專利名稱：一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病模型的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病模型的 方法。
背景技術(shù)：
冠心病、腦中風、高血脂、高血糖、風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病嚴重危害著人類健 康，患病人群呈現(xiàn)逐步增多的趨勢。采用動物模型進行新化合物的活性篩選是新 藥開發(fā)中常用的方法，系統(tǒng)全面的評價藥物在一種或者多種適應(yīng)癥的生理活性是 藥物臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。由于新藥開發(fā)的成本不斷增加、時間逐步增長，在一定程 度上制約了新藥開發(fā)的進程。目前，在新藥開發(fā)的前期過程中，采用細胞水平的 大規(guī)模篩選已應(yīng)用廣泛，但因體內(nèi)、體外生理環(huán)境的差異，使細胞水平的實驗結(jié) 果并不能有效、準確地說明化合物的適應(yīng)癥。目前文獻報道單一的動物模型很多， 例如心肌缺血動物模型、腦缺血動物模型、高血糖動物模型、高血脂動物模型、 風濕性關(guān)節(jié)炎動物模型等，'但在研究中，由于往往只能采用單一模型進行藥物在 體研究，因而，耗時長，動物使用數(shù)量多，成本高。另外， 一次實驗只能判斷化 合物的一種適應(yīng)癥，并且與一般臨床疾病患者病癥和并發(fā)癥并存的情況不符。因 此，單一的動物模型不能滿足新藥開發(fā)的需要，因此，建立在一只動物體內(nèi)多種 疾病的實驗動物模型，成為研究的新目標，這樣，不但可以有效快捷的篩選化合 物的藥效及其機理，發(fā)現(xiàn)目標化合物潛在的新的臨床適應(yīng)癥，而且能降低成本， 減少動物使用的數(shù)量。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是在一只動物體內(nèi)建立多個疾病的動物模型，它和人類疾病及其并發(fā)癥狀況相似，能夠有效篩選化合物的藥效和作用耙點，耗時短， 動物使用量少，成本低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是在同一只動物體內(nèi)建立多個疾病的動物模型， 它和人類疾病及其并發(fā)癥狀況相似，能夠有效篩選化合物的藥效和作用耙點，耗 時短，動物使用量少，成本低。
本發(fā)明提供了一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法。 本發(fā)明提出的在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法通過以下方 案實現(xiàn)
(1) 建立大鼠高血脂模型；
(2) 在(1)中的大鼠上建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型；
(3) 在(2)中的大鼠上建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖模型；
(4) 在(3)中的大鼠上建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血模
型；
(5) 在(4)中的大鼠上建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血又 腦缺血模型。本發(fā)明在在一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法的具體步驟 如下
(1)建立大鼠高血脂模型
選取無特殊病原體的Wistar大鼠，雄性，160±10g，適應(yīng)無特殊病原體級 動物實驗室環(huán)境(溫度20-26°C、日溫差《3。C、相對濕度40-70%、換氣次數(shù) 10-15次/小時、氣流速度，0. 1-0. 2m/s、壓強梯度20Pa、空氣潔凈度10000 級、落下菌數(shù)個《3/皿、氨濃度《14mg/m3、
噪聲《60dB、照度150 3001x、晝夜明暗交替時間12/12h) 3天，實驗前1天，稱體重，禁食不禁水12小時，眼睚后靜脈叢取血測定血清中總膽固醇、甘
油三酯和高密度脂蛋白含量；選擇血脂合格(總膽固醇在1.5-2.5mmol/L之間、 甘油三酯在1.0-2.0 mmol/L之間)的大鼠分為正常組和模型組，將普通飼料(水 分7. 42%、粗蛋白22. 35%、粗脂肪5. 68%、粗灰分5. 16%、粗纖維7. 24%、鈣1. 24%、 磷0.89%、水溶性氯化物0.40%)放入正常組大鼠鼠籠蓋上，大鼠自由食用，將 高脂飼料(8%蛋黃粉、1.5%膽固醇、10%豬油、0.1%膽鹽)放入模型組大鼠鼠 籠蓋上，大鼠自由食用30天，并采用試劑盒測定血中總膽固醇、甘油三酯和高 密度脂蛋白膽固醇的含量，并以模型組和正常組血脂水平比較有統(tǒng)計學上的顯著 差異(P<0.05)為造模成功的標準。
(2) 在完成(1)步驟后的大鼠中建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型 在完成(1)步驟后的模型組大鼠右足掌皮內(nèi)注射10mg/ml的Freund's佐
劑，連續(xù)觀察8天，并測定正常組和模型組大鼠足腫脹的厚度，并以模型組大鼠 足掌厚度和正常組大鼠比較有統(tǒng)計學上的顯著差異(P<0.05)為造模成功的標 準。
(3) 在完成(2)步驟后的大鼠中建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎及高血糖模型 在完成(2)步驟后的正常組和模型組大鼠均禁食24小時，于模型組大鼠腹
