專利名稱：：兩個(gè)雙倍半萜類化合物在制備抗腫瘤和抗炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及兩個(gè)雙倍半萜類化合物中甸兔耳風(fēng)萜A和中甸兔耳風(fēng)萜B在制備抗腫瘤和抗炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤是引起人類死亡的主要原因之一。中國(guó)衛(wèi)生部日前公布2006年城鄉(xiāng)居民主要死亡原因。統(tǒng)計(jì)顯示，惡性腫瘤已成為首要死因。可見(jiàn)腫瘤的預(yù)防和治療十分迫切。藥物治療是腫瘤的主要治療手段之一。目前，雖然開(kāi)發(fā)出了幾十種抗腫瘤藥物，有效的延長(zhǎng)了患者的生命或者提高了患者的生存質(zhì)量。其中有些抗腫瘤的藥物治療療效非常顯著，如藥物治療小兒急性白血病等。但腫瘤的藥物研究和開(kāi)發(fā)還面臨巨大挑戰(zhàn)，如抗腫瘤藥物多為細(xì)胞毒藥物，其副作用明顯，限制了這些藥物療效的發(fā)揮。著名腫瘤病因?qū)W家、中國(guó)工程院院士程書(shū)鈞認(rèn)為當(dāng)今醫(yī)學(xué)對(duì)于腫瘤的防治依然處于初級(jí)階段。中藥有幾千年的人體毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，也許中藥會(huì)在抗腫瘤方面走在世界的前列。從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物一直是新藥研究的熱點(diǎn)。兔耳風(fēng)屬(AinsliaeaDC)植物是菊科(Compositae)帚菊木族(MutisieaeCass)中的一屬，全世界70余種，我國(guó)有44種4變種，約占總數(shù)的37.5%。兔耳風(fēng)屬植物藥用種類較多。廣泛用于治療感冒咳喘、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、泌尿系統(tǒng)疾病等癥。我國(guó)的兔耳風(fēng)植物資源主要分布在長(zhǎng)江流域及西南華南各省?！渡虾Ｊ兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》、《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》、《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》、《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》均有收載。對(duì)兔耳風(fēng)屬植物的化學(xué)成分研究始于20世紀(jì)80年代，主要集中在杏香兔耳風(fēng)和械葉兔耳風(fēng)上。據(jù)報(bào)道兔耳風(fēng)屬植物主要含有倍半萜、甾體、三萜類化合物，研究表明倍半砲類具有很好的抗腫瘤活性。且現(xiàn)代藥理及臨床應(yīng)用表明該屬植物有很好的抗炎作用。中甸兔耳風(fēng)是菊科兔耳風(fēng)屬植物，目前對(duì)該種植物的研究為空白，我們對(duì)采自云南的中甸兔耳風(fēng)U^/^a/w/由^s)進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，以期從中分離得到具有抗腫瘤活性的化合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出兩個(gè)雙倍半萜類化合物中甸兔耳風(fēng)砲A和中甸兔耳風(fēng)砲B在制備抗腫瘤和抗炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供以此雙倍半萜類化合物為活性成分的，用于治療腫瘤的藥物組合物。本發(fā)明所說(shuō)的中甸兔耳風(fēng)萜A和中甸兔耳風(fēng)萜B的結(jié)構(gòu)式為:中甸兔耳風(fēng)萜A中甸兔耳風(fēng)萜B本發(fā)明提出的中甸兔耳風(fēng)砲A和中甸兔耳風(fēng)萜B可從中甸兔耳風(fēng)或其它植物中提取，經(jīng)分離純化得到，也可以是經(jīng)化學(xué)合成的方法得到。從中甸兔耳風(fēng)中提取上述兩種化合物的步驟如下將中甸兔耳風(fēng)的干燥全草粉碎，以濃度為80%-95%乙醇回流提取3-4次，每次1-2小時(shí)，提取液減壓濃縮得浸膏。浸膏均勻分散于水中，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到各部位萃取物；氯仿萃取部位經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜(二氯甲烷一甲醇或石油醚一乙酸乙酯)分別得到含有中甸兔耳風(fēng)萜A和中甸兔耳風(fēng)萜B的流分。含有中甸兔耳風(fēng)萜A的流分經(jīng)過(guò)C18半制備液相(甲醇一水)進(jìn)一步純化，得到中甸兔耳風(fēng)砲A純品；含有中甸兔耳風(fēng)萜B的流分以甲醇為溶劑反復(fù)重結(jié)晶，得到中甸兔耳風(fēng)萜B純品。中甸兔耳風(fēng)萜A為透明針狀結(jié)晶，ESI/MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z503[M+H]+，結(jié)合碳譜、DEPT譜和氫譜確定分子式為C3t)H3()07。該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Bohlmann,Ferdinand;Ahmed,Maniruddin;Jakupovic,Jasmin;King,RobertM,;Robinson,Harold.Naturallyoccurringterpenederivatives.Part465.DimericsesquiterpenelactonesandkolavanederivativesfromGochnatiapaniculata.Phytochemistry(1983),22(1)，191-5.)