專利名稱：一種腫瘤靶向重組dna疫苗及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，涉及一種腫瘤靶向重組DNA疫苗。更具體的說(shuō)，本發(fā)明 涉及一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)C0X-2的DNA疫苗，該疫苗在患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)腫瘤 耙向殺傷的CTL反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的目標(biāo)。
背景技術(shù)：
腫瘤在其癌變歷程中，需要促進(jìn)因子加快癌變速度，在眾多腫瘤促進(jìn)因子中環(huán)氧 合酶-2 (Cyclooxygenase-2， C0X-2)是一種重要的促進(jìn)因子之一。C0X-2與其同工酶 C0X-l是分解花生四烯酸(Arachidonic acid)生成各種內(nèi)源性前列腺(Prostaglandins, PGs)過(guò)程中關(guān)鍵的限速酶(Cell， 1995, 83(3): 493-501; Cell, 1996, 87(5): 803-809; Cell, 1998, 93(5): 705-716)。 COX酶(EC 1.14. 99.1)具有環(huán)氧合酶和過(guò)氧化酶兩種 活性，COX-l在正常組織中組成型表達(dá)，而C0X-2在組織中為誘導(dǎo)型表達(dá)(Cell, 1996， 87(5): 803-809)。 COX-2主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn) 移中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究顯示環(huán)氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2， COX-2)在肺癌、 乳腺癌、胃癌、肝癌、直腸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌與宮頸癌等腫瘤組織中高表達(dá)，而 正常組織不表達(dá)或低表達(dá)。敲除尸^s^(C0X-2基因)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)C0X-2有利于腫瘤 的產(chǎn)生，而C0X-2抑制劑可抑制腫瘤的形成。C0X-2通過(guò)下述多種途徑參與腫瘤的發(fā)生 發(fā)展1)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖；2)抑制癌細(xì)胞凋亡；3)促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移；4)促 進(jìn)腫瘤血管的形成；5)抑制免疫反應(yīng)；6)參與致癌物代謝；7)提高多藥抗藥性。因 此，C0X-2可作為腫瘤防治的一個(gè)重要靶點(diǎn)。此外，C0X-2己是炎癥治療與癌痛治療的 靶點(diǎn)。流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用非甾體抗炎藥能有效預(yù)防腫瘤發(fā)生。
目前腫瘤免疫治療可分為主動(dòng)免疫治療和被動(dòng)免疫治療，主要采用單克隆抗體、 蛋白疫苗、基因疫苗、噬菌體疫苗和細(xì)胞疫苗等。生產(chǎn)商已開發(fā)了一系列產(chǎn)品，如抗 EGF單克隆抗體商品名為ABX-EGF (N Engl J Med， 2003 ， 349 (5) :427-34)，抗EGFR單 克隆抗體商品名為ERBITUX，又名Cetuximab, IMC-C225 (Semin Oncol， 2003， 30(6): 39-50)， HER2的人源化單克隆抗體商品名Herc印tin (http:〃www. herc印tin. com)等。主動(dòng)免疫治療通過(guò)接種疫苗如蛋白與DNA疫苗誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗體、CTL及ADCC反應(yīng)，達(dá) 到免疫殺傷作用。2002年4月Niethammer等報(bào)道了構(gòu)建以VEGF受體2作為新型口服DNA疫 苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該DNA疫苗能使小鼠耐受致死劑量腫瘤細(xì)胞的接種而不長(zhǎng)腫 瘤，并縮小已成長(zhǎng)的腫瘤。在不同的動(dòng)物試驗(yàn)中均確認(rèn)了其抗腫瘤的效果(Nat Med, 2002,8(12): 1369-1375)。英國(guó)生物技術(shù)公司Plotherics PL開發(fā)的VEGF基因疫苗目前 巳進(jìn)入了預(yù)臨床試驗(yàn)階段。
目前已有用腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異促進(jìn)因子的DNA疫苗的抗腫瘤作用的報(bào)道，如人端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶(Human telomerase reverse tanscriptase, hTERT)與凋亡抑制蛋白
(Survivin)，其抗原表位肽是經(jīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體加工的產(chǎn)物，能在體外誘導(dǎo)特異性細(xì) 胞毒性CD8+Th細(xì)胞(Immunity, 1999,10(6): 673-679; Cancer Res， 2000,60:4845 -4849)?；蛞呙缈鼓[瘤的機(jī)理雖然還沒有定論，但本領(lǐng)域研究者們共識(shí)為基因疫苗 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原，部分抗原在細(xì)胞蛋白酶體加工，經(jīng)MHCI呈遞在細(xì)胞表面，誘導(dǎo)特 異性細(xì)胞毒性CD8+細(xì)胞；另一部分抗原分泌到胞外被其它免疫細(xì)胞攝取，在溶酶體作 用下加工成多肽，與MHCII分子結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面被CD4+細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)一步產(chǎn)生體 液免疫與細(xì)胞免疫。COX-2在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在正常組織不表達(dá)或低表達(dá)。腫瘤細(xì) 胞所表達(dá)的COX-2同樣可被蛋白酶體加工，部分MHC I限制方式呈遞在細(xì)胞表面，產(chǎn)生 CTL細(xì)胞反應(yīng)。COX-2的DNA疫苗可誘導(dǎo)CTL細(xì)胞特異殺傷C0X-2異常表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。但 尚未見關(guān)于C0X-2 DNA疫苗的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤靶向重組DNA疫苗，具體涉及一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展 相關(guān)COX-2的DNA疫苗。該疫苗能在在患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)腫瘤靶向殺傷的CTL反應(yīng)， 實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的目標(biāo)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的腫瘤耙向重組DNA疫苗的制備方法。 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述的腫瘤靶向重組DNA疫苗在腫瘤預(yù)防與治療中的 應(yīng)用。
本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，將腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)C0X-2、 5'-AACGTT-3'序列(免疫 刺激DNA序列Immunostimulatory DNA sequence, ISS)、鼠源泛素蛋白(MJbi)及其 pVAXl載體重組成為pVAXl-/rfJbi-ISS-COX-2-ISS;目的DNA疫苗在原核細(xì)胞擴(kuò)增后， 制備無(wú)內(nèi)毒素高純的DNA疫苗，免疫小鼠，刺激機(jī)體產(chǎn)生CTL反應(yīng)，殺傷C0X-2異常表達(dá)腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療的目的。