腔注射50mg/kg鏈尿菌素，測定大鼠血糖的含量，以模型組大鼠血糖值和正常組 大鼠血糖值比較有統(tǒng)計學上的顯著差異(P<0.05)為造模成功的標準。
(4) 在完成(3)步驟后的大鼠建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎及高血糖并心肌 缺血模型
在完成(3)步驟后的大鼠的實驗過程中，以10%的烏拉坦腹腔注射麻醉， 氣管插管，接人工呼吸機，開胸，于冠狀動脈左前降支結(jié)扎，測定結(jié)扎前及結(jié)扎 后10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘的心電圖變化，于結(jié)扎2.5小時后取心臟 測定心肌梗死面積。以模型組大鼠T波值和正常組大鼠T波值比較有統(tǒng)計學上的顯著差異(P<0.05)和出現(xiàn)心肌梗死為造模成功的標準。
(5)在完成(4)步驟后的大鼠建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎及高血糖并心肌
缺血又腦缺血模型
在完成(4)步驟大鼠的實驗后，立即取大鼠右側(cè)頸部切口，分離出頸 總動脈、頸外動
脈和頸內(nèi)動脈，并沿著頸內(nèi)動脈向下分離翼腭動脈，將栓線從右側(cè)頸總動脈 切口處緩慢插入約20毫米再向回拉2毫米，固定栓線，縫合傷口，術(shù)后24小時， 進行神經(jīng)行為學評分和取腦測定腦梗死面積。神經(jīng)行為學評分標準為0分行
為無異常；0.5分豎毛，輕度運動低下；1.0分前肢屈曲，運動障礙；2.0 分行動不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢，旋轉(zhuǎn)運動；3.0分偏癱，不能站立和行走；4.0 分痙攣，昏睡；5.0分死亡。1-3分為造模成功。 本發(fā)明的有意效果是
本發(fā)明提供的方法與現(xiàn)有的各種大鼠的疾病模型相比，更真實的模擬了臨床 疾病的發(fā)生及其存在的并發(fā)癥的實際情況，可針對性的用于篩選冠心病、心絞痛、 高血壓、高血脂、高血糖、風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。即通過少量的多疾病模型動物， 篩選出化合物的藥效以及其作用耙點，同時還可以通過本發(fā)明建立的動物模型發(fā) 現(xiàn)化合物新的適應(yīng)癥，比單一的動物模型在研究周期、使用動物數(shù)量、成本、發(fā) 現(xiàn)化合物潛在適應(yīng)癥等方面有明顯優(yōu)勢。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合具體實例作進一步說明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明之目的， 而不限于本發(fā)明范圍。
實施例1建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型
實驗采用Wistar大鼠，將普通飼料(水分7.42%、粗蛋白22.35%、粗脂肪
85. 68%、粗灰分5. 16%、粗纖維7. 24%、鈣1. 24%、磷0. 8996、水溶性氯化物0. 40%)
放入正常組大鼠鼠籠蓋上，大鼠自由食用，將高脂飼料(8%蛋黃粉、1.5%膽固
醇、10%豬油、0.1%膽鹽)放入模型組大鼠鼠籠蓋上，大鼠自由食用，連續(xù)給予
30天。分別于給予高脂飼料后30天對大鼠眼眶后靜脈叢取血，3000轉(zhuǎn)離心10
分鐘，分離血清，測定血清中膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白含量。在給予高
脂詞料的第22天，在模型組大鼠右側(cè)足掌皮內(nèi)注射10毫克/毫升的Freund's佐
劑，并于注射佐劑后的第8天測定大鼠足厚度。 表i大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型
組別 動物數(shù) 檢測指標 量
膽固醇甘油三脂 高密度脂蛋白 足厚度
(mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mm)
正常組10 2.06±0.221.10±0.21 1.10±0.22 4.89±0.23
模型組10 3.71 ±0.70** 1.83±0.30** 0.86±0.11**7.61 ±0.29**
~**P<0.01表示模型組與正常組比較有非常顯著性差異
表l的結(jié)果顯示，模型組大鼠血中的膽固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白與正
常組比較有非常顯著性差異(P<0.01)，模型組大鼠足厚度與正常組比較有非常 顯著性差異(P<0.01)，表明本發(fā)明建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型成功。 實施例2建立大鼠髙血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖模型。
在上述實施例l中的大鼠，于實驗開展的第30天，模型組繼續(xù)喂以高脂飼 料。在造高血糖模型前禁食不禁水12小時，于大鼠腹腔注射50mg/kg鏈尿菌素， 測定大鼠血糖含量。
表2大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖模型
組別動物檢測指標
數(shù)量膽固醇甘油三脂高密度脂蛋足厚度血糖值(mmo1/1)
Onmol/L)(mmol/L)白(mmol/L)(mm)造模前 造模后
正常組102.061.101.104.894.06±0.25
±0.22±0.21±0.22±0.23模型組103.711.830.867.616.21 16.01
9_±0.70**±0.30** ±0.11** ±0.29** ±0.36 ±1.26****
