專利名稱：一種活塞形狀的組織工程化骨及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程化骨，具體地說關(guān)于一種活塞形狀的組織工 程化骨及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類眼眶壁骨質(zhì)菲薄，其中內(nèi)側(cè)壁僅0. 2-0. 4mm，下壁0. 5-1. Omm， 眼眶上壁與顱前窩、額竇相鄰；內(nèi)壁、下壁分別與篩竇、上頜竇毗鄰。暴 力損傷極易造成眶壁骨折，表現(xiàn)為眶壁的塌陷及碎裂，骨折片掉入副鼻竇 中，從而形成眶壁缺損，軟組織進而病入副鼻竇中，最終對患者的外觀及 功能造成很大影響①眼球生理功能的改變視力喪失或下降、復(fù)視和眼 球運動障礙等；②面部外貌的改變目艮球內(nèi)陷、移位、上瞼下垂等；③感 染骨缺損致眼眶和副鼻竇相通，感染可通過缺損的骨壁波及眼眶及顱內(nèi)。 因此，必須及時對眶壁缺損進行精確修復(fù)。
基于眼眶解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)缺損時與四肢骨、 下頜骨等承重骨存在顯著的不同 一是眶壁菲薄、與副鼻竇相毗鄰；二是 眶壁為非承重骨，所承受應(yīng)力較低，而我們知道骨改建與應(yīng)力有密切關(guān)系， 骨組織會隨著其所受的應(yīng)力而發(fā)生相應(yīng)的改建。所以，在低應(yīng)力的環(huán)境下， 植入的材料逐步降解之后，新生骨組織會發(fā)生怎樣的改建，是否會形成我們所期待的形態(tài)及功能還有待研究。眼眶壁結(jié)構(gòu)的特殊性決定了其修復(fù)不 同于其他部位的骨骼，是一個非常復(fù)雜而且特殊的過程。眶壁骨折及缺損
的修復(fù)治療始于20世紀50年代，Converse首先應(yīng)用骨組織移植修復(fù)爆 裂性眼眶骨折。由于眶壁菲薄，發(fā)生骨折后，無法將碎裂的眶壁重新4并接 再用于修復(fù)缺損，所以目前的手術(shù)方法是將眶內(nèi)軟組織復(fù)位后，采用自體 骨組織或人工材料橋架于缺損的骨壁上來達到修復(fù)的目的。自體骨移植一 直以來都是臨床各種骨修復(fù)手術(shù)的金標準，但是自體骨的來源有限，而且 供區(qū)存在出血、感染、慢性疼痛等并發(fā)癥的風(fēng)險。異體骨來源廣泛，具有 良好的骨傳導(dǎo)性，但不具有骨誘導(dǎo)性，而且存在傳播HIV和乙型肝炎等傳 染性疾病及引起免疫排斥反應(yīng)的潛在危險。異種異體骨移植來源于動物， 供應(yīng)豐富，但是雖然經(jīng)過各種方法加以處理，去處其內(nèi)部的抗原性物質(zhì)， 但是仍不可完全避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險，此外異種骨移植存在傳播 動物源性疾病的危險，并存在倫理方面的問題。目前應(yīng)用于眼眶壁修復(fù)的 人工材料主要包括高分子多孔聚乙烯、羥基磷灰石和鈥金屬，這些材料 均不能降解或降解很隻，長期作為異物存在于機體內(nèi)'，故存在發(fā)生排異反 應(yīng)、感染、嚢腫形成和植入物移位等并發(fā)癥的危險。尤其當材料填充于眶 壁時， 一面與眶內(nèi)組織接觸，而另一面則完全暴露于鼻竇中，既沒有骨膜 覆蓋，也缺乏粘膜覆蓋，早期血供很差，非常容易發(fā)生并發(fā)癥。
目前的修復(fù)方法存在兩個主要的不足之處①材料不能降解，長期作 為異物存在于機體內(nèi)，存在排異反應(yīng)、感染、嚢胂形成和植入物移位等并 發(fā)癥；②材料橋架于骨壁之上，無法與自體骨的斷端接觸吻合，妨礙了骨 的爬行替代修復(fù)。種組織工程骨及其構(gòu)建與應(yīng)用"， 所述的組織工程骨，包括栽體支架和種子細胞，種子細胞附著于載體支架 上，形成具有骨組織三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體，所述的載體支架為改 性的具有大孔徑和高孔隙率并經(jīng)過去酸化處理的PLGA，其上負載有細胞因 子骨形態(tài)發(fā)生蛋白，即BMP;種子細胞為骨髓基質(zhì)千細胞。所述的組織工 程骨可用于構(gòu)建修復(fù)大段骨缺損的功能性組織工程化骨移植物。中國專利 文獻CN1973910公開了 "組織工程骨及其制造方法"。中國專利文獻 CN101085374公開了 "一種組織工程化骨復(fù)合體及應(yīng)用"。但是，關(guān)于活 塞形狀的組織工程化骨及其應(yīng)用方面未見凈艮道。
