專利名稱：過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種過(guò)氧化物酶模擬物的載藥微球，特別是涉及一種可生物降解的 聚酯包裹的過(guò)氧化物酶模擬物的載藥微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
亞血素六肽(Deuterohemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys， DhHP-6)是以微酶和天 然抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)為依據(jù)，設(shè)計(jì)的一種含亞血紅素的短肽模擬酶，(中國(guó)專 利02144902.3，授權(quán)公告號(hào)CN1199986C)是一種較好的過(guò)氧化物酶模擬物。該 短肽SMS分子量小于3000，可發(fā)展成高效的抗氧化藥物。但是，其生物利用率低， 易受蛋白酶降解。
聚乙二醇(PEG)是一種親水性、生物相容性趕的無(wú)毒聚合物，其結(jié)構(gòu)通式為 H (0CH2CH) nOH，其中50》n>4，其分子量為200至20000道爾頓不等。經(jīng) PEG化學(xué)偶聯(lián)修飾的DhHP-6能夠有效的提高其生物利用率，延長(zhǎng)其在生物體內(nèi)的 半衰期。隨著PEG-DhHP-6偶聯(lián)物中PEG分子量的增加，PEG-DhHP-6半衰期可 由幾小時(shí)延長(zhǎng)至幾天。如果想進(jìn)一步延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，則需要考慮進(jìn)一步使用其 它技術(shù)，如將藥物制成緩釋劑型。
乳化一溶劑揮發(fā)法因其設(shè)備要求低，操作方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于藥物緩釋 劑型的制備當(dāng)中，目前國(guó)內(nèi)外有大量相關(guān)專利及報(bào)道。其中使用較多的聚合物包括 聚乳酸(PLA)和聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有良好的生物相容性和生物降解性的過(guò)氧化物酶 模擬物聚酯載藥微球，其是以聚乳酸(PLA)或聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)作為包 覆材料，所載過(guò)氧化物酶模擬物以微區(qū)形式分布于整個(gè)微球之中，所制得的載藥微 球表面光滑，微球之間不粘連，直徑分布均勻中，載藥微球中過(guò)氧化物酶模擬物的 包封率超過(guò)90%，載藥量0.5%~13% (wt%)，載藥微球的平均粒徑為10~35y m。 其中平均粒徑通過(guò)測(cè)量掃描電鏡照片中不同區(qū)域的100個(gè)微球的直徑，通過(guò)計(jì)算求 得。
本專利所述的生物可降解過(guò)氧化物酶模擬物載藥微球，是以聚酯即聚乳酸或聚 乳酸一羥基乙酸為包覆材料。過(guò)氧化物酶模擬物為亞血紅素六肽DhHP-6或亞紅素六肽的聚乙二醇偶聯(lián)物PEG-DhHP-6，其結(jié)構(gòu)如下，其制備方法詳見(jiàn)中國(guó)專利: 200810050307.7，公開(kāi)號(hào)C謂1220084A。<formula>formula see original document page 5</formula>
其中R二H或聚乙二醇(PEG),聚乙二醇鏈的分子量為2000~20000c
作為優(yōu)選的實(shí)施方式，上述生物可降解過(guò)氧化物酶模擬物聚酯載藥微球所用的 聚乳酸的分子量為5000~40000g/mol,所制得的載藥微球中，過(guò)氧化物酶模擬物的 包封率超過(guò)90%，載藥量0.5%~13% (wt%)，載藥微球的平均粒徑為10~35nm， 緩釋時(shí)間20~60天；
所用的聚乳酸一羥基乙酸共聚物的分子量為5000~40000g/mol，共聚物中乳酸 占乳酸和羥基乙酸鏈段總摩爾數(shù)和的10~90%，所制得的載藥微球中，過(guò)氧化物酶 模擬物的包封率超過(guò)90%，載藥量0.5。/。 13。/。(wt。/。)，載藥微球的平均粒徑為10~35 y m，緩釋時(shí)間16~48天；
更優(yōu)選的實(shí)施方式中，共聚物中聚乳酸與羥基乙酸鏈段的摩爾比為10: 90、 20:
80、 30: 70、 40: 60、 50: 50、 60: 40、 70: 30、 80: 20、 90: 10;
最優(yōu)選的實(shí)施方式中，共聚物中聚乳酸與羥基乙酸鏈段的摩爾比為為50: 50;
