專利名稱：：一種構(gòu)建恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法和評(píng)估方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種構(gòu)建及評(píng)估恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：腦梗塞動(dòng)物模型在缺血性腦血管病的各種研究中起著非常重要的作用，尤其是在各種治療方法的評(píng)估方面，如新藥評(píng)價(jià)等。目前用于這方面研究的動(dòng)物包括大鼠、兔、狗、貓以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物如獼猴、狒狒等。大鼠、兔等小型動(dòng)物因經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，使用較為廣泛。但是這些動(dòng)物與人的種屬差異大，導(dǎo)致動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果與臨床實(shí)驗(yàn)不符。猴在種屬上與人非常接近，其感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能均與人有相似之處。猴腦組織形態(tài)、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分布、腦血管解剖結(jié)構(gòu)等均與人類非常近似(HardevRamandeepSinghGirn,ReperflisionSyndrome:CellularMechanismsofMicrovascularDysfunctionandPotentialTherapeuticStrategies.VaseEndovascularSurg2007;41;277.)。symon等進(jìn)行的一項(xiàng)長(zhǎng)期重復(fù)性的生理和臨床觀察表明，猴單一動(dòng)脈閉塞模型是最理想的腦缺血模型(BenjaminS.Geisler，etal.BloodOxygenLevel-DependentMRIAllowsMetabolicDescriptionofTissueatRiskinAcuteStrokePatients.Stroke,2006,37:1778-1784.)。猴腦缺血后的表現(xiàn)與人有很多相似之處，可出現(xiàn)一側(cè)上肢無(wú)力，可累及下肢，還可出現(xiàn)同向偏盲等。而在一些小型動(dòng)物則常難以評(píng)價(jià)這類癥狀。穩(wěn)定的腦缺血模型應(yīng)具備以下特點(diǎn)①能選擇性地閉塞某一支動(dòng)脈，且重復(fù)性好；②動(dòng)脈閉塞可引起局部或某一區(qū)域腦血流發(fā)生改變，并誘導(dǎo)腦實(shí)質(zhì)梗死；③閉塞的動(dòng)脈可以再通以保證較高的動(dòng)物存活率。雖然非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦缺血模型能較好地模擬人類的腦血管疾病，但由于動(dòng)物的來(lái)源有限，價(jià)格昂貴，使用猴等高等動(dòng)物構(gòu)建的腦缺血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖鄬?duì)較少，目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的猴腦缺血模型。因此，建立簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好、死亡率低且易于控制缺血時(shí)間的猴腦缺血模型是值得進(jìn)一步探索的問(wèn)題。目前猴大腦中動(dòng)脈梗塞模型主要有兩種構(gòu)建方法一種是動(dòng)脈內(nèi)栓塞法，另一種是經(jīng)眶手術(shù)夾閉MCA起始部的方法。如譚隆旺等，猴急性腦梗塞模型的建立，《西南軍醫(yī)》2005年7巻5期，報(bào)道了采用明膠海綿栓塞猴頸內(nèi)動(dòng)脈復(fù)制急性腦梗塞模型。具體方法是選用成年猴6只，經(jīng)股動(dòng)脈穿刺插管，明膠海綿栓塞頸內(nèi)動(dòng)脈，然后行數(shù)字減影血管造影(DSA)顯示血管閉塞情況，栓后3、4、6、8、12、24hCT平掃。觀察腦梗塞CT表現(xiàn)。結(jié)果6只猴栓塞后DSA顯示頸內(nèi)動(dòng)閉塞，大腦前、中動(dòng)脈未顯影。缺血后68hCT平掃可見(jiàn)栓塞側(cè)大腦半球片狀低密度死區(qū)。其使用明膠栓塞頸內(nèi)動(dòng)脈；且手術(shù)中無(wú)造影設(shè)備的監(jiān)督。造成的是一側(cè)大腦前，中動(dòng)脈的永久性缺血，猴死亡率將會(huì)很高；且缺血部位可能并不恒定。韋日明等，局部腦缺血食蟹猴動(dòng)物模型的建立《廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2006年23巻3期，選擇10只健康的食蟹猴，采用血管介入法從股動(dòng)脈插管，將微導(dǎo)管超選至大腦中動(dòng)脈(middlecerebralartery,MCA)Ml分支，注入白體血栓堵塞其血管、阻斷其血流。