專利名稱：：一種防治肌萎縮側索硬化的組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，更具體地，本發(fā)明涉及同型半胱氨酸下調劑在制備預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物中的用途。
背景技術：
：肌萎縮側索硬化(ALS)是由運動神經元選擇性死亡導致的疾病，約20%的家族性肌萎縮性脊髓側索硬化(FALS)與銅/鋅超氧化物歧化酶(S0D1)基因突變有關。過表達突變S0D1基因的模型小鼠表現出與肌萎縮側索硬化患者相似的臨床表現，因此被廣泛用于疾病的臨床和基礎研究。肌萎縮側索硬化作為一種致命的神經退行性疾病，其病因和發(fā)病機制仍未清楚，目前研究證實，谷氨酸的興奮性氨基酸毒性作用，氧化應激，線粒體功能異常，蛋白質的錯誤折疊等與肌萎縮側索硬化的發(fā)病有著密切的關系。肌萎縮側索硬化與其它神經退行性疾病如帕金森癥或阿爾茨海默癥相比，發(fā)病機制不盡相同，其下運動神經元更易受累，且進展迅速。因肌萎縮側索硬化的病因和發(fā)病機制仍未清楚，到目前為止，本領域仍然缺乏對肌萎縮側索硬化的特異有效的治療方法。因此研發(fā)特異性的肌萎縮側索硬化治療方法是目前研究中亟待解決的問題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供同型半胱氨酸下調劑在制備預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物中的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種同型半胱氨酸下調劑的用途，用于制備預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的肌萎縮側索硬化是家族性肌萎縮性脊髓側索硬化。在另一優(yōu)選例中，所述的同型半胱氨酸下調劑選自(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B2的混合物。在另一優(yōu)選例中，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(5-80):1。較佳的，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(10-40):h更佳地，葉酸與維生素B12的重量比例是(15-25):1。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于抑制炎癥反應或抑制細胞凋亡。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥反應是炎癥因子過量引起的炎癥反應；或所述的細胞凋亡是凋亡蛋白水平過高或抗凋亡蛋白水平過低引起的細胞凋亡。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于降低脊髓內炎癥因子的水平；降低脊髓內凋亡蛋白的水平；提高脊髓內抗凋亡蛋白的水平；或保護脊髓運動神經元。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥因子包括誘導型一氧化氮合酶(iNOS)或腫瘤壞死因子a(TNF-a)。在另一優(yōu)選例中，所述的凋亡蛋白包括剪切型胱冬肽酶3(CleavedCaspase-3)，或剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶(CleavedPRAP)的水平。在另一優(yōu)選例中，所述的抗凋亡蛋白包括B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物，所述的組合物含有有效量的同型半胱氨酸下調劑，以及藥學上可接受的載體；其中，所述的同型半胱氨酸下調劑是葉酸和維生素B12的混合物，含有葉酸5-80重量份；維生素B12:l重量份。在另一優(yōu)選例中，所述的混合物中，含有葉酸10-40重量份；維生素B12:l重量份。更佳的，所述的混合物中，含有葉酸15-25重量份；維生素B12:l重量份。在另一優(yōu)選例中，葉酸和維生素B12的混合物占組合物總重量的5-100y。；較佳的10-60%。在本發(fā)明的第三方面，提供一種預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的方法，給予需要的受試者有效量的同型半胱氨酸下調劑。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1.葉酸和維生素B12對S0D1-G93A小鼠發(fā)病時間和生存周期的影響。Kaplan-Meier生存分析的曲線表示了四組實驗小鼠(SOD1組，B12-SOD1組，FA-SOD1組禾卩FA+B12-SOD1組，每組小鼠數量n二9)發(fā)病時間(A)和生存周期(B)的變化。圖2.實驗小鼠120天時經LC--MS/MS檢測的Hcy水平。