專利名稱：槐角苷的制藥應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及槐角苷在制備預(yù)防和/或治療絕經(jīng)后婦女關(guān)節(jié)軟骨退化和骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis OA)是中老年中最常見的骨關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病及進展過程受年齡、激素、環(huán)境、基因等多種因素影響。最主要病理表現(xiàn)為滑膜關(guān)節(jié)的軟骨缺損。絕經(jīng)后婦女發(fā)病率高于男性，低雌激素水平婦女骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率增加(sowers MR，McConnell D，Jannausch M等，Estradiol and its metabolites and theirassociation with knee osteoarthritis Arthritis Rheum.2006 8；54(8)2481-7)，提示雌激素在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起作用。雌激素通過與關(guān)節(jié)中的雌激素受體(estrogen receptor ER)結(jié)合起作用，在軟骨及軟骨下骨中均有表達，其蛋白活性及構(gòu)象改變以及在關(guān)節(jié)中表達水平可影響骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病。
雌激素受體是核受體，屬于甾體激素受體家族。位于胞質(zhì)及胞核中，經(jīng)典的作用方式類似于配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合于靶基因的啟動子區(qū)，直接作用于同源DNA序列，或者通過蛋白-蛋白相互作用作用于其它轉(zhuǎn)錄因子。此外，基于雌激素在某些細胞體系中觀察到的快速效應(yīng)，目前學(xué)者提出了非基因組效應(yīng)。ER有兩種亞型雌激素受體-α和雌激素受體-β。雌激素受體-α基因位于染色體6q25-27，包含8個外顯子140kb。雌激素受體-β基因位于染色體14q22-24，包含8個外顯子大約40kb。
性激素對維持人體骨量起重要作用，老年性或手術(shù)性的性激素降低均可導(dǎo)致失骨，引起骨質(zhì)疏松性骨折。絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥常見于高齡婦女，其治療相當(dāng)困難。當(dāng)今社會，人口老化，踏入高齡的婦女不斷增加，婦女在絕經(jīng)后骨質(zhì)丟失率隨血循環(huán)中雌激素水平的減少而增高，進而出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥，增加了骨折的危險性，因骨質(zhì)疏松、骨折和各種并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)越來越多。
Ham等較早報道了使用獼猴去勢模型180只配對組分成3組，一組為模型組，另外兩組分別使用雌激素替代療法(estrogen replacement therapy，ERT)、大豆植物雌激素(SPE)。3年后，模型組較雌激素替代療法組軟骨缺損程度嚴(yán)重，且骨贅生長較多，提示長期的雌激素替代治療能夠緩解骨性關(guān)節(jié)炎。并測定關(guān)節(jié)軟骨中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-2、IGFBP-3、膠原、蛋白多糖水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素替代療法組IGFBP-3水平高于模型組，其它指標(biāo)則無統(tǒng)計學(xué)差異。對脛骨近端軟骨下骨區(qū)(SC)及干骺端(EMC)骨轉(zhuǎn)換指數(shù)測定后發(fā)現(xiàn)，模型組在兩區(qū)的骨轉(zhuǎn)換指數(shù)最高，大豆植物雌激素(SPE)組次之，雌激素替代療法(ERT)組最低。模型組中SC區(qū)的骨化程度高于EMC區(qū)，大豆植物雌激素組骨小梁體積高于模型組。提示長期的雌激素替代療法通過降低SC區(qū)的骨形成從而降低骨性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險，最近同一研究小組對脛骨近端關(guān)節(jié)周圍骨贅測量后發(fā)現(xiàn)長期的雌激素替代治療并不能夠持續(xù)的降低軟骨骨交界區(qū)及脛骨關(guān)節(jié)周圍骨贅的形成(Olson EJ，Lindgren BR，Carlson CS等，Effects of long-termestrogen replacement therapy on the prevalence and area of periarticular tibial osteophytes insurgically postmenopausal cynomolgus monkeys Bone.2007年4月20日)。