本發(fā)明所述的疫苗的DNA序列包括鼠源泛素蛋白(/ziJbi)、 5'-AACGTT-3'序列 (I匪nostimulatory DNA sequence, ISS)、 COX-2蛋白的DNA序列及pVAXl載體。
本發(fā)明提供的腫瘤靶向重組DNA疫苗，其特征是，用于制備該疫苗的蛋白是環(huán)氧 合酶-2 (COX-2)的功能片段，其編碼序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0 2所示；為了加快目標(biāo)蛋白C0X-2的加工與呈遞，在C0X-2蛋白的N端連接一段鼠 源的泛素蛋白』bi，其編碼序列如SEQ ID NO 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 4所 示；機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，需要免疫原的刺激，免疫刺激DNA序列ISS可激活T 細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞，誘導(dǎo)Thl細(xì)胞免疫功能，在//Ubi序列與COX-2交接處及COX-2 的3'端均有ISS序列，其序列如SEQ ID NO 5所示。
本發(fā)明提供的腫瘤靶向重組DNA疫苗在基本載體pVAXl的多克隆位點(diǎn)MCS處插入 SEQ ID NO 7的片段/zUbi-ISS-COX-2-ISS，構(gòu)建成編碼鼠源泛素蛋白/dJbi與COX-2融 合蛋白抗原，融合蛋白抗原之間由SEQ ID NO 6的柔性接頭連接，制得腫瘤耙向重組 DNA疫苗，命名為pVAXl-yziJbi-ISS-COX-2 - ISS。
本發(fā)明的腫瘤耙向重組DNA疫苗通過(guò)下述方法制備
1) 以pVAXl (購(gòu)自Invitrogen公司)為基本載體，該載體含有卡那霉素抗性基因 的表達(dá)框與多克隆位點(diǎn)(Multiple cloning site, MCS);
2) 在pVAXl的MCS位點(diǎn)插入C0X-2表達(dá)框，所述COX-2表達(dá)框的構(gòu)成是從5' 端到3'端方面依次為(I )轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子P^v， (II) MJbi序列，(III) ISS序列，(IV) C0X-2基因序列，(V) ISS序列，(VI)牛生長(zhǎng)激素 的多聚腺苷?；盘?hào)(BGHpA)，
所得DNA疫苗載體命名為pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS。
所述的疫苗，其中的PcMv使重組蛋白高水平表達(dá)、Wbi加快COX-2抗原加工與呈 遞、ISS序列作為免疫佐劑激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)腫瘤靶向CTL產(chǎn)生、殺傷COX-2 異常表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明中涉及的各種細(xì)菌擴(kuò)增、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、鑒定、純化等方法采用本領(lǐng)域公知 的常規(guī)條件與步驟。
本發(fā)明所涉及的原核細(xì)胞為大腸桿菌DH5a 。
本發(fā)明的腫瘤靶向的DNA疫苗載體pVAXl-MJbi-ISS-COX-2-ISS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci可得到含有該疫苗載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)上述含pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化 子，經(jīng)提取純化得pVAXl-y iJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗并測(cè)定濃度，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等檢驗(yàn) 疫苗的效果，如DNA疫苗免疫動(dòng)物，接種腫瘤細(xì)胞，觀察殺傷效應(yīng)(預(yù)防性實(shí)驗(yàn))，或 者在長(zhǎng)有腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)注射該疫苗，觀察抗腫瘤效果(治療性實(shí)驗(yàn))。
預(yù)防性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明預(yù)防組比對(duì)照組全部成瘤性晚9天，接瘤后的第21天全部 成瘤，對(duì)照組為接瘤后的第12天全部成瘤，表明，該腫瘤靶向DNA疫苗可明顯降低B16 黑色素瘤細(xì)胞的小鼠成瘤性。
本發(fā)明腫瘤靶向DNA疫苗可強(qiáng)烈殺傷B16腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)，在接瘤后的 第30天，抑瘤率為63.4%，治療組動(dòng)物成活率明顯高于對(duì)照組，生成期可達(dá)60天。治 療性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明治療組比對(duì)照組全部成瘤性晚2天，為接瘤后15天；本發(fā)明腫瘤 靶向DNA疫苗能降低B16黑色素瘤細(xì)胞動(dòng)物成瘤性；該DNA疫苗在B16腫瘤細(xì)胞接瘤 后的第25天，抑瘤率為58.9%，且治療組動(dòng)物成活率明顯高于對(duì)照組，其生成期可超 過(guò)45天；上述結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的腫瘤靶向重組DNA疫苗，免疫動(dòng)物后具有良好預(yù)治 腫瘤效果。
本發(fā)明還提供了一種腫瘤靶向重組DNA疫苗的應(yīng)用，其特征是，將該疫苗應(yīng)用于 制備腫瘤預(yù)防與治療的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種腫瘤靶向重組DNA疫苗的應(yīng)用，其特征是，將該疫苗應(yīng)用于 制備炎癥治療的藥劑，這主要是通過(guò)該疫苗殺傷炎癥細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種腫瘤耙向重組DNA疫苗的應(yīng)用，其特征是，將該疫苗應(yīng)用于 制備癌痛治療的藥劑。
本發(fā)明制備的腫瘤靶向DNA疫苗具有以下特點(diǎn)
1、 本發(fā)明以腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)的C0X-2分子為DNA疫苗的靶基因，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 并誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)異常表達(dá)C0X-2的腫瘤細(xì)胞的CTL反應(yīng)、導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制 和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)腫瘤生物靶向治療的目標(biāo)。
2、 5'-AACGTT-3'序列為ISS序列，ISS作為免疫佐劑激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，可作用 與T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞，并促進(jìn)IL-6、 IL-12、 IL-18及IFN等多 種細(xì)胞因子的分泌，具有較強(qiáng)誘導(dǎo)Thl細(xì)胞免疫功能。
3、泛素/ziJbi與C0X-2融合表達(dá)連接可增強(qiáng)C0X-2蛋白在蛋白酶體中的降解、呈遞，
6提高并加快抗原誘導(dǎo)的CTL免疫應(yīng)答。
4、 本疫苗易構(gòu)建、易改造、制備成本低廉并可大規(guī)模生產(chǎn)。
5、 本疫苗物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，20-25'C下可保存、便于運(yùn)輸與使用。
6、 本疫苗可長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，與常規(guī)的多肽(蛋白疫苗)相比，免疫接種量 與接種次數(shù)少。
7、 本疫苗含有/HUbi序列與ISS序列，既加快了DNA疫苗的免疫效能，同時(shí)避免各 種對(duì)人體有害的免疫佐劑。
以下通過(guò)


與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明

圖1 pVAXl-zsUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2含有』bi的片段的質(zhì)粒pVAXl-MJbi結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3 pVAXl-/zDbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗構(gòu)建示意圖。