結(jié)果栓塞后，通過(guò)數(shù)字影像血管造影系統(tǒng)(DSA)造影MCAM1分支血管顯影不良；栓塞lh后CT灌注成像可見(jiàn)急性局部腦缺血病灶；48h后進(jìn)行CT平掃可見(jiàn)低密度陳舊性局部腦缺血病灶。對(duì)2例尸體進(jìn)行解剖，取出大腦組織TTC染色呈陽(yáng)性；其余動(dòng)物清醒后均表現(xiàn)出不同程度的腦缺血癥狀與體征。結(jié)論用超選MCA白體白色血栓可建立穩(wěn)定的猴局部腦缺血模型，因該動(dòng)物模型是目前最接近臨床病例的模型，對(duì)腦卒中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究、診斷及治療，特別是溶栓治療有著切實(shí)的臨床前期應(yīng)用價(jià)值。該動(dòng)物模型通過(guò)血栓栓塞大腦中動(dòng)脈，為永久性的缺血模型，動(dòng)物死亡率高，不便于進(jìn)行藥物篩選。馮飛玲等，血管介入法導(dǎo)入自體血栓建立猴局部腦缺血模型，《中國(guó)病理生理雜志》2006年22巻10期，該文獻(xiàn)報(bào)道了采用血管介入法導(dǎo)入自體血栓，建立猴局部腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停瑸槟X缺血的相關(guān)研究提供創(chuàng)傷小、應(yīng)用前景大的基礎(chǔ)研究平臺(tái).方法以12只食蟹猴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用血管介入法從股動(dòng)脈將微導(dǎo)管超選至大腦中動(dòng)脈(MCA)Ml分枝，導(dǎo)入自體血栓堵塞MCA。通過(guò)血栓栓塞大腦中動(dòng)脈，為永久性的缺血模型，動(dòng)物死亡率高，不便于進(jìn)行藥物篩選。專利申請(qǐng)?zhí)?00410075763.9，發(fā)明名稱用獼猴制造局灶性腦缺血疾病模型的方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)試驗(yàn)研究領(lǐng)域，具體涉及一種制造靈長(zhǎng)類動(dòng)物局灶性腦缺血疾病模型的方法。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取靈長(zhǎng)類動(dòng)物獼猴Macacamulatta;血管內(nèi)介入微球囊導(dǎo)管，阻塞大腦中動(dòng)脈的起始部，按實(shí)驗(yàn)要求使大腦中動(dòng)脈供血區(qū)缺血，制造腦缺血疾病模型。本設(shè)計(jì)克服了傳統(tǒng)的靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦缺血方法缺血時(shí)間和程度不能控制的缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)合理、新穎，便于醫(yī)院及科研部門推廣和使用，為人類戰(zhàn)勝腦血栓提供必須的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，從而進(jìn)行發(fā)病機(jī)制的探討以及治療作用的研究；該專利為頸動(dòng)脈處手術(shù)分離血管，后盲法以球囊介入堵塞大腦中動(dòng)脈，而無(wú)造影設(shè)備引導(dǎo)。這類模型手術(shù)創(chuàng)傷較大，且栓塞全憑操作者經(jīng)驗(yàn)而非在造影下直視，不可能精確堵塞大腦中動(dòng)脈某一部位，很可能導(dǎo)致'模型缺血效果差別甚大，不利于進(jìn)一步的研究。但是，這些方法在模擬人腦缺血病理生理過(guò)程的可操作性、一致性及真實(shí)性方面都各有欠缺。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了的技術(shù)方案是提供了一種構(gòu)建和評(píng)估恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法。.本發(fā)明提供了一種構(gòu)建恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法，它是采用直接對(duì)實(shí)驗(yàn)猴行股動(dòng)脈穿刺方式，在數(shù)字減影機(jī)直視下進(jìn)行血管內(nèi)介入操作，用微導(dǎo)管阻塞實(shí)驗(yàn)猴大腦中動(dòng)脈并控制缺血時(shí)間建立慢性腦梗塞靈長(zhǎng)類模型的方法。