報(bào)道基本——致，故確定其為GochnatiolideA，命名為中甸兔耳風(fēng)萜A。中甸兔耳風(fēng)萜B為透明塊狀結(jié)晶，ESI/MS給出準(zhǔn)分子離子峰w/z487[M+H]+，結(jié)合碳譜、DEPT譜和氫譜確定分子式為C3QH3()06。該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Bohlmann,Ferdinand;Zdero,Christa;Schmeda-Hirschmann,Guillermo;DimericguaianolidesandotherconstituentsfromGochnatiaspecies.Phytochemistry(1986),25(5),1175-8)報(bào)道基本一致，故確定其為GochnatiolideB，命名為中甸兔耳風(fēng)萜B。本發(fā)明提出的抗腫瘤藥物組合物含有治療有效量的兩個(gè)雙倍半萜類化合物中的一種或兩種，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明提出的抗炎藥物組合物含有治療有效量的兩個(gè)雙倍半萜類化合物中的一種或兩種，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明可以組合物的形式通過(guò)口服、鼻吸入、直腸或者腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1中甸兔耳風(fēng)"!7w/Zaea/w/v/ozY^)全草50kg，用80%乙醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)，合并三次提取液減壓濃縮至無(wú)醇味的浸膏。浸膏加入適量水稀釋至體積約為50L，分別依次以石油醚(50LX3)、氯仿(50LX3)、乙酸乙酯(50LX3)、正丁醇(50LX3)萃取，得氯仿部位浸膏約為485g。該氯仿部位上硅膠柱，以體積比為100:110:l的二氯甲烷甲醇梯度洗脫，通過(guò)薄層色譜檢測(cè)在二氯甲垸甲醇的20:1極性部位含有中甸兔耳風(fēng)萜A和中甸兔耳風(fēng)萜B。該部位濃縮至干后繼續(xù)上硅膠柱，以體積比為10:10:1的石油醚乙酸乙酯梯度洗脫，通過(guò)薄層色譜檢測(cè)在l:1極性部位含有中甸兔耳風(fēng)萜A，在2:1極性部位含有中甸兔耳風(fēng)萜B。含有中甸兔耳風(fēng)萜A的部位通過(guò)C18半制備柱純化，得到中甸兔耳風(fēng)砲A純品4.11g;含有中甸兔耳風(fēng)萜B的部位濃縮后以甲醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶處理，結(jié)果得到中甸兔耳風(fēng)萜B純品1.24g。實(shí)施例2大頭兔耳風(fēng)U/似/Zaea,cracep/w/。)全草20kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，合并三次提取液減壓濃縮至無(wú)醇味的浸膏。浸膏加入適量水稀釋至體積約為20L，分別依次以石油醚(20LX3)、氯仿(20LX3)、乙酸乙酯(20LX3)、正丁醇(20LX3)萃取，得氯仿部位浸膏約為195g。該氯仿部位上硅膠柱，以體積比為100:110:1的三氯甲烷甲醇梯度洗脫，通過(guò)薄層色譜檢測(cè)在二氯甲烷甲醇的15:1極性部位含有中甸兔耳風(fēng)萜A和中甸兔耳風(fēng)萜B。該部位濃縮至干后繼續(xù)上硅膠柱，以體積比為10:11:1的石油醚乙酸乙酯梯度洗脫，通過(guò)薄層色譜檢測(cè)在l:1極性部位含有中甸兔耳風(fēng)萜A，在2:1極性部位含有中甸兔耳風(fēng)萜B。含有中甸兔耳風(fēng)萜A的部位通過(guò)C18半制備柱純化，得到中甸兔耳風(fēng)萜A純品1.95g;含有中甸兔耳風(fēng)萜B的部位濃縮后以甲醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶處理，結(jié)果得到中甸兔耳風(fēng)萜B純品0.63g。實(shí)施例3活性成分(上述兩種化合物之一種或二種)8g微晶纖維素80g玉米淀粉12g滑石粉5g制成1000片制備方法將活性成分、微晶纖維素和玉米淀粉混合，用水均勻濕潤(rùn)制成軟材，把濕潤(rùn)后的混合物制粒，過(guò)20目篩，80。C烘干，加入硬脂酸鎂，再過(guò)篩，然后將混合物壓片，每片重105mg，活性成分含量為8mg。本品口服可以用于治療腫瘤。實(shí)施例4:取活性成分(上述二種化合物之一種或2種)15g，藥用淀粉135g，用95%乙醇濕法制粒，整粒，裝1#膠囊，每粒150mg。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2005年版膠囊劑項(xiàng)下的規(guī)定。本品口服可以用于治療急慢性炎癥。實(shí)施例5:取活性成分(上述二種化合物之一種或2種)2g，加入丙二醇和乙醇各100ml，攪拌使溶解，加注射用水稀釋至10000ml,過(guò)0.22pm的微孔濾膜，灌封，10ml/支，流通蒸汽滅菌30min，檢驗(yàn)、包裝，得注射液。本品注射可以用于治療腫瘤、急性炎癥。實(shí)施例6:中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B的細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料1.1、受試樣品中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B分別用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000pg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用含DMSO的PBS(-)稀釋。