專利名稱：：卷柏降血脂有效部位及其提取方法和應用以及穗花衫雙黃酮的提取方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及了一種從巻柏脂溶性部位提取降血脂有效部位——乙酸乙酯部位，同時，還涉及該有效部位的提取方法和應用；另外，還涉及一種該乙酸乙酯有效部位經(jīng)進一步提取制得穗花衫雙黃酮的提取方法。
背景技術：
：高脂血癥(Hyperlipaemia，HLP)主要是指血清總膽固醇(TC)或甘油三酯(TG)水平過高和/或血清高密度脂蛋白——膽固醇(HDL-C)水平過低。高脂血癥是中老年的常見病和多發(fā)病，隨著人們生活水平的提高和生活習慣的改變，該病的發(fā)病率明顯增加，發(fā)病的年齡也有所提前。高脂血癥所引起的動脈粥樣硬化是造成冠心病、高血壓和腦血管疾病的主要原因，嚴重危害到了人類的生命健康。目前，西藥調節(jié)血脂雖有肯定的療效，但有不同程度的副作用，且作用靶點單一。西藥他汀類是目前公認為調脂最有效并廣泛應用的藥物，但具有肝臟和肌肉毒性等副作用。近年來，中藥調血脂以其療效好、副作用小的優(yōu)勢而成為研究的熱點。巻柏為蕨類植物門巻柏科(Selaginellaceae)巻柏屬(&/ag/"e〃")植物，約有700種，廣泛分布于全世界。我國約有50種，盛產于全國各地。2005年版《中華人民共和國藥典》收載了兩個品種巻柏5Wflgz力e〃atoman'sc/wa(Beauv.)Spring;墊裝巻柏S.;w/v/wata(Hook.etGrev.)Maxim.。巻柏是我國傳統(tǒng)中藥材，早在《本經(jīng)》中就有記載，列為上品，功能為活血通經(jīng)，破血散結。巻柏全草入藥，巻柏作為民間傳統(tǒng)中藥材，藥用歷史悠久。由于傳統(tǒng)藥物的服用方法多為水煎煮法，現(xiàn)代藥理研究也多用水煎煮液整體研究，發(fā)現(xiàn)水煎液在抗腫瘤、免疫、止血等方面均有很好的藥理活性。但對其脂溶性部位研究較少，特別是在降血脂方面的研究尚未見報道。穗花杉雙黃酮(Amentoflavone)又名阿曼托雙黃酮，是一種從天然植物中分離純化得到的雙黃酮類化合物，分子式為C3oH1801()，分子量538，植物來源廣泛，藥理活性明顯。在很多種中草藥如銀杏葉、貫葉連翹中均存在，而巻柏(包括巻柏、墊裝巻柏、中華巻柏和江南巻柏等)中穗花杉雙黃酮的含量又遠遠高于其他中草藥。文獻報道穗花杉雙黃酮具有抗病毒、抗炎、抗癲癇、神經(jīng)細胞保護、促(^2+釋放活性等活性。目前，穗花杉雙黃酮的提取方法工藝過程較為繁鎖，成本也相對較高。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種從巻柏脂溶性部位提取得到巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位。同時，本發(fā)明的目的還在于提供一種該巻柏降血脂有效部位的提取方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種該巻柏降血脂有效部位在降血脂方面的應用。本發(fā)明的目的還在于提供了一種可以利用該巻柏降血脂有效部位經(jīng)進一步提取制備穗花衫雙黃酮的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案采用了一種巻柏降血脂有效部位，該有效部位為巻柏經(jīng)丙酮水提取后經(jīng)濃縮并用乙酸乙酯萃取而得的乙酸乙酯部位。本發(fā)明的技術方案還在于采用了一種巻柏降血脂有效部位的提取方法，包括以下步驟將巻柏全草用丙酮與水的混合液在室溫下浸提2—4次，每次6—9天，后經(jīng)過濾，合并濾液減壓，壓強為0.1—0.15Mpa，回收溶劑得濃縮的提取物，將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位。所述的丙酮與水的體積比為丙酮水=(6—8):(2—4)。