數據顯示SOD1組小鼠Hcy的含量明顯高于WT組，而FA-SOD1組和FA+B12-SOD1小鼠Hcy水平比SOD1組則顯著降低。數據為平均數土SEM，*尸<0.01**尸<0.001(和WT組相比)，#尸<0.01(和SOD1組相比)每組小鼠n二8。圖3.葉酸及維生素B12對S0D1-G93A小鼠脊髓前角運動神經元的保護作用。(A)五組實驗小鼠脊髓前角運動神經元；其中，(a)WT組，(b)SODl組，(c)B12-SOD1組，(d)FA-SOD1組，(e)FA+B12-SOD1組。(B)五組小鼠脊髓L4-5段前角運動神經元數目。數據為平均數士SEM，由ANOVA分析所得。*尸<0.01，**尸<0.001(和WT組相比)，#尸<0.01(和SOD1組相比)每組小鼠n二3。Bar二100um。圖4.葉酸和維生素B12對小鼠脊髓前角膠質細胞激活的影響。CDllb和GFAP作為標記分別觀察小鼠脊髓內小膠質細胞(紅)和星形膠質細胞(綠)的數目和狀態(tài)。每組n-3，Bar-30ixm。圖5.葉酸和維生素B12對小鼠脊髓組織內炎癥相關因子和凋亡相關蛋白水平的影響。(A)五組實驗組小鼠脊髓組織內炎癥相關因子iNOS和TNF-a水平變化。(B)五組實驗組小鼠脊髓組織凋亡相關蛋白水平的變化。(C-G)五組實驗組小鼠iNOS，TNF-a，Bcl-2，剪切型Caspase-3及剪切型PRAP的定量數值。其中，*尸<0.01，(和WT組相比)，#尸<0.01，##P<0.001(和SOD1組相比)每組n=3，數值為平均值土SEM。具體實施例方式本發(fā)明人經過深入的研究，首次發(fā)現在肌萎縮側索硬化動物的血漿中同型半胱氨酸(Hcy)的含量顯著上升；并且意外地發(fā)現采用同型半胱氨酸下調劑，特別是葉酸和維生素B12的混合物，可非常有效地緩解哺乳動物的肌萎縮側索硬化；并且本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現，葉酸和維生素B12的混合物可非常有效地降低哺乳動物脊髓內炎癥因子的水平，降低脊髓內凋亡蛋白的水平，提高脊髓內抗凋亡蛋白的水平，有效地發(fā)揮抑制炎癥反應以及抗凋亡的作用。同型半胱氨酸及其下調劑同型半胱氨酸是一種具有細胞毒性作用的含硫氨基酸，是由甲硫氨酸通過脫甲基作用產生的，其在機體內代謝的平衡是幾方面共同作用的結果，而其降解轉化主要通過以下兩種途徑一是通過再甲基過程轉化為甲硫氨酸；二是在胱硫醚-0-合酶的作用下轉化為胱硫醚(Cystathkmine)。同型半胱氨酸存在多種下調劑，包括維生素B6等。通過直接或間接途徑下調體內同型半胱氨酸的物質(如減少體內同型半胱氨酸產生的物質，促進體內同型半胱氨酸代謝為無毒產物的物質等)均可用于本發(fā)明，用于降低體內同型半胱氨酸的水平。作為本發(fā)明優(yōu)選的方式，所述的下調劑是(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B12的混合物。特別優(yōu)選的，所述的下調劑是葉酸和維生素B12的混合物。所述的葉酸或維生素B12也可以以被取代的形式存在。例如所述的葉酸可以是四氫葉酸，甲基四氫葉酸。四氫葉酸可在甲基四氫葉酸轉移酶的作用下轉變?yōu)榧谆臍淙~酸。甲基四氫葉酸可以提供甲基在甲基轉移酶的作用下使同型半胱氨酸轉變?yōu)榧琢虬彼?，完成同型半胱氨酸的甲基化作用。葉酸的含量及甲基四氫葉酸的含量對同型半胱氨酸的水平有著直接的影響。而維生素B12作為甲基轉移酶的輔酶，促進同型半胱氨酸向甲硫氨酸的轉變過程。所述的葉酸或維生素B12也可以以"生理學可接受的鹽"或"生理學可接受的酸或堿衍生的鹽"形式使用。所述的鹽包括(但不限于)與如下無機酸形成的鹽如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及與有機酸形成的鹽，而有機酸則指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和馬來酸。其他鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的"前體藥物"的形式(當以這種形式給藥時，在體內可轉化成活性部分)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(5-80):l;較佳的，葉酸與維生素B12的重量比例是(10-40):1;更佳的，葉酸與維生素B12的重量比例是(15-25):1。用途本發(fā)明人首次發(fā)現在肌萎縮側索硬化模型小鼠血漿內同型半胱氨酸水平明顯高于正常對照組小鼠，從而提示同型半胱氨酸對于肌萎縮側索硬化的發(fā)生或發(fā)展有重要的影響作用。進一步深入的研究發(fā)現，葉酸和維生素B12的混合物可非常有效地緩解哺乳動物的肌萎縮側索硬化。本發(fā)明人將模型小鼠隨機分成生理鹽水組(S0D1組)，葉酸用藥組(FA-S0D1組)，維生素B12用藥組(B12-S0D1組)及葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組(FA+B12-S0D1組)，小鼠六周起用藥，直至死亡。