專利名稱：紫鉚因在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫鉚因的新用途，具體涉及紫鉚因在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生，是在原有血管基礎(chǔ)上產(chǎn)生新血管的過程。血管新生過程包括了 5 個步驟l.血管新生刺激因子的產(chǎn)生；2.靜息內(nèi)皮細(xì)胞血管新生顯型的變化，后 者被激活；3.內(nèi)皮細(xì)胞侵襲，基底膜降解；4.細(xì)胞外基質(zhì)重塑，增殖和移動；5. 內(nèi)皮細(xì)胞聚集，形成新的微血管，血管周細(xì)胞的補(bǔ)充和新基質(zhì)膜的獲得。通賞情 況下，血管新生發(fā)生在胚胎和胚胎發(fā)育后期、生殖周期和傷口愈合期，受到各種 相關(guān)因子的調(diào)控，處于動態(tài)平衡狀態(tài)；如果該，態(tài)失衡(即血管新生過?；虿蛔?， 可引起多種疾病。
己知有70多種疾病與血管新生有關(guān)，如腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、心血管 疾病、血管瘤、關(guān)節(jié)炎、銀屑病和動脈硬化癥等均與血管新生密切相關(guān)。
腫瘤一直對人類健康造成極大威脅，其生長和轉(zhuǎn)移都依賴于血管新生。腫瘤 生長包括血管前期與血管期，在血管前期，腫瘤一.般長至2 3立方毫米，為了自 身的生長，腫瘤分泌血管生長因子(如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)，腫瘤生長進(jìn)入 血管期，獲得更多的營養(yǎng)，以幾何級數(shù)迅速生長；腫瘤還通過新生的血管排除其 代謝產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)移到人體其他部位，形成腫瘤轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致人體死亡，因此抑 制血管新生是抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的有效途徑，已經(jīng)有多種血管新生抑制劑用于 臨床腫瘤治療或處于臨床試驗階段，血管新生療法已經(jīng)被全球科學(xué)界稱為繼放 療、化療、手術(shù)治療后的第四種腫瘤治療方法。
相對傳統(tǒng)的化療放療等治療方式，抗血管新生療法靶向于腫瘤的微血管而不 是腫瘤本身，具有療效明顯、毒副作用小等諸多優(yōu)點。它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖 及其活性；直接抑制血管新生蛋白的產(chǎn)生，或者中和這些蛋白的作用；或是通過 阻止血管新生蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞的作用而起效?？寡苄律幬锏牟粩喟l(fā)展已成為 治療癌癥和其他血管新生依賴性疾病的有效方法。
一些中草藥單體被發(fā)現(xiàn)具有抗血管新生的作用。紫鉚因(Biitein)又稱紫鉚 花素，是一種植物多酚類物質(zhì)，為腰果樹(&wecwpMa"flcan/^m)的莖皮，黃檀 屬(Z)a/^rgZaoJon/era)的心皮，傳統(tǒng)的中藏藥本草錦雞屬(Caraga"aj'wk7toJ 以及漆樹a/mswra/";/7皿J的莖的主要活性成分。以前的報道表明，紫鉚因可
以直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖而具有抗腫瘤活性，還具有抑制糖尿病綜合癥、抗炎等 作用，但是目前還沒有報道顯示紫鉚因可以抑制新生，或通過抑制血管新生抑制 腫瘤，也沒有作為抑制血管新生藥的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)紫鉚因作為一種新的血管生成抑制劑的藥理用途。 本發(fā)明在于紫鉚因在制備血管新生抑制藥物中的應(yīng)用，尤其是紫鉚因在制備
抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、
血管瘤等血管新生依賴性疾病中的相關(guān)應(yīng)用。
本發(fā)明提供紫鉚因在制備抑制腫瘤血管新生的藥物中的應(yīng)用，以及制備抑制
關(guān)節(jié)炎病變組織的血管新生的藥物中的應(yīng)用，所述的關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和
炎性關(guān)節(jié)炎。 '
本發(fā)明還提供紫鉚因在制備抑制新生血管:性眼病的藥物中的應(yīng)用。其中新生 血管性眼病為新生血管性角膜疾病、新生血管性視網(wǎng)膜疾病、血管新生性虹膜疾 病、新生血管性結(jié)膜眼病、生成血管型白內(nèi)障、新生血管性玻璃體眼病、新生血 管性視神經(jīng)疾病、新生血管性青光眼或者新生血管性脈絡(luò)膜疾病。而且其中新生 血管性視網(wǎng)膜疾病為糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變
或者視網(wǎng)膜動脈閉塞；新生血管性脈絡(luò)膜疾病為濕性老年黃斑病變。
