專利名稱：：一種誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌活性物質的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌活性物質的方法，屬于生物醫(yī)學領域。技術背景抗生素的大量使用已使不少病原菌產(chǎn)生了抗藥性，給一些疾病的治療帶來了困難。昆蟲、蜘蛛、蝦蟹等節(jié)肢動物體抗菌肽對革蘭氏陽性細菌及革蘭氏陰性細菌均有高效廣譜的殺傷作用，可以殺死已產(chǎn)生耐藥性的病原菌突變種，不會誘導抗藥菌株的出現(xiàn)?？咕牟粌H能作用于細菌、病毒以及其他一些原核生物，對腫瘤治療也能起到一定的作用?？咕臉O有可能成為抗菌素、抗病毒素以及抗腫瘤藥的新來源。昆蟲、蜘蛛、蝦蟹等節(jié)肢動物體體內的抗菌物質主要是通過各種體外誘導之后，昆蟲、蜘蛛、蝦蟹等節(jié)肢動物體內的一些組織(如脂肪體等)將合成抗菌物質并運輸?shù)窖馨椭?，從而形成昆蟲特有的防御系統(tǒng)。未經(jīng)體外誘導的節(jié)肢動物體內的抗菌肽抗菌活性低、數(shù)量少。尋找高效簡單的體外誘導及抗菌肽提取方法，使其能從昆蟲體內提取更多、抗菌活性更高的抗菌物質，成為技術上亟待解決的問題。蜘蛛是僅次于昆蟲的一大類無脊椎動物，數(shù)量多，分布廣，能在各種環(huán)境中生存，具有很強的抗逆能力。對蜘蛛抗菌物質的研究不僅具有重要的理論意義，而且具有廣闊的應用前景。目前，國內外關于蜘蛛抗菌物質的研究報道很少，僅見v4c朋^wo/m'ago膨s/fl"fl(—種捕鳥蛛)抗菌肽的分離、純化及分子克隆等方面研究。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的時提出一種簡便、高效的誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌活性物質的方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，操作過程為-1、紫外線照射誘導:將角類肥蛛放于培養(yǎng)皿中，于20w紫外燈下距離1米處照射0.5—3h，其中以1—1.5h為最好，然后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。2、誘導后蜘蛛的飼養(yǎng)將經(jīng)紫外線照射的蜘蛛單頭飼養(yǎng)于玻璃指管(長度X直徑42cmX4cm)內，管底墊有吸足水的海綿供蜘蛛飲水，用棉花塞封口，然后將裝有蜘蛛的玻璃指管置于25'C培養(yǎng)箱中，光照周期為12:12(Light:Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蠅("rosc^力"asp.)和搖蚊(7e"rf/pe51sp.)成蟲。3、蜘蛛血淋巴的提取采用組織勻漿法將誘導后的蜘蛛用75%酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml離心管中，加入預冷的無菌水勻漿(當外界溫度較高時，還需加入一些巰基乙醇防止抗菌物質黑化)，勻漿液于4'C、12000rpm離心20分鐘，去除上層脂肪，收集上清液置-2(TC冰箱保存。4、從紫外線照射后蜘蛛提取抗菌活性物質的時間將經(jīng)紫外線照射誘導的角類肥蛛分別于誘導后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h和120h時，用組織勻槳法采集血淋巴。以支氣管敗血博氏菌為指示菌，用涂平板打孔法，測定了各個時間角類肥蛛免疫血淋巴的抗菌活性。每處理設10次重復。用紫外線照射誘導后，蜘蛛免疫血淋巴的抗菌活性上升很快，誘導后25—70h時抗菌活性可達70%，以誘導后60h時抗菌活性最高。隨后抑菌活性隨時間的增加開始緩慢下降，至120h時，仍然保持一定的抗菌活性。(見表l)10Timeafterinducement(h)表1經(jīng)紫外線照射誘導后角類肥蛛血淋巴粗提液的抗菌活性隨時間的變化趨勢蜘蛛血淋巴抑菌活性的測定采用涂平板打孔法。