用于制備上面所述的生物可降過(guò)氧化物酶模擬物載藥微球的方法，具體步驟如
下
a) 以二氯甲烷為溶劑，將聚乳酸或聚乳酸一羥基乙酸共聚物充分溶解于二氯 甲烷中，配制成100~500mg/ml的溶液；
b) 將過(guò)氧化物酶模擬物固體粉末溶解于濃度為0.1~1g/ml的明膠溶液中，形 成濃度為10~200mg/ml的過(guò)氧化物酶模擬物明膠溶液；c) 在12000~15000rpm的高速攪拌下，將步驟b所得到的過(guò)氧化物酶模擬物 明膠溶液注入到步驟a所得到的聚合物溶液中，均勻分散，形成W/0的
初乳液，過(guò)氧化物酶模擬物明膠溶液與聚合物溶液的體積比為1: 5~10;
d) 將聚乙烯醇溶解于蒸餾水中，制成卜2.5wt。/Q的聚乙烯醇水溶液；
e) 將步驟c所得的W/0初乳液在2000~3000rpm的攪拌速度下，注入到步 驟d所得的聚乙烯醇水溶液中，該水溶液與W/0初乳液的體積比為20 ~ 50: 10，經(jīng)乳化形成W/0/W乳液，500 1000rpm下攪拌至二氯甲烷全部
揮發(fā)，使微球固化形成微球懸浮液；將獲得的微球懸浮液離心，收集，并 用蒸餾水洗滌數(shù)次，經(jīng)凍干后即可得到過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚 酯載藥微球。所得微球于冰箱內(nèi)冷凍保存。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
1. 本發(fā)明所載藥物過(guò)氧化物酶模擬物是一種水溶性生物藥物，并釆用明膠作為 輔料，有利于提高載藥微球的包封率。
2. 可通過(guò)調(diào)節(jié)所用聚合物的分子量來(lái)控制載藥微球的藥物釋放時(shí)間以及載藥 微球的粒徑大小。
3. 本發(fā)明方法采用水包油包水(W/0/W)乳化-溶劑揮發(fā)法，操作簡(jiǎn)單。
4. 本發(fā)明所述的DhHP-6及PEG—DhHP-6的用途是用于制備抗氧化藥物， 抗衰老藥物。
本發(fā)明制備的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球，過(guò)氧化物酶模擬 物的包封率超過(guò)90%，達(dá)到了《中華人民共和國(guó)藥典》中對(duì)于微球緩釋制劑中對(duì)藥 物包封率的要求。在保證一定的包封率的前提下，通過(guò)制備工藝的控制，制得了表 面光滑的微球，且微球之間不粘連，微球尺寸為10~35pm，直徑分布均勻，并具 有顯著的緩釋作用。


圖1: DhHp-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖中直線為對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合所得直線，擬合
得到的直線方程為:Y=0.07109 + 37.71505X， r>0.999;
圖2: PEG5。orDhHP-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖中直線為對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合所得直 線，擬合得到的直線方程為Y=0.06105 + 35.2413X， r>0.999;
圖3: PLA (5000)載PEG咖o-6P微球(實(shí)施例3)的掃描電鏡照片；圖中所用掃描模式為L(zhǎng)EI，標(biāo)尺為10um;
圖4: DhHP-6在PLA (5000)微球中的體外緩釋曲線；其緩釋時(shí)間為20天， 其中第一天釋放了所載藥量的約50%，其后開(kāi)始勻速釋放，最終累積釋放量約90%
圖5: DhHP-6在PLGA(2500-2500)微球中的體外緩釋曲線；其緩釋時(shí)間為 17天，其中第一天釋放了所載藥量的約50%，其后開(kāi)始勻速釋放，最終累積釋放量 約90%
圖6: PEG咖。一DhHP-6在PLA(5000)微球中的體外緩釋曲線；其緩釋時(shí)間 為31天，其中第一天釋放了所載藥量的約10%，其后開(kāi)始勻速釋放，最終累積釋 放量約98%
圖7: PEG5000—DhHP-6在PLGA(2500-2500)微球中的體外緩釋曲線；其緩 釋時(shí)間為21天，其中第一天釋放了所載藥量的約10%，其后開(kāi)始勻速釋放，最終 累積釋放量約98%
具體實(shí)施例方式
本專利中所用聚乳酸，聚乳酸一羥基乙酸購(gòu)自山東醫(yī)療器械研究所； 所用過(guò)氧化物酶模擬物DhHP-6由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供(制備方法參見(jiàn) 中國(guó)專利02144902.3，授權(quán)公告號(hào)CN1199986C)， PEG — DhHP-6為本實(shí)驗(yàn)室 合成，(其制備方法參見(jiàn)中國(guó)專利200810050307.7，公開(kāi)號(hào)CN101220084A)。 上述產(chǎn)品來(lái)源穩(wěn)定，質(zhì)量均一。 所用聚乙烯醇購(gòu)自Aldrich;