發(fā)'明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于
(1)提供一種活塞形狀的組織工程化骨； (2 )提供一種活塞形狀的組織工程化骨的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的構(gòu)建眼眶壁組織工程 骨，其核心是建立骨種子細胞與支架材料的三維空間復(fù)合體。本發(fā)聽以成 骨誘導(dǎo)的自體骨髓基質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs )作 為種子細胞，制備活塞形狀的支架材料，體外復(fù)合構(gòu)建個體化的眼眶壁組 織工程骨。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種活塞形狀的組織工程化骨，它由下列方法制得 (1)骨種子細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)；(2)制備活塞形狀的骨修復(fù)支架； (3 )體外復(fù)合骨種子細胞和骨修復(fù)支架并進行培養(yǎng)； 其中所述的步驟(3)是將培養(yǎng)至第二代時的骨種子細胞和骨修復(fù) 支架復(fù)合，形成骨種子細胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物。
所述的骨種子細胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物在體外培養(yǎng)時間為5天。 所述的骨修復(fù)支架由支架頂部和支架底部組成，所述的支架頂部厚度 為0. 5丄5毫米，支架底部厚度為1-2毫米，支架底部周邊比支架頂部寬 出1-3毫米。
所述的支架頂部和支架底部的形狀為圓形、長方形或異形，異形是不 規(guī)則形狀。
所述的骨修復(fù)支架的材料選自珊瑚、羥基磷灰石或磷酸三釣中的一
種o
所述的骨種子細胞是骨髓基質(zhì)干細胞。 活塞形狀的組織工程化骨在眼眶壁、顱骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中應(yīng)用。 本發(fā)明所公開一種活塞形狀的組織工程化骨及其應(yīng)用，其優(yōu)點表現(xiàn)
在(1)從少量骨髓中獲取BMSCs，在成骨培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)下，可短期內(nèi) 獲得大量有成骨能力的細胞。培養(yǎng)液中添加P-磷酸甘油、地塞米松及抗 壞血酸可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的BMSCs向成骨細胞分化，顯示良好的成骨活性及 增殖能力細胞生長周期以及細胞增殖不受影響；ALP、鈣結(jié)節(jié)染色呈強 陽性；表達成骨標志性蛋白(0CN， 0PN, BSP， Cbfal、 I型膠原等)及成 骨相關(guān)基因(0CN， 0PN， BSP)。 (2)活塞形狀的支架能與眶壁缺損部位良 好吻合，既增加了手術(shù)修復(fù)的精確性又方便了手術(shù)操作和固定，更重要的是能保證移植物與宿主骨斷端充分和緊密地結(jié)合，有利于新骨再生和替
代。(3)在體外構(gòu)建并培養(yǎng)的眶壁組織工程骨，與正常眼眶壁的組織結(jié)構(gòu) 和特性相似，在體內(nèi)能夠在支架材料降解的同時促進自體骨再生，并發(fā)生 合理的骨改建，最終為自體骨組織所替代，達到形態(tài)與功能的雙重修復(fù)。 克服了現(xiàn)有眶壁材料不能夠降解、易發(fā)生排異反應(yīng)、感染、嚢腫形成和植 入物移位等并發(fā)癥的缺點，同時克服了現(xiàn)有眶壁材并牛難于固定、與斷端不 能良好吻合的缺點。(4 )本發(fā)明選用培養(yǎng)至第二代時的骨種子細胞和骨修 復(fù)支架復(fù)合，形成的復(fù)合物在體外培養(yǎng)5天。優(yōu)化了本發(fā)明，節(jié)省了實一驗 時間和實驗費用。


圖1: 一種活塞形狀的骨修復(fù)支架正面圖。 圖2: —種活塞形狀的骨》多復(fù)支架側(cè)面圖。
圖3: BMSCs與p-TCP支架在體外復(fù)合5天時，掃描電鏡觀察材 料表面已經(jīng)完全被細胞所覆蓋，細胞增殖旺盛、并分泌膠原纖維。
圖4: BMSCs與p-TCP支架在體外復(fù)合5天時，掃描電鏡觀察細 胞在材料內(nèi)部帖壁生長，并相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀。