流行病學(xué)資料也提示絕經(jīng)后婦女骨量下降，所導(dǎo)致的骨生物力學(xué)改變與OA發(fā)病相關(guān)，最近，Jacobsen等對入選的3913例(男1470例，女2443例)骨性關(guān)節(jié)炎患者，測定骨密度及髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙，發(fā)現(xiàn)男性患者關(guān)節(jié)間隙終生變化不大，而女性在45歲之后關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，且與骨量降低有顯著相關(guān)性(P<0.0001)(JacobsenS，Jensen TW，Bach-Mortensen P等.Low bone mineral density is associated with reduced hip joint spacewidth in womenresults from the Copenhagen Osteoarthritis Study Menopause.2007年6月1日)。
許多研究顯示雌激素?zé)o論在體內(nèi)或是體外對軟骨細胞均有確切作用，且與雌激素受體表達水平有關(guān)。II型膠原C端肽(CTX-II)是II型膠原蛋白在體內(nèi)的特異代謝產(chǎn)物，由于體內(nèi)的II型膠原大多分布于軟骨中，因此血及尿液中的CTX-II可作為軟骨代謝特異標(biāo)志物。使用該評價指標(biāo)的相關(guān)報道較多。Andersen等觀察大鼠去勢后2、4.、6.、8周尿液中CTX-II含量并用去勢前含量做矯正，發(fā)現(xiàn)2周時軟骨代謝最旺盛，后逐漸降低。2周時ERT以及雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)可抑制2周時的軟骨代謝。而4周的軟骨代謝情況與8周后膝關(guān)節(jié)軟骨的退變情況最具相關(guān)性(Hoegh-Andersen P，Tankó LB，Andersen TL等，Ovariectomized rats as a model of postmenopausal osteoarthritisvalidation and applicationArthritis Res Ther.2004；6(2)R169-80，2004年2月19日)。
最近Oestergaard等將46只SD大鼠隨機分為4組，去勢模型組、早期ERT組、延期ERT組以及假手術(shù)(sham)組。并對血中CTX-II測定，并對9周后關(guān)節(jié)形態(tài)改變評分，用免疫組化方法測定關(guān)節(jié)中CTX-II.結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERT能緩解關(guān)節(jié)軟骨退變，且延期ERT較早期干預(yù)效果差，在關(guān)節(jié)中檢測到CTX-II，且共定位于軟骨缺損區(qū)(Oestergaard S，Sondergaard BC，Hoegh-Andersen P等，Effects of ovariectomy and estrogen therapyon type II collagen degradation and structural integrity of articular cartilage in ratsimplications of the time ofinitiation，Arthritis Rheum.2006年8月；54(8)2441-51)。已有文獻報道去勢后，關(guān)節(jié)軟骨ER表達水平降低(參見Oshima Y，Matsuda K，Yoshida A等，Localization of EstrogenReceptors alpha and betain the Articular Surface of the Rat Femur.ActaHistochem Cytochem.2007年2月27日；40(1)27-34；和Dai G，Li J，Liu X等，Therelationship of the expression of estrogen receptor in cartilage cell andosteoarthritis induced by bilateral ovariectomy in guinea pig，J.Huazhong Univ SciTechnolog Med Sci.2005；25(6)683-6)。有報道絕經(jīng)后宮頸中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達增高，而抑制其組織抑制物(TIMP)的表達。而MMP為關(guān)節(jié)軟骨膠原破壞最主要因素，Lee等發(fā)現(xiàn)17β-E2可抑制軟骨細胞MMP-1mRNA表達，并可改善MMP和TIMP之間的平衡協(xié)調(diào)(Richette P，Dumontier MF，F(xiàn)rancois M等，Dual effects of17-beta-oestradiol on interleukin 1beta-induced proteoglycan degradation in chondrocytes，Ann Rheum Dis.2004年2月；63(2)191-9)。因此，去勢后雌激素水平降低，ER表達水平降低，增加MMP表達水平，導(dǎo)致II型膠原代謝增加軟骨基質(zhì)破壞。
以上動物實驗，提示雌激素的波動可能為絕經(jīng)后婦女骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的始動因素之一，早期雌激素干預(yù)可抑制軟骨中ER水平降低防止OA的發(fā)生。而ERT后期則主要為通過雌激素受體調(diào)節(jié)軟骨下骨代謝，抑制骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生及緩解骨性關(guān)節(jié)炎進程。