掃描電鏡照片使用島津JSM—6700型掃描電子顯微鏡測(cè)量; 溶液吸光度使用UV2501PC型紫外可見(jiàn)光譜儀測(cè)量；
包封率和藥物隨時(shí)間累計(jì)釋放量，分別根據(jù)用過(guò)氧化物酶模擬物粉末配制的標(biāo) 準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線算得(附圖1， 2)。
用于計(jì)算釋藥曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方式為準(zhǔn)確稱取5mg過(guò)氧化物酶模擬物 固體粉末，以pH=7.4的磷酸緩沖液為溶劑。用容量瓶將過(guò)氧化物酶模擬物溶液準(zhǔn) 確定容至100ml，為標(biāo)準(zhǔn)溶液1，然后，將標(biāo)準(zhǔn)溶液1分別準(zhǔn)確稀釋至50倍、100 倍、500倍、1000倍、5000倍，按順序分別記為標(biāo)準(zhǔn)溶液2-6。用紫外可見(jiàn)光譜儀 測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液1一6的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖1， 2)。
微球載藥量及包封率的計(jì)算方法是，準(zhǔn)確稱取10mg載藥微球，加5ml二氯甲 垸振蕩溶解微球，再加入10mlpH二7.4的磷酸緩沖液振蕩萃取，靜置，待溶液分層 后，取上層澄清溶液測(cè)吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微球載藥量。微球包封率=(投入的藥物總質(zhì)量-微球載藥量X得到微球的質(zhì)量)/投入的藥物總質(zhì)量X100。/。。
繪制緩釋曲線時(shí)，將制得的過(guò)氧化物酶模擬物載藥微球分為若干份，每份10mg， 分別置于透析袋中，加10mlpH二7.4的磷酸鹽緩沖液，兩端扎緊，放入90mlpH二 7.4的磷酸鹽緩沖液中，每隔一定時(shí)間，將透析袋中微球取出，離心后，加5ml二氯 甲垸振蕩溶解微球，再加入10mlpH二7.4的磷酸緩沖液振蕩萃取，靜置，待溶液分 層后，取上層澄清溶液測(cè)吸光度，并跟據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋藥量。累積釋藥百分率=(微 球載藥量-微球中殘留藥品質(zhì)量)/微球載藥量X100%。至樣品中過(guò)氧化物酶模擬物 的濃度不再隨著時(shí)間增加而增大時(shí)，認(rèn)為釋放完全。整個(gè)過(guò)程所持續(xù)的時(shí)間既為釋 放時(shí)間。
實(shí)施例1:
將PLA (5000g/mol) 1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物溶液。將0.2g 明膠加入1ml水中，加熱溶解，向這一明膠溶液中，加入10mg DhHP-6，攪拌溶解。 將得到的10mg/ml的DhHP-6明膠溶液注入到聚合物溶液中，在12000 rpm高速攪 拌下均勻分散，得到W/0的初乳液；攪拌下，將初乳液注入10ml含有1wt% PVA 的水溶液中，乳化30min，形成W/0/W復(fù)乳液，500 rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷， 微球固化得到微球懸浮液，將獲得的懸浮液離心，收集其中的微球并用蒸餾水洗滌 數(shù)次后，冷凍干燥，得到過(guò)氧化物酶模擬物載藥微球。根據(jù)圖1，通過(guò)測(cè)量及計(jì)算得 到，所制得的載藥微球中，藥物包封率為90%，載藥量0.68%，微球平均粒徑為12.7 um,釋放時(shí)間為20天，如附圖4所示。
實(shí)施例2:
將PLA (5000g/mol) 1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物溶液。將0.2g 明膠加入1ml水中，加熱溶解，向這一明膠溶液中，加入50mg PEG咖o-DhHP-6， PEG咖o表示PEG的分子量為5000 ，攪拌溶解。將得到的50mg/ml的 PEG500(rDhHP-6明膠溶液注入到聚合物溶液中，在高速攪拌下均勻分散，得到W/0 的初乳液；攪拌下，將初乳液注入10ml含有1wtQ/。PVA的水溶液中，乳化30min， 形成W/OA/V復(fù)乳液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，固化微球。將獲得的懸浮液離心，收 集其中的微球并用蒸餾水洗滌數(shù)次后，冷凍干燥，得到過(guò)氧化物酶模擬物載藥微球。 根據(jù)圖1，通過(guò)測(cè)量及計(jì)算得到，所制得的載藥微球中，藥物包封率為91%，載藥 量2.71%，微球平均粒徑為14.5 wm。釋放時(shí)間為31天(附圖6)。實(shí)施例3:
將PLGA(5000g/mol， 2500-2500) 1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物 溶液。將0.2g明膠加入1ml水中，加熱溶解，向這一明膠溶液中，加入10mg DhHP-6， 攪拌溶解。將得到的10mg/ml的DhHP-6明膠溶液注入到聚合物溶液中，在高速攪 拌下均勻分散，得到W/0的初乳液；攪拌下，將初乳液注入10ml含有1wt% PVA 的水溶液中，乳化30min，形成W/0/W復(fù)乳液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲垸，固化微球。 將獲得的懸浮液離心，收集其中的微球并用蒸餾水洗滌數(shù)次后，冷凍干燥，得到過(guò) 氧化物酶模擬物載藥微球。根據(jù)圖1，通過(guò)測(cè)量及計(jì)算得到，所制得的載藥微球中， 藥物包封率為90%，載藥量0.52%，微球平均粒徑為10.2 um。釋放時(shí)間為16天 (附圖5)。
實(shí)施例4:
將PLGA(5000g/mol ， 2500-2500) 1g溶解到5ml的二氯甲烷中，得到聚合物 溶液。將0.2g明膠加入1ml水中，加熱溶解，向這一明膠溶液中，加入50mg PEG50M-DhHP-6，攪拌溶解。將得到的50mg/ml的PEG500(rDhHP-6明膠溶液注入 到聚合物溶液中，在高速攪拌下均勻分散，得到W/0的初乳液；攪拌下，將初乳液 注入10ml含有1wt。/。PVA的水溶液中，乳化30min，形成W/0/W復(fù)乳液，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去二氯甲烷，固化微球。將獲得的懸浮液離心，收集其中的微球并用蒸餾水洗 滌數(shù)次后，冷凍干燥，得到過(guò)氧化物酶模擬物載藥微球。根據(jù)圖1，通過(guò)測(cè)量及計(jì)算 得到，所制得的載藥微球中，藥物包封率為94。/。，載藥量2.88。/。，微球平均粒徑為 12.1 um。釋放時(shí)間為21天(附圖7)。
實(shí)施例5:
本實(shí)施例與實(shí)施例1基本相同，所不同的是采用的PLA的分子量為 (40000g/mol)。所制得的載藥微球中，藥物包封率為90%，載藥量0.75%，微球 平均粒徑為33.6 p m。釋放時(shí)間為53天。
實(shí)施例6:
本實(shí)施例與實(shí)施例2基本相同，所不同的是釆用的PLA的分子量為 (40000g/mol)。所制得的載藥微球中，藥物包封率為97%，載藥量3.20%，微球 平均粒徑為35.3um。釋放時(shí)間為60天。實(shí)施例7:
本實(shí)施例與實(shí)施例3基本相同，所不同的是采用的PLGA的分子量為
(40000g/mol， 20000—20000)。所制得的載藥微球中，藥物包封率為92%，載藥 量0.69%，微球平均粒徑為29.5um。釋放時(shí)間為39天。
實(shí)施例8:
本實(shí)施例與實(shí)施例4基本相同，所不同的是采用的PLGA的分子量為 (40000g/mol， 20000—20000)。所制得的載藥微球中，藥物包封率為95%，載藥 量2.98%，微球平均粒徑為31.6um。釋放時(shí)間為48天。
實(shí)施例9:
本實(shí)施例與實(shí)施例2基本相同，所不同的是采用的過(guò)氧化物酶模擬物為 PEG2。。。。-DhHP-6，藥物用量為200mg。所制得的載藥微球中，藥物包封率為97%， 載藥量12.85%，微球平均粒徑為17.7iim。釋放時(shí)間為40天。
權(quán)利要求
1、一種過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球，其特征在于是以聚乳酸或聚乳酸-羥基乙酸作為包覆材料，所載過(guò)氧化物酶模擬物以微區(qū)形式分布于整個(gè)微球之中，載藥微球中過(guò)氧化物酶模擬物的包封率超過(guò)90％，載藥量0.5％～13％(wt％)，載藥微球的平均粒徑為10～35μm。
2、 如權(quán)利要求1所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球，其特征在 于過(guò)氧化物酶模擬物為亞血紅素六肽DhHP-6。
