專利名稱：：兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑的用途及其藥物制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，具體涉及兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑在制備治療中樞疲勞中的用途及其藥物制劑。
背景技術：
：疲勞定義"持久或過度勞累造成的身體不適和工作效率減退"。中樞神經系統(tǒng)和肌肉都參與了疲勞的發(fā)生，疲勞可分為外周疲勞和中樞疲勞，外周疲勞發(fā)生在肌神經接頭和肌肉處，導致外周肌神經組織喪失了執(zhí)行中樞調節(jié)反應的能力，其涉及的機理包括ATP的缺乏和代謝副產物的累積；中樞疲勞發(fā)生在中樞神經系統(tǒng)，發(fā)生于運動神經沖動的漸進性障礙(ChaudhuriSC,BehanPO.Lancet,2004，363:978-988)。從某一方面而言，任何形式引起的疲勞都可被認為是大腦下意識協(xié)調下的、有序的、可以預料的反應的一部分，協(xié)調的最終目的是保持訓練期間所有生理系統(tǒng)的動態(tài)平衡，不管它所承受的強度、持續(xù)時間或環(huán)境狀況如何(NoakesTD，StClairGibsonA.BrJSportsMed，2004,38:648-649)。中樞性疲勞包括但不限于如手術恢復、時差反應、睡眠剝奪、飯后磕睡、慢性疲勞綜合征(chronicfatiguesyndrome,CFS)。CFS是發(fā)生中樞疲勞的一個典型例子。CFS是以持續(xù)或反復發(fā)作的嚴重疲勞為主要特征的證候群，常見的伴隨癥狀有記憶力減退、頭痛、咽喉痛、關節(jié)痛、睡眠紊亂及抑郁等多種軀體及精神神經癥狀。隨著現(xiàn)代社會競爭的加劇、生活節(jié)奏的加快、電腦應用的普及，人們不得不面對來自各方面的壓力。越來越多的人正受到CFS的困擾，發(fā)病人數(shù)在許多國家呈逐年上升的趨勢。美歐CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC)預觀U，CFS將成為21紀人類健康的主要問題之一。目前，對CFS的治療也只是減輕癥狀和改善功能，比較普遍的藥物包括安眠藥、免疫抑制劑、其它多種處方藥和一系列非處方藥，如阿片樣拮抗劑、鈉儲留劑/p阻斷劑、鈣通道阻斷劑/組胺阻斷劑，還有抗抑郁制劑、變態(tài)反應藥物和急性焦慮藥物。一個系統(tǒng)綜述評價了19892001年間數(shù)十個關于CFS治療方法的對照試驗，3/5的試驗結果表明治療組和安慰劑組療效差異無顯著性。藥物療法中免疫抑制劑和抗病毒藥物對CFS患者的疲勞和其他癥狀無效。其他的藥物療法包括抗膽堿能藥物、激素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸以及抗抑郁藥物都沒有陽性結果。因此，還沒有已知的永久性消除CFS癥狀的藥物。另外，目前使用的許多藥物產生從輕微的副作用如倦睡、頭昏和惡心到嚴重的副作用如成癮和肝臟損傷。5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE)等單胺類神經遞質水平發(fā)生異常改變是中樞性疲勞的生化基礎。5-HT是公認的參與中樞疲勞發(fā)生的物質，動物實驗已表明腦內5-HT增多會導致中樞疲勞(DavisJM,AldersonNL,WelshRS，AmJClinNutr,200072:573-578);部分臨床研究表明服用選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑(SSRIs)如帕羅西丁、氟苯氧丙胺能減少機體的運動能力(WilsonWM,MaughanRJ.ExpPhysiol1992,77:921-924;DavisJM,BaileyRJ,JacksonDAetal.MedSciSportsExerc1993:25:S78)。i午多研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠延長訓練期間，疲勞的產生與大腦內5-HT濃度的升高和DA濃度的降低有關；其他證據(jù)也表明，在一些腦區(qū)域內5-HT和DA的相反關系，5-HT/DA的比值降低能夠改善機體性能(如覺醒狀態(tài)、激發(fā)力和最佳的神經肌肉協(xié)調性)，而比值升高則降低機體性能(如激活減弱、無生氣、疲倦、肌肉協(xié)調性喪失)，而后者可導致中樞疲勞(DavisJM，BaileyRJ,JacksonDAetal.MedSciSportsExerc1997:29:45-57)。