雌激素對于關(guān)節(jié)軟骨作用的量效關(guān)系，研究較多且多為體外實驗。多認(rèn)為低劑量的雌激素可抑制炎癥因子誘導(dǎo)的軟骨基質(zhì)降解，而高劑量的雌激素可促進軟骨退變。IL1-β是目前研究骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中較為確定的前炎癥因子，Richette等通過培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細胞發(fā)現(xiàn)低濃度17β-雌二醇(E2)(0.1nmol/l)抑制白介素(IL)1β誘導(dǎo)的蛋白多糖降級，而高濃度(10nmol/l)可增加其作用(Lee YJ，Lee EB，Kwon YE等，Effect of estrogen on the expression of matrixmetalloproteinase(MMP)-1，MMP-3，and MMP-13 and tissue inhibitor of metalloproternase-1 inosteoarthritis chondrocytes Rheumatol Int.2003 Nov；23(6)282-8.2003年4月9日)。
與雌激素受體相似識別相似的DNA序列但配體尚未確定的受體，稱做雌激素受體的相關(guān)受體，屬于孤核受體，分別為ERR-α、ERR-β、ERR-γ(根據(jù)1999年核受體命名委員會命名原則分別為NR3B1、NR3B2、NR3B3)。其在某些組織中雌激素可促進其表達。研究發(fā)現(xiàn)ERR-α可能調(diào)節(jié)雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并與ER相互作用。Bonnelye等通過免疫組化染色證實ERR-α成年大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中有表達，并且發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的軟骨細胞中ERR-α過表達可誘導(dǎo)SOX-9表達增加，促進骨軟骨發(fā)育，而抑制ERR-α表達可抑制軟骨形成。提示ERR-α在軟骨形成及保持其穩(wěn)態(tài)中起作用(Bonnelye E，Zirngibl RA，Jurdic P等，The orphan nuclear estrogenreceptor-related receptor-alpha regulates cartilage formation in vitroimplication of Sox9Endocrinology 2007年3月，148(3)1195-205)。
綜上，雌激素及其受體對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病及病變程度都有影響，雌激素受體在關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨中均有表達，蛋白活性及構(gòu)型差異可影響雌激素對關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的作用，其基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病相關(guān)。目前多項研究顯示雌激素受體調(diào)節(jié)劑同樣具有雌激素替代治療的作用，且雌激素能促進其受體表達水平，提示雌激素受體介導(dǎo)了雌激素對骨性關(guān)節(jié)炎的作用。婦女絕經(jīng)后，骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率增高，雌激素替代治療效果流行病學(xué)證據(jù)尚不充分。雌激素及其受體在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用機制尚不明確，需要更多的前瞻性的流行病學(xué)觀察，以及更加深入的體外及體內(nèi)實驗研究。
但是，攝入人體雌激素也會帶來很多副作用，最嚴(yán)重的是會增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率。
所以，該技術(shù)領(lǐng)域一直想尋找一種沒有諸如增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率危險的藥物來治療骨性關(guān)節(jié)炎。
染料木素(genistein)是存在于植物中的一種異黃酮成分，在多種植物中以甙元本身或糖甙的形式存在。糖甙中組成氧甙鍵的糖可以是諸如葡萄糖的單糖，也可以是諸如新橙皮糖(neohesperidose)、葡糖基芹菜糖(glucosylapiosied)；糖鏈所在的位置可以是在7位或4’位形成單鏈，也可以在7，4’形成雙鏈；或者在8位或6，8位形成碳甙鍵。在多種糖甙中，最常見的是染料木素—4’—0—吡喃葡萄糖甙(genistein-4’-glucopyranoside)，又名槐角苷(sophoricoside)和染料木素—7—0—吡喃葡萄糖甙(genistein-7-0-glucopyranoside)，又名染料木甙(genistin)。

R1 R2 Hβ-D-Glc槐角苷 (sophoricoside) β-D-GlcH染料木甙(genistin) H H 染料木素(genistein) 染料木甙是大豆的一種活性成分，屬于異黃酮類。1953年曾經(jīng)報道在豆渣中存在，將豆渣用作牲畜的飼料，因其中所含的染料木甙具有雌激素樣活性而使牲畜的體重增加。