它具體包括如下步驟a、動(dòng)物的麻醉麻醉前動(dòng)物禁飲禁食10h;麻醉前30min，予阿托品(0.05mg/Kg)肌注；以3%戊巴比妥鈉(lml/Kg)靜脈推注，直至麻醉滿意；b、血管和腦血管造影動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)取仰臥，固定，右腹股溝區(qū)域常規(guī)備皮，消毒；選取右股動(dòng)脈搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn)為穿刺點(diǎn)行盲法穿刺；成功后置入5F動(dòng)脈血管鞘，在導(dǎo)絲(Cordis)引導(dǎo)下置入4F造影導(dǎo)管(Cordis),行主動(dòng)脈弓上血管和腦血管造影以了解顱內(nèi)動(dòng)脈走形情況；c、造影結(jié)束后，導(dǎo)管尾端接Y型帶閥接頭，其側(cè)臂帶三通軟連接管并與加壓輸液袋相連，持續(xù)滴入生理鹽水以防血栓形成(4ml/min);在DSA(PhilipAlluraXperFD20)監(jiān)視下，將造影導(dǎo)管插至頸內(nèi)動(dòng)脈起始部以下，將帶支撐導(dǎo)絲的1.9F微導(dǎo)管(Prowler-10;Cordis)送入平直一側(cè)MCA直至其頭端到達(dá)Ml起始段以阻塞大腦中動(dòng)脈；分別通過(guò)4F導(dǎo)管和1.9F微導(dǎo)管造影確認(rèn)阻斷成功和阻斷部位以后MCA遠(yuǎn)端分支顯影情況；d、確認(rèn)MCA阻斷后，鎖緊Y型閥，固定微導(dǎo)管于該處，造成持續(xù)的MCA阻塞；栓塞2h后撤出微導(dǎo)管、導(dǎo)管，拔除動(dòng)脈血管鞘，使MCA血流再通，形成局灶性腦缺血再灌注模型。本發(fā)明還提供了一種恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型，它是由上述方法構(gòu)建得到。本發(fā)明提供了一種評(píng)估恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法，它是在3.0T磁共振成像儀(GESigna-excite)上采用基于彌散張量成像及血氧水平依賴的磁共振方法行模型的評(píng)估。本發(fā)明采用微導(dǎo)管栓塞，在數(shù)字減影機(jī)直視下進(jìn)行血管介入操作法建模。該法較其他造模方法更具優(yōu)勢(shì)，包括(1)能造成單一動(dòng)脈栓塞，不影響側(cè)枝循環(huán)的形成，因此更接近人腦缺血的實(shí)際情況；(2)栓塞部位恒定，栓塞效果可靠，因而模型的缺血范圍和缺血程度的可控性更好；(3)無(wú)需使用球囊/微彈簧圈，降低成本，簡(jiǎn)化操作，且因?yàn)椴划a(chǎn)生偽影，使得能夠在腦缺血超急性期內(nèi)進(jìn)行磁共振掃描行模型的評(píng)估。(4)動(dòng)物死亡率低，適于建立用于藥物評(píng)估的慢性模型。股動(dòng)脈穿刺，數(shù)字減影機(jī)直視下行微導(dǎo)管阻塞實(shí)驗(yàn)猴大腦中動(dòng)脈方式建立的靈長(zhǎng)類腦梗塞模型缺血效果肯定、可重復(fù)性好，可良好模擬人類腦缺血的病理生理狀況；功能磁共振方法對(duì)腦缺血的探測(cè)敏感且與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀良好相關(guān)；兩者結(jié)合，為篩選新的治療急性腦梗死的藥物提供一種新方法；可見(jiàn)本模型是一種比較理想的腦缺血再灌注動(dòng)物模型，用該方法復(fù)制出的猴腦損傷模型的病變特點(diǎn)與臨床表現(xiàn)近似，模型穩(wěn)定可靠，適宜用于各種治療性研究和相關(guān)的基礎(chǔ)華研究。圖1為動(dòng)物MCAO-003RMCA栓塞前后腦血管造影結(jié)果。圖1，A為RMCA栓塞前經(jīng)4F導(dǎo)管行右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈造影結(jié)果，可見(jiàn)RMCA顯影良好(A圖中箭頭所示)。圖1，B為RMCA栓塞后經(jīng)4F導(dǎo)管行右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈造影結(jié)果，可見(jiàn)RMCA主干未顯影(B圖中黑色箭頭所示)；MCAM1段近端分支顯影(B圖中白色箭頭所示)。圖1，C為RMCA栓塞后經(jīng)微導(dǎo)管行超選擇造影結(jié)果，可見(jiàn)微導(dǎo)管的頭端標(biāo)記位于M1段遠(yuǎn)端(C圖中箭頭所示);、同時(shí)還顯示M1段遠(yuǎn)端血供情況，可見(jiàn)M2段及其遠(yuǎn)端血管顯影良好。圖2.為動(dòng)物MCAO-003的MRA圖像。圖2，A為缺血后lhMRA圖像，可見(jiàn)RMCA血流信號(hào)消失；圖2，B和圖2，C分別為缺血后2h和術(shù)后24hMRA結(jié)果，可見(jiàn)RMCA血流信號(hào)部分恢復(fù)(圖中箭頭所示)，有清晰可見(jiàn)的梗死灶。圖3為缺血后lh動(dòng)物MCAO-004的4個(gè)連續(xù)層面圖像(軸位)。圖3，A為ADC圖，可見(jiàn)RMCA供血區(qū)內(nèi)大片低信號(hào)區(qū)，累及多個(gè)層面，為缺血病灶；圖3，B為T2FLAIR圖像，此時(shí)尚未出現(xiàn)異常信號(hào)。圖4為再灌注后2h動(dòng)物MCAO-004的4個(gè)連續(xù)掃描層面圖像(軸位)。