專利名稱：人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的靶向納米粒及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種人源化單克隆抗體 Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的耙向納米粒，及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的腫瘤治療方法包括放射治療、化學(xué)治療、生物因子治療等。但這 些治療方法都不是特異性地針對(duì)腫瘤細(xì)胞，即缺乏耙向性。藥物在殺傷腫瘤細(xì) 胞的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞也產(chǎn)生廣泛毒性。致使藥物利用度有限，副作用大， 使用劑量受限。因此，需要一種有效的靶向給藥系統(tǒng)使藥物到達(dá)腫瘤區(qū)。這種 系統(tǒng)不僅可以提高藥物在腫瘤區(qū)的濃度，更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可以減 小對(duì)正常細(xì)胞、組織的損害。細(xì)胞表面具有受體，理論上，可以與特異性配體結(jié)合。由于這種結(jié)合特異 性很強(qiáng)，我們可以利用配體的向?qū)ё饔?，將藥物定向引?dǎo)至目的組織或細(xì)胞，發(fā)揮藥效，實(shí)現(xiàn)耙向治療。Trastuzumab是一種抗HER2抗原的人源化單克隆抗體， 可以特異性地識(shí)別并結(jié)合于細(xì)胞表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體-(HER2)(參見專 利JP3502885、 US5677171、 W02004008099)。已有文獻(xiàn)報(bào)道HER2在許多實(shí)體瘤 中高表達(dá)，如結(jié)子宮內(nèi)膜癌、肺癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌 等(參見文獻(xiàn)Hynes NE， Stern DF. The biology of erbB-2/neu/HER-2 and its role in cancer. Biochem Biophys Acta 1198, 1994, 165-184.)。目前，生物蛋白類藥物治療腫瘤的常用方法是免疫毒素治療。免疫毒素是 一種由毒素蛋白和靶向性配體(抗體或抗體片斷)經(jīng)基因工程技術(shù)組合形成的 融合蛋白。其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制是通過(guò)靶向性配體特異結(jié)合細(xì)胞上的受體， 免疫毒素被細(xì)胞內(nèi)吞后，毒素蛋白促使腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，免疫毒素臨床治 療腫瘤的效果并未達(dá)到令人滿意的程度，多數(shù)免疫毒素停止于臨床I 、 II試驗(yàn)。 主要原因如下首先，毒素蛋白的非特異性肝毒性及血管毒性，可以產(chǎn)生血管 滲漏綜合征(VLS)，由此導(dǎo)致治療劑量受到限制。其次，由于免疫毒素有很強(qiáng)的免疫原性，給藥后人體內(nèi)會(huì)迅速出現(xiàn)抗毒素中和性抗體，從而限制了其臨床的重復(fù)應(yīng)用。因此，在制備免疫毒素時(shí)，如何降低毒素蛋白非特異性毒性、以 及降低其免疫原性的敏感性也是亟待解決的問(wèn)題。蛋白類藥物具有分子量大及空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點(diǎn)，在藥物投遞過(guò)程中極易 受到復(fù)雜的生理環(huán)境影響(特別是大量酶類物質(zhì)的作用)，而使蛋白的結(jié)構(gòu)受到 破壞，導(dǎo)致其活性喪失。而通過(guò)制備納米粒，將蛋白包裹起來(lái)可以有效解決這一問(wèn)題。PLGA (polylactic-co-glycolicacid)是一種可生物降解的聚乳酸聚乙醇 酸嵌段共聚物，具有良好的親水性和生物相溶性，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為注射用 藥用輔料。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種特異性靶向HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的載藥納米粒， 并使所載藥物一毒素蛋白的非特異性毒性和免疫原性的敏感性降低。 本發(fā)明的另一 目的是提供上述納米粒的制備。 本發(fā)明的另一 目的是提供上述納米粒的應(yīng)用。靶向腫瘤細(xì)胞的載藥納米粒，其結(jié)構(gòu)應(yīng)包括(1)配體，可以識(shí)別并結(jié)合腫 瘤細(xì)胞表面特異性受體，易被細(xì)胞內(nèi)吞；(2)可生物降解高分子聚合物制備的 納米粒，包裹并運(yùn)載抗腫瘤藥物；(3)連接基團(tuán)，連接所述配體與納米粒。本發(fā)明選擇PLGA作為制備納米粒的生物可降解高分子聚合物。本發(fā)明在納米，立表面聯(lián)接人源化單克隆抗體Trastuzumab，該抗體可以與腫 瘤細(xì)胞表面HER2抗原結(jié)合并發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞。通過(guò)抗體的引導(dǎo)作用，靶向納米 粒原則上可以應(yīng)用于所有HER2過(guò)度表達(dá)的腫瘤。本發(fā)明將毒素蛋白包裹于納米微粒中，毒素蛋白與正常組織接觸的機(jī)會(huì)將 大大降低，從而降低毒素蛋白非特異性毒性；同時(shí)包裹又可以減少毒素蛋白與 機(jī)體產(chǎn)生的中和性抗體的接觸，可進(jìn)一步降低其免疫原性的敏感性。