專利名稱：：一種治療艾滋病的藥物化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物化學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。涉及一種治療艾滋病的藥物，同時涉及該類藥物化合物的制備方法以及該類藥物化合物在制備治療或預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：艾滋病(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的嚴重疾病。HIV屬于RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，HIV對細胞的感染過程包括與宿主細胞溶合，DNA轉(zhuǎn)錄并整合入宿主細胞基因組，進行蛋白質(zhì)表達，最后組裝新病毒溢出細胞?？拱滩《舅幬锟梢酝ㄟ^抑制或阻斷病毒復(fù)制過程中的任何一個階段達到治療和緩解疾病的目的。目前抗HIV藥物主要包括三大類核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及蛋白酶抑制劑。核苷類似物是應(yīng)用最早、種類最多的一類，包括齊多夫定(zidovudine，AZT)，司他夫定(stavudine，d4T)等。這些藥物在抗HIV一l.感染和治療AIDS時，取得了一定的效果，但也表現(xiàn)出一定的毒副反應(yīng)，而且由于HIV—1的易變異性引發(fā)的耐藥問題，使其應(yīng)用受到限制。因此，發(fā)展新的治療策略或新型抗HIV藥物一直受到人們的廣泛關(guān)注。在過去，苯并咪唑類的核苷類似物被合成并表現(xiàn)出廣泛的抗病毒活性。然而，迄今為止，尚沒有苯并咪唑類核苷類似物的二聚體合成的報道，也沒有該類化合物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。.對于抗艾滋病藥物的篩選，體外細胞感染HIV—1活病毒模型是一種最常用的方法。細胞感染模型是直接的病毒抑制試驗?zāi)Ｐ?能客觀反映藥物對病毒復(fù)制的抑制作用,是現(xiàn)代藥物篩選和評價最常用的方法。該方法是以適量藥物處理細胞，同時用HIV活病毒感染測量病毒在藥物存在條件下的復(fù)制水平，以評估藥物抗病毒活性，但高成本和較長的實驗周期使大規(guī)模藥物篩選受到限制。人們以病毒復(fù)制的特異性功能活動或特定結(jié)構(gòu)作為耙點建立了靶向篩選系統(tǒng)，例如HIV—1膜融合抑制劑篩選系統(tǒng)，逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑篩選系統(tǒng)，蛋白酶抑制劑篩選系統(tǒng)，整合酶抑制劑篩選系統(tǒng)等。這類系統(tǒng)能不使用活細胞和活病毒直接評價藥物對特定靶標的作用，因此可以不必在嚴格的實驗條件下驗證藥物對特定耙標的作用，簡便快速并可實現(xiàn)高通量篩選。但是，該系統(tǒng)只適應(yīng)于相對應(yīng)的耙向藥物的篩選，對于未知靶向的藥物篩選缺乏廣譜性。因此,建立快速、高通量、低成本的篩選平臺成為藥物篩選的迫切要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種藥物化合物，該類化合物是一類苯并咪唑類的核苷類似物。該類化合物結(jié)構(gòu)新穎，目前尚未制備合成。.本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種藥物化合物的制備方法。該方法步驟較短，簡便易行，原料易得，操作方便。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種藥物化合物在作為制備治療或預(yù)防艾滋病的藥物中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明釆用如下技術(shù)方案I型化合物的合成本發(fā)明采用三步合成目標化合物，該藥物化合物結(jié)構(gòu)式如下<formula>seeoriginaldocumentpage4</formula>其中HOOCRCOOH代表二羧酸化合物，Ac代表乙?；?，R表示鏈狀烷烴，如-(CH2)n-，n=l-5，或l,4-苯基，或l,2-苯基，或2,6-吡啶基。本發(fā)明的一個實施例中，R為l，3-丙基。合成該類藥物化合物的方法包括以下步驟(1)苯并咪唑二聚體的合成將二酸與鄰苯二胺置于4N鹽酸中130°C-140℃反應(yīng)26-28小時，冷卻至20℃-25℃，過濾，將得到的固體中和后，過濾，將得到的固體干燥可得到苯并咪唑二聚體；(2)苯并咪唑二聚體與1,2,3，5-四-0-乙?