圖4，A為ADC圖，仍可見(jiàn)RMCA供血區(qū)內(nèi)異常低信號(hào)病灶；圖4，B為T2FLAIR,可見(jiàn)異常高信號(hào)病灶，其分布與RMCA供血區(qū)一致。圖5相對(duì)平均表面彌散系數(shù)隨時(shí)間變化曲線可見(jiàn)幾個(gè)區(qū)域的rADC值在缺血后均降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降。再灌注后其值隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升。圖6相對(duì)平均表面彌散系數(shù)隨位置變化曲線可見(jiàn)在不同時(shí)點(diǎn)rADC值距離缺血中心區(qū)域越近越低，距離缺血中心區(qū)域越遠(yuǎn)越高，存在大致的線性關(guān)系。圖7相對(duì)各項(xiàng)異性分?jǐn)?shù)隨位置變化曲線表示了rAF值的趨勢(shì)。即缺血半暗帶區(qū)域(2區(qū))的值在缺血后顯著升高。且在再灌注后經(jīng)歷了一個(gè)正常化過(guò)程，而后再次升高。圖8血氧合水平依賴信號(hào)隨位置變化曲線表示了T2'較對(duì)側(cè)降低的程度與梗死區(qū)域的關(guān)系?？梢?jiàn)距離梗死灶越近T2'降低越多。且對(duì)梗死核心區(qū)而言T2，隨時(shí)間變化上升不明顯，而對(duì)半暗帶區(qū)域和良性缺血區(qū)而言T2，降低值有逐漸減少的趨勢(shì)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型建立一套通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)介入方法構(gòu)建恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型和功能磁共振評(píng)估所建模型的規(guī)程。試驗(yàn)材料1、主要試劑麻醉劑3%戊巴比妥30mg/kg硫酸阿托品10mg/2ml消毒劑聚維酮碘伏5.0g/L介入造影劑碘普羅胺注射液15g/50ml磁共振顯影劑釓噴葡胺0.5mol/L2、主要儀器、器械主要儀器設(shè)備介紹；PhilipAlluraXperFD20血管造影系統(tǒng)CordisProwler-10微導(dǎo)管，Cordis4F造影導(dǎo)管，Cordis引導(dǎo)導(dǎo)絲GESigna-excite3.0T超導(dǎo)型磁共振成像系統(tǒng)Medrad磁共振專用雙管高壓注射器RM6240BD動(dòng)物心電監(jiān)護(hù)儀(成都儀器廠)血壓計(jì)、耳溫計(jì)3、動(dòng)物及詞養(yǎng)管理3只恒河猴，動(dòng)物體重范圍5-9kg，年齡范圍5-8歲，雄性。恒河猴飼養(yǎng)于國(guó)家成都中藥安全性評(píng)價(jià)中心普通動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境并進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)治療，選擇健康(雌性須未孕)動(dòng)物作為受試動(dòng)物，不銹鋼猴籠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件符合國(guó)標(biāo)GB14925-2001，室溫18±26°C，相對(duì)濕度40±70%。猴精詞料喂養(yǎng)，自來(lái)水裝瓶自由飲用，每日喂飼水果。動(dòng)物掛頸牌和籠上貼標(biāo)簽作為動(dòng)物識(shí)別標(biāo)記。試驗(yàn)例1構(gòu)建恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法1、動(dòng)物的麻醉麻醉前動(dòng)物禁飲禁食10h;麻醉前30min,予阿托品(0.05mg/Kg)肌注；以3%戊巴比妥鈉(lml/Kg)靜脈推注，直至麻醉滿意；2、恒河猴腦梗塞模型建模手術(shù)操作方法2.1.術(shù)前動(dòng)物禁食禁飲12h。2.2.所有建模手術(shù)均在全麻狀態(tài)下進(jìn)行(動(dòng)物麻醉方法參考恒河猴手術(shù)麻醉SOP)。2.3.動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)取仰臥，用自制泡沫板固定。以繃帶固定四肢。2.4.右側(cè)腹股溝區(qū)域常規(guī)備皮。2.5.消毒術(shù)區(qū)三次，范圍超過(guò)手術(shù)穿刺點(diǎn)5厘米。手術(shù)區(qū)鋪無(wú)菌巾。2.6.選取右股動(dòng)脈搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn)為穿刺點(diǎn)行盲法穿刺。2.7.成功后置入5F動(dòng)脈血管鞘，在導(dǎo)絲引導(dǎo)(Cordis)下置入4F造影導(dǎo)管(Cordis),行主動(dòng)脈弓上血管和腦血管造影以了解顱內(nèi)動(dòng)脈走形情況。2.8.造影結(jié)束后，導(dǎo)管尾端接Y型帶閥接頭，其側(cè)臂帶三通軟連接管并與加壓輸液袋相連，持續(xù)滴入生理鹽水以防血栓形成(4ml/min)。