本發(fā)明提供了一種人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的 耙向納米粒，包括以下結(jié)構(gòu)——配體，為抗HER2人源化單克隆抗體Trastuzumab，該配體可以選擇性地識(shí)別并結(jié)合于腫瘤細(xì)胞表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體-(HER2);——可生物降解高分子聚合物PLGA制備的納米粒，納米粒中包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白藥物；以及——連接基團(tuán)，為酰胺基團(tuán)，連接所述配體與PLGA納米粒。另外，納米粒的粒徑大小也會(huì)影響藥物的靶向性，如果粒徑過(guò)大，則在血液循環(huán)中很容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬，導(dǎo)致藥物迅速清除，無(wú)法實(shí)現(xiàn)靶 向腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的特異性耙向腫瘤細(xì)胞的載藥納米粒的粒徑優(yōu)選范圍為 80-200納米，可以有效減少RES的吞噬，提高藥物制劑的耙向性。上述可生物降解高分子聚合物PLGA為羧基封端的PLGA，粘度為0.3-0.8dl/g。上述的納米粒中包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白藥物是水溶性的抗腫瘤毒素蛋 白，具體是指細(xì)菌毒素(如白喉毒素DT及假單孢菌外毒素PE)或植物毒素 (如蓖麻毒素Ricin)以及它們的突變體。本發(fā)明還提供了上述人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白 的耙向納米粒的制備方法，具體包括以下步驟(A)載藥納米粒的制備采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法(參見文獻(xiàn)S.H. Kim, J.H. Jeong, K.W. Chun, T.G. Park, Target-specific cellular uptake of PLGA nanoparticles coated with poly(L隱lysine)-poly(ethylene glycol)-folate conjugate, Langmuir 21 (19) (2005) 8852-8857.)制備納米粒。即將藥物溶液(Wl)加入溶解PLGA材料的 有機(jī)相(0)，通過(guò)超聲分散制備Wl/0初乳，再將初乳加入PVA溶液(W2) 中進(jìn)行均質(zhì)乳化，獲得Wl/0/W2復(fù)乳。低速攪拌，揮干有機(jī)溶劑，離心收集納 米粒。(B)抗體和納米粒的連接根據(jù)文獻(xiàn)Otilia Vieira, Isabelle Escargueil-blanc, Giinther Jiirgens, et al. Oxidized LDLs alter the activity of the ubiquitin-proteasome pathway: potential role in oxidized LDL-induced apoptosis, The FASEB Journal. 14(2000) 532-542.所公開的化學(xué)偶聯(lián)方法，將抗體Trastuzumab與納米粒的連接。 在偶聯(lián)試劑的催化作用下，載藥納米粒表面上的羧基與配體人源化單克隆抗體 Trastuzumab中的某一氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成酰胺基團(tuán)，進(jìn)而將靶向配體與載 藥納米粒連接，制得靶向納米粒。上述縮合反應(yīng)，形成酰胺基團(tuán)時(shí)，采用多肽縮合類試劑作為催化劑，如 b(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或N-羥基琥珀酰亞胺。 上述縮合反應(yīng)的溫度以15-25"C為宜。本發(fā)明還提供了上述人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白 的靶向納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。特別是特異性靶向抗原HER2高表 達(dá)的腫瘤細(xì)胞，如結(jié)子宮內(nèi)膜癌、肺癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀 胱癌細(xì)胞等。本發(fā)明的納米粒經(jīng)體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié) 果證明生物耙向性良好，體外殺傷耙腫瘤細(xì)胞作用顯著；同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞毒性作用很小。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證明，本發(fā)明的納米粒抗腫瘤效果明顯。