；?,-呋喃核糖的反應(yīng)將苯并咪唑二聚體溶于乙腈中，向其中加入W,O—聯(lián)(三甲基硅烷基)乙酰胺，70℃-80℃反應(yīng)0.5-2小時，冷卻至20℃-25℃后，向其中加入1,2,3,5-四-(9-乙酰基-,-呋喃核糖和三甲基硅垸基三氟甲基磺酸70℃-80℃反應(yīng)3-5小時后，濃縮柱分離得到化合物2',3',5'—三一0—乙?；籰'-脫氧一l，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一β一D—呋喃核糖；(3)2',3',5'—三一O—乙?；籰'-脫氧一l，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一β一D—呋喃核糖脫去保護的反應(yīng)將化合物2'，3',5'—三一0—乙?；?'-脫氧一1，r一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一β一D—呋喃核糖溶于甲醇中，向其中加入甲醇鈉，室溫(20-25°C)反應(yīng)40-50小時，半小時內(nèi)蒸走溶劑，溶于乙酸乙酯中，用水洗，硫酸鈉干燥18-20小時，旋干，柱分離得到苯并咪唑類核苷類似物r-脫氧一i，r一聯(lián)(1—苯并咪唑)丙垸一β一D—呋喃核糖。一種藥物化合物作為制備治療或預(yù)防艾滋病藥物的應(yīng)用過程是為構(gòu)建假病毒模型，用到以下兩種質(zhì)粒pNL4-3Luc.R-E-(NIH)質(zhì)粒(Promega公司產(chǎn)品)為含有熒光素酶報告基因的缺陷型HIV復(fù)制子(帶有熒光素酶基因的HIV嵌合型質(zhì)粒)，將HIV病毒的env(包膜蛋白基因)突變；pGL4.73質(zhì)粒(Promega公司產(chǎn)品)作為內(nèi)標。將pNL4-3Luc.R-E-(NIH)質(zhì)粒和pGL4.73質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞(購于武漢大學(xué)菌種典藏中心)(人胚胎腎細胞系)中。細胞轉(zhuǎn)染與藥物作用(1)將HEK293T細胞培養(yǎng)于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞計數(shù)為2X105個，加入500W無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司產(chǎn)品)；(2)將0.8嗎pNL4-3Luc.R-E-與O.lugpGL4.73稀釋于50ulOptiMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司產(chǎn)品)；(3)同時將2μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000((Invitrogen公司產(chǎn)品)稀釋于50μ1OptiMEM培養(yǎng)基，20℃-25℃孵育5分鐘后，與稀釋有質(zhì)粒的培養(yǎng)基混勻，室溫(20-25℃)孵育20分鐘；(4)將質(zhì)粒(pNL4-3.Luc.R—E-和pGL4.73)與轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine2000)的混合物加入細胞培養(yǎng)孔，各孔細胞均按以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法處理；(5)將不同的化合物按相同的劑量(65μM)加入不同的細胞培養(yǎng)孔，孵育40-50小時后收獲細胞檢測藥物對HIV復(fù)制的影響。上述制備的小分子核苷類藥物的抗HIV活性檢測A熒光素酶檢測用熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)檢測熒光素酶活性i將收獲的各孔細胞，分別加入100^1的熒光素酶檢測裂解緩沖液裂解細胞15分鐘；ii細胞裂解液離心12000轉(zhuǎn)/分鐘，l分鐘；iii收集同一管的細胞裂解液上清均勻分至兩個干凈的離心管，分別加入50^1熒光素酶檢測試劑和海膽熒光素酶檢測試劑，混勻后置于熒光檢測儀(Turner公司產(chǎn)品，TD20/20)檢測熒光強度。BHIV病毒的p24蛋白檢測p24蛋白ELISA檢測試劑盒(購置于中科院病毒所)檢測HIV病毒的p24蛋白的表達水平i收獲的各孔細胞加入100^11%Triton-100裂解15分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心l分鐘收集上清；ii將細胞裂解上清分別加入包被有特異性抗p24蛋白單克隆抗體96孔細胞培養(yǎng)板，37。