在DSA監(jiān)視下，將造影導(dǎo)管插至頸內(nèi)動(dòng)脈起始部，然后將帶支撐導(dǎo)絲的1.9F微導(dǎo)管(Prowler-10;Cordis)送入平直一側(cè)MCA直至其頭端到達(dá)Ml段。2.9.分別通過(guò)4F導(dǎo)管和1.9F微導(dǎo)管造影確認(rèn)阻斷成功和阻斷部位以后MCA遠(yuǎn)端分支顯影情況。2.10.確認(rèn)MCA阻斷后，鎖緊Y型闊，固定微導(dǎo)管于該處，造成持續(xù)的MCA阻塞。取清潔膠布將導(dǎo)管和動(dòng)脈血管鞘外露部分固定于動(dòng)物大腿根部，迅速將動(dòng)物轉(zhuǎn)送至磁共振檢查室。2.11.栓塞2h后撤出微導(dǎo)管、導(dǎo)管，拔除動(dòng)脈血管鞘，使MCA血流再通，形成局灶性腦缺血再灌注模型。2.12.術(shù)中定時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體溫、呼吸及血壓狀況。3、影像學(xué)評(píng)估操作方法3丄影像學(xué)評(píng)估前動(dòng)物禁食禁飲12h。3.2.所有影像學(xué)評(píng)估均在全麻狀態(tài)下進(jìn)行(動(dòng)物麻醉方法參考恒河猴手術(shù)麻醉SOP)。3.3.行術(shù)前MRI掃描以排除顱內(nèi)病變，并留取基線資料。3.3.1.動(dòng)物仰臥于MRI掃描臺(tái)，墊以一次性塑料袋以保持清潔，并蓋以毛毯以保暖。3.3.2.頭部放置于鳥(niǎo)籠式頭線圈中，棉墊填塞其頭部?jī)膳砸员ＷC其正對(duì)儀器。3.3.3.行3PL、DTI、DTI—Tl、T2*map、T2*~T1、T2map、PWI、PWI—Tl、MRA掃描以排除顱內(nèi)病變，并調(diào)整和建立恒河猴磁共振掃描各序列參數(shù)。3.4.手術(shù)日將麻醉后的實(shí)驗(yàn)猴一側(cè)上肢備皮消毒，并以PWI專用抗高壓針行靜脈穿刺并以5ml注射器以肝素封管備用。3.5.手術(shù)缺血后1小時(shí)MRI掃描。3.5.1.動(dòng)物安置方法見(jiàn)3.3.1。3.5.2.將高壓注射器抽吸好造影劑，并與針頭連接。在開(kāi)始序列掃描出現(xiàn)第一幅原始灌注圖像的同時(shí)開(kāi)始以5ml/s速度注射造影劑。3.5.3.行3PL、DTI、DTI—T1、T2*map、T2*—Tl、T2map、PWI、PWI""T1掃描。3.6.以后的掃描序列分別為缺血后2小時(shí)3PL、DTI、DTI—Tl、T2*map、T2*—T1、T2map再灌注后1小時(shí)3PL、DTI、DTI—Tl、T2*map、T2*—Tl、T2map、MRA再灌注后2小時(shí)3PL、DTI、DTI—Tl、T2*map、T2*—-Tl、T2map再灌注后3小時(shí)3PL、DTI、DTI—Tl、T2*map、T2*^T1、T2map、PWI、PWI—Tl再灌注后4小時(shí)3PL、DTI、DTI^T1、T2*map、T2*~~T1、T2map再灌注后5小時(shí)3PL、DTI、DTI—T1、T2*map、T2*—Tl、T2map再灌注后6小時(shí)3PL、DTI、DTI—T1、T2*map、T2*~~T1、T2map術(shù)后第1天3PL、DTI、DTI—Tl、T2*map、T2*—Tl、T2map、MRA術(shù)后第7天3PL、T2-FLAIR、DTI、DTI—Tl、T2*map、T2*—Tl、T2map、MRA其具體操作方法同3.5。4、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估操作方法4.1評(píng)價(jià)時(shí)間對(duì)已檢疫的恒河猴在缺血前、缺血后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)，第3、4、5、6、7天每^^同一時(shí)點(diǎn)行神經(jīng)功能評(píng)分4.2評(píng)價(jià)人員由兩位參與本實(shí)驗(yàn)的但未知手術(shù)具體操作的實(shí)驗(yàn)成員進(jìn)行4.3評(píng)價(jià)方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)前先對(duì)恒河猴進(jìn)行日常生活習(xí)性觀察，熟悉其基本的生活規(guī)律及行為習(xí)慣，然后參考文獻(xiàn)中針對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物或者大動(dòng)物腦缺血模型在神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，意識(shí)狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、骨骼肌協(xié)調(diào)功能和感覺(jué)系統(tǒng)；評(píng)分表格如下猴局部腦缺血后神經(jīng)行為打分標(biāo)準(zhǔn)__分?jǐn)?shù)意識(shí)狀態(tài)正常，總是保持警覺(jué)狀態(tài)0有意識(shí)，并有挑釁行為4有意識(shí)，對(duì)刺激能逃