專利名稱：：旋毛蟲與腫瘤相關(guān)抗原蛋白及其制備方法和醫(yī)用用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤相關(guān)抗原蛋白及其制備方法，本發(fā)明還提供了該蛋白的醫(yī)用用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：旋毛蟲是一種寄生于人和多種動物體內(nèi)的線蟲，近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有較強的抗腫瘤活性，但對其抗腫瘤活性成分尚不清楚。據(jù)報導(dǎo)惡性腫瘤細胞對異體鑒識物比較敏感，異體抗原物所產(chǎn)生的免疫細胞對惡性腫瘤具有抵抗力。旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原能產(chǎn)生針對腫瘤強的特異性和非特異性免疫反應(yīng).
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原蛋白，為一種新的蛋白物質(zhì)，具有醫(yī)藥活性。本發(fā)明還提供了該相關(guān)抗原蛋白的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明進一步公開了該蛋白的醫(yī)用用途，用于制備治療腫瘤的藥物。本發(fā)明公開的旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原蛋白，具有以下表證分子量是33.2Uku,pl是4.64，共由以下284個氨基酸組成本發(fā)明相關(guān)抗原蛋白的制備方法如下利用酶聯(lián)免疫吸附試驗確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細胞陽性血清間存在相關(guān)抗原；利用超濾及透析技術(shù)對相關(guān)抗原進行分離得到抗原蛋白。下述的藥理實驗證實了本發(fā)明抗原蛋白具有顯著的抑制腫瘤生長的作用，可以作為制備抗腫瘤藥物被應(yīng)用。3旋毛蟲與腫瘤相關(guān)抗原抗腫瘤效果將1822g的BalB/C小鼠隨機分為活蟲免疫組、ES抗原免疫組、相關(guān)抗原免疫組、佐劑免疫對照組，每組10只。將相關(guān)抗原與ES抗原各100Pg(lPg/liL)加入等量的弗氏完全佐劑乳化均勻，腹腔免疫。兩周后，以8(mg(l^A4j加入等體積的弗氏不完全佐劑進行第二次腹腔免疫。在相關(guān)抗原與ES抗原組第一次免疫的同時，給活蟲免疫組小鼠按400條/只灌胃投服旋毛蟲肌幼蟲活蟲。佐劑對照組則以佐劑加等量的滅菌生理鹽水進行首免和第二次免疫。按分組情況，第二次免疫后三天于小鼠的右后肢皮下注射接種lXl(f個細胞/只。荷瘤30d后，頸椎脫臼處死各個實驗組小鼠，并進行腫瘤體積、重量等物理指標(biāo)的測定以及CD3+、CD4+、CD8+、CD19+等免疫指標(biāo)的檢測。所有結(jié)果數(shù)據(jù)均利用SPSS14.0forWindows軟件進行分析，檢驗差異顯著性。抗腫瘤試驗結(jié)果-結(jié)果表明活蟲免疫組、粗抗原免疫組、ES抗原免疫組、相關(guān)抗原免疫組的體內(nèi)平均抑瘤率分別為50.53%，36.95%,44.49%，45.34%。接種相關(guān)抗原實驗組的瘤重顯著低于空白對照組(P〈0.01)，各組抗原的抗腫瘤情況見表2，表3)。方差分析，F(xiàn)=34.265，p=0.000,表明各組瘤重有顯著差異。LSD檢驗結(jié)果顯示，活蟲與相關(guān)抗原組抗瘤率沒有顯著差異。表2各種抗原對乳腺癌MCF—7細胞荷瘤小鼠腫瘤重量的影響(S±s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本發(fā)明的積極效果在于腫瘤細胞對異體鑒識物比較敏感，旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原能產(chǎn)生針對腫瘤強的特異性和非特異性免疫反應(yīng)，同時旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原易于制備和工業(yè)化。圖1旋毛蟲肌幼蟲總蛋白雙向電泳圖譜；圖2雙向電泳后的免疫印跡。具體實施方法實施例11.旋毛蟲與乳腺癌細胞相關(guān)抗原確定首先制備旋毛蟲可溶性抗原和乳腺癌MCF—7細胞抗原并分別免疫BalB/C小鼠制備兩種抗原的陽性血清。按常規(guī)操作步驟包被旋毛蟲可溶性抗原和乳腺癌MCF—7細胞抗原并使其分別與乳腺癌MCF—7細胞陽性血清、旋毛蟲陽性血清、健康老鼠血清反應(yīng)，酶標(biāo)儀測得0D柳值，以P/N》3為判定標(biāo)準(zhǔn)，ELISA結(jié)果顯示旋毛蟲肌幼蟲抗原與乳腺癌MCF—7細胞抗體以及乳腺癌MCF—7細胞抗原與旋毛蟲抗體均具有較好的免疫交叉反應(yīng)，所獲得的最佳抗體效價分別是乳腺癌MCF—7細胞高免血清1:6400;旋毛蟲高免血清l:3200，同時兩種抗原都不與健康小鼠血清反應(yīng)。2.旋毛蟲與乳腺癌細胞相關(guān)抗原蛋白氨基酸測定提取旋毛蟲肌幼蟲總蛋白制備雙向電泳上樣蛋白。利用雙向電泳起始試劑盒完成等點聚焦過程，將聚焦好的膠條繼續(xù)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。根據(jù)同一塊膠上的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白的電泳遷移率(Rf)，建立回歸方程，進而求出各蛋白點的分子量。取雙向分離后的凝膠中的一塊進行考染并脫色，其余凝膠與篩選好的旋毛蟲陽性血清進行免疫印跡雜交。