圖4 pVAXl-/ziUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗抗腫瘤作用(免疫治療)。
圖5 pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響(免疫治療)。
圖6 pVAXl-/wUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗抗腫瘤作用(免疫預(yù)防)。
圖7 PVAXl-/sUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響(免疫預(yù)防)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l C0X-2基因克隆 A549細(xì)胞總mRNA提取
A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10X小牛血清的完全1640培養(yǎng)液，置37'C、 5%0)2培養(yǎng)箱，胰蛋 白酶消化后離心收集細(xì)胞，棄上清，按照Trizol提取試劑盒(華舜公司)進(jìn)行總mRNA 提取，電泳檢測(cè)。
弓I物設(shè)計(jì)與RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BC013734登陸號(hào)提供的C0X-2基因序列及pVAXl載體上的酶切 位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，在上下引物中分別引入)9aMn和&oRI酶切位點(diǎn)，引物由上海賽百盛
基因技術(shù)有限公司合成
上游引物(SEQ ID NO 8 ) : 5、 -CGGGATCCGGTGGGGGCGG，Cg77CCTTGCTGTTCCAACCCA
TGTC-3'(下劃線為"a/rfU位點(diǎn)，加粗的為部分柔性接頭序列，斜體為ISS序列)；下游引物(SEQ ID NO 9):
5、-CGGAATTCTTA雄6T7CAGTTCAGTCGAACGTTCTTTTAG-3'(下劃線為AcoR I位點(diǎn)，斜 體為ISS序列)。
按Promega公司RT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行C0X-2基因cDNA合成。
PCR反應(yīng)體系為50uL:
cDNA為模板 1 u L,
5U/ u L ￡r7a<7 DNA聚合酶 0. 3 u L，
10XPCR Buffer 5n L，
10 ,1 / L d證 4 ix 1，
10 pmol /L上游引物 2nL，
10 pmol/L下游引物 2uL，
雙蒸水 35. 7 u L
總體積 50uL。
循環(huán)參數(shù)為
94'C預(yù)變性 5 min;
94'C變性 30 S，
58。C退火 60 S，
72。C延伸 120 S， 30個(gè)循環(huán);
72'C延伸 10 min, l個(gè)循環(huán);
4'C保存 ~。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在l. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。
用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(TaKaRa公司)回收大小約1. 8 kb左右上述產(chǎn)物，用TJ)NA 連接酶(TaKaRa公司)將PCR純化C0X-2 DNA片段與pMD19-T (TaKaRa公司)載體片 段相連，其質(zhì)粒載體命名為pMD19-ISS-C0X-2-ISS。
連接反應(yīng)體系20 uL
COX-2DNA片段 5 u L
pMD19-T載體片段 8uL
T4DNA連接酶 0. 5 p L
T4DNA連接酶Buffer 2 u L雙蒸水 4. 5 u L
總體積 20 uL
16'C連接過(guò)夜。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，藍(lán)白篩選，陽(yáng)性克隆接種于含5 mL Amp 的LB培養(yǎng)液中，37'C振搖過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA行PCR與酶切鑒定(具體操作按照《分 子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著黃培堂等譯2000)相關(guān)方 法進(jìn)行)，并送上海捷瑞生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BC013734登 陸號(hào)提供的C0X-2基因的序列一致，序列見SEQ ID NO 1。
實(shí)施例2 鼠源MJbi基因克隆 小鼠睪丸組織總mRNA提取
無(wú)菌條件下C57BL/6雄性小鼠(中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)的睪丸組織，并用DEPC 處理的雙蒸水清洗2次，取0.5克組織、搗碎，按照Trizol提取試劑盒(華舜公司)進(jìn) 行總mRNA提取，電泳檢測(cè)。 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR擴(kuò)增
按GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)X51703登陸號(hào)提供的MJbi基因序列及pVAXl載體上的酶切位點(diǎn)設(shè) 計(jì)引物，在上下引物中分別引入AVwffl和ife/rfil酶切位點(diǎn)，引物由上海賽百盛基因技 術(shù)有限公司合成
上游引物(SEQ ID NO 10) : 5'-CGAAGCTTGCCACCATGCAGATCTTCGTGAAAACC-3'(下 劃線為歷/70ffl位點(diǎn))；
下游引物(SEQ ID NO 11): 5' -CGGGATCCGCCACCGCCTCCGCCACCTCTCAGGCGAAGGACCA-3' (下劃線為5』I位點(diǎn)，加粗的為柔性接頭序列)。
按Pr omega公司RT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行/riJb i基因cDNA合成。
PCR反應(yīng)體系為50nL:
cDNA為模板 0.5uL，
5U/ii L ￡r7"a<7 DNA聚合酶. 0. 3 u L，
10XPCR Buffer 5uL，
10腸l /L d酵 4ti 1，
10 pmol /L上游引物 2uL,
1Opmol/L下游引物 2pL，5 min; 30 S， 30 S，
30 S， 30個(gè)循環(huán); 7 min， l個(gè)循環(huán)；
雙蒸水 36. 2 u L
總體積 50uL。 循環(huán)參數(shù)為
94'C預(yù)變性 94'C變性 58'C退火 72'C延伸 72'C延伸
4'C保存 oo。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。
用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(TaKaRa公司)回收大小約230 bp左右上述產(chǎn)物，用T4DNA 連接酶將PCR純化MJbi DNA片段與PMD19-T載體片段相連，其質(zhì)粒載體命名為 p腿9-暴i。
連接反應(yīng)、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a及其測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法同1.2方案中相應(yīng)部分。測(cè) 序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)X51703登陸號(hào)提供的MJbi基因的序列一致，序列見SEQ ID NO 3。
實(shí)施例3構(gòu)建pVAXl-zzUbi-ISS-COX-2-ISS腫瘤靶向DNA疫苗重組載體 pVAXl-zzUbi重組載體的構(gòu)建 在含20u g/mL Amp抗性的LB培養(yǎng)5mL, 37。C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)含pMD19-MJbi質(zhì)粒的 DH5a感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版提取pMD19-MJbi質(zhì)粒DNA。
同樣在含50 u g/mL Kan抗性的LB培養(yǎng)5mL， 37。C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)含pVAXl質(zhì)粒的DH5 a 感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版提取pVAXl質(zhì)粒DNA。