3、 如權(quán)利要求1所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球，其特征在 于過(guò)氧化物酶模擬物為亞紅素六肽的聚乙二醇偶聯(lián)物PEG — DhHP-6。
4、 如權(quán)利要求3所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球，其特征在 于聚乳酸的分子量為5000~40000g/mol。
5、 如權(quán)利要求3所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球，其特征在 于聚乳酸—羥基乙酸共聚物的分子量為5000~40000g/mol，共聚物中聚乳酸 占聚乳酸和羥基乙酸鏈段總摩爾數(shù)和的10~90%。
6、 如權(quán)利要求5所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球，其特征在于聚乳酸一羥基乙酸共聚物中聚乳酸與羥基乙酸鏈段的摩爾比為10: 90、 20:80、 30: 70、 40: 60、 50: 50、 60: 40、 70: 30、 80: 20或90: 10。
7、 權(quán)利要求1所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球的制備方法，其步驟如下a) 以二氯甲垸為溶劑，將聚乳酸或聚乳酸一羥基乙酸共聚物充分溶解于二氯 甲垸中，配制成100 500mg/ml的溶液；b) 將過(guò)氧化物酶模擬物固體粉末溶解于濃度為0.1~1g/ml的明膠溶液中，形 成濃度為10~200mg/ml的過(guò)氧化物酶模擬物明膠溶液；c) 在12000~15000rpm的高速攪拌下，將步驟b所得到的過(guò)氧化物酶模擬物 明膠溶液注入到步驟a所得到的聚合物溶液中，均勻分散，形成W/0的初 乳液，過(guò)氧化物酶模擬物明膠溶液與聚合物溶液的體積比為1: 5~10;d) 將聚乙烯醇溶解于蒸餾水中，制成1 2.5wt。/o的聚乙烯醇水溶液；e) 將步驟c所得的W/0初乳液在2000~3000rpm的攪拌速度下，注入到步 驟d所得的聚乙烯醇水溶液中，該水溶液與W/0初乳液的體積比為20 ~ 50: 10，經(jīng)乳化形成W/0/W乳液，500 1000rpm下攪拌至二氯甲烷全部揮發(fā)，使微球固化形成微球懸浮液；將獲得的微球懸浮液離心，收集，并 用蒸餾水洗滌數(shù)次，經(jīng)凍干后即可得到過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚 酯載藥微球。
8、如權(quán)利要求7所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球的制備方法， 其特征在于過(guò)氧化物酶模擬物為亞血紅素六肽DhHP-6或亞紅素六肽的聚乙二 醇偶聯(lián)物PEG_DhHP-6。
9、 如權(quán)利要求7所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球的制備方法， 其特征在于聚乳酸的分子量為5000~40000g/mol。
10、 如權(quán)利要求7所述的過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球的制備方法， 其特征在于聚乳酸一羥基乙酸共聚物的分子量為5000~40000g/mol，共聚物 中聚乳酸占聚乳酸和羥基乙酸鏈段總摩爾數(shù)和的10~90%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種過(guò)氧化物酶模擬物的生物可降解聚酯載藥微球及其制備方法。所采用的包覆材料為聚乳酸或聚乳酸-羥基乙酸，所采用的過(guò)氧化物酶模擬物為亞血紅素六肽或亞紅素六肽的聚乙二醇偶聯(lián)物。其是將聚酯充分溶解于二氯甲烷中，在高速攪拌下，將過(guò)氧化物酶模擬物的明膠溶液注入到二氯甲烷溶液中，均勻分散，形成W/O的初乳液，將該初乳液在攪拌下注入聚乙烯醇的水溶液中，經(jīng)乳化形成W/O/W乳液，攪拌至二氯甲烷全部揮發(fā)，使微球固化后凍干。本發(fā)明制備的過(guò)氧化物酶模擬物載藥微球，包封率達(dá)到90％以上，載藥量為0.5％～13％(質(zhì)量)，而且微球表面光滑，不粘連，微球尺寸為10～35μm，直徑分布均勻，并具有顯著的緩釋作用。
文檔編號(hào)A61K47/34GK101406458SQ20081005145
公開(kāi)日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者輝 任, 惟 李, 航 林, 磊 栗, 鈞 湯, 王麗萍, 王敏楠, 趙曉亮 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)