專利名稱：一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無(wú)機(jī)材料表面改性技術(shù)，特別涉及人工器官材料Ti-0薄膜表 面的生物化改性方法。
背景技術(shù)：
鈦基金屬已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而其表面自然形成的Ti-0薄層 被認(rèn)為是鈦具有良好生物相容性的主要原因。但是，就臨床應(yīng)用而言，鈥基金 屬的生物相容性遠(yuǎn)未滿足臨床需要。
在生物材料表面進(jìn)行生物大分子固定已經(jīng)成為提高其表面生物相容性的 最優(yōu)方法之一，另外，在材料表面引入細(xì)胞膜受體所能識(shí)別的生物特異性蛋白， 將促進(jìn)受體-配體作用，改善生物相容性。層粘連蛋白(Ln)是胚胎發(fā)育中出 現(xiàn)最早的細(xì)胞外基質(zhì)成分，因此材料表面固定Ln生物分子可促進(jìn)細(xì)胞的粘附 和生長(zhǎng)。但層粘連蛋白的長(zhǎng)久穩(wěn)定固定通常要求材料表面具有可與其發(fā)生反應(yīng) 的活性基團(tuán)，如羥基(-0H)、氨基(-NH2)、羧基(-C00H );而Ti-0薄膜為 無(wú)機(jī)材料，無(wú)法直接與生物分子發(fā)生作用而將其固定。目前也無(wú)將層粘連蛋白 固定到Ti-O薄膜的文獻(xiàn)才艮道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法， 用該種方法可在Ti-O薄膜表面牢固固定層粘連蛋白，Ti-O薄膜具有良好的血 液相容性和內(nèi)皮細(xì)胞相容性。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明的目的采用的技術(shù)方案是， 一種在Ti-0薄膜表面固 定層粘連蛋白的方法，其步驟為
A、 Ti-O薄膜清洗將Ti-O薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清 洗，獲得潔凈的薄膜表面，干燥；
B、 強(qiáng)堿活化在50-80。C振蕩條件下，將潔凈的Ti-0薄膜放入濃度為 8-12% WT的NaOH溶液中浸泡1-5小時(shí)，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；
C、 強(qiáng)酸活化將98% (WT) H2S04與30% (WT) HA按體積比1: 0. 5-3配制
混合液，在60-95。C下，將B步獲得的Ti-0薄膜用該混合液浸泡l-4小時(shí)，然 后用雙蒸水沖洗，再干燥；
D、 偶聯(lián)配制1 - 3% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE )的乙醇溶液作為 偶聯(lián)劑溶液，在50-7(TC下，將C步獲得的Ti-0薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中 24-72小時(shí)，然后回流漂洗2-6小時(shí)，之后在蒸餾水中超聲清洗，從而在Ti-0 薄膜表面形成偶^:劑單層，然后干燥；
E、 生物分子固定配制20-60mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入5-15mL/L 的水溶性碳二亞胺(EDC)催化劑，并用0. 22ijm慮膜過(guò)濾；在無(wú)菌條件下，將 D步獲得的Ti-0薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒溫孵化箱靜置6-24 小時(shí)，使層粘連蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗， 常溫晾干，即得。
參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1，本發(fā)明的反應(yīng)過(guò)程與機(jī)理是，通過(guò)強(qiáng)堿與強(qiáng)酸及HA 溶液浸泡，在Ti-O薄膜表面獲得輕基，然后通過(guò)r-氨丙基三乙氧基硅烷的乙 醇偶聯(lián)劑溶液浸泡，使Ti-0薄膜表面的羥基與偶聯(lián)劑的乙氧基團(tuán)反應(yīng)，而在 Ti-O薄膜表面形成偶聯(lián)劑單層，最后，通過(guò)在加有水溶性碳二亞胺(EDC)催 化劑的層粘連蛋白溶液中浸泡，使偶聯(lián)劑的氨基與層粘連蛋白的羧基發(fā)生反 應(yīng)，從而在Ti-O薄膜表面固定上層粘連蛋白單層。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
一、 創(chuàng)造性的選擇出活化方式、偶聯(lián)劑和生物分子，從而借助特別的表面 活化-偶聯(lián)-生物分子固定的方法，先將Ti-0薄膜表面活化形成羥基，再通 過(guò)羥基構(gòu)建一層偶聯(lián)劑中間層，該中間層與Ti - 0薄膜和生物分子層均能形成 化學(xué)鍵合。這樣， 一方面使層粘連蛋白在Ti-0薄膜表面的固定均勻牢固，另 一方面使得Ti-0薄膜具有優(yōu)異的生物相容性。試驗(yàn)也證明，用同樣方法固定 纖粘連蛋白，其血小板粘附數(shù)量增加，血液相容性差，而本發(fā)明方法在Ti-0 薄膜表面固定層粘連蛋白后同時(shí)具有良好的血液相容性和內(nèi)皮細(xì)胞相容性，即 生物相容性好。
二、 由于整個(gè)過(guò)程均采用浸泡方式進(jìn)行，因此可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)上具有復(fù)雜體 型結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)用裝置如人工心臟瓣膜、血管支架、血栓濾器等表面層粘連蛋 白生物化修—飾，其適用范圍廣。
三、 由于整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊昂貴的設(shè)備，其制作成本低。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