腦內DA由酪氨酸轉變而來，DA又可以轉變?yōu)镹E和腎上腺素(E)。大腦重要核團NE缺乏，同樣會導致疲勞癥狀的出現(xiàn)。DA和NE對神經系統(tǒng)的電活動整體上來說有興奮作用，隨著中樞疲勞的出現(xiàn)，腦內DA和NE含量趨于減小。DA是哺乳動物大腦中主要的兒茶酚胺類神經遞質，它控制著運動，認知，情感，正性強化，攝食，內分泌調節(jié)等許多功能。在人類身體和心理健康方面，DA發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用。DA的主要失活機制在于突觸前膜上的多巴胺轉運蛋白(dopaminetransporter，DAT)重新攝入多巴胺。因此，DAT主要功能為介導DA再攝取，降低突觸間隙DA濃度，在時程上和強度上調節(jié)DA神經信號傳導，是調節(jié)和維持DA神經功能穩(wěn)態(tài)的最重要的因子(Girosetal.Nature1996,379，696)。NE是哺乳動物大腦中另一重要的兒茶酚胺類神經遞質，同時也是一種生理激素。作為神經遞質，去甲腎上腺素主要調控覺醒、情感、夢等活動。它廣泛存在于節(jié)后交感神經和中樞神經系統(tǒng)內。在神經活動中，去甲腎上腺轉運蛋白(NET)可以將釋放到突觸間隙的NE主動攝入突觸前神經元，降低突觸間隙NE濃度，在時程上和強度上調節(jié)NE神經信號傳導。另外，單胺氧化酶(MAO)是兒茶酚胺以及5-HT代謝的重要酶系統(tǒng)。DA和NE經兒茶酚胺轉運蛋白(DAT和NET)攝取后，經MAO系統(tǒng)降解而失活，從而最終降低兒茶酚胺神經系統(tǒng)活性。因此，通過抑制兒茶酚胺轉運蛋白攝取功能和/或抑制MAO的降解活性，可增加突觸間隙兒茶酚胺含量，對中樞性疲勞具有顯著緩解作用。中藥補骨脂(Psomleacorylifolia)性溫味辛微苦，具有補腎壯陽、強筋健骨功效。研究證明，其石油醚部位中雙香豆類成分對MAO具有明顯的抑制作用(Kongetal.，Pharmacology&Toxicology88:75—80)，可顯著升高強迫游泳小鼠腦中兒茶酚胺的含量(Yanetal.,JournalofEthnopharmacology96:451~459)，提示對兒茶酚胺神經系統(tǒng)具有正性調節(jié)作用。我們推測，這種正性調節(jié)作用的另類分子靶點可能為兒茶酚胺轉運蛋白，即補骨脂及其成分可能對兒茶酚胺轉運蛋白有顯著的抑制作用；補骨脂及其成分可能通過調節(jié)兒茶酚胺轉運蛋白機制，緩解中樞性疲勞。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一是提供兒茶酚胺重攝取抑制劑，即兒茶酚胺轉運蛋白(DAT和NET)選擇性抑制劑在制備預防、改善或治療中樞性疲勞藥物中的用途。本發(fā)明的目的之二是提供一種預防、改善或治療中樞疲勞的藥物制劑。本發(fā)明的目的之三是提供一種預防、改善或治療中樞疲勞的方法。本發(fā)明提供了兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑在制備預防、改善或治療中樞性疲勞藥物中的用途。中樞疲勞作用機理可能為由于5—HT是公認的參與中樞疲勞發(fā)生的物質，它影響中樞疲勞的機制可能是通過抑制DA和NE系統(tǒng)來實現(xiàn)的。本發(fā)明的研究者發(fā)現(xiàn)一種兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑能同時有效地抑制多巴胺轉運蛋白和去甲腎上腺素轉運蛋白的生物活性，從而維持腦內正常水平DA和NE的含量或濃度，起到預防、改善或治療中樞疲勞的作用。本發(fā)明所述中樞疲勞包括但不限于如手術恢復、時差反應、睡眠剝奪、飯后磕睡、慢性疲勞綜合征，優(yōu)選慢性疲勞綜合征。本發(fā)明所述的兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑優(yōu)選為補骨脂的水或有機溶劑粗提物，更優(yōu)選可為補骨脂的石油醚部位提取物，其特點在于多耙向調節(jié)作用，即能抑制單胺氧化酶活性，又抑制兒茶酚胺轉運蛋白；本發(fā)明所述的兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑可為具有下列結構通式(I)的化合物，或其藥學可接收的鹽或前藥，CI)其中，R,和R6分別獨立選自氫、垸基、酰基或鹵族元素。