Rotarod檢測和生存時間統(tǒng)計結果表明葉酸用藥或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥能夠顯著延緩疾病的發(fā)生，延長模型小鼠的生存時間。免疫組化和蛋白質印跡結果說明，葉酸用藥或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥能夠明顯抑制模型小鼠脊髓中小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，降低其脊髓中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和腫瘤壞死因子a(TNF-a)的蛋白水平。此外葉酸用藥及葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥還可明顯抑制凋亡相關蛋白剪切型Caspase-3和剪切型PARP的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。因此，基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現，本發(fā)明提供一種同型半胱氨酸下調劑的用途，用于制備預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物。所述的肌萎縮側索硬化是家族性肌萎縮性脊髓側索硬化。所述的同型半胱氨酸下調劑優(yōu)選地選自(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B12的混合物。所述的同型半胱氨酸下調劑可用于抑制炎癥反應或抑制細胞凋亡。所述的炎癥反應是體內炎癥因子過量引起的炎癥反應；所述的細胞凋亡是體內凋亡蛋白水平過高或抗凋亡蛋白水平過低引起的細胞凋亡。所述的同型半胱氨酸下調劑可用于降低脊髓內炎癥因子的水平。優(yōu)選地，所述的炎癥因子包括iNOS或TNF-a。所述的同型半胱氨酸下調劑可用于降低脊髓內凋亡蛋白的水平。優(yōu)選地，所述的凋亡蛋白包括剪切型(Cleaved)Caspase-3，或剪切型(Cleaved)PRAP。所述的同型半胱氨酸下調劑可用于提高脊髓內抗凋亡蛋白的水平。優(yōu)選地，所述的抗凋亡蛋白包括Bcl-2。組合物如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構成"、"基本上由......構成"、和"由......構成"；"主要由......構成"、"基本上由......構成"和"由......構成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。如本文所用，術語"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，術語"藥學上可接受的"的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、剌激和變態(tài)反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。"藥學上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N丄1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質等。術語"本發(fā)明的組合物"包括但不限于藥物組合物、食物組合物或保健品組合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的組合物的各組分的用量如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>較佳地，在組合物中，葉酸和維生素B12的混合物占組合物總重量的5-100%;更佳的10-60%。對于本發(fā)明所述的組合物的劑型沒有特別的限制，可以是任何適用于哺乳動物服用的劑型；優(yōu)選的，所述的劑型可選自口服液、混懸液、膠囊劑、顆粒劑、片劑、丸劑、或乳劑。本發(fā)明的組合物中可以加入制備不同劑型時所需要的各種常規(guī)載體或輔料，如填充劑(如淀粉)、矯味劑(如甜菊素)、抗氧化劑、或包衣材料等?？刹捎贸Ｒ?guī)的方法制備成任何一種常用的劑型，如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑。本發(fā)明的混合物或組合物的用量可隨給予的模式、劑型和受試者的患病嚴重程度而變化。然而，通常當本發(fā)明的組合物每天以約0.0001lg/kg動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以14次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言，每天的總劑量約為0.00550g，較佳地約為0.0220g。