專利名稱：一類谷胱甘肽衍生物及其抗腫瘤醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
現(xiàn)臨床上使用或正在研發(fā)的很多藥物靠直接或間接地抑制DNA和/或蛋白質(zhì)來達(dá)到攻擊 腫瘤細(xì)胞的目的。所以，快速分裂的正常細(xì)胞，如腸的上皮和骨髓也同樣受到不利的影響而 產(chǎn)生強(qiáng)烈的副作用。此技術(shù)發(fā)明描述的一種獨(dú)特的小分子抗腫瘤化合物，它不依賴于細(xì)胞的 分裂與分化，而是作用于乙二酸酶系統(tǒng)，而引起腫瘤細(xì)胞的程序死亡，可大大降低毒副作用。
人體的糖代謝過程中不可避免地產(chǎn)生一種叫甲基乙二醛的有毒的化合物，它可以引起細(xì) 胞的程序死亡。人體在長期的進(jìn)化過程中發(fā)展了一種叫乙二醛酶的系統(tǒng)，它由乙二醛酶I (glyoxalase I，簡稱Glxl)和乙二醛酶II (glyoxalase II，簡稱GlxII)組成，起到解毒甲基乙二醛的 作用。多種腫瘤細(xì)胞中Gbd高度表達(dá)，該酶的抑制劑可以抑制或延緩人的腫瘤細(xì)胞在老鼠的 生長，但沒有明顯的副作用。但該酶的抑制劑多為競爭性抑制劑，為了抑制小鼠腫瘤的生長， 必須高劑量長期靜脈注射給藥。如果開發(fā)Gkl的不可逆抑制劑，它可以使Gbd完全持續(xù)失 活，而更加有效地抑制它的活性，可大大降低動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的抗腫瘤所需劑量，最終可將此類抑 制劑帶入臨床試驗(yàn)和市場。
背景技術(shù)：
乙二醛酶是一種谷胱甘肽(GSH)為基質(zhì)的酶系統(tǒng)，它的功能是，將細(xì)胞內(nèi)有毒的甲基 乙二醛通過Glxl和GlxII，有序地轉(zhuǎn)化成無毒性的D-乳酸.
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甲基乙二醛 硫代半縮醛S-D-乳酰谷胱甘肽 D-乳酸
甲基乙二醛是化學(xué)反應(yīng)活性很高的oc-羰醛，可以共價(jià)鍵的形式與蛋白質(zhì)和DNA起反應(yīng)，而直 接影響細(xì)胞的生存。Gbd的抑制劑可以成為抗腫瘤藥物的觀點(diǎn)由來已久，因?yàn)樗梢蕴岣吣[ 瘤細(xì)胞內(nèi)甲基乙二醛的濃度，還有，快速分裂的腫瘤細(xì)胞對外來的甲基乙二醛異常敏感 (Creighotonetal， Drugs ofthe Future, 2000， 25,385)。此敏感性的機(jī)理尚不十分清楚，有一種 可能是甲基乙二醛與叫Hsp27的蛋白質(zhì)廣泛地發(fā)生共價(jià)鍵修飾，導(dǎo)致細(xì)胞的分化和程序死亡 (Vince et al, J. Med. Chem., 1971, 14, 35)。
為了印證上述假說，Creightonde等人合成了一系列過度態(tài)類似物，發(fā)現(xiàn)此化合物是Gbd 最強(qiáng)的抑制劑(Murthy et al, J. Med. Chem.， 1994， 37, 2161)，抑制常數(shù)(Kis)達(dá)到了 10—8M,其 中S(N-對氯苯基-N-羥氨甲酰)谷胱甘肽(CHG)的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formula see original document page 3</formula>此過度態(tài)類似物的[甘氨酰，谷氨酰]二乙酯前提藥物，可以抑制貓白血病L1210和黑素 瘤B16細(xì)胞的生長，IC5o為數(shù)微摩爾濃度。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了腫瘤殺傷活性起因于抑制Glxl， 而且此類過度態(tài)類似物的Ki與二乙酯前提藥物的IC5Q值有很強(qiáng)的相關(guān)性。
表1.正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中乙二酸酶的活性比較
組織 乙二醛酶活性 (mU/mg protein) __Gkl GlxII_GlxI/GlxII
正常
腦(人)1113±19817±1561.4
肝(人)209 土56360 ±130.6
心(鼠)339 ±24280 ±471.2
腎(人)323 ± 48330 ±861.0
淋巴(小鼠)360 士 30200 ± 301.8
腫瘤
黑色素瘤B16(小鼠)419±7327 ±715.5
白血病L1210(小鼠)310±3020 士 315.5
成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(人)290 ±5653± 105.5
乳房纖維腺瘤(人)419±7327 ±715.5