近年來，人們進一步發(fā)現(xiàn)，大豆中的這類異黃酮能降低絕經(jīng)期前婦女患乳腺癌的危險，并能抑制大鼠膀胱腫瘤的生長和前列腺癌的早期發(fā)展。最近又報道含有染料木甙的大豆提取作為雌激素劑外，尚可抑制腸道的葡萄糖攝入，從而可能用于糖尿病以及用作葡萄糖誘導(dǎo)脂類過氧化的保護劑。此外，從老齡雌性大鼠所得股骨干骺端組織(femoral-metaphyseal tissues)的體外試驗，染料木甙或染料木素能引起干骺端組織中堿性磷酸酶、DNA和鈣含量的顯著增加，表明他們具有對骨代謝的合成作用，同時染料木甙能預(yù)防對卵巢功能切除大鼠的骨丟失。
槐角苷(sophoricoside)得自槐角，即豆科(Leguminosae)槐屬植物槐樹(Sophora japonica L)的果實，為常用中藥，槐角苷尚存在于尼泊爾黃花木(Piptanthus nepalensis)莖和漆樹科植物寬葉尚乳香(Schinus latifolius)葉中，槐角苷具有抗炎作用，能明顯抑制發(fā)炎過程的增生期，并有降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用。近年尚報道能同時抑制大鼠由角叉菜膠引起的水腫和巴豆油誘導(dǎo)的耳水腫，以及作為白介素—5的抑制劑。
日本專利申請JP11-116487只揭示了槐角苷在治療糖尿病等疾病中的應(yīng)用。
中國專利CN01113081.4也只揭示了槐角苷在治療婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供對人體的乳房和子宮沒有雌激素樣副作用的槐角苷在制備預(yù)防和/或治療關(guān)節(jié)軟骨退化，特別是絕經(jīng)后婦女關(guān)節(jié)軟骨退化的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是提供對人體的乳房和子宮沒有雌激素樣副作用的槐角苷在制備預(yù)防和/或治療骨性關(guān)節(jié)炎，特別是絕經(jīng)后婦女骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明一粉末涉及一種下式槐角苷在制備預(yù)防和/或治療絕經(jīng)后婦女關(guān)節(jié)軟骨退化的藥物中的應(yīng)用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氫-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羥基異黃酮-4’-D-葡糖苷)。
本發(fā)明另一方面涉及一種下式槐角苷在制備預(yù)防和/或治療絕經(jīng)后婦女骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氫-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羥基異黃酮-4’-D-葡糖苷)。
優(yōu)選的是，所述的槐角苷從豆科植物(sophora subprograms)，如大豆或槐角，特別是槐角中提取得到。
制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)常規(guī)的技術(shù)，將所述的槐角苷制備成各種劑型，如口服的膠囊劑、片劑等常規(guī)劑型。



圖1是實施例3中顯示各組子宮HE染色情況的顯微鏡圖(40倍物鏡)。
圖2是實施例4中顯示各組CTX-II基線比值變化情況的曲線圖。
圖3A是關(guān)節(jié)整體病理切片甲苯胺藍染色顯微鏡圖(1倍物鏡)，其中顯示了股骨、脛骨和內(nèi)外側(cè)半月板；圖3B是關(guān)節(jié)面病理切片甲苯胺藍染色的顯微鏡圖，其中顯示了股骨、脛骨和關(guān)節(jié)面缺損。
圖4是實施例5中顯示各組面病變情況的柱性圖，它基本上體現(xiàn)了表3的內(nèi)容。
圖5是正常關(guān)節(jié)軟骨ER-α免疫組化染色的顯微圖，(40倍物鏡)；正常關(guān)節(jié)軟骨ER-α表達于表層、中間層及肥大細胞層。
圖6是病變關(guān)節(jié)軟骨ER-α疫組化染色的顯微圖(40倍物鏡)，其中，關(guān)節(jié)面破壞區(qū)軟骨細胞ER-α失表達。
圖7是實施例6中各組關(guān)節(jié)軟骨ER-α免疫組化染色顯微圖(40倍物鏡)。
圖8是各組關(guān)節(jié)軟骨細胞ER-α表達陽性率比較的柱形圖，它基本上體現(xiàn)了表4的內(nèi)容。
圖9是正常關(guān)節(jié)軟骨TUNEL染色的顯微圖(40倍物鏡)，圖中少量調(diào)亡細胞分布于鈣化軟骨細胞層及肥大軟骨細胞層，箭頭表示凋亡細胞。
圖10是各組關(guān)節(jié)軟骨TUNEL染色的顯微圖(40倍物鏡)。
圖11是實施例7中各組關(guān)節(jié)軟骨凋亡指數(shù)比較的柱形圖，它基本上體現(xiàn)了表5的內(nèi)容。

具體實施例方式 實施例1動物分組及造模 66只6月齡雌性SD大鼠隨機分為模型組(ovariectomized，OVX)、假手術(shù)組(SHAM)，以及各藥物干預(yù)組ERT組、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)組、仙靈骨葆組、槐角苷10毫克組(HDA10)、槐角苷20毫克組(HDA20)、槐角苷40毫克組(HDA40)、槐角苷80毫克組(HDA80)。