用歷'"dll和Aa/zH I (TaKaRa公司)分別雙酶切pMD19-/ Ubi質(zhì)粒DNA與pVAXl質(zhì)粒 DNA (Invitrogen公司)，酶切反應(yīng)體系為80uL: 質(zhì)粒DNA 20 yL
幼'慮 3uL fe/zH I 3 P L
10Xbuffer K 8u L雙蒸水 46 u L
總體積 80uL。 37"C水浴酶切過(guò)夜。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳。用DNA凝膠回收試劑盒分別回收230bp的/ziJbi DNA片段與3. Okb的pVAXl DNA片段，T4 DNA連接酶連接上述片段 連接反應(yīng)體系20uL
/sUbi DNA片段5nL
pVAXl DNA片段8"
T4DNA連接酶0.5uL
T4DNA連接酶Buffer2uL
雙蒸水4. 5nL
總體積
16'C連接過(guò)夜。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，涂布在50ug/mL Kan抗性的LB固體培 養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，陽(yáng)性克隆接種于含50ug/mL Kan抗性5 mL LB培養(yǎng)液中，37。C振搖 過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA行PCR與A'/7cffl和5』I酶切鑒定(具體操作按照《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》第三版(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著黃培堂等譯2000)相關(guān)方法進(jìn)行)。
pVAXl-znUbi-ISS-COX-2-ISS重組載體的構(gòu)建
在含20 P g/mL Amp抗性的LB培養(yǎng)5mL， 37。C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)含pMD19-ISS-COX-2-ISS 質(zhì)粒的DH5a感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版提取 pMD19-ISS-COX-2-ISS質(zhì)粒DNA。
同樣在含50 u g/mL Kan抗性的LB培養(yǎng)5mL， 37。C震蕩過(guò)夜培養(yǎng)含pVAXl-/dJbi質(zhì) 粒的DH5 a感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版提取pVAXl-Wbi質(zhì)粒DNA。 用fe/ziU和fcoRl (TaKaRa公司生產(chǎn))分別雙酶切pVAXl-MJbi質(zhì)粒DNA與 pMD19-ISS-C0X-2-ISS質(zhì)粒DNA (Invitrogen公司)，酶切反應(yīng)體系為80uL (酶切反 應(yīng)體系與酶切條件同重組載體的構(gòu)建)
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳。用DNA凝膠回收試劑盒分別回收l(shuí). 8kb的ISS-COX-2-ISS DNA片段與3. 2kb的pVAXl-zzUbi DNA片段，T4 DNA連接酶連接上述片段(連接 反應(yīng)體系與酶切反應(yīng)條件同上述)。
11連接產(chǎn)物pVAXl-』bi-ISS-COX-2-ISS轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)大腸桿菌、Kan抗性轉(zhuǎn)化 子大規(guī)模培養(yǎng)、堿裂解法制備pVAXl-/BUbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗DNA。yW〃^dlI和5』I 酶切鑒定MJbi DNA片段，用5a/zH I和ScoR I鑒定ISS-COX-2-ISS DNA片段， 和￡coR I鑒定Wbi-ISS-COX-2-ISS DNA片段，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳依次可獲 得230bp， 1.8kb及2.0kb地下的片段，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符合(具體反應(yīng)體系與反應(yīng) 條件參見3. 1方案)。酶切鑒定后并送上海鼎安生物公司測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果見SEQ ID NO 7。
實(shí)施例4 大量制備與純化pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗DNA
采用堿裂解法大量制備pVAXl-/*bi-ISS-COX-2-ISS疫苗及對(duì)照pVAXl質(zhì)粒DNA， TritonX-IOO去除內(nèi)毒素，PEG8000沉淀后溶于生理鹽水中，測(cè)定八26?！?8。值為1. 8，調(diào) 整濃度為lug/uL(具體操作按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(J.薩姆布魯克，D.W. 拉塞爾著黃培堂等譯2000)相關(guān)方法進(jìn)行)。
實(shí)施例5腫瘤靶向DNA疫苗實(shí)驗(yàn)治療腫瘤
1) 建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤模型 體外培養(yǎng)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞
小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞預(yù)活化，B16黑色素瘤細(xì)胞接種在含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置37'C、 5%0)2培養(yǎng)箱；
小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)，胰蛋白酶消化預(yù)活化后B16黑色素瘤細(xì)胞，離心收集 細(xì)胞用無(wú)小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中清洗2-3次，接種在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng) 液中，置37'C、 5%(:02培養(yǎng)箱4-5天，備用；
荷黑色素瘤B16小鼠C57BL/6為模型
實(shí)驗(yàn)用鼠6~8周齡、體重18 22g、健康雌性C57BL/6純系小鼠(早)(購(gòu)至中科 院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，在動(dòng)物房培養(yǎng)3-4天(以小鼠適應(yīng)新的環(huán)境)，
胰蛋白酶消化B16黑色素瘤細(xì)胞，用PBS (pH7.4)清洗2-3次，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，在 C57BL/6純系小鼠右前肢腋下皮下接種5 X 106-7 X106，選取9-10天內(nèi)腫瘤大小為1-3mm 的小鼠作為實(shí)驗(yàn)用鼠。
2) 黑色素瘤的免疫治療實(shí)驗(yàn)治療組(IO只)C57BL/6接種B16黑色素瘤后的第3天注射100ug本發(fā)明腫瘤靶 向DNA疫苗在小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射 1 u g/u LpVAXl-函i-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗100 ^L，每周1次，共3次；
對(duì)照組(IO只)C57BL/6接種B16黑色素瘤后的第3天注射100 u g本腫瘤靶向DNA 疫苗在小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射1 u g/y L pVAXl DNA疫苗100;/L，每周1次，共3次；
接種腫瘤細(xì)胞后10天，觀察成瘤性；觀察腫瘤大小，測(cè)定腫瘤長(zhǎng)徑與短徑，腫瘤 體積(國(guó)3)=(長(zhǎng)徑/2) X短徑、計(jì)算抑瘤率=(對(duì)照組瘤體積-實(shí)驗(yàn)組瘤體積)/對(duì)照組 瘤體積X10(E，觀察小鼠的生存期；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組比對(duì)照組全部成瘤性晚2天，為接瘤后15天；開始成瘤為