圖1為本發(fā)明方法各步驟在Ti-0薄膜表面所對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的共價(jià)接枝過(guò)程的 示意圖。
圖h為未固定層粘連蛋白的Ti-O薄膜表面粘附的血小板的掃描電鏡圖。 圖化為用本發(fā)明方法園定層粘連蛋白后的Ti-0薄膜表面粘附的血小板的 掃描電鏡圖。
圖3a為未固定層粘連蛋白的Ti-0薄膜表面生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的掃描電鏡圖。
圖3b為用本發(fā)明方法中固定層粘連蛋白后的Ti-O薄膜表面生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì) 胞的掃描電鏡圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
參見(jiàn)圖1,本發(fā)明的第一種具體實(shí)施方式
是， 一種在Ti-0薄膜表面固定 層粘連蛋白的方法，其步驟為
A、 Ti-0薄膜清洗將銳鈥礦晶型Ti-0薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水 進(jìn)行超聲波清洗，分別IO分鐘，獲得潔凈的薄膜表面，放入凈化室干燥箱中 進(jìn)行干燥；
B、 強(qiáng)堿活化在50。C振蕩條件下，將潔凈的Ti-0薄膜放入濃度為10% WT 的NaOH溶液中浸泡3小時(shí)，然后用雙蒸水沖洗，再真空干燥；
C、 強(qiáng)酸活化將98% (WT) H2S(h與30% (WT) HA按體積比1: 1配制混合 液，在9(TC下，將B步獲得的Ti-0薄膜用該混合液浸泡2小時(shí)，然后用雙蒸 水沖洗，再真空干燥；
D、 偶聯(lián)配制1% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為偶 聯(lián)劑溶液,在6(TC下，將C步獲得的Ti-0薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中48小時(shí)， 然后回流漂洗4小時(shí)，之后在蒸餾水中超聲清洗3分鐘，從而在Ti-0薄膜表 面形成偶聯(lián)劑單層，然后真空干燥；
E、 生物分子固定配制40mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入10mL/L的 水溶性碳二亞胺(EDC )催化劑，并用0. 22pm慮膜過(guò)濾；在無(wú)菌條件下，將D 步獲得的Ti-0薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒溫孵化箱靜置12小
時(shí)，使層粘連蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗3 分鐘，常溫晾干，即得。 實(shí)施例2
一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法，其步驟為
A、 Ti-0薄膜清洗將以銳鈦礦為主的銳鈦礦與金紅石混合晶型Ti-0薄 膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清洗，分別8分鐘，獲得潔凈的薄膜 表面，放入凈化室干燥箱中進(jìn)行干燥；
B、 強(qiáng)堿活化在80。C振蕩條件下，將潔凈的Ti-0薄膜放入濃度為8% WT 的NaOH溶液中浸泡1小時(shí)，然后用雙蒸水沖洗，再真空干燥；
C、 強(qiáng)酸活化將98% (WT) HzS04與30% (WT) HA按體積比1: 3配制混合 液，在60'C下，將B步獲得的Ti-0薄膜用該混合液浸泡4小時(shí)，然后用雙蒸
水沖洗，再真空干燥；
D、 偶聯(lián)配制3% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為偶 聯(lián)劑溶液,在5(TC下，將C步獲得的Ti-0薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中72小時(shí)， 然后回流漂洗6小時(shí)，之后在蒸餾水中超聲清洗3分鐘，從而在Ti-O薄膜表 面形成偶聯(lián)劑單層，然后真空干燥；
E、 生物分子固定配制60mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入15mL/L的 水溶性碳二亞胺(EDC )催化劑，并用0. 22pm慮膜過(guò)濾；在無(wú)菌條件下，將D 步獲得的Ti-O薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒溫孵化箱靜置6小時(shí)， 使層粘連蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗3分鐘， 常溫晾干，即得。
實(shí)施例3
一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法，其步驟為
A、 Ti-0薄膜清洗將銳鈥礦晶型Ti-0薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水 進(jìn)行超聲波清洗，分別5分鐘，獲得潔凈的薄膜表面，干燥；
B、 強(qiáng)堿活化在60。C振蕩條件下，將潔凈的Ti-0薄膜放入濃度為12% WT 的NaOH溶液中浸泡5小時(shí)，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；
C、 強(qiáng)酸活化將98% (WT) H2S(X與30% (WT) &02按體積比1: 0. 5配制混 合液，在95。C下，將B步獲得的Ti-0薄膜用該混合液浸泡1小時(shí)，然后用雙 蒸水沖洗，再干燥；
D、 偶聯(lián)配制1.5% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為 偶聯(lián)劑溶液，在7(TC下，將C步獲得的Ti-0薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中24 小時(shí)，然后回流漂洗2小時(shí)，之后在蒸餾水中超聲清洗3分鐘，從而在Ti-0 薄膜表面形成偶聯(lián)劑單層，然后干燥；