進一步講，本發(fā)明的技術方案還采用了一種穗花衫雙黃酮的提取方法，其由巻柏降血脂有效部位經(jīng)進一歩提取而制得，具體包括以下步驟將巻柏全草用丙酮與水的混合液在室溫下浸提2—4次，每次6—9天，后經(jīng)過濾，合并濾液減壓，壓強為0.1—0.15Mpa，回收溶劑得濃縮的提取物，將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位；將制得的乙酸乙酯部位進行硅膠常壓柱層析，用石油醚一丙酮按體積比為10:1—7:3梯度洗脫，TLC檢測合并含有穗花衫雙黃酮部分，在SephadexLH-20柱色譜以丙酮進行洗脫，得到穗花衫雙黃酮。所述的硅膠為200—300目。另外，本發(fā)明的技術方案還采用了巻柏降血脂有效部位在降血脂方面的應用。本發(fā)明的巻柏降血脂有效部位是從巻柏脂溶性部位提取得到，巻柏在自然界中分布很廣泛，這就使得本發(fā)明的原料易得，成本很低。另外，本發(fā)明的提取方法工藝過程簡單，易操作。實驗表明利用本發(fā)明的巻柏降血脂有效部位經(jīng)過進一步提取得到的穗花衫雙黃酮具有很好的降血脂作用。體內實驗表明能降低高脂血癥小鼠的血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，來降低血脂水平。本發(fā)明穗花衫雙黃酮具有較高的提取率，一次提取率可高達30%—40%。采用本發(fā)明的巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位進一步制備而得的單體化合物經(jīng)鑒定為穗花衫雙黃酮，其結構式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>穗花衫雙黃翻Amentoflavone圖1為穗花衫雙黃酮標準品質量與峰面積的標準曲線圖；圖2為樣品含量測定色譜圖。具體實施方式實施例1本實施例為巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位的制備方法，具體步驟如下取干燥巻柏全草，用丙酮與水按體積比為7:3冷浸3次，每次7天，過濾，合并濾液減壓(壓強為0.1Mpa)回收溶劑得濃縮提取物，將得到的濃縮提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。實施例2本實施例為穗花衫雙黃酮的提取方法，具體步驟如下取實施例l制得的乙酸乙酯部位，進行硅膠常壓柱(200-300目)層析，石油醚-丙酮按體積比為10:1、8:2和7:3進行梯度洗脫(每個梯度洗脫5個柱體積，速度為5ml/秒)，TLC檢測合并含有穗花衫雙黃酮部分，在SephadexLH-20柱色譜以丙酮進行洗脫，得到穗花衫雙黃酮純品。結構鑒定化合物穗花衫雙黃酮，EIMSm/z:538(]VT),270,121;'H-NMR(DMSO-^)5:13.10(1H，s,5-OH)，13.00(1H,s,5"-OH)，6.83(1H，s,H-3),6.21(1H,d，/=2.0Hz，H-6)，6.48(1H,d,聲2.0Hz,H畫8),8.03(1H，s，H-2'),7.17(1H,d，《/=9.3Hz,H畫5')，8.01(1H，d，^9.3Hz，H-6'),6.80(1H，s,H-3"),6.42(1H,s,H-6"),7.59(2H，d,>/=8.8Hz,H-2"'，6"'),6.74(2H,d,/=8.8Hz,H-3"'，5'").13C-NMR(DMSOOS:163.8(C-2),102.9(C-3),181.7(C畫4),161.5(C畫5),98.9(C-6),164.1(C國7),94.0(C畫8),157.4(C-9)，103.7(C-IO)，121.0(C-1132.3(C畫1'),127.8(C隱2'),120.0(C-4'),116.2(C-5'),131.4(C-6'),163.7(C-2"),102.6(C國3"),182.1(C-4"),160.5(C-5"),98.6(C-6"),161.9(C-7"),104.0(C畫8"),154.5(C隱9")，103.7(C畫10"),121.4(C-l'"),128.2(C-2"'),115.8(C-3"')，161.0(C-4'"),115.8(C畫5'"),128.2(C畫6"')。