1.2、細(xì)胞株A549(人肺癌細(xì)胞)LOVO(人腸癌細(xì)胞)6T-CEM(人T細(xì)胞白血病細(xì)胞)MDA-MB-435(人乳腺癌細(xì)胞)1.3、培養(yǎng)液RPMI1640+150/掘S+雙抗1.4、其他材料全自動(dòng)酶標(biāo)儀型號(hào)WellscanMK-2，生產(chǎn)廠商Labsystems進(jìn)口96孔培養(yǎng)板等。2、試驗(yàn)方法MTT法96孔板每孔加入濃度為46X1()4個(gè)/ml的細(xì)胞懸液100pl，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)。24h后，加入樣品液，10ial/孔，設(shè)雙復(fù)孔，37°C，5%(202作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20pl，作用4h后加入溶解液，100pl/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)，溶解后用MK-2全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)570nmOD值。3、試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表l，結(jié)果顯示，中甸兔耳風(fēng)砲A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)人肺癌細(xì)胞，人腸癌細(xì)胞，人T細(xì)胞白血病細(xì)胞，人乳腺癌細(xì)胞均有較好的抑制活性，中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B有很好的抗腫瘤作用。因此，該化合物可用于制備抗腫瘤藥物。實(shí)施例7:中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)小鼠S180肉瘤(實(shí)體型)的療效實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料1.1受試樣品中甸兔耳風(fēng)砲A、中甸兔耳風(fēng)萜B分別用少量吐溫一80助溶后用0.5%CMC配成溶液。1.2動(dòng)物品系昆明種小鼠來(lái)源第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)滬動(dòng)合證字107號(hào)體重18—20g性別雌性。1.3移植性腫瘤小鼠S180肉瘤，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院傳代維持。2、實(shí)驗(yàn)方法取生長(zhǎng)良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理鹽水以l:4稀釋，每只小鼠腋皮下接種0.2ml，隨機(jī)分組，分為對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組(CTX組，20mg/kg，ipX7)、給藥(5mg/kg)組，接種后次日起給藥，給藥體積為0.5ml/20g體重，連續(xù)灌胃7天。接種后10日脫頸處死動(dòng)物，稱動(dòng)物體重后解剖取瘤塊，稱瘤重。結(jié)果判定根據(jù)以下公式-對(duì)照組平均瘤重—給藥組平均瘤重腫瘤抑制率％=-"00%對(duì)照組平均瘤重3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B有顯著的抑瘤作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表l中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)人體腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01。實(shí)施例8:中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B抗炎實(shí)驗(yàn)小鼠耳腫脹模型1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Swiss種小鼠，雄性，體重20-24g。2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜏y(cè)試方法取小鼠80只，隨機(jī)分成8組，按表3所示的劑量灌胃給藥3d，于末次給藥后lh，用0.05ml的二甲苯將小鼠左耳致炎，用直徑為7mm的打孔器將雙耳重疊打孔，將打下的圓片在扭力天平(靈敏度為萬(wàn)分之一)上稱量，用鼠耳兩圓片的重量差表示其腫脹度。3統(tǒng)計(jì)分析全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用studentt-檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)與空白組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗(yàn)結(jié)果表3.中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)小鼠耳腫脹試驗(yàn)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照藥氫化可的松、中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)小鼠耳腫脹模型引起的炎癥有顯著的抑制作用。