"P<0.01表示模型組與正常組比較有非常顯著性差異；**P<0.01表示造模后與造模前比較有非常顯著
性差異
表2的結(jié)果顯示，在建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型成功的基礎(chǔ)上，模 型組大鼠血糖值與正常組比較有非常顯著性差異(P<0.01),表明本發(fā)明建立大 鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并髙血糖模型成功。 實施例3建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血模型
在上述實施例2中的大鼠，于造高血糖模型成功后的第二天，以烏拉坦1g/kg 腹腔注射麻醉，仰位固定，胸部、頸部備皮待用，頸部做氣管插管，連接呼吸機 及生理記錄儀，穩(wěn)定30分鐘后記錄正常心電圖。15分鐘后，進行冠狀動脈結(jié)扎 手術(shù)，術(shù)后連接生理記錄儀，記錄藥前、結(jié)扎后10分鐘、20分鐘、30分鐘、 60分鐘心電圖。剪取心臟，采用硝基四氮唑藍染色法染色，計算梗死面積。
表3大鼠髙血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血模型
組別動物檢測指標
數(shù)量膽固醇甘油三脂高密度脂蛋足厚度血糖值(mmo1/1)
(mmol/LO(mmol/L)白(mmol/L)(mm)造模前造模后
正常組102.06 ±0.221.10 ±0.211.10 ±0.224.89 ±0.234.06±0.25模型組103.711.830.867.616.2116.01
±0.70**±0.30**±0.11**±0.29**±0.36±1.26****
續(xù)表3大鼠髙血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血模型組別動物心臟T波(mV)心肌梗死 TST扣 f O厶、
數(shù)量結(jié)扎前結(jié)扎后囬積 、76 J
10分鐘20分鐘30分鐘60分鐘
正常組100.070.080.100.090.09——
±0.03±0.05±0.05±0.04±0.05
模型組100.080.390.430.400.4436.11
±0.04±0.12**** ±0.25**** ±0.19****±0.21 ****±19.26
** P<0. 01表示模型組與正常組比較有非常顯著性差異；"P<0. 01表示造模 后與造模前比較有非常顯著性差異，結(jié)扎后與結(jié)扎前比較有非常顯著性差異
表3的結(jié)果顯示，在建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖模型成功的基 礎(chǔ)上，模型組大鼠心臟T波值與正常組比較有非常顯著性差異(P<0.01)，與自
10身造模前比較有非常顯著性差異(P<0.01)，表明本發(fā)明建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血模型成功。
實施例4建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血又腦缺血模型
在上述實施例3中的大鼠，取大鼠右側(cè)頸部切口，分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，并沿著頸內(nèi)動脈向下分離翼腭動脈，將栓線從右側(cè)頸總動脈切口處緩慢插入約20毫米，再向回拉2毫米，固定栓線，縫合傷口，并進行神經(jīng)學評分。實驗過程維持大鼠肛溫37士0.5'C。模型成功的判斷為行為神經(jīng)檢査等級評分0分行為無異常；0.5分豎毛，輕度運動低下；1.0分前肢屈曲，運動障礙；2.0分行動不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢，旋轉(zhuǎn)運動；3.0分偏癱，不能站立和行走；4.0分痙攣，昏睡；5.0分死亡。術(shù)后24小時，測定行為學評分后將腦取出，去掉嗅球，小腦和低位腦干，冠狀切片，采用氯化三苯基四氮唑染色，計算梗死面積。
表4大鼠髙血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并髙血糖及心肌缺血又腦缺血模型
組別動物各評分分數(shù)大鼠數(shù)量(只)
數(shù)量00.51.02.03.04.05.0腦梗死面積(％)
分分分分分分分
正常組1010000000—
模型組10000640031.09±13.61
表4的結(jié)果顯示，在建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖模型及心肌缺血成功的基礎(chǔ)上，模型組大鼠神經(jīng)行為學評分中有6只2,0分，4只3.0分，腦梗死面積達31.09±13.61%明腦缺血模型成功。
以上實驗結(jié)果表明，本發(fā)明建立大鼠高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血又腦缺血模型成功。
權(quán)利要求