圖5:組織工程骨植入犬皮下1月即見新生骨組織和血管形成(50X )。 圖6:組織工程骨才直入犬皮下3月新生骨組織明顯增多，并出現(xiàn)骨 髓樣脂肪組織(50X)。
圖7:犬眶內(nèi)側(cè)壁造成一直徑為lOmm的圓形缺損，破壞骨膜和眶隔。 圖8:手術(shù)植入自體誘導(dǎo)BMSCs和p-TCP構(gòu)建的"plug"式樣眶壁組織工程骨，活塞狀骨修復(fù)支架的支架頂部與內(nèi)側(cè)壁缺損吻合，支架底部覆 蓋于眶壁內(nèi)側(cè)，無需固定。
圖9:應(yīng)用體外構(gòu)建的眶壁組織工程骨原位修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺損， 術(shù)后CT影像隨訪見復(fù)合物逐漸降解變薄，至3月時已接近正?？舯诤穸?(框內(nèi)區(qū)域)。
圖10:應(yīng)用體外構(gòu)建的眶壁組織工程骨原位修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺 損，術(shù)后3月CT三維重建圖像見植入物與周圍眶壁融為一體、發(fā)生骨性 連接。
圖11:應(yīng)用體外構(gòu)建的眶壁組織工程骨原位修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺 損，術(shù)后3月大體觀察(正面觀)眶內(nèi)側(cè)壁缺損處得到良好修復(fù)，植入物 不突出于周圍眶內(nèi)側(cè)壁，與周邊骨缺損斷面吻合良好，結(jié)合線已模糊不清。
圖12:應(yīng)用體外構(gòu)建的眶壁組織工程骨原位修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺 損，術(shù)后3月大體觀察(側(cè)面觀)植入物與周圍眶壁呈骨性連接，菲薄， 具備生理弧度。
圖13A:骨》務(wù)復(fù)支架復(fù)合BMSCs后修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁缺損3月后， Micro-CT顯示才直入物與周圍眶壁已形成骨性連"l妄，與生理形態(tài)下的眶壁 相似。
圖13B:骨修復(fù)支架復(fù)合BMSCs后修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁缺損3月后在靠 近篩竇的植入物表面可見覆蓋有完整的粘膜,且可見新生的蜂窩狀篩骨紙 板。
圖14:眶壁組織工程骨修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁缺損3月后，硬組織切片焚 光顯微鏡下觀察材料內(nèi)部可見廣泛分布的條帶狀熒光標記區(qū)域，相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀。與材料表面相連的蜂窩狀組織也可見條帶狀熒光。
圖15A:骨修復(fù)支架復(fù)合BMSCs后修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁缺損3月后，硬 組織切片VAN GIESON-苦p未酸品紅染色》見察示骨》務(wù)復(fù)支架與眶壁的骨 性結(jié)合(50x )。
圖15B:骨修復(fù)支架復(fù)合BMSCs后修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁缺損3月后，硬 組織切片VAN GIESON-苦味酸品紅染色觀察示新生骨及少量未降解的 材料(50x )。
圖15C:骨修復(fù)支架復(fù)合BMSCs后修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁缺損3月后，硬 組織切片VAN GIESON-苦味酸品紅染色觀察示新生骨表面有完整的粘 膜覆蓋，并向篩竇內(nèi)生長蜂窩狀骨組織(50x )。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。 實施例1
體外構(gòu)建犬眼眶壁組織工程骨 一、BMSCs的體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及檢測