圖l本發(fā)明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的納米粒粒徑分布2本發(fā)明的納米粒連接抗體Trastuzumab過(guò)程示意3本發(fā)明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4本發(fā)明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的耙向納米粒的體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5本發(fā)明的包裹毒素蛋白PE38KDEL的靶向納米粒的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6本發(fā)明的包裹毒素蛋白R(shí)ICINA的納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖7本發(fā)明的包裹毒素蛋白R(shí)ICINA的靶向納米粒的體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。 實(shí)施例1:抗腫瘤毒素蛋白PE38KDEL分離純化PE38是細(xì)菌毒素中假單孢菌外毒素(pseudomonas extoxin , PE)的一種，分子 量為38KD， PE38KDEL是優(yōu)選的PE38突變體，具有非特異性毒性小的優(yōu)點(diǎn)。參照文獻(xiàn)Song S， Xue J， Fan K, et al. Preparation and characterization of fUsion protein truncated Pseudomonas Exotoxin A (PE38KDEL) in Escherichia coli. Protein Expr Purif 2005; 44: 52-7.方法，首先構(gòu)建PE38KDEL的pET表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn) 入工程菌BL21(DE3)中，利用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出PE38KDEL毒素蛋白。 然后，通過(guò)鎳柱親和層析的方法來(lái)得到在細(xì)菌中可溶性表達(dá)的PE38KDEL。最 后通過(guò)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物體外蛋白翻譯系統(tǒng)，細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí) PE38KDEL的活性。實(shí)施例2:包裹抗腫瘤毒素蛋白PE38KDEL納米粒的制備用BCA法精密測(cè)定分離純化后毒素蛋白PE38KDEL的水溶液的濃度，濃度 范圍在2-10mg/ml為宜。將PLGA溶于1體積的乙酸乙酯中，PLGA濃度范圍 (10-40mg/ml)，加入1/12-1/5體積的蛋白毒素溶液，探頭超聲2分鐘(100W) 后加入到等體積的3XPVA溶液中，均質(zhì)乳勻機(jī)乳化2分鐘(轉(zhuǎn)速22000rpm) 形成復(fù)乳；將上述復(fù)乳溶液倒入10體積的0.3XPVA溶液中低速攪拌6-8小時(shí)， 高速離心機(jī)離心30min (30000 rpm)，蒸餾水重懸洗滌三次，加少量甘露醇冷凍干燥24小時(shí)，即得載藥納米粒。粒徑分布范圍為80-200nm，如圖1所示。 實(shí)施例3:抗體和納米粒表面的連接取冷凍干燥后的載藥納米粒IO毫克，分別加入lml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(200-500mM)和lml的N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (50-200mM)，溫和攪拌15分鐘，將得到的N-羥基琥珀酰亞胺活化納米粒，立 即加入抗體Trastuzumab (商品名Herceptin，購(gòu)買于Genentech公司)(含量為占 納米?？傊亓康?-5%)，溫和攪拌15分鐘，離心收集，即可得人源化單克隆抗 體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白PE38KDEL的PLGA納米粒。詳見圖2。 實(shí)施例4:毒素蛋白PE38KDEL納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)精密稱取載PE38KDEL納米粒與空白納米粒20mg分別置于7ml離心管中， 加入一定體積10mMpH7.2磷酸鹽緩沖液。將離心管放在37'C恒溫水浴搖床中， 以100rpm速度振蕩。分別在指定的時(shí)間點(diǎn)(0—480小時(shí))取出離心管，30000rpm 速度離心30min，吸取釋放介質(zhì)，待測(cè)。更換等量新的釋放介質(zhì)后，將離心管放 回水浴搖床中，繼續(xù)操作。以空白納米粒釋放的上清液作為空白對(duì)照，按Micro BCA試劑盒要求進(jìn)行操作，測(cè)定釋放液于562nm波長(zhǎng)處的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲 線計(jì)算求得釋放液中毒素蛋白PE38KDEL的含量。結(jié)果見圖3。藥物在釋放初期突釋效應(yīng)明顯，1小時(shí)累積釋藥達(dá)24.5%， 72 小時(shí)后藥物累積釋放達(dá)80%。之后，藥物在納米粒中緩慢釋放大約3周。 實(shí)施例5:毒素蛋白PE38KDEL靶向納米粒的體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們采用96孔板細(xì)胞增值試驗(yàn)(Ce11 Titer 96 non-radioactive cell proliferation assay kit)來(lái)評(píng)價(jià)靶向納米粒的體外抗腫瘤效果。