將處于對數(shù)生長期的細菌配成106cfWml濃度的菌液，用L型玻璃棒均勻涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花狀打孔，孔徑為0.5cm。每孔加血淋巴粗提液15^。將平板于4。C倒置2h后，于3。C培養(yǎng)16-18h,測量記錄抗菌活性。抗菌活性的大小用抑菌圈直徑來表示(抑菌圈直徑=總直徑-孔的直徑)。采用三種方法(紫外線照射、大腸桿菌注射法和饑餓法)誘導角類肥蛛，然后以涂平板打孔法(Hultmark，1984)測定蜘蛛血淋巴對指示菌的抗菌活性，比較3種誘導方法的效果。經(jīng)過誘導的角類肥蛛血淋巴粗提液對支氣管敗血博氏菌和豬葡萄球菌兩種菌的抗菌活性，均顯著高于未經(jīng)誘導的血淋巴粗提液的抗菌活性(表l)。其中，紫外線照射誘導的蜘蛛血淋巴粗提液對支氣管敗血博氏菌的抑菌效果顯著高于注射誘導法，對豬葡萄球菌的效果也大于細菌注射法，但差異沒有達到顯著水平。在三種誘導方法中，對2種指示菌的抑菌效果均以紫外線照射誘導抑菌圈的直徑最大，效果最好。表1不同方法誘導角類肥蛛血淋巴粗提液的抑菌效果供試細菌支氣管敗血博氏菌誘導方法細菌注射饑餓無誘導抑菌圈直徑(mm)9.01±0.14a8.03±0.19b4.60±0.26c豬葡萄球菌紫外線照射細菌注射饑餓無誘導6.08±0.36a5.95士0.16a2.85±0.21b1.25士0.11c注抑菌效果用抑菌圈的直徑大小來表示。數(shù)據(jù)后的不同字母表示P〈0.05(r^l0)水平上有顯著差異。"-"表示沒有抑菌效果。與細菌注射法及饑餓法相比，紫外線照射法誘導的免疫血淋巴具有最好的抑菌效果，且操作簡單方便，適合大規(guī)模誘導，對一些個體較小、不宜進行注射的蜘蛛以及其他小型動物體特別有效，是一種較好的誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌物質的方法。(細菌注射法將供試蜘蛛于冰上麻醉后，在超凈工作臺上用微量進樣器于其腹部腹面注射，每蛛注射lpl已制備好的大腸桿菌懸液(濃度為lX106cfu/ml)，后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。饑餓法將角類肥蛛饑餓60h后，取血淋巴進行抗菌活性測定。)紫外線誘導后蜘蛛免疫血淋巴抑菌活性譜的測定將經(jīng)紫外線誘導后60h的蜘蛛血淋巴，用涂平板打孔法測定其對支氣管敗血博氏菌等11種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌效果。每處理設10次重復。結果見表2。從表2可以看出，蜘蛛經(jīng)紫外線誘導后，其血淋巴對支氣管敗血博氏菌、豬葡萄球菌、豬鏈球菌I型、豬鏈球菌II型、雞葡萄球菌、大腸桿菌078、大腸桿菌02、大腸桿菌Ku、豬霍亂沙門氏菌、雞沙門氏菌共IO種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有明顯的抗菌活性。其中，對支氣管敗血博氏菌、豬葡萄球菌及豬鏈球菌的抑菌活力最強，對大腸桿菌及其它供試細菌的抑菌活力次之。而末經(jīng)誘導的蜘蛛血淋巴，沒有抗菌活性或者其抗菌活性顯著低于經(jīng)紫外線誘導后的蜘蛛血淋巴。表2紫外線誘導后角類肥蛛血淋巴粗提液的抗菌譜經(jīng)紫外線誘導未經(jīng)紫外線誘革蘭氏陽性供試細菌血淋巴的抑菌圈導血淋巴的抑細菌/陰細菌直徑(cm)菌圈直徑(cm:支氣管敗血博氏菌5on3fete//afera"cA/sepft'caG9.01±0.14a*-豬葡萄球菌Stop/—COCCM5/"'CW5G+6.08±0.36b*1.25±0.11豬鏈球菌I型Srre/7tococcus湖'sIG+4.91±0.16c未作對照豬鏈球菌II型浙eptococcwssw/sIIG+4.86±0.13c未作對照雞葡萄球菌Sto//jy/ococcMSga//far"jG+3.65±0.14d*1.35±0.25大腸桿菌Esc/jm'c/n'aco//078G—3.57±0.09d*1.07±0.09大腸桿菌i!ycAmWac。//。