本發(fā)明還提供紫鉚因在制備抑制血管瘤病變組織血管新生的藥物中的應(yīng)用； 制備抑制銀屑病病變組織血管新生的藥物中的應(yīng)用；制備抑制實體瘤病變組織血 管新生的藥物中的應(yīng)用；制備抑制血管瘤的藥物中的應(yīng)用。其中，實體瘤為原發(fā) 性或者繼發(fā)性的實體瘤；血管瘤為多發(fā)性血管瘤或者血管母細(xì)胞瘤。
本發(fā)明還提供紫鉚因在制備抑制Kaposi'， s肉瘤病變組織血管新生的藥物中 的應(yīng)用；制備抑制白血病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌癥的藥物中的應(yīng)用；以及制 備抑制Paget' s疾病的藥物中的應(yīng)用，以及紫鉚因在制備血管新生抑制劑組合 物上的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效量的紫鉚因和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制成 藥物組合物，也可以添加其他與紫鉚因沒有拮抗作用的抗血管新生藥物'。其制劑 可以是藥學(xué)上的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、'膠囊劑、丸劑、口 服液、注射劑、脂質(zhì)體等。
為實施本發(fā)明的方法，紫鉚因可通過口服、腸胃外、吸入式噴霧或通過植入 式ie存器給藥。"腸胃外"包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、 滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸入技術(shù)。
口服可用固體或液體狀的劑量單位，如末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、 顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、舌下含片等劑型進(jìn)行給藥。末劑是將本發(fā)明化合物磨成適當(dāng)?shù)募?xì)度而制成。散劑是將本發(fā)明化合物磨成 適當(dāng)?shù)募?xì)度，然后與同樣細(xì)度的醫(yī)藥用載體(如載體、甘露糖醇之類可貪性碳水 化合物等)混合制成。根據(jù)需要，也可混入矯味劑、防腐劑、分散劑、著色劑、
香料等物質(zhì)。
膠囊劑是將如上所述制成粉末狀的末劑和散劑或入片劑部分所述的顆粒化的 物質(zhì)填充到如明膠膠囊外殼中而制成。也可將潤滑劑和助流劑等混合到粉末狀物 質(zhì)中，然后在膠囊中進(jìn)行填充操作。若添加助溶劑和崩解劑等，如聚乙二醇，碳 酸鈉，可改善膠囊攝取時的藥效。
本發(fā)明公丌了紫鉚因在制備血管新生藥物中的應(yīng)用。實驗表明，紫鉚因在人 臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖實驗、HUVEC細(xì)胞遷移實驗、HUVEC細(xì)胞 侵襲實驗、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)細(xì)胞成管實驗、雞胚尿囊膜血管新生 等均有明顯的抑制作用，可用于制備抑制血管新生的藥物。


圖1:紫鉚因抑制HUVEC細(xì)胞的增殖
圖2:紫鉚因抑制HUVEC細(xì)胞的體外劃痕遷移照片
其中A.對照；B.10nM紫鉚因 圖3:紫鉚因抑制HUVEC細(xì)胞的修飾的Boyden小室遷移照片
其中A.對照；B.100nM紫鉚因 圖4:紫鉚因抑制HMEC—1細(xì)胞的成管照片 其中A.對照；B.10yM紫鉚因
圖5:紫鉚因抑制雞胚尿囊膜新生血管形成的照片 其中A.對照;B. l嗎/disc紫鉚因
具體實施例方式
實施例1:紫鉚因抑制HUVEC細(xì)胞增殖
目的和原理細(xì)胞增殖實驗采用MTS assay。 MTS assay是一種在活細(xì)胞中 運(yùn)用比色法確定細(xì)胞增殖數(shù)量的測定方法。NADPH脫氫酶將MTS四唑鹽化合 物轉(zhuǎn)變成一種溶于組織培養(yǎng)液的一種有色物質(zhì)，其顏色深淺與細(xì)胞株的活細(xì)胞數(shù) 目在一定范圍內(nèi)高度相關(guān)。通過該模型可評價藥物對細(xì)胞增殖能力的影響。
方法將1 X 105個/ml的HUVEC細(xì)胞懸液接種于96孔板中，分別加入含 有不同濃度紫鉚因的培養(yǎng)基作用48小時，然后每孔加入顯色劑，孵育3小時， 再用酶標(biāo)儀在490nm處讀出每個孔中的光吸收值。
結(jié)果與評價與對照組相比，加入紫鉚因后，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力奪到抑制， 說明紫鉚因可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。 '
實施例2:紫鉚因抑制HUVEC細(xì)胞體外劃痕遷移實驗
目的和原理細(xì)胞遷移實驗又叫體外劃痕實驗。本實驗通過在培養(yǎng)板中長滿 的單層內(nèi)皮細(xì)胞上制造劃痕，在顯微鏡下觀察，并記錄下劃痕邊緣細(xì)胞朝劃痕部 位遷移的情況，來評價藥物對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。 '