BMSCs在應(yīng)用添加了 p-磷酸甘油、地塞米松及抗壞血酸的a-MEM培 養(yǎng)液進行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，以未誘導(dǎo)BMSCs為對照，進行細胞形態(tài)學(xué)及 成骨活性檢測。結(jié)果顯示犬BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細胞生長周期以及 細胞增殖不受影響，可傳至10代以上，細胞形態(tài)和增殖率仍與原代基本 相似，足夠數(shù)量作為種子細胞種植載體；ALP、釣結(jié)節(jié)染色呈強陽性；表 達成骨標志性蛋白(OCN， OPN， BSP, Cbfal、 I型膠原等)及成骨相關(guān)基因(0CN， 0PN， BSP)。而未誘導(dǎo)BMSCs的ALP染色呈弱陽性、4丐結(jié)節(jié)染 色陰性，成骨標志性蛋白及相關(guān)基因的表達量低于誘導(dǎo)組。
二、 犬眼眶壁P-TCP活塞形狀支架材料的制造 犬眼眶內(nèi)側(cè)壁有一直徑為10mm的圓形全層骨缺損。 制備骨修復(fù)支架，請參照圖1，圖2。
圖1，圖2為一種活塞形狀的骨修復(fù)支架，該支架由支架頂部1和支 架底部2組成，支架頂部1和支架底部2的形狀為圓形，支架頂部1直徑 為10毫米，支架底部2直徑為12毫米，支架頂部1厚度為1毫米，支架 底部2厚度為2毫米。所述一種活塞形狀骨修復(fù)支架的制備方法如下使 用樹脂模型進行硅橡膠取陰模，將P -磷酸三鈣粉末攪拌成糊狀后注入模 具，放入干燥箱8(TC中12小時，然后進行微波燒結(jié)一次成型。Co 60 (25kGy)消毒后，并對材料進行內(nèi)部結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能的檢測。結(jié)果顯示 制備的P-TCP支架為多孔、較為致密，5ml注射器針尖不能輕易刺入，材 料親水性良好。內(nèi)部呈均勻的多孔三維結(jié)構(gòu)，平均孔徑406. 3jum，孔隙 率約為84.63°/。，力學(xué)強度〉2Mpa，達到眼眶壁組織工考呈支架的要求。
三、 BMSCs與TCP支架復(fù)合體外構(gòu)建眶壁組織工程骨 成骨誘導(dǎo)BMSCs細胞培養(yǎng)至第二代時，胰蛋白酶消化后計數(shù)離心，制
備細胞懸液并調(diào)整密度為2 x l07cells/ml。以單細胞懸液滴滲法接種到 無菌培^jni中的預(yù)制P-TCP支架上，得到細胞/支架復(fù)合體。將該復(fù)合體 在37。C培養(yǎng)箱(5%C02， 95%02， 100%飽和濕度)中靜置4小時，以利于細 胞貼壁。之后緩慢加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，充分浸沒材料，于上述條件繼續(xù) 培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。分別于復(fù)合4小時、1天、3天、5天和7天，。以銳利刀片將其中一個標本切 為兩個半圓部分，以了解細胞在支架內(nèi)部的分布增殖情況。結(jié)果顯示P -TCP具有良好的多孔三維結(jié)構(gòu)，與BMSCs在體外復(fù)合4小時就完成了黏 附，較適宜的體外復(fù)合培養(yǎng)時間為5天(圖3,圖4 )。 實施例2
眼眶壁組織工程骨異位成骨能力的實驗
按實施例l的方法體外復(fù)合自體誘導(dǎo)BMSCs和P -TCP支架材料構(gòu)建組 織工程骨。
每只犬背部皮下植入3塊材料自體誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP l塊，自體未 誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP l塊，單純TCP材料1塊。手術(shù)方法實驗動物犬麻醉后， 于其背部3個獨立分開區(qū)域各切開1. 5cm的小口 ，充分游離周圍的皮下組織 后將材料植入，用l號線間斷縫合切口。
分別于材料才l/v后l月、2月、3月取出標本，每個時間點取3只犬 的背部皮下標本9塊(即自體誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP、自體無誘導(dǎo)BMSCs復(fù) 合TCP、單純TCP材料各3塊)。標本經(jīng)4%多聚曱醛固定后用1(T/。EDTA溶 液脫鈣，行HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察新骨形成和血管化情況。