R2Rs為氫或卣族元素。優(yōu)選的補骨脂酚類化合物為結構式如(II)的化合物(以下簡稱△3,2-hydroxybakuchiol，即B310),7(II)或其藥學可接收的鹽或前藥。本發(fā)明的另一方面，提供了一種預防、改善或治療中樞疲勞的藥物制劑，包括兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑及可藥用的鹽和藥學可接受的載體。本發(fā)明的再一方面是提供并公開了采用治療有效量的通式(I)所表示的化合物或含有通式(I)所表示的化合物的藥物組合物單獨或者與其它藥物聯(lián)合使用進行預防、改善或治療中樞疲勞的方法。圖1A.補骨脂石油醚部位提取物對多巴胺轉運蛋白攝取活力的作用。圖IB.補骨脂石油醚部位提取物對去甲腎上腺素轉運蛋白攝取活力的作用。圖2A.B310對多巴胺轉運蛋白攝取活力的作用。圖2B.B310對去甲腎上腺素轉運蛋白攝取活力的作用。圖3.B310對5-羥色胺轉運蛋白攝取活力的作用。圖4.B310對GAT-1細胞攝取Y-氨基丁酸活性的作用。圖5.B310對COS-7攝取L-谷氨酸活性的作用。具體實施例方式本發(fā)明中，部分術語定義如下"兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑"是指一類能特異性抑制多巴胺轉運蛋白和去甲腎上腺素轉運蛋白攝取DA和NE的物質，而該物質對5-羥色胺轉運蛋白、Y-氨基丁酸轉運蛋白和谷氨酸轉運蛋白活性均無抑制作用。該物質既8可為化合物也可是組合物。"鹵素"是指氟、氯、溴和碘。"垸基"當作一基團或一基團的部分時是指直鏈或者帶有支鏈的脂肪烴基團。優(yōu)先選擇垸基為C1-C14的烷基；更優(yōu)先選擇為Cl-C10烷基；最優(yōu)先選擇為C1-C6，除非另有指明。直鏈或和帶有支鏈的C1-C6烷基的實例包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、異丁基、特丁基、己基等。"?；?包括(垸基-co)-的基團和(芳基-co)-的基團，除非另有說明。其中烷基或芳基均見本文中的有關定義。?；膶嵗ǎ幌抻谝阴；?、丙?；?、異丁?；?、苯甲?；?。本發(fā)明包括通式(I)所表示的化合物及其可能的各種異構型式。包括非鏡像異構體、鏡像異構體、互變異構體和"E"或"Z"構型異構體的幾何異構體等。任何具有一定基礎的化學工作者均可以分離出上述光學純的化合物或者立體異構純的化合物。本發(fā)明包括通式(1)所表示的化合物及其可能的消旋體或/和鏡像異構物/或/和非鏡像異構物的混合物。此外，通式(I)所表示的化合物在應用上也涵蓋該化合物的溶劑化及非溶劑化型式。因此，各式均包括具有所指明構造的化合物，包括其水合及無水合型式。除了通式(I)所表示的化合物的外，不同具體實施方案包括藥學上可接受的鹽，前藥和該等化合物的活性代謝物，和該等代謝物的藥學上可接受的鹽。術語"藥學上可接受的鹽"是指上述化合物能保持原有生物活性并且適合于醫(yī)藥用途的某些鹽類。通式(I)所表示的化合物的藥學上可接受的鹽有兩種形成形式一是與酸形成的鹽；另一是與堿或者堿金屬形成的鹽。與通式(I)所表示的化合物形成藥學上可接受的鹽的酸包括無機酸和有機酸。合適的無機酸包括鹽酸，硫酸和磷酸。合適的有機酸可選自脂肪族、環(huán)脂肪族、芳香性、雜環(huán)羧酸和磺酸類有機酸；其實例包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、甘氨酸、精氨酸、檸檬酸、反丁烯二酸、烷基磺酸、芳級磺酸等。與通式(I)所表示的化合物形成藥學上可接受的鹽的堿金屬包括鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、鋁、鋅等；與通式(I)所表示的化合物形成藥學上可接受的鹽的堿包括膽堿、二乙醇胺、嗎啉等。"前藥"是一種通式(I)所表示的衍生物，借助于在體內代謝的方式將其于活體內轉化(例如藉由水解，還原或氧化)成通式(I)所表示的化合物。例如，可以將通式(I)所表示的、含有羥基基團的化合物與酸反應制備成相應的酯。相應的酯即為前藥，可以再活體內水解母體藥物。適合來制備"前藥"的酸包括但不限于乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、草酸、水楊酸、琥珀酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、亞甲基-雙-(3-羥基萘酸、龍膽酸、羥乙基磺酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。