專利名稱：靛玉紅在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靛玉紅的新用途，具體涉及靛玉紅在制備抑制血管新生藥物中的 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生是在已有血管基礎(chǔ)上產(chǎn)生新血管的過程，包括五個(gè)基本過程①血 管基底膜降解；②內(nèi)皮細(xì)胞穿過基底膜遷移到血管周圍基質(zhì)；③內(nèi)皮細(xì)胞增殖、 相互黏附并連接；④形成管腔樣結(jié)構(gòu)；⑤基質(zhì)重塑和平滑肌細(xì)胞的包繞及血管 的相互吻合形成血管網(wǎng)。血管新生在生理和病理?xiàng)l件下都有發(fā)生，生理性血管新生主要發(fā)生在胚胎發(fā) 育和女性生理周期，對(duì)于正常的發(fā)育非常關(guān)鍵；病理性血管新生是許多種重大疾 病發(fā)生的重要原因，包括腫瘤、心血管疾病、糖尿病等，另外，關(guān)節(jié)炎、角膜、 視網(wǎng)膜血管新生及老年黃斑病變等眼科疾病等都涉及血管新生。腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移依賴于血管新生，腫瘤在沒有養(yǎng)分的供應(yīng)下， 一般只能長 到2 — 3立方毫米， 一旦有新生血管與其相連，腫瘤獲得營養(yǎng)，以幾何級(jí)數(shù)迅速 生長，同時(shí)腫瘤細(xì)胞還可以通過新生血管轉(zhuǎn)移到其他器官，引起腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致 人體死亡，因此，抑制血管新生可以抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移，血管新生對(duì)腫瘤研究 具有重要意義。2004年美國FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)血管新生抑制劑用于治療結(jié)腸癌，現(xiàn)有多種 類似制劑在進(jìn)行臨床試驗(yàn)， 一些中草藥單體也已被發(fā)現(xiàn)具有抗血管新生的作用。 靛玉紅(Indirubin)是一種中草藥單體，主要來源于馬藍(lán)(5ap/^acw7^^cim'a)、蓼藍(lán)(Po/少gcwwm /"iw"w7-w 7)及菘藍(lán)(7《ato /wcZ/go/"/ca)等禾直物。雖然己有報(bào)道稱靛玉紅可以直接作用于腫瘤細(xì)胞而具有抗癌作用，但是目前還沒有靛玉紅抑制血管新生的報(bào)道，或通過抑制血管新生來抑制腫瘤，也沒有靛玉紅作為抑制血管新生藥的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供靛玉紅在制備血管新生藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是靛玉紅在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用，尤其是靛玉 紅在制備抑制眼科疾病、腫瘤、關(guān)節(jié)炎、血管瘤、銀屑病等血管新生性疾病。其 中制備治療眼科疾病的藥物中眼科疾病是指抑制新生血管性眼病的藥物；新生血 管性眼病為新生血管性角膜疾??；或者新生血管性視網(wǎng)膜疾病；或者抑制血管新 生性虹膜疾??；或者抑制新生血管性青光眼；或者新生血管性脈絡(luò)膜疾病；或者 新生血管性結(jié)膜眼病；或者新生血管性玻璃體眼??；或者新生血管性視神經(jīng)疾病。 其中網(wǎng)膜病為糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞或者早熟性視網(wǎng)膜病；新生血 管性脈絡(luò)膜疾病為濕性老年黃斑病變。靛玉紅在制備治療制關(guān)節(jié)炎病變組織的血管新生的藥物中的應(yīng)用，其中關(guān)節(jié) 炎是指類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎性關(guān)節(jié)炎。 .本發(fā)明還提供靛玉紅作為制備治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用，其中血管瘤為多 發(fā)性血管瘤或者血管母細(xì)胞瘤。本發(fā)明還提供靛玉紅作為制備治療銀屑病病變組織血管新生的藥物。本發(fā)明還提供靛玉紅作為制備治療抑制實(shí)體瘤病變組織血管新生的藥物，其 中實(shí)體瘤為原發(fā)性或者繼發(fā)性的實(shí)體瘤。提供靛玉紅作為制備治療抑制血管新生藥物為抑制Kaposi' s肉瘤病變組織 血管新生的藥物，以及制備治療抑制血管新生藥物為抑制白血病、淋巴瘤、骨髓 瘤血液癌癥的藥物，以及制備治療抑制血管新生藥物為抑制Paget' s疾病的藥 物。根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效量的靛玉紅和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制成 藥物組合物，也可以添加其他與靛玉紅沒有拮抗作用的其他抗血管新生藥物。其 制劑可以是藥學(xué)上的任意一種劑型，包括但不限于散劑、片劑、濃縮丸、分散片、 顆粒劑、大輸液、糖漿、滴丸、膠囊劑、半膠囊劑、丸劑、茶劑、酒劑、噴霧劑、 搽劑、貼膏劑、軟膏劑、口服液、注射劑、栓劑、脂質(zhì)體、舌下含片、懸浮劑、 溶液劑等制劑。施用該藥物的載體可采用一種以上固體、半固體或液體狀的稀釋劑、填充劑 及其他處方用的輔助劑。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可經(jīng)口服藥、組織內(nèi)給藥、局部給 藥(經(jīng)皮給藥等)或直腸內(nèi)給藥。以適合于這些給藥方法的劑型投藥,例如特別好的是口服給藥。本發(fā)明公開了靛玉紅的新用途，及靛玉紅在制備血管新生藥物中的應(yīng)用。實(shí) 驗(yàn)表明，靛玉紅在HMEC-1(人微血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、HUVEC (人臍靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、HUVEC細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)體外劃痕遷移 實(shí)驗(yàn)、HUVEC細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)修飾的Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)、 HMEC-1(人微血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)、雞胚尿囊膜血管新生等均有明顯的 抑制作用，可用于制備抑制血管新生的藥物。


圖1:靛玉紅抑制HMEC-1及HUVEC細(xì)胞的增殖圖2:靛玉紅抑制HUVEC細(xì)胞體外劃痕遷移照片圖3:靛玉紅抑制HUVEC細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移照片圖4:靛玉紅抑制HMEC — 1細(xì)胞的成管照片圖5:靛玉紅抑制雞胚尿囊膜新生血管形成的照片具體實(shí)施方式