結(jié)果顯示自體誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合TCP支架材料構(gòu)建的組織工程骨植入 犬皮下1月即見新生骨組織和血管形成，3月時新生骨明顯增多，并可見 豐富的新生血管和骨髓脂肪組織(圖5，圖6 )。未誘導(dǎo)BMSCs/ P -TCP復(fù) 合物僅見少量成骨，而單純P-TCP不具備異位成骨能力。
實施例3眼眶壁組織工程骨原位修復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺損的實驗
按實施例l的方法體外復(fù)合自體誘導(dǎo)BMSCs和p -TCP支架材料構(gòu)建組 織工程骨。
犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺損模型的建立作下眼瞼皮膚切口，頓性分離皮下組 織及肌肉，剝離骨膜，充分暴露眶內(nèi)側(cè)壁，使用直徑10mm的骨科環(huán)鉆在眶 內(nèi)側(cè)壁篩骨紙板處造成一直徑為10mm的圓形缺損，破壞骨膜和眶隔(圖7 )。 植入自體誘導(dǎo)BMSCs和P-TCP構(gòu)建的"plug"式樣眶壁組織工程骨，活塞 狀骨修復(fù)支架的支架頂部與內(nèi)側(cè)壁缺損吻合，支架底部覆蓋于眶壁內(nèi)側(cè)， 無需固定(圖8 )。隨后逐層關(guān)閉創(chuàng)口 。以自體無誘導(dǎo)BMSCs/ P -TCP復(fù)合物、 單純P-TCP材料作為對照。術(shù)后第一天起青霉素80萬單位肌注(每天2次 x3天)，預(yù)防感染。在處死動物取材前2天采用四環(huán)素靜脈滴注，對新生 骨進行熒光標記。
術(shù)后1周、4周、8周、12周分別進行螺旋CT檢查和三維重建觀察。術(shù) 后12周取材，進行大體觀察、骨密度檢測、Micro-CT檢查及組織學(xué)觀察， 對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，評價修復(fù)效果。
結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)BMSCs和TCP復(fù)合構(gòu)建的眶壁組織工程骨寸務(wù) 復(fù)犬眶內(nèi)側(cè)壁缺損，術(shù)后CT影像隨訪見復(fù)合物逐漸降解變薄，至3月時 已接近正常眶壁厚度(圖9,圖10);大體觀察眶內(nèi)側(cè)壁缺損處得到良好 修復(fù)，才1^物不突出于周圍眶內(nèi)側(cè)壁，與周邊骨缺損斷面吻合良好，結(jié)合 線已才莫糊不清(圖11，圖12); Micro-CT和組織學(xué)^r查顯示植入物與周 圍眶壁已形成骨性連接，在靠近篩竇的材一牛表面可見^隻蓋有完整的粘膜， 且可見新生的蜂窩狀篩骨紙板(圖13A，圖13B，圖14,圖15A，圖15 B,圖15 C );其骨密度為0. 16 ± 0. 03g/cm2,與正常骨密度(0. 11 ± 0. 01g/cm2) 無顯著差別(P 〉 0. 05 )。而未誘導(dǎo)BMSCs/TCP復(fù)合物及單純材料植入后降 解緩慢，3月后仍然明顯凸出于正?？舯?；組織學(xué)檢測表明大部分材料未 降解，僅在材料表面可見新生骨組織；骨密度與正常組有顯著差異(P<
0. 05 )。
實施例4
BMSCs與P -TCP支架體外復(fù)合的合適時間實驗
一、 復(fù)合方法
BMSCs細胞培養(yǎng)至第二代時，胰蛋白酶消化后計數(shù)離心，制備細胞懸 液并調(diào)整密度為2 x 10'cells/ml。以單細胞懸液滴滲法接種到無菌培養(yǎng)皿 中的圓片狀P-TCP支架上，細胞/支架復(fù)合體在37。C培養(yǎng)箱(5y。C02, 95%02, 100%飽和濕度)中靜置4小時，以利于細胞貼壁。之后將細胞/支架復(fù)合體 轉(zhuǎn)移至6孔板中，每孔緩慢加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液約4ml，充分浸沒材料，于 上述條件繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。
BMSCs與TCP體外復(fù)合后，分別于復(fù)合4小時、1天、3天、5天 和7天，分別取2個細胞材料復(fù)合體進行電鏡觀察。以銳利刀片將其中一 個標本切為兩個半圓部分，以了解細^<在支架內(nèi)部的分布增殖情況。
二、 電鏡觀察細胞-材料復(fù)合體的體外培養(yǎng)情況
1. 細胞在材料表面的生長情況