1.造模方法 OVX組及各藥物干預(yù)組以1％戊巴比妥鈉溶液按5ml/kg，腹腔注射，待麻醉起效后，大鼠俯臥體位，肋弓下第3腰椎處去毛，以苯扎溴銨酊消毒皮膚，切皮，切口長約1cm，切開皮下、筋膜，鈍性分離肌肉，小心切開腹膜，組織鑷伸入切口，小心提起腹腔白色脂肪，輕手翻開脂肪，找到梅花狀卵巢，1號無菌絲線結(jié)扎，眼科剪從輸卵管剪斷分離卵巢，壓迫止血后，將脂肪小心放入腹腔，將切口移向?qū)?cè)，同樣方法切除對側(cè)卵巢，逐層縫合腹膜、筋膜、皮下、皮膚。消毒傷口。
SHAM組以同樣方法暴露卵巢，但不予切除，切除同量周圍脂肪后，閉合切口。
2.動物飼養(yǎng)條件及干預(yù)措施 大鼠飼養(yǎng)于中科院上海生命科學(xué)研究院動物實驗中心SPF級動物房。恒溫、恒濕清潔環(huán)境。溫度24℃。濕度40～60％。每天12h光照/12h黑暗，凈化水、普通飼料喂養(yǎng)。
藥物溶媒選擇1％羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethycellulose，CMC-Na)，SHAM組及OVX組以溶媒灌胃。
藥物組分別采取以下劑量溶解于所述溶媒后灌胃 ERT組補佳樂(Progynova，戊酸雌二醇片，法國schering S.A生產(chǎn)，批號072A-2)0.8mg/kg/天； SERM組易維特(Evisa，鹽酸雷洛昔芬片，西班牙lilly S.A生產(chǎn)，批號A208711)3mg/kg/天； XLGB組仙靈骨葆膠囊(貴州同濟堂制藥有限公司，批號060361)270mg/kg/天； HDA10組槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批號04292004)10mg/kg/天； HDA20組槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批號04292004)20mg/kg/天； HDA40組槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批號04292004)40mg/kg/天； HDA80組槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批號04292004)80mg/kg/天。
3.動物取材 大鼠分別于造模前、3周、5周、7周用代謝籠收集大鼠尿液1～1.5ml于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存。
11周后頸椎脫臼法處死大鼠，取子宮測量其濕重后投入4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)固定。取右側(cè)完整膝關(guān)節(jié)投入4％PFA中固定。
實施例2實驗前后大鼠體重及子宮濕重 實驗前后稱量大鼠體重，處死取材時同時取子宮稱量濕重，結(jié)果如表1。
表1 實驗前后大鼠體重及子宮濕重(x±Sx)
注與SHAM組比較**P<0.01，*P<0.05；與OVX組比較△△P<0.01，△P<0.05。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用方差分析，SHAM組子宮濕重組內(nèi)差異大，考慮處于不同月經(jīng)周期所致。實驗前后各組間體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。去卵巢處理各組與SHAM組子宮濕重有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，提示卵巢摘除成功。SHAM組及ERT組子宮濕重與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其他處理組與OVX組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示雌激素對子宮有刺激作用，而其他各組則無明顯子宮刺激作用。
實施例3子宮切片觀察 1.包埋將實施例1得到的大鼠子宮4％多聚甲醛固定24小時；75％酒精脫水過夜；85％酒精脫水45分鐘；95％酒精脫水45分鐘×2；100％酒精脫水45分鐘×2；浸入二甲苯中透明15分鐘×2；65℃烘箱，浸蠟3小時；石蠟包埋。
2.切片制作取大鼠子宮管腔冠狀面，石蠟切片機(Leica，ModelRM2235)切片，厚5μm.放入溫水30℃中，多聚賴氨酸處理載玻片鋪片。65℃烘箱烤片3小時切片備用。
3.子宮HE染色1)切片脫蠟至水65℃烘箱3小時；浸入二甲苯10分鐘×3；100％酒精10分鐘×2；95％酒精10分鐘×2；85％酒精10分鐘；75％酒精10分鐘；雙蒸水。
2)染色蘇木素4分鐘；流水沖洗反藍10分鐘；伊紅A液4分鐘；伊紅B液2分鐘； 3)脫水95％酒精10分鐘×2；100％酒精10分鐘×2； 4)透明二甲苯10分鐘×2； 5)中性塑膠封片 圖1顯示了40倍顯微鏡下各組子宮HE染色的情況。圖1中的第一行從左至右分別為SHAN組、ERT組和SERM組；第二行從左至右分別為XLGB組、HDA 10組和HDA 20組；第三行從左至右分別為HDA 40組、HDA 80組和OVX組。其中Sham組子宮內(nèi)膜增厚、呈鱗屑狀；OVX組子宮內(nèi)膜變薄、平坦；ERT組子宮內(nèi)膜較OVX組厚；其他各組類似OVX組。