E、 生物分子固定配制20mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入5mL/L的水 溶性碳二亞胺(EDC )催化劑，并用0. 22|jm慮膜過(guò)濾；在無(wú)菌條件下，將D步 獲得的Ti-0薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒溫孵化箱靜置24小時(shí)， 使層粘連蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗3分鐘， 常溫晾干，即得。
本發(fā)明方法中薄膜清洗時(shí)，用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清洗對(duì)時(shí)間 沒(méi)有嚴(yán)格要求，只要能將薄膜清洗干凈即可。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用本發(fā)明方法生物改性后的Ti-0薄膜具有良好的生物相 容性
圖2a為未固定層粘連蛋白的Ti-0薄膜表面粘附的血小板的掃描電鏡圖。 圖2b為用本發(fā)明方法固定層粘連蛋白后的Ti-0薄膜表面粘附的血小板的掃描 電鏡圖。圖2b及圖2a可以看出，用本發(fā)明方法固定層粘連蛋白后，Ti-O薄膜 表面血小板粘附的數(shù)量顯著減少，幾乎沒(méi)有。這說(shuō)明用本發(fā)明方法生物改性后 的Ti-0薄膜表面血液相容性明顯改善。
圖3a為未固定層粘連蛋白的Ti-0薄膜表面生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的掃描電鏡 圖。圖3b為用本發(fā)明方法中固定層粘連蛋白后的Ti-0薄膜表面生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì) 胞的掃描電鏡圖。圖3b及圖3a可以看出，用本發(fā)明方法固定層粘連蛋白后， Ti-O薄膜表面內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)良好，細(xì)胞增殖明顯。這說(shuō)明用本發(fā)明方法生物 改性后的Ti-0薄膜表面細(xì)胞相容性明顯改善。
權(quán)利要求
1、一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法，其步驟為A、Ti-O薄膜清洗將Ti-O薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清洗，獲得潔凈的薄膜表面，干燥；B、強(qiáng)堿活化在50-80℃振蕩條件下，將潔凈的Ti-O薄膜放入濃度為8-12％WT的NaOH溶液中浸泡1-5小時(shí)，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；C、強(qiáng)酸活化將98％(WT)H2SO4與30％(WT)H2O2按體積比1∶0.5-3配制混合液，在60-95℃下，將B步獲得的Ti-O薄膜用該混合液浸泡1-4小時(shí)，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；D、偶聯(lián)配制1-3％wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為偶聯(lián)劑溶液，在50-70℃下，將C步獲得的Ti-O薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中24-72小時(shí)，然后回流漂洗2-6小時(shí)，之后在蒸餾水中超聲清洗，從而在Ti-O薄膜表面形成偶聯(lián)劑單層，然后干燥；E、生物分子固定配制20-60mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入5-15mL/L的水溶性碳二亞胺(EDC)催化劑，并用0.22μm慮膜過(guò)濾；在無(wú)菌條件下，將D步獲得的Ti-O薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37±0.5℃恒溫孵化箱靜置6-24小時(shí)，使層粘連蛋白固定到Ti-O薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗，常溫晾干，即得。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在Ti-0薄膜表面固定層粘連蛋白的方法， 其特征在于所述Ti-0薄膜為銳鈥礦晶型或以銳鈦礦為主的銳鈥礦與金紅石 混合晶型。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在Ti-0薄膜表面固定層粘連蛋白的方法， 其特征在于所述B、 C、 D步驟中的干燥為真空干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法。在Ti-O薄膜表面，通過(guò)強(qiáng)堿與強(qiáng)酸活化在Ti-O薄膜表面形成反應(yīng)性官能團(tuán)羥基-OH，然后用硅烷偶聯(lián)劑氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)在Ti-O薄膜表面與生物分子層之間構(gòu)建一層與兩者分別具有化學(xué)鍵合能力的偶聯(lián)層，以提高后續(xù)所固定生物分子的穩(wěn)定性。最后以水溶性碳二亞胺(EDC)為固定蛋白的催化劑，固定層粘連蛋白分子，從而在Ti-O薄膜表面牢固形成層粘連蛋白生物化層。本發(fā)明在Ti-O薄膜表面牢固結(jié)合固定層粘連蛋白生物化層，顯著提高Ti-O薄膜表面的血液相容性和內(nèi)皮細(xì)胞相容性。
文檔編號(hào)A61L31/12GK101357240SQ20081004604
公開(kāi)日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者萬(wàn)國(guó)江, 冷永祥, 熹 吳, 鴻 孫, 蘋(píng) 楊, 游天雪, 進(jìn) 王, 葛勝男, 趙安莎, 陳俊英, 楠 黃 申請(qǐng)人:西南交通大學(xué);成都交大麥迪克科技有限公司