BMSCs接種于P -TCP上4小時后可見細胞單層復(fù)著于材料表面，分布均勻，大部分細胞向周圍伸展而成多角形；小部分細胞呈圓形，尚未伸展。 接種l天后細胞基本均已向外伸展呈多角形，細胞緊密貼附于材料表面， 可見多個細胞相互形成網(wǎng)狀或團塊狀，細胞進入孔與孔的孔內(nèi)連接中。接 種3天后，細胞增殖迅速、重疊生長，呈規(guī)則排列的長梭狀，材料表面的 孔隙基本被細胞覆蓋填充。接種5天后，可見細胞繼續(xù)快速增殖，呈多層 重疊生長，材料的表面及孔隙已被完全覆蓋，細胞之間可見分泌的膠原纖 維。接種7天后，材料表面的細胞形態(tài)與接種5天時相似，也完全覆蓋材料 表面。
2.細胞在材料內(nèi)部的生長情況
BMSCs接種于P-TCP上4小時后可見細胞單層復(fù)著于材料內(nèi)部的孔隙 表面，細胞呈圓形，尚未向周圍伸展；靠近材料表面的孔隙內(nèi)細胞較多， 而越靠近材料中心部，細胞的數(shù)量越少。接種l天后細胞開始向外伸展呈 多角形，細胞緊密貼附于材坤牛表面，并開始增殖。接種3天后，細胞增殖 迅速，可見多個細胞相互形成網(wǎng)狀或團塊狀，細胞通過孔內(nèi)連接相互溝通。 接種5天后，可見細胞繼續(xù)增殖，細胞形態(tài)和分布于第3天相似，更多的細 胞間相互形成網(wǎng)狀或團塊狀。接種7天后，材料表面的細胞形態(tài)出現(xiàn)老化， 細胞數(shù)量較前反而減少，考慮為隨著培養(yǎng)時間的增加，材料表面被增生的 細胞所覆蓋，影響了材料中間細胞與外界的氣體和營養(yǎng)交換，所以細胞的 生長受到影響。4艮據(jù)觀察結(jié)果顯示，BMSCs與P-TCP復(fù)合后體外培養(yǎng)的適 宜時間為5天。
三、討論組織工程的核心是構(gòu)建細胞與生物支架復(fù)合物。在形成細胞-材料復(fù) 合物的過程中，細胞與材料的粘附A^出，細胞必須與材料發(fā)生適當?shù)恼?附才能進行遷移、分化和增殖，而接種密度與細胞在材料上的粘附生長密
切相關(guān)。Goshima等發(fā)現(xiàn)磷酸三鈣和羥基磷灰石復(fù)合物BMSCs接種密度為 5 x 107ml時，僅1/12標本有皮下成骨現(xiàn)象。Haynesworth等以磷酸三釣 和羥基磷灰石復(fù)合物為支架進行研究，認為0. 7-20 x 107ml是較佳的初 始接種細胞濃度范圍。Bruder認為過高的接種濃度(大于50 x l06/ml ) 不利于骨髓基質(zhì)干細胞粘附生長，并造成細胞營養(yǎng)供應(yīng)不足。為此我們在 本實驗中選擇20 x 107ml作為初始接種細胞密度。
體外構(gòu)建組織工程骨的另外一個重要因素是復(fù)合時間。目前對于細 胞和材料在體外需復(fù)合多少時間再回才直尚無定i侖，不同的細胞和不同的材 料所需的復(fù)合時間不盡相同。目前主要有兩種觀點， 一種意見提倡較長的 體外培養(yǎng)時間，其優(yōu)點是體外的恒定環(huán)境能為細胞在材料表面附著和生 長提供一個穩(wěn)定的營養(yǎng)環(huán)境并利于觀察，尤其當利用生物反應(yīng)器時，既能 模擬體內(nèi)的血液動力學(xué)、物理機械環(huán)境，又能保持穩(wěn)定的適合細胞生長的 環(huán)境。Mauney將BMSCs和支架材料在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)16天，并給予一 定的才幾械刺激和一定濃度的地塞米+>進^^秀導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)0PN及礦化基質(zhì)都有 較高的分泌表達。另一種觀點是盡可能的縮短體外培養(yǎng)時間，盡早回植， 其依據(jù)為體內(nèi)的各種營養(yǎng)、動力學(xué)和物理^/L械環(huán)境對細胞的生長非常重 要，尤其是成骨細胞在骨形成的過程中需要一定的力學(xué)刺激，而體外無法 完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境。本實驗通過掃描電鏡觀察了細胞-材料體外復(fù) 合后的在不同時間點，細胞的黏附、生長、增殖情況，以期為細胞-材料體外構(gòu)建的培養(yǎng)時間選擇提供參考。