可調節(jié)此劑量方案以提供最佳治療效果。例如，由治療狀況的需要，可每天分開給予若干次的單一劑量，或將劑量按比例地減少。當然，具體劑量還應考慮施用方式、施用對象的身體狀況等因素，這些都是本領域技能范圍之內的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。I.材料和方法實驗動物攜帶人源突變的銅/鋅超氧化物歧化酶(S0D1)(G93A突變體)的轉基因小鼠(B6SJL-TgN[SODl-G93A]lGur，編號002726)購自美國JacksonLaboratory(Barharbor，ME，U.S.A)。根據文獻報道，小鼠的保種和繁殖方法為一個野生型母鼠和一個轉基因公鼠交配，其子代用幼鼠的鼠尾抽提獲得的DNA通過聚合酶鏈反應(PCR)鑒定。動物分組和給藥48只S0D1-G93A轉基因小鼠隨機分為四組(1)0.9。/。生理鹽水灌胃組(SODl組，n-12);(2)4mg葉酸/kg體重/天灌胃用藥組(FA-SODl組，n=12);(3)0.2mg維生素B12/kg體重/天灌胃用藥組(B12-SODl組，n=2);(4)4mg葉酸和0.2mg維生素B12/kg體重/天聯(lián)合用藥組(FA+B12-SODl組，n=12)。所有小鼠自出生42天(6周)開始每天給藥，直至死亡。其中36只轉基因小鼠(SODl組，n=9;FA-SODl組，n=9;B12-SOD1組，n=9;FA+B12-SOD1組，n=9)用于小鼠發(fā)病時間的判定及小鼠生存周期的觀測。其余的轉基因小鼠用于免疫組化和蛋白質印跡樣本的制作。同時，10只與S0D1-G93A轉基因小鼠同窩的野生型小鼠用于制作免疫組化和蛋白質印跡時的對照樣本(即正常對照組，WT)。運動能力的評測和生存周期的觀測小鼠運動能力的評測從70天開始。在Rotarod儀器上(4cm直徑，20rpm轉速)，小鼠先練習5天使之習慣次運動并同時得到一個基礎運動值。記錄小鼠在儀器上停留的時間(5分鐘為上限)。每隔一天測定一次，每次實驗重復3次并取其最好成績記錄。疾病發(fā)生定義為如小鼠在Rotarod儀器上停留的時間小于5分鐘，則該天記錄為小鼠疾病發(fā)生的時間。S0D1-G93A轉基因小鼠疾病發(fā)生后逐漸表現出靜止性震，發(fā)展性步態(tài)不穩(wěn)，隨之雙下肢出現偏惻或雙惻的肢體癱瘓，疾病最后階段則完全癱瘓，不能自主進食。從倫理學講應在其不能自主進食前將其處死，而轉基因小鼠的死亡判定標準為將小鼠側臥放置，如其不能在30秒內翻身為正常姿態(tài)者，判斷其死亡，該天記錄為小鼠的死亡時間。血漿同型半胱氨酸的測定A.樣本的制備1.樣品制備準確吸取50|til血漿樣品于1.5ml離心管中，分別加入50|iil內標液(DL-高胱胺酸-D8)和50^1還原劑(l,4-二硫蘇糖醇)，混勻。室溫放置30分鐘，加入5(V1蛋白沉淀齊U(三氯醋酸)，窩旋混合30秒，高速離心15,000rpmX3分鐘，吸取上清液供色譜進行分析。2.標準品制備準確吸取5pl對照液(DL-同型半胱氨酸)，加入45ial稀釋液(小牛血清水溶液)稀釋后，與血漿樣品同樣的處理方法處理，得到的上清供色譜分析所用。B.液相色譜-串聯(lián)質譜分析(LC-MS/MS分析)1.色譜條件色譜柱為十八垸基硅烷鍵合硅膠填充；流動相為0.02%甲酸的甲醇溶液-0.02%甲酸的水溶液(10:90)，流速0.20ml/min;柱溫為25。C;進樣量為5|il。2.質譜條件電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；MRM掃描分析，Ql/Q3離子通道分別選擇為m/z:136—90amu(Hcy)和140—94amu(內標)。離子源參數包括霧化氣流速0.48MPa，氣簾氣流速0.52MPa，碰撞氣流速0.40MPa;離子源電壓2500V，離子源溫度450°C。3.樣品測定取處理好的對照品、質控品和測定樣品溶液各5/xl注入液質聯(lián)用儀，記錄色譜圖。4.結果計算以3個對照品的標示濃度(5、15、45nmol/L)為橫坐標(x)，以3個對照品的實際測定峰面積與各自內標峰面積的比值為縱坐標(y)，繪制標準曲線。將測定樣本同型半胱氨酸峰面積和內標峰面積的比值代入標準曲線方程，計算測定樣本同型半胱氨酸濃度。脊髓切片和尼氏染色分析轉基因小鼠(S0D1組，n=3;FA-SOD1組，n=3;B12-S0D1組，n=3;FA+B12-S0D1組，n=3)和野生型小鼠(n=3)在120天時被隨機挑選出來做脊髓樣本的采集。小鼠用10%水合氯醛深度麻醉后，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)心臟灌流10分鐘。一部分小鼠的脊髓(L4-L5段)用于組織病理學分析和免疫組織化學分析。脊髓取出后，浸泡于4%的多聚甲醛中4匸過夜，隨后用5%，30%的蔗糖溶液4°〇分別處理24小時。另一部分脊髓(Cl-L3段)用于蛋白質印跡(Westernblot)，其取出后迅速置于液氮中。脊髓L4-L5段經上述處理后，用OCT包被，冰凍于-8(TC冰箱。