實(shí)施伊J 1:靛玉紅抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖目的和原理內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTS assay。 MTS assay是一種運(yùn)用比 色法間接測(cè)量活細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定方法。在活細(xì)胞中，線粒體中的NADPH脫氫酶 將MTS四唑鹽化合物轉(zhuǎn)變成一種溶于細(xì)胞培養(yǎng)液的有色物質(zhì)?；罴?xì)胞數(shù)越多， 就可以更多地轉(zhuǎn)變四唑鹽成為這種有色物質(zhì)。所以測(cè)定該物質(zhì)在490nm處的光 吸收值可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量。通過該方法可評(píng)價(jià)藥物對(duì)兩種內(nèi)皮細(xì)胞增殖 能力的影響。方法96孔板中接入內(nèi)皮細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)或人微血管 內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)，設(shè)置對(duì)照組和加樣組，對(duì)照組不加靛玉紅，加樣組加入 含有不同濃度靛玉紅的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)濃度重復(fù)三個(gè)孔，作用48 72小時(shí)后， 加入20plCellTiter 96 Aqueous細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，孵育3小時(shí)，用酶標(biāo)儀在 4卯nm處檢測(cè)光吸收值。結(jié)果與評(píng)價(jià)與對(duì)照組相比，加入靛玉紅的實(shí)驗(yàn)組，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力受 到抑制，說明靛玉紅可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。實(shí)施例2:靛玉紅抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外劃痕遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮硗ㄟ^觀察、記錄、統(tǒng)計(jì)有或無藥物作用下，劃痕處新遷入的內(nèi) 皮細(xì)胞的數(shù)量，來評(píng)價(jià)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。方法6孔板中接入人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細(xì)胞，待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)期， 用微量移液器Tip頭劃十字線，用PBS洗凈劃下的細(xì)胞，加入含不同藥物濃度及 4ng/mlVEGF的培養(yǎng)基，于5%C02培養(yǎng)箱中37。C培養(yǎng)至劃線兩側(cè)的細(xì)胞遷移至 劃線區(qū)域中央。結(jié)果與評(píng)價(jià)在OLYMPUS倒置顯微鏡下觀察拍照統(tǒng)計(jì)，結(jié)果為其中A為 對(duì)照組；B為含靛玉紅100nM組。與對(duì)照組相比，加入靛玉紅后，人臍靜脈內(nèi) 皮細(xì)胞(HUVEC)的遷移受到抑制，說明靛玉紅可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的 遷移。實(shí)施例3:靛玉紅抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn) 目的和原理Boyben小室最初是Boyden發(fā)明的，用于研究白細(xì)胞的趨化性， 這種研究基于小室被微孔分離成兩個(gè)部分。細(xì)胞置于上面的部分，下面的部分含 有趨化因子，在趨化因子的誘導(dǎo)下，上層可以穿過微孔膜遷移至膜的底部并貼附 在膜的背面。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)采用Millicell(Millipore)細(xì) 胞培養(yǎng)小室。細(xì)胞在生長因子的誘導(dǎo)下可以透過孔徑為8pm的多聚碳酸鹽濾膜， 此實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞穿過微孔膜能力的影響。方法用0.1%的明膠將小室包被，5%C02培養(yǎng)箱中37'C孵育20分鐘，棄 去明膠，用PBS洗三遍。小室外六孔板中加入600 u 1含有20%血清和10ng/ml 的VEGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。小室中接入20000個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞在37'C 5%(302培養(yǎng) 箱中孵育四小時(shí)。結(jié)果與評(píng)價(jià)四小時(shí)后，將小室內(nèi)外的細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，用棉棒將上層細(xì)胞 拭去，將小室浸泡在4%多聚甲醛中固定20分鐘，用PBS洗三遍吸干，蘇木精 伊紅染色，用PBS將背景多余染料洗去，室溫晾干。OLYMPUS顯微鏡下拍照 計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果為其中A為對(duì)照組；B為含靛玉紅100nM組。與對(duì)照組 比，給予靛玉紅后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞穿過Boyden小室的能力受到抑制，說明 靛玉紅可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞穿過微孔膜的能力。實(shí)施例4:靛玉紅抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮鞰atrigel是從小鼠肉瘤EHS ( Engkebreth-Holm-Swarm)中抽提得到的可容性基底膜抽提物。富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其主要成份是層粘連蛋白、膠原rv、硫酸肝素糖蛋白、TGF-e等。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人微管內(nèi)皮細(xì)胞可以在Matrigd上貼附成管，可以利用人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在Mtrigel上的這種成管 特性來研究藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響。