實施例4CTX-II含量測定 1.采用Urine Pre-clinical(PC)Cartilaps ELISA試劑盒，競爭性酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定實施例1得到的尿液中CTX-II濃度，多功能生化儀(Beckman coulter，DXC800)測定尿液中肌苷(creatinine，下稱為Crea)濃度，并采用以下公式矯正CTX-II含量 矯正CTX-II(mg/mmol)＝CTX-II(g/L)/Crea(mmol/L) 2.ELISA方法原理 ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
3.CTX-II(μg/L)測定 1)取實施例1得到的大鼠尿液，解凍，室溫溶解30分鐘，取200μl分裝，用于Crea測定，另取各樣品10μl加標(biāo)準(zhǔn)A液，4倍稀釋； 2)標(biāo)準(zhǔn)品配制按下表分別配制，0μg/L，1.56μg/L，3.13μg/L，6.25μg/L，12.5μg/L，25μg/L，50μg/L，100μg/L8個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品； 表2CTX-II(μg/L)測定標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度配制
3)取已包被抗生物素蛋白鏈菌素的96孔板，向其中加入100μL生物素化抗原，加封口膜室溫孵育30分鐘； 4)清洗液15去離子水稀釋，備用； 5)洗板5次； 6)將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、質(zhì)控品10μL加入各孔，接著向各孔中加入150μL主要抗體，封口膜封閉后，放入4℃冰箱孵育21±3小時； 7)洗板5次； 8)每孔加入100μL過氧化物酶聯(lián)抗體，封口膜封閉，室溫孵育60分鐘； 9)洗板5次； 10)每孔加入100μL四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)底物顯色，暗室孵育15分鐘； 11)向每孔加入終止液各10μL； 12)酶標(biāo)儀(Molecular Devices Corporation，BD03315)測定吸光度值(optical density，OD)，分別以450nm及650nm，測吸光度，生成4參數(shù)logistic回歸曲線，讀取各樣本濃度值。
4.尿液中Crea(mmol/L)的測定由上海瑞金醫(yī)院檢驗科采用多功能生化儀(Beckman coulter，DXC800)測定。
根據(jù)上式計算出CTX—II基線比值，結(jié)果如圖2所示，與同時間點模型組比較圖中的**表示P<0.01，圖中的*表示P<0.05。
去卵巢后各組CTX-II型濃度基線百分比變化趨勢如圖2所示，數(shù)據(jù)處理采用方差分析，結(jié)果提示OVX組去卵巢后尿中CTX-II含量明顯增加(P<0.01)，關(guān)節(jié)軟骨Col II代謝旺盛，但在7周內(nèi)逐漸回到接近基線水平。SHAM組實驗期間尿中CTX-II含量基本穩(wěn)定(P>0.05)，關(guān)節(jié)軟骨Col II代謝基本穩(wěn)定。雌激素替代療法、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、HDA80可以顯著壓低去卵巢后短期內(nèi)CTX-II的代謝峰(P<0.01)。中成藥仙靈骨葆、HDA40同樣有此作用，但作用相對較弱(P<0.05)。雌激素替代療法、有雌激素樣作用雌激素受體調(diào)節(jié)劑、HDA和中成藥有預(yù)防及緩解此病理過程的作用。
實施例5關(guān)節(jié)面病變情況觀察 1.大鼠膝關(guān)節(jié)病理學(xué)石蠟切片制作 A)包埋1)大鼠膝關(guān)節(jié)4％PFA固定48小時；2)15％乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)脫鈣15日；3)75％酒精脫水過夜；4)85％酒精脫水45分鐘；5)95％酒精脫水45分鐘×2；6)100％酒精脫水45分鐘×2；7)二甲苯透明20分鐘×2；8)65℃烘箱，浸蠟3小時；9)石蠟包埋。
B)切片制作以內(nèi)側(cè)副韌帶為標(biāo)志做冠狀面，石蠟切片機(Leica，ModelRM2235)切片，厚5μm.放入溫水30℃中，多聚賴氨酸處理載玻片鋪片。65℃烘箱烤片3小時，切片備用。
2.甲苯氨藍染色、關(guān)節(jié)面缺損測量 A)甲苯氨藍染色 1)切片脫蠟至水65℃烘箱3小時，二甲苯10分鐘×3，100％酒精10分鐘×2，95％酒精10分鐘×2，85％酒精10分鐘，75％酒精10分鐘，雙蒸水； 2)染色1％甲苯氨藍5分鐘，流水沖洗10分鐘； 3)脫水丙酮I、II各10分鐘； 4)透明 二甲苯I、II各10分鐘； 5)中性塑膠封片。
B)關(guān)節(jié)病變圖像分析 由2位資深圖像分析技師采用Axionplan 2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)(Axioplan 2多功能自動熒光顯微鏡，KS400圖像分析系統(tǒng)Ver3.0，AxioCam數(shù)碼相機分辨率3900×3090)獨立測量病變長度測量股骨內(nèi)外側(cè)髁，脛骨平臺內(nèi)外側(cè)四個關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨面病變區(qū)(如圖3A和3B所示)，最后取平均值，并分別計算4個關(guān)節(jié)面病變百分比，最后計算膝關(guān)節(jié)總體病變白分比 關(guān)節(jié)面各部病變百分比＝病變區(qū)長度/負(fù)重關(guān)節(jié)面總長度×100％ 膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面病變百分比＝病變區(qū)總長度/關(guān)節(jié)面總長度×100％ 各組大鼠膝關(guān)節(jié)各部分及整體退變情況如下表3及說明書附4所示，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。