所說的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑，如淀粉、蔗糖等，粘合劑，如纖維素衍生物明膠、聚乙烯吡咯烷酮等，潤滑劑，如滑石粉等。本發(fā)明的藥物制劑，優(yōu)選含有B310或其可藥用的鹽作為活性成分和一種或多種可藥用載體。其中B310或其可藥用的鹽的重量比可以約為0.1-99%。本發(fā)明的藥物制劑可以采用藥學領域常規(guī)的方法進行制備可用于配制本發(fā)明口服劑型的、具體的藥學上可接受的載體和賦形劑例子，在美國專利No3，903，297(1975年9月2日授予Robert)中有描述。用于制造本發(fā)明的有用劑型的技術和組合物，在下列文獻中有描述7種現(xiàn)代制劑(7ModernPharmaceutics)第9和10章(Banker&Rhodes編輯，1979):Lieberman等人，藥物劑型:片劑(PharmaceuticalDosageForms:Tablets)(1981);禾卩Ansel,藥物齊U型導i侖(IntroductiontoPharmaceuticalDosageForms)2版(1976)。本發(fā)明的藥物制劑可口服給藥或腸胃外給藥。腸胃外給藥包括靜脈、肌內、腹膜、皮下、直腸、局部給藥途徑(包括粘膜，舌下或鼻噴霧等)。本發(fā)明的藥物制劑可以呈適于口服使用的形式，例如片劑、緩釋片、錠劑、水溶液或油混懸液、顆粒劑、乳液、硬或軟膠囊、或糖槳劑。用于口服使用的本發(fā)明制劑可依據(jù)本領域用于制備口服藥物組合物的任何已知方法制得，并且這樣的組合物可包含一種或多種選自下列的物質甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑，以提供藥學美觀和適口的制劑。10片劑含有活性組分以及與其混合的適于制備片劑的藥學上可接受的賦形劑。這些賦形劑可以是惰性稀釋劑如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒劑和崩解劑例如微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、玉米淀粉或藻酸;粘合劑例如淀粉、明膠、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯樹膠；和潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是未包衣的或者可通過本領域公知的技術將其包衣以掩蔽藥物的令人不愉快的味道或者延遲其在胃腸道的崩解和吸收，以及由此在更長的時間內維持持續(xù)的作用。例如，可使用水溶性味道掩蔽材料例如羥丙基甲基纖維素或羥丙基纖維素或者時間延遲材料例如乙基纖維素、乙酸丁酸纖維素。本發(fā)明的口服制劑還可以以硬明膠膠囊提供，其中活性組分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣和高嶺土混合，或以軟明膠膠囊提供，其中活性成分與水溶性載體例如聚乙二醇或油性介質例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。本發(fā)明的水混懸液含有活性物質以及與其混合的適于制備水混懸液的賦形劑或分散劑。所述的賦形劑包括混懸劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠。所述的分散劑可以是天然磷脂例如卵磷脂、或烯化氧與脂肪酸的縮合產物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或烯化氧與長鏈脂族醇的縮合產物例如十七乙稀氧基鯨蠟醇，或者烯化氧與衍生自脂肪和和己糖醇的偏酯的縮合產物，例如聚氧乙烷山梨糖醇單油酸酯。本發(fā)明的注射劑是含有活性物質的無菌注射粉末，通過使用水或有機溶劑如酒精、甲醇、丙酮、氯仿等溶解結晶，通過常溫干燥或冷凍干燥得到無菌注射的粉末或結晶。本發(fā)明的注射劑是含有活性物質的無菌注射液，可使用水、或林格溶液、氯化鈉溶液和/或葡萄糖溶液做載體，形成無菌注射溶液。本發(fā)明的注射劑可通過局部快速濃注引入到患者血流中或者其他可以給藥的部位，或者通過靜脈滴注的形式引入到患者血流中。本發(fā)明的另一方面是提供了一種制備藥物制劑的方法，包括將上述的本發(fā)明的藥物組合物與一種或多種可藥用的載體或賦形劑混合。