方法將細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞長至卯％以上，用微量移液器的lml
的吸頭在每孔中劃一條線。用PBS將劃掉的死細(xì)胞洗凈，再加入VEGF165以及 含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基，于5。/。C02培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)約24小時左右，直至
VEGF!65組長滿。
結(jié)果與評價在顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果為其中A為對照組；B為10nM
紫鉚因，與對照組相比，給予紫鉚因后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受到抑制，說明紫鉚因 可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動。
實施例3: 紫鉚因抑制HUVEC細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移實驗
目的和原理內(nèi)皮細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移實驗采用Millicell (Millopore) 小室。修飾的Boyden小室是一類可插入細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)皿，底層有孔徑為8他 的多聚碳酸鹽濾膜，在生長因子的誘導(dǎo)下細(xì)胞可以透過膜的一側(cè)粘附于含有高濃 度生長因子的另一側(cè)。此實驗可以檢測藥物對內(nèi)皮細(xì)胞有阻力遷移能力的影響。
方法向24孔板中加入明膠于37。C孵育30分鐘，棄去明膠，用PBS洗三 遍。小室外24孔板中加入含有血清和VEGF165內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。小室中接入細(xì)胞， 之后再加入不同濃度的藥物，于37'C 5%0)2培養(yǎng)箱中孵育四小時。
結(jié)果與評價四小時后，將小室內(nèi)外的細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，下層細(xì)胞遷移的細(xì) 胞用4%多聚甲醛固定20分鐘，用PBS洗三遍，吸干，用蘇木精伊紅染色20分 鐘，用PBS將背景多余染料洗去，室溫晾干。OLYMPUS顯微鏡下拍照計數(shù)統(tǒng)計數(shù) 據(jù)。結(jié)果為其中A為對照組；B為100nM紫鉚因組；與對照組比，給予紫鉚因 后，內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力受到影響，說明紫鉚因可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞有阻力的遷移的 能力。
實施例4: 紫鉚因抑制HMEC-1細(xì)胞成管實驗
目的和原理Matrigel (基質(zhì)膠)是從EHS (Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠
肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物，富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其主要成份是 層粘連蛋白，還有膠原IV、內(nèi)功素、硫酸肝素糖蛋白以及TGF-p、纖維母細(xì)胞 生長因子、組織纖溶酶原激活物(tPA.)和其它的生長因子。在室溫下，Matrigel 可聚合成一種具有生物活性的基質(zhì)材料，作用與哺乳動物細(xì)胞基底膜類似，對細(xì) 胞的粘附和分化有作用。內(nèi)皮細(xì)胞可以在Matrigel上融合形成微管，利用這種特 性可以用來研究藥物對血管形成的影響。
方法將Matrigel鋪到48孔板上，每孔10(^1，于37。C， 5%0)2培養(yǎng)箱放
置30min待其凝固。每孔加入HMEC-1，再加入含有不同濃度紫鉚因的培養(yǎng)基， 混勻。于37'C 5X培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h后在顯微.鏡下觀察微管形成情7兄。每孔 選擇不同部位，計算微管形成數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)i+學(xué)分析。
結(jié)果與評價內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel中生長16-18h后，細(xì)胞由原來的多角形 變成長梭形，在Matrigel中延伸生長，單個細(xì)胞巻成管狀并相互連接，形成三
維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果為其中A:對照組；B: IO幽紫鉚因；與對照組相比，給予
紫鉚因之后，內(nèi)皮成管過程受到影響，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，說明紫鉚因可以 抑制內(nèi)皮細(xì)胞微管形成。 .