實施例3本實施例為巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位及穗花衫雙黃酮在降血脂方面的應用例。體內降血脂抗氧化試驗動物昆明小鼠，空腹體重為23士2g，全部雄性。由河南省醫(yī)學動物實驗中心提供。材料與試劑巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位、穗花衫雙黃酮由河南大學天然藥物研究所制備提供。決明子降脂片，吉林吉春制藥有限公司批號070501。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供?？偰懝檀?TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒，北京中生生物工程高技術公司提供。試驗方法高脂乳劑的配制豬油40g、膽固醇20g、丙硫氧嘧啶lg、2g膽鹽(配成10%溶液)、丙二醇2ml和吐溫801ml，加水至100ml，超生30min。動物分組與處理取50只小鼠，平均體重23士2g，按實驗要求分為正常對照組，高脂模型組，給藥組(包括穗花衫雙黃酮給藥組和巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位給藥組)，陽性對照組(決明子降脂片)。正常對照組動物上午ig(灌胃)給于蒸餾水，下午ig0.5%CMC-Na，高脂模型組均于每天上午ig給于高脂乳劑(0.2ml/10g*d)，下午ig0.5%CMC-Na，給藥組分別于每天上午ig給于高脂乳劑(0.2ml/10g*d)，下午ig給藥，給藥量見表2。20天后，各組小鼠均禁食12h，眼底靜脈叢取血，離心分離血清用于血脂及SOD、MDA的測定。表1動物分組與處理<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>指標測定方法TC，TG，LDL-C，HDL-C，MDA，SOD的測定按試劑盒說明方法進行。數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)x土s表示，實驗統(tǒng)計采用spsslO.O統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。結果巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位和化合物穗花衫雙黃酮對高脂血癥小鼠血脂的影響，結果見表2。與高脂模型對照組相比巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位、化合物穗花衫黃酮血漿中TC、LDL-C均有所降低，數(shù)據(jù)差異有顯著意義，HDL-C有顯著提高，TG無顯著影響；陽性對照組血漿中TC、LDL-C均有顯著性降低。與陽性藥組相比巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位給藥組、化合物穗花衫黃酮組能更加顯著的提高血漿中HDL-C的水平。表2巻柏降血脂有效部位——乙酸乙酯部位與穗花衫雙黃酮對營養(yǎng)性高脂血癥小鼠血脂的作用(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與模型組比較'p<0.001，P<0.01,P<0.05與空白組比較AMP<0.001，MP<0.01，;、P<0.05以上結果可知在穗花衫雙黃酮的用量為乙酸乙酯部位二分之一時，二者對高脂血癥小鼠血脂的作用基本相當，對乙酸乙酯部位中穗花衫雙黃酮的含量測定，發(fā)現(xiàn)穗花衫雙黃酮在乙酸乙酯部位的含量為31.64%，由此可知乙酸乙酯部位的主要有效成分是穗花衫雙黃酮。以下是對乙酸乙酯部位中穗花衫雙黃酮的含量測定。HPLC法測定儀器與試劑儀器島津LC-2010高效液相色譜儀，UV-2010A檢測器，自動進樣器，四元低壓梯度泵，CLASS-vp色譜工作站，AL-104型電子天平(梅特勒一托利多)，KQ3200型超聲波清洗器。試劑甲醇(色譜純，廠家)，高純水，磷酸為分析純，穗花山雙黃酮標準品為天然產物研究所自制，純度98%。