本發(fā)明的化合物可單獨使用，也可以與其它一種或者多種藥物聯(lián)合使用；或者與手術或者放療聯(lián)合使用；或與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑做成一定的劑型給藥。具體的劑型依據(jù)給藥途徑而定。術語"治療有效量"或"治療量"均是指足以產生療效的量。有效量可分一或多次給藥。通常，有效量足以緩和、改善、穩(wěn)定、減慢或延遲疾病的進一步發(fā)展。優(yōu)先選擇的劑量范圍為每公斤體重每天約為0.01—300毫克。更優(yōu)選的劑量范圍為每公斤體重每天為0.2—80毫克。也可以選擇適當?shù)膭┝棵刻於啻谓o藥。通式(I)所表示的化合物或含有通式(I)所表示的化合物的藥物組合物單獨或者與其它藥物聯(lián)合使用進行預防、改善或治療中樞疲勞，優(yōu)選慢性疲勞。以下結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。本發(fā)明涉及常規(guī)分子生物學的實驗方法，在所屬領域中已是廣泛己知，并在諸如MolecularCloning:alaboratoryManual第3版，Sambrook等人編輯，ColdSpringHarborlaboratoryPress,ClodSpringHarbor,N.Y"2001及CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯等方法參考書有詳細的介紹。實施例1補骨脂提取物和B310制備及鑒定一、補骨脂石油醚部位提取物的提取取產自安徽補骨脂粗粉1千克，加95%工業(yè)酒精3000ml，70度加熱回流提取三次，每次三小時，沸騰后開始記時。合并濾液，減壓濃縮，得浸膏190克。將乙醇浸膏加3000ml石油醚在室溫下冷浸三次，每次24小時。合并濾液5060ml，減壓濃縮，得石油醚部位提取物(FP)浸膏75g。12一R"n4V虔知她/0--、*v乂J'j一Uj一LJ經體外活性跟蹤顯示，石油醚部位含有化單胺類神經遞質轉運蛋白抑制劑，因此采用層析分離技術分離該類活性物質。取上述石油醚提取物75g，用100ml丙酮溶解，100-200目硅膠100g拌樣，100-200目硅膠lkg裝柱。洗脫劑石油醚丙酮=100:1，50:1，20:1，10:1。薄層色譜檢測，展開劑氯仿甲醇=30:1。細胞活性跟蹤含有有效化合物的部位，共5.15g。該樣品用250ml丙酮溶解，200-300目硅膠10g拌樣，200-300目硅膠500g裝柱；洗脫劑氯仿甲醇=100:1。經細胞活性檢測，得含有有效化合物的部位2.85g。取上述部位300mg，用LH-20凝膠進一步純化，流動相為甲醇，結果得樣品85mg。再用LH-20凝膠進一步純化，流動相為甲醇氯仿=1:2，得較純樣品25mg，即為B310。化學結構鑒定，采用UV，IR，EMS和1HNMR(400HZ)。相關參數(shù)UV入MeOHmaxnm:262;IRVmffilmmax:3356(OH),1600,967(C=C)，3078，3033，1511,1442,1361,1233，1167,909，852,811,746;EIMSm/z(rel.int.):314[M]+(0.4),215(23.7),173(100)，145(12.9)，107(8.1),79(7.4),43(28.0),41(5.2);H誦NMR:7.21d(8.5),6.75d(8.5)，7.21d(8.5),6.23d(16.2)，6.03d(16.2)，2.20d(16.2),5.61m，5.61m，1.30s，130s，1.16s,5.87dd(10.8,17.3)，4.99d(17.4)，5.03d(10.8)。結構式見結構式(II)純度檢測，采用HPLC歸一化法，B310純度為96.8°/。。實施例2體外補骨脂提取物和B310抑制活性實驗參照中國專利申請200410066324.1建立永久表達去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺轉運蛋白、Y-氨基丁酸四種神經轉運蛋白的CHO細胞系，分別命名為NET，D8，GAT-1細胞。分別培養(yǎng)、NET、D8、S6、GAT-1細胞于48孔板(Costar)至平板鋪滿(大約每孔6萬細胞)。棄培液，用PBS洗滌一次，吸去PBS溶液，每孔加入90jilHBS(10mMHepes，100mMNaCl，PH8.0)，25'C溫育10分鐘，每孔加入10plHBS反應液。