C孵育40分鐘后用0.01M的PBS沖洗細胞板；iii加入辣根過氧化物酶標記的抗p24蛋白的多隆抗體孵育30分鐘，用0.01M的PBS沖洗細胞板；iv加入辣根過氧化物酶顯色底物，室溫(20-25°C)孵育10分鐘后加入反應(yīng)終止液，吸光光度計采用450nm吸光波長檢測。發(fā)明優(yōu)點和效果本發(fā)明合成了新型結(jié)構(gòu)的核苷類小分子藥物并利用HIV假病毒模型對其進行活性篩選。該類藥物合成步驟較短。熒光素酶檢測結(jié)果如圖l所示，在相同的劑量(65nM)下，臨床藥物司他夫定(d4T)對HIV表現(xiàn)出46%的抑制率，齊多夫定(AZT)表現(xiàn)出61X的抑制率，而I型化合物(l'-脫氧一l，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙垸一^一D—呋喃核糖)具有57%的抑制率。p24蛋白結(jié)果如圖2所示，司他夫定(d4T)的抑制率為29%，齊多夫定(AZT)為24%，I型化合物為27%。l'-脫氧一l，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一^一D—呋喃核糖具有和臨床藥物AZT相當?shù)幕钚?，是一種有潛力的新型抗HIV小分子藥物。另外本發(fā)明構(gòu)建了HIV假病毒模型，該模型具有簡單易行、高安全性的優(yōu)點，可應(yīng)用于常規(guī)實驗室的安全藥物篩選。下面的表格為不同藥物對HIV病毒的抑制活性數(shù)據(jù)表<table><row><column></column><column>藥物</column><column>Blank</column><column>不加藥</column><column>AZT</column><column>d4T</column><column>I型化合物</column></row><row><column></column><column>熒光素酶活性</column><column>0.01676</column><column>3,90612</column><column>1.53224</column><column>2.09331</column><column>1.67843</column></row><row><column></column><column>p24蛋白表達量(％)</column><column>/</column><column>100</column><column>23</column><column>29</column><column>27</column></row><table>圖1為不同藥物與表達出的熒光素酶活性關(guān)系示意圖，其中，blank為未加病毒的空白對照，Nodmg為未加藥物的對照。圖2為不同藥物與p24蛋白的表達量關(guān)系示意圖，其中，Control為未加藥物的對照。具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步對本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容進行說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例ir-脫氧一i，r一聯(lián)(i-苯并咪唑)丙烷一刀一D—呋喃核糖(i)的合成(1)i，r一聯(lián)(i-苯并咪唑)丙垸(n)的制備將丙二酸(1.34g,10mmol)與鄰苯二胺(2.2g,20mmol)置于4N鹽酸(50ml)中130℃-140℃反應(yīng)27小時。冷卻至20℃-25℃，過濾。將得到的固體中和后，過濾。將得到的固體20℃-25℃干燥可得到白色粉末1.9g(產(chǎn)率69%)。1HNMR(DMSO-d6，300MHz)S7.47(m,4H)，7.13-7.10(m,4H)，2,91(t,J=7.2Hz,4H),2.29(q,J=7.2Hz:2H)。結(jié)構(gòu)式如下<formula>seeoriginaldocumentpage8</formula>(2)2',3',5'—三一0—乙?；?'-脫氧一1，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一β一D一呋喃核糖(III)的制備氮氣保護下，將1，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙垸(276mg,1mmol)溶于乙腈(30mL)中，向其中加入N，o—聯(lián)(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA，0.58mL，2.4mmo1)，70℃-80℃反應(yīng)1小時。