實(shí)施例9:中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B抗炎實(shí)驗(yàn)大鼠角叉菜膠足腫脹模型1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雌雄兼用，體重180-220g。2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜏y(cè)試方法取大鼠80只，隨機(jī)分成8組，按表4所示的劑量灌胃給藥4d，于末次給藥前測(cè)量致炎前容積；末次給藥后30min,于大鼠右后肢足跎皮下注射1%角叉菜膠0.1ml致炎。分別于致炎后2、4、6h測(cè)量右踝關(guān)節(jié)以下容積。3統(tǒng)計(jì)分析全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用studentt-檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)與空白組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗(yàn)結(jié)果表4.中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)大鼠角叉菜膠足腫脹試驗(yàn)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松、中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)大鼠角叉菜膠足腫脹模型所引起的炎癥有顯著的抑制作用。實(shí)施例10:中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)砲B抗炎實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NH系小鼠，雌雄兼用，體重18-22g。2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜏y(cè)試方法取大鼠80只，隨機(jī)分成8組，按表5所示的劑量灌胃給藥lh，尾靜脈注射2%依文思藍(lán)生理鹽水溶液0.1ml/10g體重，隨即腹腔注射0.8%醋酸生理鹽水溶液0.20ml/只，20min后脫頸椎處死小鼠，用5ml生理鹽水分?jǐn)?shù)次洗滌腹腔，3000轉(zhuǎn)/分，離心15min;取上清液用酶標(biāo)儀于570nm比色測(cè)定其光密度(0D)值。3統(tǒng)計(jì)分析全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用studentt-檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)與空白組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗(yàn)結(jié)果表5.中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與空白組比較，*p<0.05,**P<0.01結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松、中甸兔耳風(fēng)萜A、中甸兔耳風(fēng)萜B對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)引起的炎癥有顯著的抑制作用。權(quán)利要求1、兩個(gè)雙倍半萜類化合物在制備抗腫瘤或抗炎藥物中的應(yīng)用，所述化合物為中甸兔耳風(fēng)萜A和中甸兔耳風(fēng)萜B，其結(jié)構(gòu)式如下中甸兔耳風(fēng)萜A中甸兔耳風(fēng)萜B。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雙倍半萜類化合物從植物中提取或者化學(xué)合成得到。3、一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于含有如權(quán)利要求1中所述的二個(gè)雙倍半萜類化合物中的一種或2種，以及藥學(xué)上可以接受的載體。4、一種抗炎的藥物組合物，其特征在于含有如權(quán)利要求1中所述的二個(gè)雙倍半萜類化合物中的一種或2種，以及藥學(xué)上可以接受的載體。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
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，具體為兩個(gè)雙倍半萜類化合物在制備抗腫瘤和抗炎癥藥物中的應(yīng)用。所述化合物為中甸兔耳風(fēng)萜A和中甸兔耳風(fēng)萜B，可從中甸兔耳風(fēng)或其它植物中提取分離得到，也可用化學(xué)合成方法得到。經(jīng)研究實(shí)驗(yàn)表明，這兩種化合物對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制作用，而且對(duì)炎癥也有顯著的抑制作用。因此，可以用來(lái)制備抗藥物和抗炎癥藥物。文檔編號(hào)A61K31/365GK101284004SQ200810038569公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日發(fā)明者磊單,張衛(wèi)東,李慧梁,柳潤(rùn)輝,燕王,娟蘇,金慧子申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)