掃描電鏡照片顯示BMSCs與P-TCP 復(fù)合4小時時就完成了黏附，有部分細胞伸展為多角形，在材料表面和內(nèi) 部均有細胞分布；l天后，細胞與材料表面完全貼附、伸展，開始分化和 增殖，材料內(nèi)部的細胞也開始增殖；至第5天，細胞進一步分化和增殖， 形成復(fù)合細胞層完全覆蓋TCP材料的表面，材料內(nèi)部的細胞也進一步連成 網(wǎng)狀或團塊狀，可見分泌細胞外基質(zhì)及膠原纖維；但是第7天時，材料內(nèi) 部的細胞開始老化，形態(tài)發(fā)生改變，數(shù)量也較前減少。由于靜態(tài)培養(yǎng)條件 下支架表面的細胞優(yōu)勢生長，在培養(yǎng)5天后，細胞-支架復(fù)合體的表面均 形成了復(fù)合細胞層，加劇了支架內(nèi)部由彌散限制導(dǎo)致的營養(yǎng)供應(yīng)不足。因 此，在靜態(tài)培養(yǎng)條件下BMSCs與0-TCP體外復(fù)合培養(yǎng)的時間不宜過長， 根據(jù)本實驗的結(jié)果，體外培養(yǎng)5天較為合適。 實施例5
BMSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)代數(shù)實驗 在a -MEM培養(yǎng)液中添加10mM |3 -磷酸甘油、10nM地塞米;)^及50 u M抗 壞血酸作為成骨誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的犬BMSCs向成骨細胞分化， 并顯示良好的成骨活性及增殖能力。犬BMSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)至第二代即可 表達成骨細胞表型(ALP，鈞結(jié)節(jié)，0CN， 0PN， BSP, Cbfal和I型膠原的 表達等)，可作為理想的骨種子細胞。 一、BMSCs成骨功能的生化;^測 1、堿性磷酸酶(ALP)染色
ALP定性染色結(jié)果表明，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的第二代BMSCs AKP染色 為強陽性，陽性反應(yīng)細胞胞漿呈紫藍色，局部細胞染色較深；而未誘導(dǎo)BMSCs則顯色弱，提示AKP無明顯表達。
2、 茜素紅(ARS)染色
第二代BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28天，茜素紅染色在大體及鏡下觀察均見 紅色的結(jié)節(jié)，而未誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下BMSCs萏素紅染色為陰性，說明BMSCs 在成骨誘導(dǎo)條件下可形成礦化結(jié)節(jié)。
3、 Von Kossa染色
第二代BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28天，形成的白色結(jié)節(jié)經(jīng)Von Kossa染色 呈棕褐色至棕黑色，未誘導(dǎo)的細胞因成骨分化較弱顯淡褐色。
二、 免疫細胞化學(xué)檢測BMSCs成骨相關(guān)蛋白的表達情況
誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs能表達OCN、 0PN、 BSP、 I型膠原和Cbfal:免疫 細胞化學(xué)染色可見大部分細胞胞漿中有椋色顆粒，免疫熒光觀察大部分細 胞胞漿見綠色焚光。未誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs可表達0CN、 BSP, OPN和I型月交原 染色見部分細胞胞漿內(nèi)有棕色顆粒，免疫熒光見部分細胞胞漿呈綠色熒 光，但表達較誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs弱，且未見有Cbfal的陽性表達。人成纖 維細胞的染色除I型膠原陽性外其余均為陰性，空白對照均為陰性。
三、 Western-blot半定量檢測BMSCs細胞0CN、 OPN蛋白表達情況 檢測結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs和未i秀導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs組在1 5 KD
和3 6KD處均有條帶形成，i兌明兩組細月包中均有0CN、 0PN蛋白的分泌 表達。但是誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs的0CN和OPN蛋白條帶比未誘導(dǎo)組深，提示 BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后的骨基質(zhì)蛋白的分泌增加。