冷卻至20℃-25℃后，向其中加入1，2，3,5-四-<9-乙?；?-呋喃核糖(TAR，640mg,2mmol)和三甲基硅烷基三氟甲基磺酸(TMSOTf，0.45mL,2.5mmol)70。C-80℃反應(yīng)4小時后，濃縮柱分離得到黃色固體243mg(產(chǎn)率31%)。NMR(CDC13,300MHz)57.73(d，J=7.5Hz，2H),7.60(d,J=7.8Hz,2H),7.25(m，4H),6.12(d,J=6.9Hz,2H),5.58(t,J=6.9Hz，2H)，5.46(dd,力=4.2Hz,力=6.6Hz,2H),4.43(d，J=3.0Hz,4H),4.23(m,2H)，3.15(m,4H),2.59(m,2H),2.22(s，6H),2.15(s,6H),1.86(s,6H);13CNMR(CDC13,75MHz)S170.2,169.5,169.2,154.0,142.9,132.6,122.7,119.4，111.5,86.3,79.8,70.9,69.3,62.9，26.4,24.7,20,7,20.5,19.9.HRMS(ESI):793.2930for[M+H]+(calcd:793.2927forC39H45014N4)。結(jié)構(gòu)式為<formula>seeoriginaldocumentpage8</formula>其中Ac代表乙?；?3)l'-脫氧一l，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷β-D-呋喃核糖(I)的制備將2'，3',5'—三一o—乙?；?‘-脫氧一1，1’一聯(lián)(1-苯并咪唑)丙烷一β—D—呋喃核糖(166mg,0.21mmol)溶于甲醇(lOmL)中，向其中加入甲醇鈉(452mg,4.2mmol)，室溫(20-25°C)反應(yīng)48小時，半小時內(nèi)蒸走溶劑，溶于乙酸乙酯(150mL)中，用水(3x50mL)洗。硫酸鈉干燥20小時，旋干。柱分離得到白色固體100mg(產(chǎn)率88%)。NMR(CDCl3/DMSO-d6,300MHz)S7.68(m，2H)，6.82(m,4H),6.69(m,2H),6.00(d，J=6.0Hz,2H),4.89(bs,2H),4.55(m，2H),4.26(m，2H),3.96(m，4H),3.76(m,2H),3.20(m，4H),2.69(m,2H);"CNMR(DMSO-66,75MHz)5160.2，148.0,138.5,127.3，123.9,118.5，93.7,91.2,77.0，75.1,66.8,32.1,30.5.HRMS(ESI):541.2298for[M+H]+(calcd:541.2293forC27H3308N4)。結(jié)構(gòu)式為<formula>seeoriginaldocumentpage9</formula>實施例2為構(gòu)建假病毒模型，用到以下兩種質(zhì)粒pNL4-3丄uc.R-E-(NIH)質(zhì)粒為含有熒光素酶報告基因的缺陷型HIV復(fù)制子，將HIV病毒的^v(包膜蛋白基因)突變；pGL4.73質(zhì)粒(Promega公司產(chǎn)品)作為內(nèi)標。將二者共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞(人胚胎腎細胞系)中。實施例3細胞轉(zhuǎn)染與藥物作用(1)將HEK293T細胞培養(yǎng)于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞計數(shù)為2X105個，加入500W無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司產(chǎn)品)；(2)將0.8pgpNL4-3丄uc.R—E—與O,lpgpGL4.73稀釋于50piOptiMEM培養(yǎng)基(Invi加gen公司產(chǎn)品)；(3)同時將2ixl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000((Invitrogen公司產(chǎn)品)稀釋于50plOptiMEM⑧培養(yǎng)基，室溫(20-25°C)孵育5分鐘后，與稀釋有質(zhì)粒的培養(yǎng)基混勻，室溫孵育20分鐘；(4)將質(zhì)粒(pNL4-3丄uc.R-E-和pGL4.73)與轉(zhuǎn)染試劑的混合物加入細胞培養(yǎng)孔，各孔細胞均按以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法處理；.