實施例5:紫鉚因抑制雞胚尿囊膜血管新生
目的和原理在雞胚生長早期，其機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未完全建立，處于對各種 外來抗原免疫耐受階段，對所加的測試藥物不會產(chǎn)生排斥反應(yīng)。將含藥物的載體 置于其表面，可觀察到藥物對雞胚尿囊膜新生血管的影響。目前來說，是一種較 為理想的研究血管生成的器官水平的活體模型。.
方法用r;的新潔爾滅消毒種蛋外殼，將其置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育5
天。在超凈工作臺中，用酒精棉擦拭其表面，在蛋殼鈍端(氣室端)用鑷子輕敲 并小心地丌一個直徑約1厘米的小口。通過開出的小孔觀察胚胎所在的位置，在 血管稀疏的地方用鑷子撕開氣室膜從而露出尿囊膜。之前準(zhǔn)備好加入不同濃度紫 鉚因、經(jīng)高壓滅菌的直徑為5毫米圓形濾紙片，將濾紙片加在尿囊膜上無血管或
血管稀疏的區(qū)域，用滅菌的透明膠帶封口。 (A:對照組，不加紫鉚因B:lPg/disc
紫鉚因)
結(jié)果與評價放入濾紙片的雞胚放入孵育箱中繼續(xù)孵育兩天，之后揭去透明
膠帶，剝殼將尿囊膜盡量暴露，在OLYMPUS體視顯微鏡下拍照。試驗表明
與對照組比較，給予紫鉚因之后，新的微血管生成受到抑制，說明紫鉚因可以抑 制雞胚尿囊膜新血管的生成。
權(quán)利要求
1.紫鉚因在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制腫瘤 血管新生的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制關(guān)節(jié) 炎病變組織的血管新生的藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎 性關(guān)節(jié)炎。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制新生 血管性眼病的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于新生血管性眼病為新生血管性 角膜疾病、新生血管性視網(wǎng)膜疾病、血管新生性虹膜疾病、新生血管性結(jié)膜眼病、 生成血管型白內(nèi)障、新生血管性玻璃體眼病、新生血管性視神經(jīng)疾病、新生血眘 性青光眼或者新生血管性脈絡(luò)膜疾病。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于新生血管性視網(wǎng)膜疾病為糖尿 病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變或者視網(wǎng)膜動脈閉塞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于新生血管性脈絡(luò)膜疾病為濕性 老年黃斑病變。
9. 根據(jù)權(quán)利要求求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制血 管瘤病變組織血管新生的藥物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制銀屑 病病變組織血管新生的藥物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制實體 瘤病變組織血管新生的藥物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于實體瘤為原發(fā)性或者繼發(fā)性 的實體瘤。 '
13. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生的藥物為抑制血 管瘤的藥物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于血管瘤為多發(fā)性血管瘤或者 血管母細(xì)胞瘤。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制 Kaposi' s肉瘤病變組織血管新生的藥物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制白血 病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌癥的藥物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制 Paget' s疾病的藥物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求l-17所述的應(yīng)用。其特征在于紫鉚因在制備血管新生抑制 劑組合物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫鉚因的新用途，具體涉及紫鉚因在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。具體指的是紫鉚因在制備抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病綜合癥、血管瘤等血管新生依賴性疾病中的相關(guān)應(yīng)用。紫鉚因在人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖實驗、HUVEC細(xì)胞遷移實驗、HUVEC細(xì)胞侵襲實驗、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)細(xì)胞成管實驗、雞胚尿囊膜血管新生等均有明顯的抑制作用，可用于制備抑制血管新生的藥物。
文檔編號A61P35/00GK101336909SQ20081003843
公開日2009年1月7日 申請日期2008年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月2日
發(fā)明者劉明耀, 盧彬彬, 京 張, 張曉麗, 易庭芳, 易正芳, 力 賴 申請人:華東師范大學(xué)