實驗組及陽性對照藥加入8(^1HBS，10^d不同濃度的樣品藥物及陽性對照藥安非他酮(BPR)，及10ul3H標記的底物(S6采用3H-5-HT;NET采用3H-NE;D8采用3H-DA)，100pM13維生素C和lOOpM帕吉林。25。C溫育20分鐘，用冰浴的PBS溶液洗滌三遍，用裂解液裂解60分鐘，吸取各孔的裂解液加入到1.2ml的閃爍液中，放入液閃計數(shù)儀(BeckmanLS5000TA)中檢測DMP值，以此來衡量樣品藥物對五羥色胺轉運蛋白、去甲腎上腺素轉運蛋白、多巴胺轉運蛋白的活性。對于GABA轉運蛋白檢測，方法類似于多巴胺轉運蛋白，50nM3H-GABA(AmershamPharmaciaBiotech)取代了反應體系中的3H-DA或3H-NE或3H-5-HT和維生素C及帕吉林。對谷氨酸轉運蛋白攝取活性的影響采用COS-7細胞為篩選模型，3H-GlutamicAcid和3H-AsparateAcid代替上述反應中的同位素，以lmMGlutamicAcid和AsparateAcid為陰性對照，其他方法不變。其中，安非他酮(BPR)是去甲腎上腺素和多巴胺再攝取的中效抑制劑，對單胺氧化酶沒有抑制作用。結果補骨脂石油醚部位提取物(FP)在0.3-100Ug/ml濃度下呈劑量依賴性地抑制DA和NE的攝取，分別見圖1A和圖1B。見圖2A，B310在0.1-10uM濃度下，對多巴胺轉運蛋白(DAT)也顯示很強的抑制活力。在O.lpM濃度下可抑制21.9%，1PM濃度下可抑制62.5%，10(iM濃度下可抑制88.7.1%。在1PM濃度下，B310對D8細胞多巴胺攝取活力的抑制效果與陽性對照藥物安非他酮(BPR)相當(P>0.05)。在0.1-10UM濃度范圍內取7個濃度點，經半對數(shù)曲線相關性分析，計算B310對多巴胺攝取活性的IC50為8.3341±4.5702uM。見圖2B，在0.1-10uM濃度下，B310對去甲腎上腺素轉運蛋白的攝取活力有顯著抑制作用(P<0.05)。0.1ixM濃度下可抑制3.1%,luM濃度下可抑制56.1%，10uM濃度下可抑制89.1%。在luM濃度下，B310對NET細胞攝取活力的抑制效果與陽性對照藥物安非他酮(BPR)相當(P〉0.05)。在0.1-10uM濃度范圍內取7個濃度點，經同位素標記的去甲腎上腺素攝取活力的檢測，通過半對數(shù)曲線相關性分析，得出B310的IC50為0.9724±0.443uM。在0.3-10uM濃度下，B310對5-羥色胺轉運蛋白的攝取活力無顯著抑制作用(P>0.05)，見圖3。在lOOuM以下的各個濃度點，B310對GAT-1細胞攝取Y-氨基丁酸以及C0S-7攝取L-谷氨酸活性均沒有影響(P>0.05)。見圖4，圖5。上述結果表明B310對多巴胺轉運蛋白、去甲腎上腺素轉運蛋白均有顯著地抑制活性，其抑制作用強于陽性對照藥物安非他酮(BPR)，而對5-羥色胺轉運蛋白、Y-氮基丁酸轉運蛋白和谷氨酸轉運蛋白活性均沒有影響。因此，B310對單胺類神經遞質轉運蛋白的抑制作用具有選擇性。實施例3急性毒性反應昆明小白鼠60只，體重18土2g，購自中國科學院上海實驗動物中心，按性別隨機均分為6組，每組10只，雌雄各5只。分組后，按以下劑量腹腔注射B310:743.4mg/kg、826.2mg/kg、918mg/kg、1020.6mg/kg、1134mg/kg、1260mg/kg。給藥體積為20ml/kg。組間劑量比為1.1。給藥后觀察記錄各組動物的急性毒性反應，在24小時內觀察多次，連續(xù)觀察7天，每天記錄動物的死亡和毒副反應情況。計算腹腔注射B310對小鼠的LD50。結果各組在給藥2小時后出現(xiàn)不同程度死亡；在24小時內，各組小鼠死亡情況見下表。24小時后，再無死亡情況發(fā)生。表l昆明小鼠腹腔注射B310后7天內死亡情況劑量(mg/kg)743826918102011341260小鼠總數(shù)(只)101010101010小鼠死亡數(shù)(只)031268經計算，昆明小鼠腹腔注射B310的LDs。為1101.8mg/kg。實施例4對慢性疲勞綜合征動物模型的作用第一部分B310對慢性疲勞綜合癥模型大鼠的力竭游泳時間的影響成年健康雄性Sprague-Dauley(SD)大鼠39只,由中科院上海實驗動物中心提供,體重200士10g,室溫(22±2。C)下單籠詞養(yǎng),光-暗周期為12h,自由飲食。適應7天。SD大鼠按體重隨機分為:A組:空白對照組；B組:模型組；C組:15mg/kgB-310組；D組45mg/kgB-310組；E組60mg/kgB-310組；F組:15陽性對照(30mg/kg人參皂甙)組。