脊髓連續(xù)切片的厚度為10|am，切片被貼到明膠(1%)包被過的載玻片上。為了計數運動神經元，脊髓L4-L5段連續(xù)切片200張，每3張切片取1張做尼氏染色處理(1%甲苯胺藍染色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片)。處理好的切片用顯微鏡明視野拍照后，計數。計數的標準為(l)計數的目的神經元所在的區(qū)域為脊髓前角部分，中央管(centralcanal)以上的部分。(2)運動神經元的直徑在20|am以上。(3)運動神經元有明顯的細胞核。脊髓切片的免疫組化分析脊髓切片(L4-L5段)分別用一抗CDllb(l:100'Serotec，Oxford,UK)，GFAP(1:2000，Sigma,St.Louis,MO，USA)來檢測小膠質細胞(Microglia)和星形膠質細胞(Astrocyte)的狀態(tài)。同時為排除假陽性，部分切片用單一的二抗處理，觀察。免疫組化的具體步驟如下1.0.01MPBS洗2X5min后，繼以1%&02室溫處理10min。2.封閉4。C1小時(PBS含4。/。血清，0.3%Triton-X-100，0.05%疊氮鈉)3.—抗CDllb或GFAP4。C孵育過夜(CDllb:1:100;GFAP:1:2000)。4.0.01MPBS洗3X5min后，二抗(熒光素標記，分別為cy3:1:1000;FITC:1:200)室溫孵育2h。5.0.01MPBS洗3X5min后，終止反應，顯微鏡下觀察，拍照。蛋白免疫印跡分析(Westernblot)蛋白樣本從液氮中取出，置于RIPA裂解液中(50MmTris-CLPh7.4，l%NP-40，0.25。/。Na-脫氧膽酸鹽(deoxycholate)，150mMNacl，lmMEDTA，lmMPMSF，lpg/ml抑肽酶(Aprotinin)，lfig/ml亮肽素(Leupeptin)，lpg/ml抑肽素(Pepstatin))。超聲破碎1分鐘。12，000rpm，4。C離心，15分鐘，取上清。SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉液(TBST+5。/。脫脂奶粉)，PVDF膜室溫封閉1小時。PVDF膜覆于一抗(iNOS，1:5000，chemicon，CA，USA;TNF-a，1:1000，cellsignaling,MA，USA;Bcl-2，l細0，SantaCruzBiotechnology,INC，SantaCruz;cleavedCaspase3，1:1000,SantaCruzBiotechnology,INC，SantaCruz;PARPandcleavage,1:1000，Cellsignaling,MA;USA,P隱actin，1:4000，Cellsignaling,MA，USA)4。C孵育過夜。二抗(抗兔HRP相連的IgG，1:2000;抗鼠HRP相連的IgG，1:2000，Pierce),室溫孵育2小時。采用化學發(fā)光法(SuperSignalWestDuraExtendedDurationSubstrate,Pierce;ILU.S.A)。顯影于X膠片，顯影，定影后使用Bio-Rad，QuantityOne-4.2.0圖象分析系統(tǒng)對Westernblot結果迸行灰度分析，從而對蛋白條帶的密度進行定量；每個樣品的免疫印跡蛋白條帶與同一樣品的e-actin相比較后得出一個密度比，再進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計學分析小鼠發(fā)病時間和生存周期數據使用Kaplan-Meier生存分析(SPSS13.0)，通過log-rank試驗可得到一個x2值用于確定數據的差異性。其余數據使用ANOVA進行檢測，若得到的尸值小于0.05則認為數值之間差異明顯。所有的數據以平均數±SEM的形式表示。II.實施例實施例1.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥延緩SOD1-G93A模型小鼠的發(fā)病時間，延長小鼠壽命S0D1-G93A轉基因小鼠的發(fā)病癥狀與ALS患者的臨床表現十分相似，表現為漸進性的肌無力，肌萎縮，直至癱瘓和死亡，病理標志為運動神經元選擇性退行性病變。在實施例中，本發(fā)明人采用了Rotarod儀器檢測小鼠的運動能力，以此作為評價疾病發(fā)生發(fā)展的指標。通過觀測發(fā)現，葉酸灌胃的FA-SOD1組小鼠比生理鹽水灌胃的SOD1組小鼠其平均發(fā)病時間延緩了7天(114.4±1.7天(FA-SOD1)vs107.9士1.8天(SODl)，x2=6.33，尸<0.05)，FA+B12-SOD1組比SOD1組小鼠發(fā)病時間延緩了9天(116.3士2.0天(FA+B12-SOD1)vs107.9±1.8天(SODl)，x2=8.989，尸<0.05)，而維生素B12單獨使用對小鼠的發(fā)病則無明顯延緩(109.4士1.7天(B12-SODl)vs107.9±1.8天(SODl)，x2=0.015，尸〉0.05)，見14圖1A。