1.一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)建立大鼠高血脂模型選取無特定病原體級Wistar大鼠，雄性，160±10g，適應(yīng)無特定病原體級動物實驗室環(huán)境3天，實驗前1天，稱體重，禁食不禁水12小時，眼眶后靜脈叢取血測定血清中總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白含量；選擇血脂中總膽固醇在1.5-2.5mmol/L之間、甘油三酯在1.0-2.0mmol/L之間的大鼠分為正常組和模型組，正常組喂以普通飼料水分7.42％、粗蛋白22.35％、粗脂肪5.68％、粗灰分5.16％、粗纖維7.24％、鈣1.24％、磷0.89％、水溶性氯化物0.40％，模型組喂以高脂飼料8％蛋黃粉、1.5％膽固醇、10％豬油、0.1％膽鹽30天，并采用試劑盒測定血中總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白膽固醇的含量，并以模型組和正常組血脂水平比較有統(tǒng)計學上的顯著差異為造模成功的標準；(2)在完成(1)步驟后的大鼠中建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型在完成(1)步驟后的模型組大鼠右足掌皮內(nèi)注射10mg/ml的Freund’s佐劑，連續(xù)觀察8天，并測定正常組和模型組大鼠足腫脹的厚度，并以模型組大鼠足掌厚度和正常組大鼠比較有統(tǒng)計學上的顯著差異P＜0.05為造模成功的標準；(3)在完成(2)步驟后的大鼠中建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎及高血糖模型在完成(2)步驟后的正常組和模型組大鼠均禁食24小時，于模型組大鼠腹腔注射50mg/kg鏈尿菌素，測定大鼠血糖的含量，以模型組大鼠血糖值和正常組大鼠血糖值比較有統(tǒng)計學上的顯著差異為造模成功的標準P＜0.05；(4)在完成(3)步驟后的大鼠建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎及高血糖并心肌缺血模型在完成(3)步驟后的大鼠的實驗過程中，以10％的烏拉坦腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸機，開胸，于冠狀動脈左前降支結(jié)扎，測定結(jié)扎前及結(jié)扎后10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘的心電圖變化，于結(jié)扎2.5小時后取心臟測定心肌梗死面積；以模型組大鼠T波值和正常組大鼠T波值比較有統(tǒng)計學上的顯著差異P＜0.05和出現(xiàn)心肌梗死為造模成功的標準；(5)在完成(4)步驟后的大鼠建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎及高血糖并心肌缺血又腦缺血模型在完成(4)步驟大鼠的實驗后，立即取大鼠右側(cè)頸部切口，分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，并沿著頸內(nèi)動脈向下分離翼腭動脈，將栓線從右側(cè)頸總動脈切口處緩慢插入約20毫米再向回拉2毫米，固定栓線，縫合傷口，術(shù)后24小時，進行神經(jīng)行為學評分和取腦測定腦梗死面積；神經(jīng)行為學評分標準為0分行為無異常；0.5分豎毛，輕度運動低下；1.0分前肢屈曲，運動障礙；2.0分行動不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢，旋轉(zhuǎn)運動；3.0分偏癱，不能站立和行走；4.0分痙攣，昏睡；5.0分死亡；1-3分為造模成功。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠體內(nèi)同時建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血又腦缺血模型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠體內(nèi)同時建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖及心肌缺血模型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠體內(nèi)同時建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎并高血糖模型。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的方法，其特征在于在同一只大鼠體內(nèi)同時建立高血脂和風濕性關(guān)節(jié)炎模型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病動物模型的 方法，其特征在于通過該方法在同一只大鼠體內(nèi)建立的多種疾病動物模型用于 篩選治療心肌缺血藥物、治療腦缺血藥物、治療高脂血癥藥物、治療高血糖藥物 或治療風濕關(guān)節(jié)炎藥物的一種適應(yīng)癥或一種以上適應(yīng)癥治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在同一只大鼠體內(nèi)建立多種疾病模型的方法。通過本發(fā)明的方法，在同一只大鼠體內(nèi)同時建立了心肌缺血、腦缺血、高血脂、高血糖、風濕性關(guān)節(jié)炎等病癥的模型，經(jīng)過檢測相關(guān)特異性指標確證了多種疾病模型已建立。本發(fā)明更真實的反映了臨床人體病癥及并發(fā)癥存在的實際情況，為藥物篩選提供了更高效的方法，縮短了研發(fā)周期，減少了動物使用數(shù)量，降低了成本，有較大的應(yīng)用價值。
文檔編號A61P3/00GK101513533SQ20081003371
公開日2009年8月26日 申請日期2008年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者宋浩亮, 張勁濤, 晨 毛, 陳春麟 申請人:上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司;美迪西普亞醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司