將乳腺癌BT-474細(xì)胞(HER2抗 原高表達(dá)細(xì)胞)和MCF-7細(xì)胞(表面無(wú)HER2抗原的陰性對(duì)照)(細(xì)胞購(gòu)于中國(guó) 科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)分別按3X 104每孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 取不同濃度的PE38KDEL靶向納米粒(0.1 10,000 pM ) 20(^1分別加到樣品孔中， 后將培養(yǎng)板于二氧化碳孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)。取出培養(yǎng)板，在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中 加入20^1的MTS/PMS溶液。再經(jīng)過(guò)2小時(shí)培養(yǎng)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定96孔培養(yǎng)板 中樣品孔在490nm處的吸光度。獲得靶向納米粒的殺傷曲線，計(jì)算求出其1<35()值。 以同樣方法，將無(wú)Trastuzumab靶向的載藥納米粒與未包裹的PE38KDEL原藥(三 組中PE38KDEL藥量相等)，分別加入至(JBT-474、 MCF-7細(xì)胞中作為對(duì)照組試驗(yàn)，比較靶向納米粒的抗腫瘤效果。結(jié)果見圖4，靶向納米粒對(duì)HER2高表達(dá)細(xì)胞殺傷效果明顯(IC5o-46pM),而 對(duì)無(wú)HER2抗原的細(xì)胞無(wú)明顯作用(IC5o^80pM)。說(shuō)明靶向納米粒的的靶向性良好，對(duì)其它細(xì)胞毒性作用很小。同時(shí)，對(duì)比對(duì)照組結(jié)果，靶向納米粒的體外抗腫瘤效果明顯，分別是無(wú)Tmstuzumab耙向的載藥納米粒與未包裹的 PE38KDEL原藥組的10、 ll倍。實(shí)施例6:毒素蛋白PE38KDEL靶向納米粒的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)選取40支鼠齡為4周的BALB/c裸鼠，背部注射0.5ml濃度8x106個(gè)/ml的 BT-474細(xì)胞，構(gòu)建小鼠乳腺癌模型。將40只雌雄各半的BALB/c裸鼠乳腺癌模型 隨機(jī)分為4組即:靶向納米微粒、載藥納米粒組、原藥組、對(duì)照組。具體分組情況 如下1、 靶向納米微粒組(10只)將Trastuzumab修飾的包裹PE38KDEL的靶向納 米粒分散于生理鹽水中，從裸鼠尾靜脈注射(相當(dāng)于0.5mg毒素蛋白/kg)。2、 載藥納米微粒組(10只):將載PE38KDEL納米粒分散于生理鹽水中，從裸 鼠尾靜脈注射(相當(dāng)于0.5mg毒素蛋白/kg)。3、 PE38KDEL原藥組(10只):將PE38KDEL分散于生理鹽水中，從裸鼠尾靜 脈注射(0.5mg毒素蛋白/kg)。4、 對(duì)照組(10只):尾靜脈注射生理鹽水。連續(xù)2天同樣劑量藥物加強(qiáng)治療。以腫瘤體積作為治療指標(biāo)進(jìn)行觀察，隨后 每5天測(cè)定一次，觀察50天，計(jì)算公式為腫瘤體積=(長(zhǎng)度X寬度2) /2。結(jié)果如圖5所示。對(duì)比對(duì)照組結(jié)果，靶向納米粒組活體抑制腫瘤生長(zhǎng)效果明 顯，腫瘤平均體積顯著減小。實(shí)施例7:包裹抗腫瘤毒素蛋白R(shí)ICINA的靶向納米粒的制備Ricin A是植物毒素中蓖麻毒素的突變體，目前常用于免疫毒素的合成 (Jinbiao Zhan, Yongdui Chen, Keyi Wang, Shu Zheng.Expression of ricin A chainand ricin A chain-KDEL in Escherichia coli. Protein Expression and Purification34 ;2004:197—201)。采用與實(shí)施例2，實(shí)施例3相同的方法進(jìn)行制備，亦可制得Trastuzumab修飾的包裹RICINA的靶向PLGA納米粒。粒徑分布范圍為80-200nm。實(shí)施例8:毒素蛋白R(shí)icinA納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)參照實(shí)施4方法，將Ricin A納米粒與空白納米粒的磷酸鹽溶液，放于37"C恒溫水浴搖床中振蕩。分別在指定的時(shí)間點(diǎn)(0—240小時(shí))取出吸取釋放介質(zhì)，按照Micro BCA試劑盒方法，測(cè)定釋放介質(zhì)562nm處吸光度，計(jì)算求得釋放液中毒素蛋白R(shí)icin A的含量。結(jié)果如圖6小時(shí)后藥物累積釋放達(dá)80%。之后，藥物在納米粒中平穩(wěn)釋放大約10天。 實(shí)施例9:毒素蛋白R(shí)icinA靶向納米粒的體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)參照實(shí)施5方法評(píng)價(jià)靶向納米粒的體外抗腫瘤效果。取不同濃度的RICIN A 靶向納米粒，加到接種BT-474細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)48 小時(shí)后，培養(yǎng)孔中加入MTS/PMS溶液。再經(jīng)過(guò)2小時(shí)培養(yǎng)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣 品孔在490nm處的吸光度。獲得靶向納米粒的殺傷曲線，計(jì)算求出其IC"直。以 非靶向的載藥納米粒與未包裹的Ricin A原藥同法對(duì)照試驗(yàn)，比較包裹Ricin A的 靶向納米粒的抗腫瘤效果。結(jié)果如圖7所示，與實(shí)施5相似，靶向納米粒對(duì)BT-474細(xì)胞殺傷效果明顯 (ICso = 88 pM),而對(duì)MCF-7細(xì)胞無(wú)明顯作用(IC5oM200pM)。靶向納米粒較對(duì) 照組體外抗腫瘤效果明顯，分別是非靶向載Ricin A納米粒與未包裹的Ridn A 原藥組的9、 10倍。