避6有意識(shí)，對(duì)刺激反應(yīng)時(shí)有時(shí)無(wú)8昏睡，刺激能喚醒10昏睡，對(duì)短暫強(qiáng)烈刺激能睜眼16昏睡，需持續(xù)強(qiáng)烈刺激方可喚醒20淺昏迷，對(duì)光反射存在24深昏迷，無(wú)光反射28運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)健側(cè)/殘側(cè)上肢運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度正常0/0減弱2/2癱瘓4/4下肢運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度正常，行動(dòng)自如0/0能抬腿運(yùn)動(dòng)，并可屈膝2/2需加幫助方可移動(dòng)4/4癱瘓6/6上肢張力正常0/0完全痙攣或者完全松弛3/3下肢張力正常0/0完全痙攣或者完全松弛3/3骨骼肌協(xié)調(diào)功能正常行走0稍微不協(xié)調(diào)，行走時(shí)有些步態(tài)變形4不協(xié)調(diào)，但尚能攀爬6能站立，但行走幾步后即倒下10能坐，不能走12只能側(cè)躺或背躺16無(wú)運(yùn)動(dòng)18感覺(jué)系統(tǒng)健側(cè)/殘側(cè)臉部感覺(jué)所有區(qū)域?qū)佑|刺激均有反應(yīng)0/0某些區(qū)域無(wú)反應(yīng)3/3耳翼反射對(duì)剌激有煽動(dòng)反應(yīng)0/0對(duì)刺激缺失反應(yīng)3/3疼痛反射用針刺腳趾能有強(qiáng)烈、快速和完全的縮腳反應(yīng)0/0反應(yīng)減弱3/3反應(yīng)缺失_5/5注總計(jì)最高分為100分11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5、影像學(xué)數(shù)據(jù)處理方法5.1參數(shù)采集將DIT圖像重建出平均彌散系數(shù)(DCvag)圖、部分各向異性(AF)圖。所得參數(shù)包括DCvag、AF值。將T2*map和T2map用fiinctool2軟件重建，并行函數(shù)相減，得到T2，圖。5.2感興趣(ROI)區(qū)選擇兩名實(shí)驗(yàn)人員以盲法選擇4點(diǎn)R01，均為6.3mm(16pix)。1點(diǎn)為梗死中心區(qū)，3點(diǎn)為邊緣區(qū)，2點(diǎn)為1、3點(diǎn)的中點(diǎn)，4點(diǎn)為DTI正常信號(hào)區(qū)。測(cè)量DCvag、AF、T2'值。為避免梗死部位差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，計(jì)算時(shí)采用病變側(cè)與正常對(duì)側(cè)的相對(duì)值。5.3以spsssl3.0軟件行統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血造模效果及評(píng)價(jià)以編號(hào)03223實(shí)驗(yàn)猴為例，其影像學(xué)評(píng)估結(jié)果如下1、數(shù)字減影血管造影評(píng)估結(jié)果行栓塞側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈造影，可見(jiàn)該側(cè)MCA主干未顯影，證實(shí)微導(dǎo)管栓塞MCA成功，此時(shí)，Ml段近端部分分支尚可見(jiàn)；然后經(jīng)微導(dǎo)管行MCA超選擇造影，見(jiàn)栓塞部位以遠(yuǎn)的血管顯影，并顯示微導(dǎo)管頭端所在位置(即栓塞部位)。(見(jiàn)圖1)2、核磁共振評(píng)估結(jié)果2.1普通序列MRI圖像評(píng)估結(jié)果評(píng)估MRI圖像，證實(shí)確有MCA的閉塞，以及缺血所致的梗死灶。(見(jiàn)圖2)'2.2功能序列MRI圖像評(píng)估結(jié)果MCA閉塞后，3只動(dòng)物的DTI和T2FLAIR結(jié)果都顯示了與栓塞側(cè)MCA供血區(qū)分布一致的缺血損傷病灶。缺血后lh，ADC圖顯示異常低信號(hào)病灶(圖3,A)，其分布與RMCA供血區(qū)一致；此時(shí)，T2FLAIR像尚未出現(xiàn)異常信號(hào)(圖3，B)。再灌注后2h，ADC圖和T2FLAIR像均顯示RMCA供血區(qū)內(nèi)的異常信號(hào)(圖4,A-B)。2.3功能序列參數(shù)評(píng)估結(jié)果ADC、AF、1一VR、RA、T2'值結(jié)果及演變規(guī)律如下表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>圖5可見(jiàn)幾個(gè)區(qū)域的rADC值在缺血后均降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降。再灌注后其值隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升。圖6可見(jiàn)在不同時(shí)點(diǎn)rADC值距離缺血中心區(qū)域越近越低，距離缺血中心區(qū)域越遠(yuǎn)越高，存在大致的線性關(guān)系。