本發(fā)明人通過檢測發(fā)病晚期小鼠的翻身情況確定小鼠的生存周期，經統(tǒng)計分析發(fā)現，葉酸灌胃的FA-S0D1組小鼠比生理鹽水灌胃的S0D1組小鼠其平均生存周期延長了9天(137.7士1.9天(FA-S0D1)vs128.8±3.4天(S0D1)，x2=3.95，尸<0.05)，FA+B12-S0D1組比S0D1組小鼠平均生存周期延長了13天(141.4±2.9天(FA+B12-SODl)vs128.8±3.4天(SODl)，x2=5.0，PO.05),而維生素B12單獨給藥仍無明顯作用(132.3il.9天(B12-SODl)vs128.8±3.4(S0D1)，x2=0.015，尸>0.05)，見圖1B。實施例2.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥降低小鼠血漿同型半胱氨酸水平鑒于同型半胱氨酸對神經細胞的損傷作用，且可能在S0D1-G93A小鼠體內造成神經退行性病變，測定各組模型小鼠和野生型小鼠血漿內的Hcy水平以定量其變化顯的尤為重要。根據LC-MS/MS的結果，本發(fā)明人看到120天的SOD1組小鼠和野生型小鼠(WT)之間血柴Hcy水平存在顯著的差別(6.84土0.4pmol/L(SODl)vs3.8±0.26pmol/L(WT)，/^0.001)，S0D1組小鼠Hcy含量幾乎是野生型小鼠的兩倍。而葉酸用藥或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組小鼠血漿Hcy則分別下降了61%或69%(4.98±0.38/amol/L(FA-SODl)，4.75±0.67famol/L(FA+B12-SODl)vs6.84±0.4pmol/L(SODl)，尸<0.01)。維生素B12單獨使用組Hcy水平則只有微弱的，無顯著差異的下降(6.56士0.8|amol/L(B12-SODl)vs6.84±0.4nmol/L(SODl)在S0D1組，尸>0.05),見圖2。結果說明，S0D1-G93A模型小鼠血漿內Hcy水平明顯高于野生型小鼠，而葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥則可以顯著降低模型小鼠血漿Hcy水平。實施例3.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥減少脊髄運動神經元退行性病變導致S0D1-G93A轉基因小鼠發(fā)生疾病的直接因素為脊髓前角運動神經元退行性變。本實施例中，本發(fā)明人通過對各組轉基因小鼠脊髓(L4-5)前角組織切片，尼氏染色，顯微鏡觀察和計數。結果發(fā)現，與正常對照組小鼠相比，120天SOD1轉基因小鼠脊髓運動神經元數目明顯下降(219.67±21.32個(S0D1)vs792±40.07個(WT);n=3;尸O.OOl)，見圖3A中a和b。而葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以有效保護脊髓前角運動神經元，使疾病晚期(120天)小鼠脊髓前角運動神經元存活的數目明顯增多，運動神經元的胞體也較生理鹽水組明顯增大(383.5土24.43個(FA-S0D1)，413.67±32.48個(FA+B12國S0D1)vs219.67±21.32個(S0D1);n=3;尸<0.01)，見圖3A中d和e。而維生素B12單獨用藥對脊髓前角運動神經元的存活則無明顯的保護作用(248土24.49個(B12-S0D1)vs219.67±21.32個(SOD1);n=3;尸>0.05)，見圖3A中c)。同時，對各組運動神經元的存活數目進行統(tǒng)計也得出了相應的結果，見圖3B。實施例4.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥抑制轉基因小鼠脊髓膠質細胞的激活，減少了炎癥因子的分泌據文獻報道，炎癥反應在ALS病情的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，膠質細胞的激活是S0D1-G93A轉基因小鼠體內炎癥反應的檢測標準之一。在本實施例中，本發(fā)明人使用CDllb和GFAP作為標記分別觀測轉基因小鼠脊髓前角小膠質細胞和星形膠質細胞的形態(tài)。本發(fā)明人發(fā)現，120天時S0D1-G93A轉基因小鼠脊髓前角膠質細胞包括小膠質細胞和星形膠質細胞被廣泛激活，而葉酸尤其是葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組小鼠脊髓膠質細胞的激活得到了顯著的抑制，表現為膠質細胞數目減少，尤其是激活態(tài)的膠質細胞減少顯著。維生素B12單獨用藥組膠質細胞數目和形態(tài)的改變則不明顯。結果見圖4。在本發(fā)明人的實驗中還使用Westernblot的方法檢測五組實驗小鼠脊髓組織中iNOS和TNF-a的水平。