權(quán)利要求
1、一種人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的靶向納米粒，包括以下結(jié)構(gòu)，且粒徑范圍為80-200納米配體，為抗HER2人源化單克隆抗體Trastuzumab；包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白的PLGA納米粒；以及連接基團(tuán)，為酰胺基團(tuán)，連接配體與PLGA納米粒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白 的靶向納米粒，其特征在于其中的PLGA為羧基封端的PLGA，粘度為0.3-0.8 dl/g。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白 的耙向納米粒，其特征在于其中的抗腫瘤毒素蛋白是細(xì)菌毒素或植物毒素，以 及它們的突變體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白 的靶向納米粒，其特征在于其中的細(xì)菌毒素是白喉毒素或假單孢菌外毒素。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白 的靶向納米粒，其特征在于其中的植物毒素是蓖麻毒素。
6、 一種如權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋 白的耙向納米粒的制備方法，包括以下步驟(A) 采用復(fù)乳一溶劑揮發(fā)法制備包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白的PLGA納米粒；(B) 采用化學(xué)偶聯(lián)方法，將PLGA納米粒表面上的羧基與配體人源化單克 隆抗體Trastuzumab中的某一氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成酰胺基團(tuán)，進(jìn)而將配體與 PLGA納米粒連接。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟(A) 將藥物溶液(Wl)加入溶解PLGA材料的有機(jī)相(0)，通過(guò)超聲分 散制備W1/0初乳，再將初乳加入PVA溶液(W2 )中進(jìn)行均質(zhì)乳化，獲得 Wl/0/W2復(fù)乳，低速攪拌，揮干有機(jī)溶劑，離心收集納米粒；(B) 在偶聯(lián)試劑的催化作用下，將PLGA納米粒表面上的羧基與配體人源 化單克隆抗體Trastuzumab中的某一氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成酰胺基團(tuán)，進(jìn)而將 配體與PLGA納米粒連接，制得人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素 蛋白的耙向納米粒；上述偶聯(lián)試劑是多肽縮合類試劑作為催化劑； 上述縮合反應(yīng)的溫度為15-25°C。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于其中的多肽縮合類試劑是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或N-羥基琥珀酰亞胺。
9、 一種如權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體Tmstuzumab修飾的包裹毒素蛋 白的耙向納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白 的靶向納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中的腫瘤是子宮內(nèi)膜癌、肺癌、 直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌或膀胱癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如放射治療、化學(xué)治療、生物因子治療等缺乏靶向性，免疫毒素治療又存在著毒素蛋白的非特異性毒性和免疫原性的敏感性等問(wèn)題。本發(fā)明的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的靶向納米粒，在納米粒表面聯(lián)接Trastuzumab，可與腫瘤細(xì)胞表面HER2抗原結(jié)合并發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞；毒素蛋白包裹于納米粒中，可降低毒素蛋白非特異性毒性和免疫原性的敏感性。本發(fā)明還提供了上述納米粒的制備與應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明生物靶向性良好，體外殺傷靶腫瘤細(xì)胞作用顯著；同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞毒性作用很小。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證明，本發(fā)明的納米?？鼓[瘤效果明顯。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101249262SQ20081003570
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者孫治國(guó), 庚 寇, 翮 張, 張欣榮, 莉 樊, 郭亞軍, 鐘延強(qiáng), 陳懷文, 潔 高, 瑩 魯 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)