膀胱HT-1107(人)542 ±388± 167.8
前列腺PC-3 (人)4206 ± 29445 ±393.4
睪丸Tl (人)4767±27594± 1251.0
腸HT29(人)542 ±5911 ± 149.3
這種抗腫瘤戰(zhàn)略應(yīng)用時(shí)，如表1中所列幾種腫瘤細(xì)胞中，前列腺腫瘤與膀胱癌是特別適
合的靶標(biāo)。除了腦細(xì)胞，前列腺腫瘤與膀胱癌細(xì)胞中GlxI的活性始終比大多數(shù)其他正常或腫 瘤細(xì)胞高8倍或以上(Creighton et al， 2000, supra)。此外，它們的腫瘤細(xì)胞中GlxII的活性 卻低。高度表達(dá)Gbd的活性可以提供一種補(bǔ)償解毒的機(jī)理，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞旺盛的代謝所需能 源嚴(yán)重依賴糖的分解，由此而產(chǎn)生額外的大量的甲基乙二醛。事實(shí)上，前列腺癌細(xì)胞對外源 性的甲基乙二醛的毒性特別敏感，可能是由程序死亡的結(jié)果引起。所以，前列腺腫瘤可能對 抑制乙二醛酶系統(tǒng)反應(yīng)特別敏感。
后來，另一研究表明，Glxl的濃度在肺癌細(xì)胞里也象前列腺腫瘤細(xì)胞中一樣高度表達(dá)， 而且，叫BBGC的Gbd的競爭性抑制劑有效地抑制肺癌細(xì)胞的生長，對移植DMS114的小 鼠在100mg/Kg的劑量下有顯著的抑制效果，而沒有明顯的毒副作用。如下表2的7種肺癌 細(xì)胞中Gbd的表達(dá)水平越高，對其抑制劑也越敏感，即抑制所需的有效濃度也越低(Sakamoto etal, Clinical Cancer Research, 2001,7, 2513)。這些研究結(jié)果表明，Glxl是治療前列腺癌、肺 癌、膀胱癌等腫瘤疾病的理想的耙標(biāo)，Gbd的抑制劑有可能成為治療這些癌癥的理想的藥物。表2.肺癌細(xì)胞中Glxl活性與對BBGC的敏感性
細(xì)胞株GM活性IC50 to BBGCa
(mol/min/mg蛋白質(zhì))(一)
NCI-H4600.81 ±0.0228.8 ±0.7
NCI-H2260.86 ± 0.0425.1 ±0.3
A5490.99 ± 0.0429.7 ± 1.2
NCI-H232.47 ±0.0318.9 ±0.6
DMS2732.63 ± 0.037.8 ±0.5
DMS1143.48 ±0.037.5 ±0.7
NCI-H5228.47 ±0.104.4 ± 0.2
a細(xì)胞用BBGC處理48小時(shí).BBGC的ICso值用MTS法測得。
數(shù)值為三次不同實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

發(fā)明內(nèi)容
合成了一類谷胱甘肽衍生物S-(溴乙酰胺基丙氨酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)與S-(溴乙酰 胺基丁氨酰甲基)谷胱甘肽(BBSG)，測定了此類化合物對GlxI的不可逆的抑制活性，此兩種 抑制劑和酶的解離常數(shù)GO分別為155和160 一。此抑制劑以共價(jià)鍵的形式與Gbd進(jìn)行結(jié)合 而使其失活。此類抑制劑可以應(yīng)用于治療前列腺癌、肺癌、膀胱癌等各種腫瘤疾病的治療。
具體實(shí)施方式
合成Gbd的不可逆抑制劑
S-(溴乙酰胺基丙氨酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)與S-(溴乙酰胺基丁氨酰甲基)谷胱甘肽(BBSG) 的合成途徑表示如下
O
BrCH2CCl
NH2(CH2)nNH2- BrCH2C(0)NH(CH2)nNHC(0)CH2Br
(-2HBr) 二溴乙?；?1， 3)丙二氨(11=3)
二溴乙酰基(l， 4)丁二氨(!1=4)
GS訓(xùn)aOH
GSCH2C(0)NH(CH2)nNHC(0)CH2Br
BPSG, n=3 BBSG， n=4
二溴乙酰(l， 3)丙二胺
100毫升的燒瓶中放入50毫升三氯甲烷和1,3-丙二氨(13 mmol),然后放入冰浴中待冷卻 后，攪拌條件下慢慢滴入溴乙酰氯(1.03g，26mmo1)，滴完后繼續(xù)攪拌半個(gè)小時(shí)。溶劑用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀減壓蒸干，得到淺棕色粗產(chǎn)物。產(chǎn)率卯％。 'H NMR 300 MHz (CDC13, TMS) 5 3.80 (4H, s, -C(0)CH2Br), 3.25 (4H, t， J = 6.25 Hz, -NHCH2CH2-)， 1.85 (2H， p， J = 6.25 Hz, -NHCH2CH2-). ESI MS: (M(Br79)+H+)314.93.