接瘤后的第12天，而對(duì)照組為接瘤后的第10天，本發(fā)明腫瘤靶向DNA疫苗可降低B16 黑色素瘤細(xì)胞動(dòng)物成瘤性；腫瘤體積大小表明pVAXl-yrfJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗 具有明顯的抗腫瘤作用，能抑制B16腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，在接瘤后的第25天，抑瘤率為58. 9% (圖4與圖5),治療組動(dòng)物成活率明顯高于對(duì)照組，其生成期超過(guò)45天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證 實(shí)本pVAXl-zriJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗具有良好的抗腫瘤作用。
表1是pVAXl-/dJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗免疫治療對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞動(dòng)物成 瘤性的影響。
表2是pVAXl-MJbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗免疫治療對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞動(dòng)物生 存期的影響(活動(dòng)物)。
表1
接瘤后時(shí)間(d)10111213141516
對(duì)照組(n=10)14910101010
治療組(n=10)001791010
表2接瘤后時(shí)間(d)15202530354045
對(duì)照組(n=10)101071000
治療組(n=10)101010101092
實(shí)施例6腫瘤靶向DNA疫苗對(duì)腫瘤的免疫預(yù)防實(shí)驗(yàn)
1)建立荷黑色素瘤B16小鼠C57BL/6為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤模型方法同實(shí)施例5;2)黑色素瘤的免疫預(yù)防實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)組在C57BL/6小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射 1 u g/u L pVAXl-滿i-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗100 ^L,每周1次，共4次，末次免 疫結(jié)束后，在C57BL/6純系小鼠右前肢腋下皮下接種5X1(T-7X106， 10天觀察腫瘤大 小，測(cè)定腫瘤長(zhǎng)徑與短徑，腫瘤體積=(長(zhǎng)徑/2) X短徑2，計(jì)算抑瘤率=(對(duì)照組瘤體 積-實(shí)驗(yàn)組瘤體積)/對(duì)照組瘤體積X 100%，觀察小鼠的生存期；
對(duì)照組在C57BL/6小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射 lug/ixLpVAXl DNA疫苗100;/L，每周1次，共4次，末次免疫結(jié)束后，在C57BL/6 純系小鼠右前肢腋下皮下接種5XlCf-7X106。 IO天觀察腫瘤大小，腫瘤測(cè)定與體積計(jì) 算方法與實(shí)驗(yàn)組的相同。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)防組比對(duì)照組全部成瘤性晚9天，為接瘤后21天；開始成瘤期 為16天，而對(duì)照組為10天，表明，該腫瘤耙向DNA疫苗可明顯降低B16黑色素瘤細(xì) 胞的小鼠成瘤性。腫瘤體積結(jié)果表明pVAXl-』bi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗具有明顯 的抗腫瘤作用，可強(qiáng)烈殺傷B16腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)，在接瘤后的第30天，抑瘤 率為63.4% (圖6與圖7)，治療組動(dòng)物成活率明顯高于對(duì)照組，生成期可達(dá)60天。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)pVAXl-Wbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗具有良好的腫瘤預(yù)防作用。 表3 pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗免疫預(yù)防對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞動(dòng)物成瘤 性的影響。
表4 pVAXl-/zUbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗預(yù)防治療對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞動(dòng)物生存 期的影響(活動(dòng)物)。
表3
接瘤后時(shí)間(d)101112131416182021
對(duì)照組(n=10)2810101010101010
治療組(n=10)0000013910
表4接瘤后時(shí)間(d)20253035 4045505560 65
對(duì)照組(n=10)10930 00000 0
治療組(n=10)10101010 109721 0序列表
SEQUENCE LISTING <110>同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院 <120〉 一種腫瘤靶向重組DNA疫苗及其制備與應(yīng)用 <130〉 81 <160〉 11
<170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211〉 1764 <212〉 DNA <213> Homo sapiens
<220〉 <221〉 CDS <222〉 ("..(1764) <223>
<400〉 1
cct tgc tgt tec aac cca tgt caa aac cga ggt gta tgt atg agt gtg 48 Pro Cys Cys Ser Asn Pro Cys Gin Asn Arg Gly Val Cys Met Ser Val 15 10 15
gga ttt gac cag tat aag tgc gat tgt acc egg aca gga ttc tat gga 96 Gly Phe Asp Gin Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Gly 20 25 30
gaa aac tgc tea aca ccg gaa ttt ttg aca aga ata aaa tta ttt ctg 144 Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg lie Lys Leu Phe Leu 35 40 45aaa ccc act cca aac aca gtg cac tac ata ctt acc cac ttc aag gga 192 Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr lie Leu Thr His Phe Lys Gly 50 55 60
ttt tgg aac gtt gtg aat aac att ccc ttc ctt cga aat gca att atg 240 Phe Trp Asn Val Val Asn Asn lie Pro Phe Leu Arg Asn Ala lie Met 65 70 75 80
agt tat gtg ttg aca tec aga tea cat ttg att gac agt cca cca act 288 Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu lie Asp Ser Pro Pro Thr 85 90 95
tac aat get gac tat ggc tac aaa age tgg gaa gcc ttc tct aac etc 336 Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe Ser Asn Leu 100 105 110
tec tat tat act aga gcc ctt cct cct gtg cct gat gat tgc ccg act 384 Ser Tyr Tyr Thr Arg Ala Leu Pro Pro Val Pro Asp Asp Cys Pro Thr 115 120 125
ccc ttg ggt gtc aaa ggt aaa aag cag ctt cct gat tea aat gag att 432 Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gin Leu Pro Asp Ser Asn Glu lie 130 135 140