圖7表示了rFA值的趨勢(shì)。即缺血半暗帶區(qū)域(2區(qū))的值在缺血后顯著升高，且在再灌注后經(jīng)歷了一個(gè)正?；^(guò)程，而后再次升高。圖8表示了T2'較對(duì)側(cè)降低的程度與梗死區(qū)域的關(guān)系?？梢?jiàn)距離梗死灶越近T2，降低越多。且對(duì)梗死核心區(qū)而言T2，隨時(shí)間變化上升不明顯，而對(duì)半暗帶區(qū)域和'良性缺血區(qū)而言T2，降低值有逐漸減少的趨勢(shì)。其中ADC:表面彌散系數(shù)(apparentdiffosioncoefficient)rADC:相對(duì)ADC(相對(duì)表面彌散系數(shù))rFA:相對(duì)FA(梗死區(qū)各向異性分?jǐn)?shù)/對(duì)側(cè)正常腦區(qū)各向異性分?jǐn)?shù))。T2，血氧合水平依賴信號(hào)3、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估結(jié)果以編號(hào)03223實(shí)驗(yàn)猴為例，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)猴有從缺血引起的神經(jīng)功能損害中逐漸恢復(fù)的過(guò)程。猴局部腦缺血后神經(jīng)行為打分標(biāo)準(zhǔn)08.2.2908.3.208.3.308.3.408.3.508.3.608.3.708.3.911:0023:3507:0013:5013:3013:3011:0011:00意識(shí)狀態(tài)010844000上肢運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度0/02/22/22/40/20/20/20/0下肢運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度0/04/42/22/62/40/20/20/0上肢張力0/03/30/30/30/30/00/00/0下肢張力0/00330/30/30/30/00/00/0骨骼肌協(xié)調(diào)功能01210106444臉部感覺(jué)0/03/30/30/30/30/30/00/0耳翼反射0/03/30/30/30/30/30/00/0疼痛反射0/03/33/30/33/30/30/00/014<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本發(fā)明動(dòng)物模型可用于篩選治療腦梗塞藥物，在研究腦梗塞機(jī)理中也有用處。腦梗塞發(fā)病率高，對(duì)人類的健康危害極大，由于本病的發(fā)病機(jī)理不完全確定，所以臨床尚缺乏有效的治療藥物和治療手段。而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的滯后是制約以上疾病機(jī)理研究和治療藥物開(kāi)發(fā)的瓶頸之一。因此，尋找合適的動(dòng)物模型對(duì)腦梗塞的相關(guān)研究尤為重要。以替代、修復(fù)或再造人體各種組織為特色的再生醫(yī)學(xué)是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的前沿學(xué)科，越來(lái)越多的再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)品己經(jīng)應(yīng)用于臨床治療。靈長(zhǎng)類動(dòng)物的解剖特點(diǎn)、生理功能及對(duì)疾病和治療藥物的反應(yīng)性與人類極為相近，是進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)品臨床前有效性評(píng)價(jià)的敏感動(dòng)物。本研究構(gòu)建的恒河猴腦梗塞模型適用范圍舉例1.近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是高度特異的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子，隸屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，參與整個(gè)腦缺血病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展；誘導(dǎo)新生血管生成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和遲發(fā)性死亡?？衫煤愫雍锬X梗塞模型研究VEGF特異的生物學(xué)作用，以發(fā)掘新的治療手段，為人類治療腦缺血性疾病提供可能的方法。2j斗學(xué)家在干細(xì)胞移植治療腦血管疾病的研究中傾注了大量的人力和物力。胚胎干細(xì)胞移植治療腦梗塞的相關(guān)研究因倫理學(xué)原因及法規(guī)所限最終擱淺。新近研究者將注意力轉(zhuǎn)移至間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell,MSC)的移植研究。