2G—3.13±0.05d*1.06±0.10大腸桿菌_&c/je"-cWaco/z'KnG.3.11±0.18d*1.13±o.n豬沙門氏菌Sa/附o"e〃ac/zo/eraesw/sG—3.05±0.08de*1.25±0.21雞沙門氏菌Sa/附o"e〃agaffiwara/wG—2.33±O.lOe*1.15±0.12變形桿菌iVofewsvw/gar&G.--G+表示革蘭氏陽性菌，G—表示革蘭氏陰性菌。"+"表示有抑菌效果，"-"表示沒有抑菌效果。數(shù)據(jù)后的小寫字母不同表示蜘蛛血淋巴對不同細菌的抗菌活性在P<0.05水平下差異顯著，*表示免疫血淋巴與對照對同一細菌抑菌活性在p<0.05水平下差異顯著。本發(fā)明的優(yōu)點及前景本發(fā)明比較了紫外線照射、細菌注射法及饑餓法三種誘導蜘蛛產(chǎn)生免疫血淋巴的方法。饑餓法產(chǎn)生的誘導效果明顯低于其他兩種方法，而使用細菌注射法常常引起蜘蛛局部被微生物感染或體液倒流嚴重而造成蜘蛛死亡。同時，由于蜘蛛體型較小，采用細菌注射法誘導很麻煩、費時。同細菌注射誘導法比較，本發(fā)明誘導效果最好，免疫血淋巴對細菌的抑菌活性最高。同時，因其誘導方法簡便、快速、省力，適于一次完成較大量免疫血淋巴的收集，在操作上比細菌注射法大為簡化，適合大規(guī)模進行誘導，是一種極好的誘導抗菌物質生產(chǎn)方法。具體實施例方式實施例l:1.采集角類肥蛛成蛛90頭，分為兩組，第一組80頭做誘導，第二組10頭做對照。將第一組的80頭蜘蛛放于培養(yǎng)皿中，于20w紫外燈下距離l米處照射lh(—次可照射50頭)，然后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。第二組的10頭蜘蛛不照射，在正常條件下飼喂，作為對照。2.將經(jīng)紫外線照射后的80頭蜘蛛以及未經(jīng)誘導的10頭蜘蛛單頭飼養(yǎng)于玻璃指管(長度X直徑42cmX4cm)內，管底墊有吸足水的海綿供蜘蛛飲水，用棉花塞封口，然后將裝有蜘蛛的玻璃指管置于25'C培養(yǎng)箱中，光照周期為12:12(Light:Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蠅(Zrosop力Wasp.)和搖蚊(re/7A'/essp.)成蟲。3.分別于誘導后Oh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h時取蜘蛛提取其血淋巴，每個時間取5頭蜘蛛。0h的蜘蛛即為對照組蜘蛛。血淋巴的提取采用組織勻漿法將蜘蛛用75%酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml離心管中，加入預冷的無菌水勻漿(當外界溫度較高時，還需加入一些巰基乙醇防止抗菌物質黑化)，勻漿液于4。C、12000rpm離心20分鐘，去除上層脂肪，收集上清液，共收集320(Hil,置-2(TC冰箱保存，。4.將處于對數(shù)生長期的支氣管敗血博氏菌配成10SdWml濃度的菌液，用L型玻璃棒均勻涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花狀打孔，孔徑為0.5cm。取步驟3中已提取的血淋巴粗提液加樣，每孔加15nl。設10次重復。將平板于4'C倒置2h后，于37'C培養(yǎng)16-18h。5.測量記錄抗菌活性?？咕钚缘拇笮∮靡志χ睆絹肀硎?抑菌圈直徑=總直徑-孔的直徑)。不同時間提取的血淋巴粗提液的抗菌活性如表3所示，未經(jīng)誘導的蜘蛛血淋巴粗提液沒有抗菌活性，用紫外線照射誘導后，蜘蛛免疫血淋巴的抗菌活性上升很快，以誘導后60h時抗菌活性最高，抑菌圈直徑為9.01mm。隨后抑菌活性隨時間的增加開始緩慢下降，至120h時，仍然保持一定的抗菌活性。因此，蜘蛛血淋巴的提取以誘導后60h為最佳。表3.經(jīng)紫外線照射誘導后角類肥蛛血淋巴粗提液不同時間的抗菌活性(抑菌圈直徑，mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2:1.采集大腹園蛛40頭，放于培養(yǎng)皿中，于20w紫外燈下距離l米處照射lh。