色譜條件RP-18色譜柱(4.6mmx250mm,5pm)，Merck公司生產；流動相甲醇0.1%磷酸水溶液(65:35)，流速0.8ml/min;檢測波長337nm;柱溫25°C，定量方法為外標峰面積法。標準曲線的制定精密稱取標準品1.2mg于10ml容量瓶中，搖勻備用。取一定量用過濾器(0.45pm)過濾得0.12mg/ml標準品溶液，分別進樣1pl、3^1、5pl、7^1、10^1，將所得峰面積對雙黃酮質量進行線性回歸，得標準曲線Y=5E+06X-10436,r=1.000，線性范圍為0.12嗎~1.2嗎。結果見表4，據(jù)表4做標準曲線，見圖l。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>樣品測定精密稱取3mg乙酸乙酯有效部位至于10ml容量瓶中，加入甲醇8ml，超聲使溶解，定容至10ml，過濾(0.45|im)的樣品溶液。平行6份，含量測定色譜圖見圖2，其中A為標準品色譜圖，B為樣品色譜圖。結果平均含量為31.64%，i^D=0.75%。本發(fā)明還分別測定了巻柏、墊裝巻柏、江南巻柏、中華巻柏等巻柏屬巻柏中穗花衫雙黃酮的含量，結果如表5所示。表5不同種巻柏屬植物中穗花衫雙黃酮的含量植物_穗花衫雙黃酮百分含:湖南產巻柏0.51%西藏產墊裝巻柏0.36%江南巻柏0.31%中華巻柏0.42%最后所應說明的是以上實施例僅用以說明，而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。權利要求1、一種卷柏降血脂有效部位，其特征在于該有效部位為卷柏經(jīng)丙酮水提取后經(jīng)濃縮并用乙酸乙酯萃取而得的乙酸乙酯部位。2、一種如權利要求l所述的巻柏降血脂有效部位的提取方法，其特征在于包括以下步驟將巻柏全草用丙酮與水的混合液在室溫下浸提2—4次，每次6—9天，后經(jīng)過濾，合并濾液減壓回收溶劑得濃縮的提取物，將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位。3、根據(jù)權利要求2所述的巻柏降血脂有效部位的提取方法，其特征在于所述的丙酮與水的體積比為丙酮水=(6—8):(2—4)。4、穗花衫雙黃酮的提取方法，其特征在于包括以下步驟將巻柏全草用丙酮與水的混合液在室溫下浸提2—4次，每次6—9天，后經(jīng)過濾，合并濾液減壓回收溶劑得濃縮的提取物，將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取2—4次，得巻柏降血脂有效部位，即乙酸乙酯部位；將制得的乙酸乙酯部位進行硅膠常壓柱層析，用石油醚一丙酮按體積比為10:1—7:3梯度洗脫，TLC檢測合并含有穗花衫雙黃酮部分，在SephadexLH-20柱色譜以丙酮進行洗脫，得到穗花衫雙黃酮。5、根據(jù)權利要求4所述的穗花衫雙黃酮的提取方法，其特征在于所述的硅膠為200_300目。6、一種如權利要求1所述的巻柏降血脂有效部位在降血脂方面的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種卷柏降血脂有效部位及其制備方法和應用，該有效部位為卷柏經(jīng)丙酮水提取后經(jīng)濃縮并用乙酸乙酯萃取而得的乙酸乙酯部位。本發(fā)明的卷柏降血脂有效部位是從卷柏脂溶性部位提取得到，卷柏在自然界中分布很廣泛，這就使得本發(fā)明的原料易得，成本很低。另外，本發(fā)明的提取方法工藝過程簡單，易操作。實驗表明利用本發(fā)明的卷柏降血脂有效部位經(jīng)過進一步提取得到的穗花衫雙黃酮具有很好的降血脂作用。體內實驗表明能降低高脂血癥小鼠的血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，來降低血脂水平。本發(fā)明穗花衫雙黃酮具有較高的提取率，一次提取率可高達30％-40％。文檔編號A61K31/352GK101606955SQ20081005005公開日2009年12月23日申請日期2008年6月18日優(yōu)先權日2008年6月18日發(fā)明者姬志強,康文藝,賀光東,郭曙光申請人:河南大學