MSC具有多種分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，且增殖力強(qiáng)，可塑性、遷移性和整合性能好，且能透過(guò)血腦屏障。有人認(rèn)為MSCs可能是保留(潛伏)于成年組織器官中的胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ESCs)，具有ESCs的特性。MSC的發(fā)現(xiàn)和成功分化為神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的移植治療提供了"種子細(xì)胞"，近期有研究報(bào)道了MSC移植治療腦梗塞能減輕大鼠神經(jīng)功能缺損，且立體定向移植、血管注射移植、蛛網(wǎng)膜下腔移植(枕大池注入、腰穿注入)、側(cè)腦室內(nèi)移植均獲得成功，可利用恒河猴腦梗塞模型研究該方法的作用機(jī)理及治療作用。權(quán)利要求1、一種構(gòu)建恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法，其特征在于它是采用直接對(duì)實(shí)驗(yàn)猴行股動(dòng)脈穿刺方式，在數(shù)字減影機(jī)直視下進(jìn)行血管內(nèi)介入操作，用微導(dǎo)管阻塞實(shí)驗(yàn)猴大腦中動(dòng)脈并控制缺血時(shí)間建立慢性腦梗塞靈長(zhǎng)類模型的方法。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法，它包括如下步驟-a、動(dòng)物的麻醉麻醉前動(dòng)物禁飲禁食10h;麻醉前30min，予阿托品0.05mg/Kg肌注；以3%戊巴比妥鈉lml/Kg靜脈推注，直至麻醉滿意；b、血管和腦血管造影動(dòng)物于手術(shù)臺(tái)取仰臥，固定，右腹股溝區(qū)域常規(guī)備皮，消毒；選取右股動(dòng)脈搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn)為穿刺點(diǎn)行盲法穿剌；成功后置入5F動(dòng)脈血管鞘，在導(dǎo)絲引導(dǎo)下置入4F造影導(dǎo)管，行主動(dòng)脈弓上血管和腦血管造影以了解顱內(nèi)動(dòng)脈走形情況；c、造影結(jié)束后，導(dǎo)管尾端接Y型帶閥接頭，其側(cè)臂帶三通軟連接管并與加壓輸液袋相連，持續(xù)滴入生理鹽水以防血栓形成，滴速為4ml/min;在DSA監(jiān)視下，將造影導(dǎo)管插至頸內(nèi)動(dòng)脈起始部以下，將帶支撐導(dǎo)絲的1.9F微導(dǎo)管送入平直一側(cè)MCA直至其頭端到達(dá)Ml起始段以阻塞大腦中動(dòng)脈；分別通過(guò)4F導(dǎo)管和1.9F微導(dǎo)管造影確認(rèn)阻斷成功和阻斷部位以后MCA遠(yuǎn)端分支顯影情況；d、確認(rèn)MCA阻斷后，鎖緊Y型閥，固定微導(dǎo)管于該處，造成持續(xù)的MCA阻塞；栓塞2h后撤出微導(dǎo)管、導(dǎo)管，拔除動(dòng)脈血管鞘，使MCA血流再通，形成局灶性腦缺血再灌注模型。3、一種恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型，它是由權(quán)利要求1或2所述的方法構(gòu)建得到。4、一種評(píng)估權(quán)利要求3所述的恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法，其特征在于它是在3.0T磁共振成像儀上采用主要基于彌散張量成像及血氧水平依賴的功能磁共振方法行模型的評(píng)估。5、權(quán)利要求3所述恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型在篩選治療腦梗塞藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種構(gòu)建恒河猴大腦中動(dòng)脈缺血模型的方法，它是采用直接對(duì)實(shí)驗(yàn)猴行股動(dòng)脈穿刺方式，在數(shù)字減影機(jī)直視下進(jìn)行血管內(nèi)介入操作，用微導(dǎo)管阻塞實(shí)驗(yàn)猴大腦中動(dòng)脈并控制缺血時(shí)間建立慢性腦梗塞靈長(zhǎng)類模型的方法。本模型是一種比較理想的腦缺血再灌注動(dòng)物模型，用該方法復(fù)制出的猴腦損傷模型的病變特點(diǎn)與臨床表現(xiàn)近似，模型穩(wěn)定可靠，適宜用于各種治療性研究和相關(guān)的基礎(chǔ)性研究。文檔編號(hào)A61B19/00GK101653378SQ20081004584公開(kāi)日2010年2月24日申請(qǐng)日期2008年8月20日優(yōu)先權(quán)日2008年8月20日發(fā)明者俐何,東周,周沐科,曹文英,李宏霞,覓楊,雪楊,莉王,王朝華,王玉才,潔羊,力肖,鄭洪波,建郭申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院;成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司