嚴格參照免疫印跡結(jié)果，分別于三張凝膠上同時選取能夠與乳腺癌MCF—7細胞高免血清雜交的旋毛蟲肌幼蟲蛋白點，進行串聯(lián)質(zhì)譜分析。以Typsin酶解考染樣品，并用50%乙腈與0.1。/。無水三氟乙酸(TFA)混合液提取肽段，并在N2流下吹干濃縮。將完全干燥的肽段重新溶解于0.7化，0.5g/L的a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA溶劑，0.1%TFA+50%ACN)溶液中，并將其全部點到192iell靶板上，室溫下自然干燥，采用正離子模式、反射式飛行時間方式檢測，采用Myoglobin的標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶酶解肽段做外標(biāo)校正，質(zhì)量誤差小于5X10-加速電壓20kV,激光源為波長355nm、脈沖200Hz的Nd:YAG固體紫外激光器。釆集質(zhì)譜(MS)圖條件一級質(zhì)譜掃描范圍10004000歷/z，選擇符合要求的離子作為母離子繼續(xù)二級質(zhì)譜，在上述各主要參數(shù)固定的前提下，獲得一系列串聯(lián)質(zhì)譜圖。MALDI-TOF/TOF-MS得到的譜圖用AppliedBiosystems公司的專用譜圖處理軟件DataExplorer4.5和4700Explorer2.0分析，并運用MASCOT引擎檢索數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫檢索條件為肽譜、串級質(zhì)譜圖質(zhì)量偏差分別為O.1和0.5Da，選擇N端乙酰化修飾，電荷選擇:MALDI為+1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲總蛋白經(jīng)pH310膠條等電聚焦和SDS-PAGE分離后，再經(jīng)考馬斯亮蘭R-250染色后得到二維圖譜。蛋白點主要分布于pH47、分子量14100ku的范圍(如圖l所示)。通過ImageMaster5.0軟件分析，5張膠同一樣本蛋白點匹配率91%,圖譜重復(fù)性很好。①通過自動點檢測(Autodetection)獲得蛋白質(zhì)檢測圖；②利用背景扣除(backgroundduduction)消減部分背景條紋；③選取其中的一張凝膠作為參考凝膠(refrencegel)，其余圖譜與之匹配，生成凝膠報告，并進行修正，從而在凝膠報告中獲得蛋白點的等電點、分子量、凝膠之間的點匹配率等信息。軟件分析顯示，考染后的凝膠共有288土12個蛋白點。將雙向電泳分離后的旋毛蟲總蛋白與Sp2/0骨髓瘤高免血清進行免疫雜交，得到了三種不同分子量和等電點的相關(guān)抗原蛋白。分別是分子量為33ku、pl是4.6和6.8的蛋白以及分子量為66ku、pl是6.9的蛋白(如圖2所示)。經(jīng)過飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析，最終確定這種與乳腺癌細胞相關(guān)的抗原成分主要是旋毛蟲的原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)，其精確分子量是33.211ku，pl是4.64，共由284個氨基酸組成權(quán)利要求1、一種旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原蛋白，其特征在于分子量是33.211ku，pI是4.64，其氨基酸序列為MDAIKKKMQAMKIEKDNAMDRADAAEEKARQQQERVEKLEEELRDTQKKMMQVENELDKAQEELTGANAQLEEKEKKVQEAEAEVAALNRRIQLLEEDFERAEERLIIATEKLGEASQTADESERVRKVMENRSLQDEERVYQLEAQLKEAQLLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAEAGENKIVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEKALQREDSYEEQIRLLTQRLKEAETRAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVHEKEKYKAISEELDQTFQELSGY。2.權(quán)利要求l所述抗原蛋白的制備方法，包括以下步驟利用酶聯(lián)免疫吸附試驗確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細胞陽性血清間存在相關(guān)抗原；利用超濾及透析技術(shù)對相關(guān)抗原進行分離得到抗原蛋白。3.權(quán)利要求1所述抗原蛋白在制備治療腫瘤藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤相關(guān)抗原蛋白及其制備方法，該抗原蛋白分子量是33.211ku，pI是4.64，共由284個氨基酸組成；旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原能產(chǎn)生針對腫瘤強的特異性和非特異性免疫反應(yīng)，同時旋毛蟲與腫瘤細胞相關(guān)抗原易于制備和工業(yè)化。本發(fā)明還提供了該蛋白用于制備治療腫瘤的藥物。文檔編號A61P35/00GK101508731SQ20081005172公開日2009年8月19日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者宮鵬濤,楠張,張景芝,張西臣,李建華,舉楊申請人:吉林大學(xué)