(5)將不同的化合物按相同的劑量(65pM)加入不同的細胞培養(yǎng)孔，孵育48小時后收獲細胞檢測藥物對HIV復(fù)制的影響。實施例4熒光素酶檢測用熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)檢測熒光素酶活性i將收獲的各孔細胞，分別加入100^1的熒光素酶檢測裂解緩沖液裂解細胞15分鐘；ii細胞裂解液離心12000轉(zhuǎn)/分鐘，l分鐘；iii收集同一管的細胞裂解液上清均勻分至兩個干凈的離心管，分別加入50ul熒光素酶檢測試劑和5(Hil海膽熒光素酶檢測試劑，混勻后置于熒光檢測儀(Turner公司產(chǎn)品，TD20/20)檢測熒光強度。實施例5HIV病毒的p24蛋白檢測p24蛋白ELISA檢測試劑盒(購置于中科院病毒所)檢測HIV病毒的p24蛋白的表達水平i收獲的各孔細胞加入100pll%Triton-100裂解15分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘收集上清；ii將細胞裂解上清分別加入包被有特異性抗p24蛋白單克隆抗體96孔細胞培養(yǎng)板，37r孵育40分鐘后用0.01M的PBS沖洗細胞板；iii加入辣根過氧化物酶標記的抗p24蛋白的多隆抗體孵育30分鐘，用0.01M的PBS沖洗細胞板；iv加入辣根過氧化物酶顯色底物，室溫孵育10分鐘后加入反應(yīng)終止液，吸光光度計采用450nm吸光波長檢測。權(quán)利要求1、由下述化合物結(jié)構(gòu)式(I)其中R表示-(CH2)n-，n＝1-5，或1，4-苯基，或1，2-苯基，或2，6-吡啶基。2、一種制備權(quán)利要求1所述的I型化合物的方法，其步驟是A、苯并咪唑二聚體的合成將二酸與鄰苯二胺置于4N鹽酸中回流反應(yīng)26-28小時，冷卻至20°C-25°C，過濾，將得到的固體中和后，過濾，將得到的固體干燥可得到苯并咪唑二聚體；B、苯并咪唑二聚體與1,2,3,5-四-(9-乙酰基-刀-呋喃核糖的反應(yīng)將苯并咪唑二聚體溶于乙腈中，向其中加入7V，o—聯(lián)(三甲基硅烷基)乙酰胺，70。C-8(TC反應(yīng)0.5-2小時，冷卻至2(TC-25。C后，向其中加入1，2,3,5-四-<9-乙?；?刀-呋喃核糖和三甲基硅垸基三氟甲基磺酸7(TC-80。C反應(yīng)3-5小時后，濃縮柱分離得到化合物2',3',5'—三一0—乙?；籸-脫氧一l，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙垸一刀一D一呋喃核糖；C、2',3',5'—三一0—乙?；?'-脫氧一1，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一^—D—呋喃核糖脫去保護的反應(yīng)將化合物2',3',5'—三一0—乙?；籰'-脫氧一l，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一"一D—呋喃核糖溶于甲醇中，向其中加入甲醇鈉，室溫(20-25°C)反應(yīng)40-50小時，半小時內(nèi)蒸走溶劑，溶于乙酸乙酯中，用水洗，硫酸鈉干燥18-20小時，旋干，柱分離得到苯并咪唑類核苷類似物l'-脫氧一1，l'一聯(lián)(l-苯并咪唑)丙烷一^一D—呋喃核糖。3、權(quán)利要求書1所述的一種化合物在制備治療或預(yù)防抗艾滋病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種治療艾滋病的藥物化合物及其制備方法和應(yīng)用，化合物結(jié)構(gòu)式(I)表示的小分子藥物，其中R表示，-(CH₂)_n-，n＝1-5，或1，4-苯基，或1，2-苯基，或2，6-吡啶基。其中I型化合物由三步反應(yīng)得到首先鄰苯二胺與二酸反應(yīng)得到苯并咪唑二聚體，然后它與五元糖反應(yīng)，再通過脫保護可得到終產(chǎn)物。化合物合成后，通過構(gòu)建HIV假病毒模型對其活性進行檢測。結(jié)果顯示，苯并咪唑核苷類化合物具有抗HIV活性，結(jié)果表明，該化合物可用于治療或預(yù)防艾滋病。文檔編號A61K31/7056GK101343303SQ20081004891公開日2009年1月14日申請日期2008年8月19日優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日發(fā)明者俊劉,翔周,李國瑞,章曉聯(lián)申請人:武漢大學(xué)