實驗結(jié)果提示OVX組關(guān)節(jié)軟骨退變情況與SHAM組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示去卵巢后關(guān)節(jié)軟骨退變加重。除HDA10、HDA20外各藥物均可延緩去卵巢所引起的關(guān)節(jié)軟骨退變，其中ERT組與HDA80組效果較好，與OVX組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與SHAM組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而XLGB組、SERM組、HDA40有效但不能完全逆轉(zhuǎn)，與OVX組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與SHAM組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表3 各組關(guān)節(jié)面病變百分比(x±Sx)
注與OVX組比較**P<0.01，*P<0.05；與SHAM組比較△△P<0.01，△P<0.05。
實施例6關(guān)節(jié)軟骨細胞雌激素受體染色、陽性細胞百分比計算 1.軟骨細胞雌激素受體染色1)切片脫蠟至水；65℃烘箱3小時；二甲苯5分鐘×2；100％酒精5分鐘×2；95％酒精5分鐘×2；85％酒精5分鐘；75％酒精5分鐘；雙蒸水5分鐘×2；PBS5分鐘×3； 2)消除內(nèi)源性過氧化物酶3％H2O2-甲醇10分鐘，PBS清洗5分鐘×3； 3)抗原封閉0.3％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)30分鐘 4)加一抗加ER α抗體(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.sc-542)(150)55μl/片，4℃過夜，PBS清洗5分鐘×3； 5)加二抗加生物素化二抗(1200)37℃ 30分鐘，PBS清洗5分鐘×3； 6)加SABC(StreptAvidin Biotin Complex)加SABC(1300)37℃ 30分鐘，PBS清洗5分鐘×3； 7)顯色加二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)75μl/片3～6分鐘，顯微鏡下觀察； 8)套染流水漂洗3分鐘；蘇木素10秒；流水沖洗10分鐘；95％酒精10分鐘×2；100％酒精10分鐘×2；二甲苯10分鐘×2；中性塑膠封片。
2.圖像分析、陽性細胞百分比計算由2位資深圖像分析技師采用Axionplan 2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)(同以上實施例)分別在膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)外側(cè)髁，脛骨平臺內(nèi)外側(cè)，各取兩個視野獨立計算ER-α表達陽性細胞百分比，取平均值作為該區(qū)域的陽性細胞百分比。取四區(qū)平均值作為該膝關(guān)節(jié)總體陽性細胞百分比。取2人計算結(jié)果平均值為最終實驗結(jié)果。
陽性細胞百分比＝視野陽性軟骨細胞數(shù)/視野總軟骨細胞數(shù)×100％ 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ER-α表達情況如圖7所示，其中SHAM組ER-表達于關(guān)節(jié)軟骨各層，OVX組、HDA10、HDA20組關(guān)節(jié)軟骨淺層ER-α陽性細胞較正常關(guān)節(jié)軟骨明顯減少，ERT組、HDA80關(guān)節(jié)軟骨ER-α陽性細胞較OVX顯著增多，接近于正常關(guān)節(jié)軟骨。SERM組、XLGB組表達較OVX組增多。
ER-α表達陽性率及各組間差異如下表4和圖8所示。實驗結(jié)果提示正常關(guān)節(jié)軟骨(SHAM組)ER-α表達于表層、中間層及肥大細胞層(圖5)。軟骨關(guān)節(jié)面病變區(qū)域ER-α失表達。去卵巢后大鼠關(guān)節(jié)軟骨ER-α表達明顯減少(P<0.01)。雌激素、SERM以及除10mg劑量組的HDA干預(yù)的去卵巢大鼠ER-α表達增加(P<0.01)。但很難恢復(fù)到正常水平(與SHAM組比較ERT組P<0.05；其它各組P<0.01)。XLGB組與OVX組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，且ERT效果最佳明顯優(yōu)于其它組P<0.01。
表4 關(guān)節(jié)軟骨細胞ER-α表達陽性率(x±Sx)
注與OVX組比較**P<0.01，*P<0.05；與SHAM組比較△△P<0.01，△P<0.05。
實施例7軟骨細胞凋亡情況觀察 1.TUNEL法檢測凋亡細胞原理 細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30％的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(ternminaldeoxynucleotidyl transferase，TdT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法。