gtg gaa aaa ttg ctt eta aga aga aag ttc ate cct gat ccc cag ggc 480 Val Glu Lys Leu Leu Leu Arg Arg Lys Phe lie Pro Asp Pro Gin Gly 145 150 155 160
tea aac atg atg Ut gca ttc ttt gcc cag cac ttc acg cat cag ttt 528 Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gin His Phe Thr His Gin Phe 165 170 175
ttc卿aca gat cat aag cga ggg cca get ttc acc aac ggg ctg ggc 576 Phe Lys Thr Asp His Lys Arg Gly Pro Ala Phe Thr Asn Gly Leu Gly 180 185 190
cat ggg gtg gac tta aat cat att tac ggt gaa act ctg get aga cag 624 His Gly Val Asp Leu Asn His lie Tyr Gly Glu Thr Leu Ala Arg Gin 195 200 205
cgt aaa ctg cgc ctt ttc aag gat gga aaa atg aaa tat cag ata att 672 Arg Lys Leu Arg Leu Phe Lys Asp Gly Lys Met Lys Tyr Gin .lie lie 210 215 220
gst gga gag atg tat cct ccc aca gtc aas gat act csg ges gsg atg 720 Asp Gly Glu Met Tyr Pro Pro Thr Val Lys Asp Thr Gin Ala Glu Met 225 230 235 240
ate tac cct cct caa gtc cct gag cat eta egg ttt get gtg ggg cag 768 lie Tyr Pro Pro Gin Val Pro Glu His Leu Arg Phe Ala Val Gly Gin 245 250 255
gag gtc ttt ggt ctg gtg cct ggt ctg atg atg tat gcc aca ate tgg 816 Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala Thr lie Trp 260 265 270ctg egg gaa cac aac aga gta tgc gat gtg ctt aaa cag gag cat cct 864 Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gin Glu His Pro 275 280 285
gaa tgg ggt gst gag cag ttg ttc cag aca age agg eta ata ctg ata 912 Glu Trp Gly Asp Glu Gin Leu Phe Gin Thr Ser Arg Leu lie Leu lie 290 295 300
gga gag act att aag att gtg att gaa gat tat gtg caa cac ttg agt 960 Gly Glu Thr lie Lys lie Val lie Glu Asp Tyr Val Gin His Leu Ser 305 310 315 320
ggc tat cac ttc aaa ctg aaa ttt gac cca gaa eta ctt ttc aac aaa1008 Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu Phe Asn Lys 325 330 335
caa ttc cag tac caa aat cgt att get get gaa ttt aac acc etc tat1056 Gin Phe Gin Tyr Gin Asn Arg lie Ala Ala Glu Phe Asn Thr Leu Tyr 340 345 350
cac tgg cat ccc ctt ctg cct gac acc ttt caa att cat .gac cag aaa1104 His Trp His Pro Leu Leu Pro Asp Thr Phe Gin lie His Asp Gin Lys 355 360 365
tac aac tat caa cag ttt ate tac aac aac tct ata ttg ctg gaa cat1152 Tyr Asn Tyr Gin Gin Phe lie Tyr Asn Asn Ser lie Leu Leu Glu His 370 375 380
gga att acc cag ttt gtt gaa tea ttc acc agg caa att get ggc agg 1200 Gly lie Thr Gin Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gin lie Ala Gly Arg 385 390 395 400
gtt get ggt ggt agg aat gtt cca ccc gca gta cag aaa gta tea cag1248 Val Ala Gly Gly Arg Asn Val Pro Pro Ala Val Gin Lys Val Ser Gin 405 410 415
get tec att gac cag age agg cag atg aaa tac cag tct ttt aat gag 1296 Ala Ser He Asp Gin Ser Arg Gin Met Lys Tyr Gin Ser Phe Asn Glu 420 425 430
tac cgc aaa cgc ttt atg ctg aag ccc tat gaa tea ttt gaa gaa ctt 1344 Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe Glu Glu Leu 435 440 445
aca gga gaa sag gaa atg tct gca gag ttg gas gca etc t3t ggt gac 1392 Thr Gly Glu Lys Glu Met Ser Ala Glu Leu Glu Ala Leu Tyr Gly Asp 450 455 460
ate gat get gtg gag ctg tat cct gcc ctt ctg gta gaa aag cct egg 1440 lie Asp Ala Val Glu Leu Tyr Pro Ala Leu Leu Val Glu Lys Pro Arg 465 470 475 480
cca gat gcc ate ttt ggt gaa acc atg gta gaa gtt gga gca cca ttc1488 Pro Asp Ala lie Phe Gly Glu Thr Met Val Glu Val Gly Ala Pro Phe 485 490 495
17tcc ttg aaa gga ctt atg ggt aat gtt ata tgt tct cct gcc tac tgg 1536 Ser Leu Lys Gly Leu Met Gly Asn Val lie Cys Ser Pro Ala Tyr Trp 500 505 510
aag cca age act ttt ggt gga gaa gtg ggt ttt caa ate ate aac act1584 Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Gin lie lie Asn Thr 515 520 525
gcc tea att cag tct etc ate tgc aat aac gtg aag ggc tgt ccc ttt1632 Ala Ser lie Gin Ser Leu lie Cys Asn Asn Val Lys Gly Cys Pro Phe 530 535 540
act tea ttc agt gtt cca gat cca gag etc att. aaa aca gtc acc ate1680 Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu lie Lys Thr Val Thr lie 545 550 555 560
犯t gca agt tct tcc cgc tcc gga cta gat gst 3tc aat ccc aca gta1728 Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Leu Asp Asp lie Asn Pro Thr Val 565 570 575
cta cta aaa gaa cgt teg act gaa ctg aac gtt taa 1764
Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu Asn Val 580 585
<210〉 2
<211〉 587