2.將經(jīng)紫外線照射后的40頭蜘蛛單頭詞養(yǎng)于玻璃指管(長度X直徑42cmX4cm)內，管底墊有吸足水的海綿供蜘蛛飲水，用棉花塞封口，然后將裝有蜘蛛的玻璃指管置于25X:培養(yǎng)箱中，光照周期為12:12(Light:Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蠅(Z^owp/^7asp.)和搖蚊(re/M^pessp.)成蟲。3.飼養(yǎng)經(jīng)紫外線照射后的蜘蛛60h后，取蜘蛛提取血淋巴。將蜘蛛用75%酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml離心管中，加入預冷的無菌水勻漿(當外界溫度較高時，還需加入一些巰基乙醇防止抗菌物質黑化)，勻漿液于4'C、12000rpm離心20分鐘，去除上層脂肪，收集上清液，共收集2000W，置-2(TC冰箱保存。4.將處于對數(shù)生長期的支氣管敗血博氏菌、豬葡萄球菌、豬鏈球菌I型、豬鏈球菌II型、雞葡萄球菌、大腸桿菌078、大腸桿菌02、大腸桿菌Ki2、豬霍亂沙門氏菌、雞沙門氏菌、變形桿菌共11種細菌分別配成106cfio/ml濃度的菌液，用L型玻璃棒分別均勻涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花狀打L，孔徑為0.5cm。取步驟3已提取的血淋巴粗提液加樣，每孔加15pl。設10次重復。將平板于4。C倒置2h后，于37。C培養(yǎng)16-18h。5.測量記錄抗菌活性?？咕钚缘拇笮∮靡志χ睆絹肀硎?抑菌圈直徑=總直徑-孔的直徑)。如表2所示，蜘蛛經(jīng)紫外線誘導后，其血淋巴對支氣管敗血博氏菌、豬葡萄球菌、豬鏈球菌I型、豬鏈球菌II型、雞葡萄球菌、大腸桿菌078、大腸桿菌02、大腸桿菌Ku、豬霍亂沙門氏菌、雞沙門氏菌共10種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有明顯的抗菌活性，提示其具有較廣的抗菌活性。其中，對支氣管敗血博氏菌、豬葡萄球菌及豬鏈球菌的抑菌活力最強，對大腸桿菌及其它供試細菌的抑菌活力次之。而末經(jīng)誘導的蜘蛛血淋巴，沒有抗菌活性或者其抗菌活性顯著低于經(jīng)紫外線誘導后的蜘蛛血淋巴。實施例3:1.采集角類肥蛛40頭，分為四組，每組10頭。前三組分別采用紫外線照射法誘導、細菌注射法誘導、饑餓法誘導，第四組不誘導，做為對照組。紫外線照射誘導將10頭供試蜘蛛放于培養(yǎng)皿中，于20w紫外燈下距離1米處照射lh，然后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。細菌注射法將10頭供試蜘蛛于冰上麻醉后，在超凈工作臺上用微量進樣器于其腹部腹面注射，每蛛注射lpl已制備好的大腸桿菌懸液(濃度為lX106dWml)，后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。饑餓法將10頭供試蜘蛛饑餓60h后，取血淋巴進行抗菌活性測定。2.將經(jīng)紫外線照射誘導，細菌注射誘導、未經(jīng)誘導的對照組蜘蛛單頭飼養(yǎng)于玻璃指管(長度X直徑zl2ciiiX4cm)內，管底墊有吸足水的海綿供蜘蛛飲水，用棉花塞封口，然后將裝有蜘蛛的玻璃指管置于25'C培養(yǎng)箱中，光照周期為12:12(Light:Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蠅("roso;/^7a印.)和搖蚊(re/j&'pessp.)成蟲。饑餓法誘導的蜘蛛不喂果蠅和搖蚊，其他條件同前邊三組。3.將誘導后的蜘蛛用75%酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml離心管中，加入預冷的無菌水勻漿(當外界溫度較高時，還需加入一些巰基乙醇防止抗菌物質黑化)，勻漿液于4。C、12000rpm離心20分鐘，去除上層脂肪，收集上清液，共收集400nl，置-2(TC冰箱保存。4.