造模方法A組不給予任何刺激條件，飼養(yǎng)條件同其他組，在其他組訓練的時候，不給予食、水。C、D、E、F在每天上午給藥后，與B組一樣按下列方法訓練:上午懸吊，下午進行冷水游泳,連續(xù)12天。懸吊每3天循序加量1次,時間分別為lh、1.5h、2h、2.5h。游泳訓練為每天下午在IO'C冷水中游泳5min。(尹喜玲,肖穎，李可基。中國運動醫(yī)學雜志，2005，24(4)，452—456)除A、B組不給藥外，C、D、E、F組腹腔注射相應劑量的相應藥物。力竭游泳時間,從放入IO'C冷水中開始到力竭的時間作為考察各組效果的指標。力竭標準①游泳動作明顯失調,不能再堅持。②沉入水下10s不能回到水面。實驗結果均以均數(shù)士標準差(x士s)表示，組間差異采用t檢驗。結果各組動物在l(TC冷水中力竭游泳時間見下表不同組別動物l(TC冷水中力竭游泳時間(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>與模型組比乾*<0.05。B310在對抗慢性疲勞綜合癥方面，有較好的效果第二部分補骨脂石油醚部位提取物(FP)對慢性疲勞綜合癥模型大鼠的力竭游泳時間的影響(I)實驗動物模型同第一部分。大鼠適應7天后，隨機分為6組，分別為A組(空白對照組，n:8)，B組(模型組，n-8)，C組(陽性對照，30mg/kg人參20皂甙組，n=8),D組(15mg/kg補骨脂石油醚部位提取物組，n=8),E組(30mg/kg補骨脂石油醚部位提取物組，n=8)和F組(45mg/kg補骨脂石油醚部位提取物組，n=9)。給藥方法除A、B組不給藥外(對照溶液腹腔注射)，C、D、E、F組腹腔注射相應劑量的相應藥物。造模方法及行為指標測定同第一部分。結果各組動物在l(TC冷水中力竭游泳時間見下表不同組別動物l(TC冷水中力竭游泳時間(x±s)組另U_0_劑量(mg/kg)_力竭游泳時間(s)~I§709.5±99*~~B8586±55C830679±90*D815609±56E830675±83*F945727±86**與模型組比較，*尸<0.05，**尸<0.01補骨脂石油醚部位提取物具有顯著的對抗慢性疲勞綜合癥的效果，其45mg/kg抗疲勞綜合癥的效果還略好于30mg/kg的人參皂甙的效果。第三部分補骨脂石油醚部位提取物(FP)對慢性疲勞綜合癥模型大鼠的力竭游泳時間的影響(II)實驗動物成年健康雄性昆明小鼠53只,由中科院上海實驗動物中心提供,體重18±2g，室溫(22±2°C)下飼養(yǎng),光-暗周期為12h,自由飲食。適應7天。動物分組按體重隨機分為:A組(空白對照組，n:8),B組(模型組，n=7)，C組(陽性對照，30mg/kg人參皂甙組，n=7)，D組(陽性對照，60mg/kg人參皂甙組，n=6)，E組(15mg/kg補骨脂石油醚部位提取物組，n=6)，F(xiàn)組(30mg/kg補骨脂石油醚部位提取物組，n=7),G組(45mg/kg補骨脂石油醚部位提取物組，n-7)和H組(60mg/kg補骨脂石油醚部位提取物組，n=5)。給藥方法除A、B組不給藥外，C、D、E、F、G、H組腹腔注射相應劑量的相應藥物。造模方法C、D、E、F、G、H組在每天上午給藥后，與B組一樣按下列方法訓練每天將B、C、D、E、F、G、H組動物置入束縛筒內束縛一次，每次束縛過程三組同步進行。每天束縛開始時間不同，隨機確定。每次束縛時,使動物鉆進束縛筒內，并塞紙團調節(jié)到其不產生強烈反抗的緊張程度，平架在木板上。4h后，三組動物同步取出。在整個束縛過程中，A組動物在同一環(huán)境中，但不給藥，不予以進食水。共束縛14天。在第15天,進行行為學方面的測定。行為指標測定先測A:開場中2min內運動的距離。后測B:力竭游泳時間,從放入18i:水中開始到力竭的時間作為考察各組效果的指標。力竭標準:①游泳動作明顯失調，不能再堅持。②沉入水下10s不能回到水面。結果-.A、不同組別動物開場中2min內運動的距離見表l:表l不同組別動物開場中2min內運動的距離(x士s)組別n齊慢(mg/kg)開場中運動距離(mm)A81659±275B71157±160C7301611±458D6601820±933E6151280±227F7301507±279G7451626±465H5601799±604B、各組動物在18"C水中力竭游泳時間見下表表2不同組別動物18'C水中力竭游泳時間(x±s)組別n劑量(mg/kg)力竭游泳時間(s)A8780±173B7564±47C730746±239D660929±292E615574±57F730762±160G745751±173H560884±28718結論上述行為學結果A和B經統(tǒng)計學處理，表明補骨脂石油醚部位提取物具有顯著的對抗慢性疲勞綜合癥的效果。