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Pro Cys Cys Ser Asn Pro Cys Gin Asn Arg Gly Val Cys Met Ser Val 15 10 15
Gly Phe Asp Gin Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Gly 20 25 30
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg lie Lys Leu Phe Leu 35 40 45
Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr lie Leu Thr His Phe Lys Gly 50 55 60
Phe Trp Asn Val Val Asn Asn lie Pro Phe Leu Arg Asn Ala lie Met 65 70 75 80Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu lie Asp Ser Pro Pro Thr 85 90 95
Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe Ser Asn Leu 100 105 110
Ser Tyr Tyr Thr Arg Ala l_eu Pro Pro Val Pro Asp Asp Cys Pro Thr 115 120 125
Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gin Leu Pro Asp Ser Asn Glu lie 130 135 140
Val Glu Lys Leu Leu Leu Arg Arg Lys Phe lie Pro Asp Pro Gin Gly 145 150 155 160
Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gin His Phe Thr His Gin Phe 165 170 175
Phe Lys Thr Asp His Lys Arg Gly Pro Ala Phe Thr Asn Gly Leu Gly 180 185 190
His Gly Val Asp Leu Asn His lie Tyr Gly Glu Thr Leu Ala Arg Gin 195 200 205
Arg Lys Leu Arg Leu Phe Lys Asp Gly Lys Met Lys Tyr Gin lie lie 210 215 220
Asp Gly Glu Met Tyr Pro Pro Thr Val Lys Asp Thr Gin Ala Glu Met 225 230 235 240
lie Tyr Pro Pro Gin Val Pro Glu His Leu Arg Phe Ala Val Gly Gin 245 250 255
Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala Thr lie Trp 260 265 270
Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gin Glu His Pro 275 280 285
Glu Trp Gly Asp Glu Gin Leu Phe Gin Thr Ser Arg Leu lie Leu lie 290 295 300Gly Glu Thr lie Lys lie Val lie Glu Asp Tyr Val Gin His Leu Ser 305 310 315 320
Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu Phe Asn Lys 325 330 335
Gin Phe Gin Tyr Gin Asn Arg lie Ala Ala Glu Phe Asn Thr Leu Tyr 340 345 350
His Trp His Pro Leu Leu Pro Asp Thr Phe Gin lie His Asp Gin Lys 355 360 365
Tyr Asn Tyr Gin Gin Phe lie Tyr Asn Asn Ser lie Leu Leu Glu His 370 375 380
Gly lie Thr Gin Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gin lie Ala Gly Arg 385 390 395 400
Val Ala Gly Gly Arg Asn Val Pro Pro Ala Val Gin Lys Val Ser Gin 405 410 415
Ala Ser lie Asp Gin Ser Arg Gin Met Lys Tyr Gin Ser Phe Asn Glu 420 425 430
Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe Glu Glu Leu 435 440 445
Thr Gly Glu Lys Glu Met Ser Ala Glu Leu Glu Ala Leu Tyr Gly Asp 450 455 460
lie Asp Ala Val Glu Leu Tyr Pro Ala Leu Leu Val Glu Lys Pro Arg 465 470 475 480
Pro Asp Ala lie Phe Gly Glu Thr Met Val Glu Val Gly Ala Pro Phe 485 490 495
Ser Leu Lys Gly Leu Met Gly Asn Val lie Cys Ser Pro Ala Tyr Trp 500 505 510
Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Gin lie lie Asn Thr 515 520 525
20Ala Ser lie Gin Ser Leu Ne Cys Asn Asn Val Lys Gly Cys Pro Phe 530 535 540
Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu lie Lys Thr Val Thr lie 545 550 555 560
Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Leu Asp Asp lie Asn Pro Thr Val 565 570 575
Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu Asn Val 580 585
<210〉 <211> <212> <213>
<220〉 <221〉 <222> <223>
3
228
DNA
小鼠
CDS
(1)..(228)
<400〉 3
8tg cag ate ttc gtg 3ag sec ctg 8cc ggc sag sec 3tc sec cts gag 48 Met Gin lie Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr lie Thr Leu Glu 15 10 15
gtg gag ccc sgt gsc sec 3tc gsg sac gtg犯g gcc 33g 3tc csg gst 96 Val Glu Pro Ser Asp Thr lie Glu Asn Val Lys Ala Lys lie Gin Asp 20 25 30
aaa gag ggc ate ccc cct gac cag cag柳ctg ate ttt gcc ggc卿 Lys Glu Gly lie Pro Pro Asp Gin Gin Arg Leu lie Phe Ala Gly Lys 35 40 45
144
csg ctg gas gat ggc cgc see etc tct gat tac asc ate csg卿gag 192 Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn lie Gin Lys Glu 50 55 60
tea acc ctg cac ctg gtc ctt cgc ctg aga ggt ggc 228Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 65 70 75
<210〉 4
<211〉 76
<212> PRT <213〉小鼠
<400> 4
Met Gin lie Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr lie Thr Leu Glu 15 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr lie Glu Asn Val Lys Ala Lys lie Gin Asp 20 25 30
Lys Glu Gly lie Pro Pro Asp Gin Gin Arg Leu lie Phe Ala Gly Lys 35 40 45