方法將Matrigel鋪到24孔板上，37°C, 5%C02，放置30min待其多聚化。 每孔加入60000個(gè)細(xì)胞，加入含有不同濃度靛玉紅的培養(yǎng)基，混勻。于37'C 5 XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h，在顯微鏡下觀察微管形成情況，每孔選擇四個(gè)不同 部位，計(jì)算微管形成數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果與評(píng)價(jià)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel中生長16-18h后，細(xì)胞Matrigel中延伸生長，單個(gè)細(xì)胞巻成管裝相互連接，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果為其中A: 對(duì)照組；B:lOpM。與對(duì)照組相比，給予靛玉紅之后，內(nèi)皮成管過程受到影響， 三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，說明靛玉紅可以抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞微管形成。 實(shí)施例5:靛玉紅抑制雞胚尿囊膜血管新生目的和原理雞胚尿囊膜模型目前來說，是一種較為理想的國內(nèi)外篩選血管 新生類藥物公認(rèn)的篩選模型。經(jīng)含藥物載體置于受精雞胚尿囊膜表面的無血管 區(qū)，可觀察到藥物對(duì)新的微血管生成的影響。方法將受精的雞胚置于孵化箱中孵化5天，在超凈工作臺(tái)中，用70%酒精 浸泡的棉球擦拭其表面,在卵殼鈍端用鑷子小心地開一個(gè)直徑約0.5厘米的小口 ， 觀察胚胎所在位置，剝除外殼，撕開氣室膜，露出尿囊膜。將含不同量的靛玉紅加到直徑為0.5平方毫米的滅菌濾紙上，將濾紙片加在尿囊膜上無血管區(qū)，用滅菌膠帶封口，繼續(xù)孵育。(A:對(duì)照組，不加靛玉紅B: 10)^g/disc)結(jié)果與評(píng)價(jià)放入濾紙的雞胚繼續(xù)孵育兩天后，揭去膠帶，在OLYMPUS體 視顯微鏡下拍照，計(jì)算濾紙周圍2.5毫米環(huán)形范圍內(nèi)新生微血管數(shù)量，統(tǒng)計(jì)。結(jié)果為與對(duì)照組比較，加靛玉紅之后，新的微血管生成受到抑制，說明靛玉紅可 以抑制雞胚尿囊膜新血管的生成。
權(quán)利要求
1. 靛玉紅在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制腫瘤血 管新生的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制關(guān)節(jié)炎 病變組織的血管新生的藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者炎 性關(guān)節(jié)炎。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制新生血管性眼病的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于新生血管性眼病為新生血管性角 膜疾病；或者新生血管性視網(wǎng)膜疾病；或者抑制血管新生性虹膜疾病；或者抑制 新生血管性青光眼；或者新生血管性脈絡(luò)膜疾?。换蛘咝律苄越Y(jié)膜眼??；或 者新生血管性玻璃體眼病；或者新生血管性視神經(jīng)疾病。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于視網(wǎng)膜病為糖尿病性視網(wǎng)膜病、 視網(wǎng)膜靜脈閉塞或者早熟性視網(wǎng)膜病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于新生血管性脈絡(luò)膜疾病為濕性老 年黃斑病變。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制血管瘤 病變組織血管新生的藥物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于血管瘤為多發(fā)性血管瘤或者血 管母細(xì)胞瘤。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制銀屑 病病變組織血管新生的藥物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制實(shí)體 瘤病變組織血管新生的藥物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于實(shí)體瘤為原發(fā)性或者繼發(fā)性的 實(shí)體瘤。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制 Kaposi， s肉瘤病變組織血管新生的藥物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征布于抑制血管新生藥物為抑制白血 病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌癥的藥物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制Paget' s疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及靛玉紅的新用途，具體涉及靛玉紅在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。靛玉紅在制備抑制眼科疾病、腫瘤、關(guān)節(jié)炎、血管瘤、銀屑病等血管新生性疾病。實(shí)驗(yàn)表明，靛玉紅在HMEC-1(人微血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、HUVEC細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)體外劃痕遷移實(shí)驗(yàn)、HUVEC細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)修飾的Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)、HMEC-1(人微血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)、雞胚尿囊膜血管新生等均有明顯的抑制作用，可用于制備抑制血管新生的藥物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101284005SQ20081003810
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者劉明耀, 盧彬彬, 京 張, 張曉麗, 易庭芳, 易正芳, 力 賴 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)