5二溴乙酰(l， 4)丁二胺
此化合物的途徑合成與二溴乙?；?l， 3)丙二胺的大體相同。待反應(yīng)結(jié)束后，溶液用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀減壓蒸千，得到淺黃色粗產(chǎn)物。產(chǎn)率89%。 'H NMR 300 MHz (CDC13, TMS) S 3.81 (4H, s, -C(0)CH2Br), 1.58 (4H, p， J = 6.5 Hz, -NHCH2CH2-)， 3.25 (4H, t, J = 6.5 Hz, -NHCH2CH2-). ESI MS: (M(Br79)+H+)328.94. S-(溴乙酰胺基丙胺酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)
將二溴乙酰(l， 3)丙二胺(l.lg，3.48mmol)溶于18毫升丙酮中，慢慢滴入將谷胱甘肽(0.2g, 0.65 mmol)溶于10毫升1M濃度氫氧化納的水溶液。此反應(yīng)液室溫?cái)嚢?小時(shí)。此混合物用氯仿 洗三次(3X50ml),然后水溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。粗產(chǎn)物用反相HPLC (Waters jxBondapak C18, 19X150mm)分離，洗脫液為水乙腈三氟乙酸(85: 15: 0.1,v/v/v). 產(chǎn)率15%. NMR 300 MHz (D20， ref HOD (5 4.8)) 5 3.81 (2H, s, -C(0)CH2Br), 1.86 (2H, p, J = 6.25 Hz, -NHCH2CH2-)， 3.24 (2H， t, J = 6.4 Hz, -SCH2C(0)NHCH2CH2-)， 3.21 (2H, t, J = 6.4 Hz, -BrCH2C(0)NHCH2CH2-)， 4.02 (2H, s, Gly-CH2), 3.40 (2H, s, -SCH2C(0)N)， 2.92 (1H, q, J = 14.7， 9.0 Hz, -CCHxHyS-)， 3.12 (IH， q, J = 14.7, 5.2 Hz, -CCHxHyS-)， 4.58 (1H, q, J = 14.1, 6.0 Hz, Cys-CH)， 2.14 (2H, t， J = 7.2 Hz), 2.51 (2H， t， J = 7.2 Hz), 3.78 (IH， t, J = 6.0 Hz). ESI MS: (M(Br79)+H+) 541.08.
S-(溴乙酰胺基丁胺酰甲基)谷胱甘肽(BBSG)
此化合物與BPSG大體相同的途徑和方法合成。產(chǎn)率18%。 'H NMR 300 MHz (D20, ref HOD (5 4.8)) 5 3.82 (2H, s, -C(0)CH2Br)， 1.59 (4H, m, -NHCH2CH2-)， 3.25 (2H， t， J = 6.4 Hz， -SCH2C(0)NHCH2CH2-)， 3.22 (2H, t, J = 6.4 Hz, -BrCH2C(0)NHCH2CH2-)， 4.02 (2H, s， Gly-CH2), 3.41 (2H, s， -SCH2C(0)N), 2.93 (1H, q, J = 14.7, 9,0 Hz， -CCHxHyS-)， 3.12 (1H, q, J = 14.7, 5.2 Hz, -CCHxHyS-)， 4.59 (1H, q, J = 14.1, 6.0 Hz, Cys-CH), 2.14 (2H， t, J = 7.2 Hz), 2.51 (2H, t, J = 7.2 Hz)， 3.78 (1H， t， J = 6.0 Hz). ESI MS: (M(Br79)+H+) 555.10.
