PRT<213>人工序列 <220><221> misc_feature<222> (1)...(6)<223>輕鏈可變區(qū)CDR3<400> 10Ala lie Thr Phe Pro Arg
權(quán)利要求
1. 一全人源重組抗-IgE抗體，其特征在于，所述抗體的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO5所示的CDR1，SEQ ID NO6所示的CDR2，SEQ ID NO7所示的CDR3。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述及的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:l 所示的氨基酸序列。
3. —重組抗-IgE抗體，其特征在于，所述抗體的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有選 自下組的CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:7所示的CDR3。
4. 一全人源重組抗-IgE抗體，其特征在于，所述抗體的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū) 具有選自下組的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO:8所示的CDR1 ， SEQ ID NO:9所示的CDR2， SEQ ID NO: 10所示的CDR3 。
5. 如權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于，所述及的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:2 所示的氨基酸序列。
6. —全人源重組抗-IgE抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)鏈和輕鏈可變區(qū)鏈分別 具有SEQIDNO:l和SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。
7. 如權(quán)利要求6所述的抗體，其特征在于，所述及的抗體包括任何重組抗體變異 形式。
8. 如權(quán)利要求7所述的抗體，其特征在于，所述及的抗體包括任何重組抗體形式。
9. 如權(quán)利要求8所述的抗體，其特征在于，所述及的抗體為單鏈抗體片段(scFv)， Fab， Fab'或F(ab')2的形式。
10. 如權(quán)利要求6 9任一所述的抗體，其特征在于，所述及的抗體為融合其他蛋 白質(zhì)，多肽或有小分子標(biāo)記的形式。
11. 一種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求6所述的全人源重組抗-IgE抗體。
12. 如權(quán)利要求11所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQIDNO:3所示的編碼所述抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQIDNO:4所示的編碼所述抗體 輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
13. —種如權(quán)利要求l-12任一所述的抗體在制備治療變態(tài)反應(yīng)疾病中的應(yīng)用。
14. 一種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1-12任一所述的抗體和藥學(xué)上 可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一重組全人源的抗-IgE抗體，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，該抗體分子與人免疫球蛋E的Fc區(qū)結(jié)合，其親和力約10^-7-10^-8M。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼該抗體的DNA分子。本發(fā)明公開(kāi)了該抗體在制備治療變態(tài)反應(yīng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P37/08GK101230103SQ200810032639
公開(kāi)日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日
發(fā)明者何明躍, 明 吳, 張勇俠, 王明蓉, 強(qiáng) 高 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所