結果發(fā)現，轉基因小鼠與野生型小鼠相比iNOS和TNF-a的水平明顯升高，而葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可顯著降低S0D1-G93A小鼠脊髓內兩種炎癥因子的水平，見圖5A。同時，本發(fā)明人也注意到，葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組轉基因小鼠脊髓組織內iNOS和TNF-a的水平與葉酸單用組相比更低，說明聯(lián)合用藥對小鼠體內炎癥反應的抑制效果更好，見圖5C和圖5D。維生素B12單獨用藥對小鼠脊髓兩種炎癥因子的釋放并沒有明顯作用，見圖5A。實施例5.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥影響脊髓凋亡相關蛋白的水平，減少了凋亡的發(fā)生已有報道說明高水平的Hcy可以通過激活神經元凋亡途徑導致神經元細胞的死亡。葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥均可降低轉基因小鼠血漿Hcy水平，為進一步探討其對小鼠體內凋亡水平的影響，本發(fā)明人用Westernblot的方法檢測了各組實驗小鼠脊髓組織內凋亡相關蛋白如Bcl-2，剪切型(Cleaved)Caspase-3(即Caspase-3蛋白的活性形式)和剪切型(Cleaved)PRAP(即PRAP蛋白的活性形式)的水平。實驗結果顯示，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥與灌胃生理鹽水相比，可明顯降低凋亡蛋白cleavedCaspase-3和cleavedPRAP的水平，同時可顯著增加抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，見圖5B。尤其是發(fā)現葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可使抗凋亡蛋白BcI-2的水平升高，接近正常野生型小鼠的水平，而且更顯著抑制了cleavedCaspase-3和cleavedPRAP的水平，這也說明了葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥在SOD1-G93A轉基因小鼠脊髓內有非常顯著的抗凋亡作用。維生素B12單獨使用則作用不明顯。統(tǒng)計數據也說明，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥在模型小鼠體內可通過影響凋亡相關蛋白的表達起到顯著的抗凋亡作用，且葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥的效果更佳，見圖5E-G。實施例6組合物的制備和用藥本發(fā)明人配制了組合物，精密稱量如下重量的各組分:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>將按照上表組合物的配方稱取組分，充分混合，與1000ml蒸餾水混合，制成液態(tài)組合物。按照實施例1的方法將各組合物給藥模型小鼠，發(fā)現各組合物均可有效延長小鼠的存活時間，其中組合物1的效果最為優(yōu)異。討論在本發(fā)明人的實驗中首次發(fā)現ALS轉基因小鼠S0D1-G93A血漿中同型半胱氨酸(Hcy)的水平遠遠高于正常的野生型小鼠，這提示本發(fā)明人考慮使用針對性的降低Hcy的治療方法是否能夠降低SODl-G93A小鼠體內的Hcy的水平，以及考慮這種針對性的治療方式對S0D1-G93A轉基因小鼠的病情的發(fā)生發(fā)展是否有一定的保護作用。進而，本發(fā)明人試驗了多種藥物，發(fā)現葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以明顯延緩S0D1-G93A小鼠的發(fā)病時間，同時也顯著延長了轉基因小鼠的生存周期。本發(fā)明人進一步研究了葉酸或葉酸和維生素B12對S0D1-G93A小鼠保護作用的機制，研究發(fā)現葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以保護脊髓運動神經元，明顯增加120天的轉基因小鼠脊髓前角運動神經元的存活數目。同時葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可抑制小鼠脊髓內膠質細胞的激活，減少膠質細胞尤其是激活態(tài)膠質細胞的數目，顯著降低炎癥相關因子iNOS和TNF-a的水平。此外，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥還可增加抗凋亡蛋白Bc-2的水平，降低凋亡蛋白cleavedCaspase-3及cleavedPRAP的水平。本發(fā)明人的研究結果表明，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥對ALS轉基因小鼠S0D1-G93A有著非常明顯的保護作用。