GM的不可ii抑制作用
此發(fā)明提供了不可逆抑制Gbd的一系列谷胱甘肽衍生物。不可逆抑制劑與Glxl的活性 中心結(jié)合后通過以共價(jià)鍵形式化學(xué)修改使酶永久性地失去活性。不可逆抑制劑對酶的親和性 越高(離解常數(shù)Kd越低)，對酶的抑制作用更持久。 不可逆抑制動(dòng)力學(xué)
如圖2所示，S-(溴乙酰胺基丙胺酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)和S-(溴乙酰胺基丁胺酰甲基) 谷胱甘肽(BBSG)均在含20%甘油的pH 7的25°C磷酸鈉緩沖溶液中，不可逆地抑制人體Glxl 的活性。含有酶(10單位/毫升)和不同濃度不可逆抑制劑的磷酸緩沖液放入各塑料試管管中， 在25。C的水浴里溫育。隨時(shí)間連續(xù)采樣，將各樣品加到含有l(wèi).O毫升谷胱甘肽-甲基乙二醛-硫代半縮醛溶液(由谷胱甘肽和甲基乙二醛縮合而成)的比色皿中，檢測反應(yīng)產(chǎn)物在240納米 的吸光度隨時(shí)間變化的速率.從產(chǎn)物的起始速率，可以計(jì)算酶的催化活性.從剩余酶活性的對 數(shù)值隨時(shí)間的改變的斜率，可以計(jì)算人體乙二醛酶失活表觀一級(jí)速率常數(shù)(ki一).從該速率 常數(shù)隨抑制劑濃度變化的曲線，可以計(jì)算抑制劑和酶的解離常數(shù)GO及k,d的最大值.
6劑CHG起保護(hù)酶失活的作 用，還有，滅活的過程顯示飽和動(dòng)力學(xué)。另外，失活的酶的MALDI (matrix assisted laser desorption)質(zhì)譜顯示，每一個(gè)肽鏈(蛋白質(zhì))是被一分子不可逆抑制劑以共價(jià)鍵的方式結(jié)合 的，且以從不可逆抑制劑中失去溴原子的方式。電腦模擬實(shí)驗(yàn)中，將BPSG與BBSG嵌入Gbd 的活性中心時(shí)，Cys(60)的巰基在滅活過程中正好處于易于取代BPSG與BBSG的溴原子的位 置。
權(quán)利要求
1.如結(jié)構(gòu)通式I所示的谷胱甘肽衍生物用作抗腫瘤藥物，結(jié)構(gòu)通式I中的R1為1～6個(gè)碳的烷基中的任一種，以及H，CH2CH2Cl，CH2CH2Br，環(huán)戊烷，環(huán)己烷；結(jié)構(gòu)通式I中的R2為1～6個(gè)碳的烷基中的任一種，以及H，CH2CH2Cl，CH2CH2Br，環(huán)戊烷，環(huán)己烷，R1和R2可以相同或者不同；結(jié)構(gòu)通式I中的n為1～12中的任一種；結(jié)構(gòu)通式I中的X為F、Cl、Br、I等鹵素原子中的任一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征是所述的抗腫瘤藥物為抗前列腺癌、肺癌、腸癌、睪 丸癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、皮膚癌、白血病等惡性腫瘤的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的應(yīng)用，其藥物劑型可以是注射劑、片劑、膠囊劑、栓劑。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，S-(溴乙酰胺基丙氨酰甲基)谷胱甘肽與S-(溴乙酰胺基丁氨酰甲基)谷胱甘肽用作抗腫瘤藥物。此類化合物以共價(jià)鍵的形式與乙二醛酶I進(jìn)行反應(yīng)而使其不可逆地失去活性。此類化合物在治療前列腺癌、肺癌、腸癌、睪丸癌、白血病、乳腺癌、皮膚癌等惡性腫瘤藥物方面具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K38/06GK101658666SQ20081004214
公開日2010年3月3日 申請日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者鄭哲彬 申請人:上海遠(yuǎn)農(nóng)醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司