實施例5B310注射液的制備處方B310200g鹽酸(PH調節(jié)劑)20g注射用水加至1000ml工藝在制備容器中，加處方量80%得注射用水，加B310溶解后，調節(jié)藥液pH6.06.2，注射用水至全量，再加入0.15%活性炭脫色，過濾至澄明，用垂熔玻璃濾器與膜濾器過濾，并在氮氣氣流下灌封，最后于IO(TC流通蒸汽15min滅菌，即得。實施例6B310片劑的制備處方B310330g淀粉40g10%淀粉漿24g干淀粉23g硬脂酸鎂3g制成1000片工藝將B310過80目篩，與淀粉混勻，加淀粉漿制成軟材，用14目篩制粒后，置7(TC8(TC干燥后于12目篩整粒，加入干淀粉及硬脂酸鎂混勻后，壓片，即得。實施例7補骨脂石油醚部位提取物顆粒劑的制備處方19補骨脂石油醚部位提取物1000gPVPK3010g交聯(lián)PVP15g乳糖1000g蔗糖1000g擰檬黃lg硬脂酸20g工藝將補骨脂石油醚部位提取物與乳糖、蔗糖混勻，加含檸檬黃的PVPK30漿制成軟材，用14目篩制粒后，置7(TC8(TC干燥后于12目篩整粒，加入交聯(lián)PVP和硬脂酸混勻后，裝1000袋即可。本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發(fā)明各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的范圍之內。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。20權利要求1、兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑在制備預防、改善或治療中樞性疲勞藥物中的用途。2、如權利要求l所述的用途，其特征在于所述中樞疲勞選自手術恢復、時差反應、睡眠剝奪、飯后瞌睡或慢性疲勞綜合征。3、如權利要求l所述的用途，其特征在于所述中樞疲勞為慢性疲勞綜合征。4、如權利要求1所述的用途，其特征在于所述兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑可為補骨脂的水提物或有機溶劑粗提物。5、如權利要求1所述的用途，其特征在于所述兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑為補骨脂的石油醚部位提取物。6、如權利要求1所述的用途，其特征在于所述兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑可為具有下列結構通式(I)的化合物，或其藥學可接受的鹽或前藥，(I)其中，Ri和R6分別獨立選自氫、烷基、?；螓u族元素，R2Rs為氫或鹵族元素。7、如權利要求1所述的用途，其特征在于所述兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑為結構式如(II)的化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)或其藥學可接受的鹽或前藥。8、一種預防、改善或治療中樞疲勞的藥物制劑，包括權利要求1所述兒茶酚胺轉運蛋白抑制劑及其可藥用的鹽或前藥和藥學可接受的載體。9、如權利要求8所述藥物制劑可為口服劑、注射劑和局部給藥制劑。10、如權利要求9所述藥物制劑可為口服劑可為片劑、緩釋片、錠劑、水溶液或油混懸液、顆粒劑、乳液、硬或軟膠囊、或糖漿劑。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，具體涉及兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑在制備治療中樞疲勞藥物中的用途及其藥物制劑。本發(fā)明提供了一類兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑在制備預防、改善或治療中樞性疲勞藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面，提供了一種預防、改善或治療中樞疲勞的藥物制劑，包括兒茶酚胺轉運蛋白選擇性抑制劑及可藥用的鹽和藥學可接受的載體。文檔編號A61K31/045GK101496830SQ200810033449公開日2009年8月5日申請日期2008年2月2日優(yōu)先權日2008年2月2日發(fā)明者代趙明,臧紹云,蔣芝華,剛趙,郭禮和申請人:和泓生物技術(上海)有限公司