四、 RT-PCR檢測細胞中OCN、 OPN和BSP的mRNA表達情況
檢測結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代BMSCs和未誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代BMSCs組均有0CN、 0PN和BSP的mRNA表達。提示BMSCs中存在確定性骨祖細胞 要，并能自動分化為成骨細胞)。
五、熒光定量PCR檢測細胞中OCN、 OPN和BSP的mRNA表達差異
由SYBR Green法進行的Rea卜time PCR結(jié)果表明在進行成骨誘導(dǎo)培 養(yǎng)后的BMSCs的OCN表達量為未i秀導(dǎo)時的3. 32倍，OPN的表達為未誘導(dǎo)時 的2. 68倍。
無需進一步詳細闡述，相信閱讀了本發(fā)明上述公開的內(nèi)容后，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明，可作各種改動或修改，因此，前面的 實施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1、一種活塞形狀的組織工程化骨，它由下列方法制得(1)骨種子細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)；(2)制備活塞形狀的骨修復(fù)支架；(3)體外復(fù)合骨種子細胞和骨修復(fù)支架并進行培養(yǎng)；其特征在于所述的步驟(3)是將培養(yǎng)至第二代時的骨種子細胞和骨修復(fù)支架復(fù)合，形成骨種子細胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于所述的骨種子細 胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物在體外培養(yǎng)時間為5天。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于所述的骨修復(fù)支 架由支架頂部和支架底部組成，所述的支架頂部厚度為0. 5-1. 5毫米，支架底 部厚度為1-2毫米，支架底部周邊比支架頂部寬出1-3毫米。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織工程化骨，其特征在于支架頂部和支架 底部的形狀為圓形、長方形或異形。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化骨，其特征在于所述的骨修復(fù)支 架的材料選自珊瑚、羥基磷灰石或磷酸三鈣中的一種。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化骨，其特征在于所述的骨種子細 胞是骨髓基質(zhì)干細胞。
7、 權(quán)利要求l-6任一所述的組織工程化骨在眼眶壁、顱骨缺損修復(fù)領(lǐng)域 中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活塞形狀的組織工程化骨及其應(yīng)用。一種活塞形狀的組織工程化骨由下列方法制得(1)骨種子細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)；(2)制備活塞形狀的骨修復(fù)支架；(3)體外復(fù)合骨種子細胞和骨修復(fù)支架并進行培養(yǎng)；其中所述的步驟(3)是將培養(yǎng)至第二代時的骨種子細胞和骨修復(fù)支架復(fù)合，形成骨種子細胞和骨修復(fù)支架復(fù)合物。在體外構(gòu)建并培養(yǎng)的眶壁組織工程骨，與正常眼眶壁的組織結(jié)構(gòu)和特性相似，在體內(nèi)能夠在支架材料降解的同時促進自體骨再生，并發(fā)生合理的骨改建，最終為自體骨組織所替代，達到形態(tài)與功能的雙重修復(fù)?；钊螤畹慕M織工程化骨應(yīng)用于眼眶壁、顱骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中。
文檔編號A61L27/38GK101628128SQ200810040540
公開日2010年1月20日 申請日期2008年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者周慧芳, 范先群 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院