已報道Hcy作為一種毒性的含硫氨基酸，與帕金森病，阿爾茨海默病等神經退行性疾病的發(fā)生有著密切的關系。但是，肌萎縮側索硬化與帕金森癥或阿爾茨海默癥相比，發(fā)病機制不盡相同；且確切的Hcy在ALS患者或轉基因小鼠體內的水平變化或明確的Hcy與ALS發(fā)生發(fā)展的證據一直沒有報道。在小鼠的炎癥反應方面，通過本發(fā)明人的實驗結果觀察到葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以明顯抑制轉基因小鼠脊髓前角膠質細胞的激活同時降低炎癥相關蛋白iNOS和TNF-a的水平。在本發(fā)明人的實驗中還發(fā)現，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以明顯增加轉基因小鼠脊髓組織內Bcl-2的水平，這為葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥的抗凋亡作用提供了有力的證據。cleavedCaspase-3及cleavedPRAP位于凋亡通路的下游，在S0D1-G93A小鼠脊髓運動神經元的凋亡中發(fā)揮重要作用。這些結果證實了葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以通過抑制S0D1-G93A小鼠體內的凋亡水平達到其對脊髓運動神經元的保護作用。通過本發(fā)明人的實驗和分析，可以確定葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥18200810042947.3對ALS模型小鼠的發(fā)病和生存都有著顯著的延長作用，且葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥是非常有效的預防和治療ALS的手段，在臨床上有著良好的應用前在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種同型半胱氨酸下調劑的用途，用于制備預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物。2.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的同型半胱氨酸下調劑選自(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B12的混合物。3.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(5-80):1。4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(10-40):1。5.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物用于抑制炎癥反應或抑制細胞凋亡。6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述的炎癥反應是炎癥因子過量引起的炎癥反應；或所述的細胞凋亡是凋亡蛋白水平過高或抗凋亡蛋白水平過低引起的細胞凋亡。7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的炎癥因子包括誘導型一氧化氮合酶或腫瘤壞死因子a。8.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的凋亡蛋白包括剪切型胱冬肽酶3，或剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶的水平。9.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抗凋亡蛋白包括B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白。10.—種預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物，所述的組合物含有-有效量的同型半胱氨酸下調劑，所述的同型半胱氨酸下調劑是葉酸和維生素B12的混合物，含有葉酸5-80重量份；維生素B12:l重量份；以及藥學上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及防治肌萎縮側索硬化的組合物。本發(fā)明公開了一種同型半胱氨酸下調劑的用途，用于制備預防、緩解或治療哺乳動物肌萎縮側索硬化的組合物；所述的下調劑是葉酸或葉酸和維生素B12的混合物。所述的下調劑可非常有效地緩解哺乳動物的肌萎縮側索硬化，降低哺乳動物脊髓內炎癥因子的水平，降低脊髓內凋亡蛋白的水平，提高脊髓內抗凋亡蛋白的水平。文檔編號A61P37/06GK101675932SQ20081004294公開日2010年3月24日申請日期2008年9月16日優(yōu)先權日2008年9月16日發(fā)明者樂衛(wèi)東,張曉潔,靚李,倩王,晟陳申請人:中國科學院上海生命科學研究院