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn He Gin Lys Glu 50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 65 70 75
<210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial
<400> 5 6 83cgtt
<210〉 6 <211> 36 <212> DNA
22<213> Artificial
<400〉 6
ggaggcggtg gcggatccgg tgggggcggt aacgtt 36
<210> 7 <211〉 2028 <212〉 DNA <213〉 Artificial
<400> 7
atgcagatct tcgtgssgac cctgaccggc 3agaccatca ccctsgaggt ggagcccagt 60
gsc3cc3tcg sgsscgtgss ggcc33g3tc csggstsssg sgggcstccc ccctgsccsg 120
cagaggctga tctttgccgg caagcagctg gaagatggcc gcaccctctc tgattacsac 180
3tccsgaagg sgtcasccct gcscctggtc cttcgcctga gsggtggcgg sggcggtggc 240
ggatccggtg ggggcggtss cgttccttgc tgttccsacc cstgtcsssa ccgsggtgts 300
tgtatgagtg tgggatttga ccagtataag tgcgattgta cccggacagg attctatgga 360
gaaaactgct caacaccgga atttttgaca agaataaaat tatttctgaa acccactcca 420
aacacagtgc actacatact tacccacttc aagggatttt ggaacgttgt gaataacatt 480
cccttccttc gaaatgcaat tatgagttat gtgttgacat ccagatcaca tttgattgac 540
agtccacc犯cttscsatgc tgsctstggc tscsaaagct ggg犯gcctt ctctsacctc 600
tcctatt3ta ctegagccct tcctcctgtg cctgstgatt gcccgsctcc cttgggtgtc 660
3aaggt8aa3 agcsgcttcc tg愈3犯t gagattgtgg 8asaattgct tctssgasga 720
aagttcatcc ctgatcccca gggctcaaac atgatgtttg cattctttgc ccagcacttc 780
acgcatcagt加caagac agatcataag cgagggccag ctttcaccaa cgggctgggc 840
catggggtgg acttaaatca tatttacggt gaaactctgg ctagacagcg taaactgcgc 900cttttcaagg atgga3333t g333tatcag at3attgatg g3gagatgt3 tcctcccaca 960
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gctgtggggc aggaggtctt tggtctggtg cctggtctga tgatgtatgc cacaatctgg 1080
ctgcggg犯c 3c3ac3g3gt stgcgstgtg ctt333c3gg sgcstcctgs stggggtgat 1140
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gcccttctgg t3g犯3agcc tcggccagat gcc3tctttg gtg3犯cc8t ggtsg卿tt 1740
ggagcaccat tctccttgaa aggacttatg ggtaatgtta tatgttctcc tgcctactgg 1800
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tctctcatct gcaataacgt gaagggctgt ccctttactt cattcagtgt tccagatcca 1920
gsgctcstta 333cagtc3c C3tc3atgc3 agttcttccc gctccggsct agatgatstc 1980
aatcccacag tactactaaa agaacgttcg actgaactga acgtttaa 2028
<210> 8 <211> 48 <212> DNA <213〉 Artificial<400〉 8
cgggatccgg tgggggcggt aacgttcctt gctgttccaa cccatgtc 48
<210> 9<211> 41<212〉 DNA<213〉 Artificial
<400〉 9
cggaattctt aaacgttcag ttcagtcgaa cgttctttta g 41
<210〉 10<211〉 35<212> DNA<213〉 Artificial
<400〉 10
cgasgcttgc caccatgcsg 3tcttcgtgs犯3cc 35
<210〉 11
<2"〉 43
<212〉 DNA
<213> Artificial
<400> 11
cgggstccgc csccgcctcc gccscctctc 8ggcg33gg3 ccs 4權(quán)利要求
1、一種腫瘤靶向重組DNA疫苗，其特征是，含有環(huán)氧合酶-2蛋白(COX-2)，鼠源泛素蛋白mUbi，免疫刺激DNA序列ISS及載體pVAX1。
2、 按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向重組DNA疫苗，其特征是所述的環(huán)氧合酶-2蛋白具有SEQ ID NO 1的編碼序列及SEQ ID NO 2的氨基酸序列；所述的鼠源泛素蛋白mUbi具有SEQ ID NO 3的編碼序列及SEQ ID NO 4的氨基酸序列；所述的免疫刺激DNA序列ISS DNA序列如SEQ ID NO 5。
3、 權(quán)利要求l的腫瘤靶向重組DNA疫苗的制備方法，其特征是，在基本載體pVAXl的多克隆位點(diǎn)MCS處插入SEQ ID NO 7的片段/wUbi-ISS-COX-2-ISS，構(gòu)建成編碼鼠源泛素蛋白mUbi與COX-2融合蛋白抗原，融合蛋白抗原之間由SEQIDN0 6的柔性接頭連接，制得腫瘤靶向重組DNA疫苗，命名為pVAXl-wUbi-ISS-COX-2 —ISS。
4、 按權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的載體pVAXl的MCS位點(diǎn)插入COX-2表達(dá)框，所述的COX-2表達(dá)框的構(gòu)成是從5'端到3'端方面依次為(I )轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子PcMV, (II)mUbi序列，(III) ISS序列，(IV) COX-2基因序列，(V) ISS序列，(VI)牛生長(zhǎng)激素的多聚腺苷?；盘?hào)(BGHpA)，所得DNA疫苗載體命名為pVAXl-wUbi-ISS-COX-2-ISS。
5、 腫瘤靶向重組DNA疫苗在制備腫瘤預(yù)防與治療藥劑中的用途。
6、 腫瘤靶向重組DNA疫苗在制備治療炎癥的藥劑中的用途。
7、 腫瘤靶向重組DNA疫苗在制備治療癌痛藥劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，涉及腫瘤靶向重組DNA疫苗及其制備、應(yīng)用。本發(fā)明利用基因工程方法，將鼠源泛素mUbi、COX-2及免疫刺激DNA序列ISS進(jìn)行重組。在基本載體pVAX1的多克隆位點(diǎn)MCS處插入片段mUbi-ISS-COX-2-ISS，構(gòu)建成編碼鼠源泛素蛋白mUbi與COX-2融合蛋白抗原，融合蛋白抗原之間由柔性接頭連接，制得腫瘤靶向重組DNA疫苗，本發(fā)明疫苗免疫動(dòng)物體后，能激活機(jī)體免疫反應(yīng)，在體內(nèi)快速誘導(dǎo)COX-2特異的高效CTL反應(yīng)，靶向殺傷COX-2異常表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療的目標(biāo)。本發(fā)明制備簡(jiǎn)單、安全性高、生產(chǎn)成本低、可大規(guī)?；a(chǎn)、免疫應(yīng)答持久，還可用于炎癥治療與癌痛治療領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101648011SQ20081004158
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2008年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月11日
發(fā)明者周彩存, 亮 唐, 王和勇, 恒 羅, 趙應(yīng)敏 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院