2.TUNEL染色 1)切片脫蠟至水65℃烘箱3小時；二甲苯5分鐘×2；100％酒精5分鐘×2；95％酒精5分鐘×2；85％酒精5分鐘；75％酒精5分鐘；PBS5分鐘×2； 2)預(yù)處理加新鮮蛋白酶K(20μg/ml)60μl/片，37℃濕盒20分鐘；PBS清洗2分鐘×2； 3)消除內(nèi)源性過氧化物酶3％H2O2甲醇5分鐘，PBS清洗5分鐘×2； 4)加平衡液沖洗75μl/片10s，倒去多余液體，吸棄周圍液體； 5)加TdT酶立即加入55μl/片工作液(陽性對照不加)37℃濕盒1小時； 6)終止加終止液輕搖15分鐘，PBS清洗3分鐘×3，輕輕取出多余液體； 7)顯色加抗地高辛-過氧化物酶65μl/片室溫濕盒30min，PBS清洗2min×4，加足量過氧化物酶底物75μl/片3～6分鐘，顯微鏡下觀察； 8)套染流水漂洗3分鐘；蘇木素10秒；流水沖洗10分鐘；95％酒精10分鐘×2；100％酒精10分鐘×2；二甲苯10分鐘×2；中性塑膠封片。
3.圖像分析、凋亡指數(shù)計算由2位資深圖像分析技師采用Axionplan 2imaging顯微圖像分析系統(tǒng)(Axioplan 2多功能自動熒光顯微鏡，KS400圖像分析系統(tǒng)Ver3.0，AxioCam數(shù)碼相機分辨率3900×3090)在膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)外側(cè)髁，脛骨平臺內(nèi)外側(cè)，各取兩個視野獨立計算凋亡指數(shù)，取平均值作為該區(qū)域的凋亡指數(shù)。取四區(qū)凋亡指數(shù)平均值作為該膝關(guān)節(jié)總體凋亡指數(shù)。取2人平均值為實驗結(jié)果。
凋亡指數(shù)＝視野陽性細胞數(shù)/視野總軟骨細胞數(shù)×100％ 圖10是各組關(guān)節(jié)軟骨TUNEL染色的顯微圖(40倍物鏡)。其中顯示OVX組關(guān)節(jié)軟骨各層均可見大量的凋亡細胞且表層、中層分布增多。SHAM組凋亡細胞則主要集中于軟骨鈣化層，量少。ERT組、HAD 80關(guān)節(jié)軟骨凋亡細胞較OVX組少，接近于正常關(guān)節(jié)軟骨。其他各組除HAD 20組外較OVX組均有減少。這提示，大鼠正常關(guān)節(jié)軟骨在鈣化軟骨層有少量凋亡細胞存在，去卵巢后(OVX組)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡增多(P<0.01)，關(guān)節(jié)軟骨淺層包括表層及中間層均可見凋亡的軟骨細胞(參見圖10)，除HDA20外各藥物干預(yù)組均能減少軟骨細胞的凋亡，與OVX組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中XLGB組、HDA40組效果較弱，與SHAM組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
下表5及圖11顯示了各組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細胞凋亡指數(shù)。
表5 各組關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡指數(shù)(x±Sx) Tab 5 The apoptotic index of the 6 groups(x±Sx)
注與模型組比較**P<0.01，*P<0.05；與SHAM組比較△△P<0.01，△P<0.05。
權(quán)利要求
1.一種下式槐角苷在制備預(yù)防和/或治療絕經(jīng)后婦女關(guān)節(jié)軟骨退化的藥物中的應(yīng)用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氫-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羥基異黃酮-4’-D-葡糖苷)。
2.一種下式槐角苷在制備預(yù)防和/或治療絕經(jīng)后婦女的骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氫-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羥基異黃酮-4’-D-葡糖苷)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的槐角苷從豆科植物中得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的槐角苷從大豆或槐角中提取得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及槐角苷在制備預(yù)防和/或治療絕經(jīng)后婦女關(guān)節(jié)軟骨退化或骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其療效顯著，但沒有動物體雌激素對子宮、乳房等的副作用，提取方便，來源豐富，有著很廣闊的市場前景。
文檔編號A61P19/00GK101396369SQ20081004144
公開日2009年4月1日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者寧 杜, 峰 高 申請人:寧 杜