將處于對數(shù)生長期的支氣管敗血博氏菌及豬葡萄球菌分別配成106cfij/ml濃度的菌液，用L型玻璃棒均勻涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花狀打孔，孔徑為0.5cm。取已提取的血淋巴粗提液加樣，每孔加15nl。設10次重復。將平板于4。C倒置2h后，于37。C培養(yǎng)16-18h。5.測量記錄抗菌活性?？咕钚缘拇笮∮靡志χ睆絹肀硎?抑菌圈直徑=總直徑-孔的直徑)。結果如表1所示，經(jīng)過誘導的角類肥蛛血淋巴粗提液對支氣管敗血博氏菌和豬葡萄球菌兩種菌的抗菌活性，均顯著高于未經(jīng)誘導的血淋巴粗提液的抗菌活性(表l)。其中，紫外線照射誘導的蜘蛛血淋巴粗提液對支氣管敗血博氏菌的抑菌效果顯著高于注射誘導法，對豬葡萄球菌的效果也大于細菌注射法，但差異沒有達到顯著水平。在三種誘導方法中，對2種指示菌的抑菌效果均以紫外線照射誘導抑菌圈的直徑最大，效果最好。與細菌注射法及饑餓法相比，紫外線照射法誘導的免疫血淋巴具有最好的抑菌效果，且操作簡單方便，適合大規(guī)模誘導，對一些個體較小、不宜進行注射的蜘蛛如角類肥蛛、卡氏毛園蛛以及其他小型動物體特別有效，是一種很好的抗菌物質誘導方法。權利要求1、一種誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌活性物質的方法，其特征在于步驟為a、紫外線照射誘導將角類肥蛛放于培養(yǎng)皿中，于20w紫外燈下距離1米處照射0.5-3h，然后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)；b、誘導后蜘蛛的飼養(yǎng)將經(jīng)紫外線照射的蜘蛛單頭飼養(yǎng)于φ4×12cm玻璃指管內，管底墊有吸足水的海綿供蜘蛛飲水，用棉花塞封口，然后將裝有蜘蛛的玻璃指管置于25℃培養(yǎng)箱中，光照周期為12∶12(Light∶Dark)，每2天清洗玻璃指管，并喂以果蠅(Drosophilasp.)和搖蚊(Tendipessp.)成蟲；c、采用組織勻漿法提取采集蜘蛛血淋巴將誘導后1-120h的蜘蛛用75％酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml離心管中，加入預冷的無菌水勻漿，當外界溫度較高時，還需加入1-5％的防止抗菌物質黑化的巰基乙醇，勻漿液于4℃、12000rpm離心20分鐘，去除上層脂肪，收集上清液置-20℃冰箱保存；d、以支氣管敗血博氏菌為指示菌，用涂平板打孔法，測定血淋巴的抗菌活性。2、根據(jù)權利要求1所述的一種誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌活性物質的方法，其特征在于所述的紫外線照射誘導是將角類肥蛛放于培養(yǎng)皿中，于20w紫外燈下距離l米處照射l一1.5h，然后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。3、根據(jù)權利要求1所述的一種誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌活性物質的方法，其特征在于所述的用組織勻漿法采集蜘蛛血淋巴是將經(jīng)紫外線照射誘導后25—70h進行。全文摘要本發(fā)明提出了一種簡便、高效的誘導蜘蛛產(chǎn)生抗菌活性物質的方法。其步驟為a.紫外線照射誘導將角類肥蛛放于培養(yǎng)皿中，于20w紫外燈下距離1米處照射0.5-3h，然后在正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)；b.將誘導后1-120h的蜘蛛用組織勻漿法提取采集蜘蛛血淋巴，c.以支氣管敗血博氏菌為指示菌，用涂平板打孔法，測定血淋巴的抗菌活性。經(jīng)紫外線照射誘導的蜘蛛提取的蜘蛛血淋巴抗菌活性最高，用該抗菌活性物質可以用于抗菌藥物的開發(fā)。文檔編號A61K35/56GK101233838SQ20081004687公開日2008年8月6日申請日期2008年2月4日優(yōu)先權日2008年2月4日發(fā)明者劉鳳想,宇彭,徐慧君,淼汪,焦曉國,建陳申請人:湖北大學