專利名稱：：抑制人bFGF基因表達增殖的siRNA序列及其表達載體和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物工程技術，特別是一種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA序列及其表達栽體和應用。
背景技術：
：多肽生長因子也稱細胞生長調節(jié)因子，是生物機體內(nèi)調節(jié)細胞生長、增殖、分化等具有多種功能的信號因子，很多腫瘤可以分泌生長因子，通過自分泌和旁分泌的方式刺激腫瘤細胞生長，所以從某種意義上講，細胞的癌變是以某種方式干擾或破壞了生長因子的正常信號通路，使細胞的生長、增殖、分化從有序狀態(tài)變?yōu)槭Э貭顟B(tài)。而這些多肽生長因子均具備癌基因的生物學特性，可以稱為前癌基因。生長因子類基因中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的生物學作用顯著，它是成纖維細胞生長因子家族中的代表成員，其作用較其它成員強十倍或數(shù)十倍?，F(xiàn)已探明該基因與膠質瘤的血管生成，與膠質瘤的細胞增殖關系密切，并有可,能抑制了膠質瘤細胞的凋亡，在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。國內(nèi)'外研究證實，bFGF反義寡核苷酸可以在體外抑制膠質瘤細胞的增殖，但該技術也存在轉染效率低，作用時間短的不足，使其抑瘤作用受到限制，.另外，人工合成寡核苷酸的費用昂貴，也使該技術的應用遇到技術困難。近年的研究發(fā)現(xiàn)，一些小的雙鏈RNA(double-strandedRM，dsRNA)可以高效、特異地促使體內(nèi)特定基因mRNA降解，誘使細胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，這種技術即RMi。在RNAi作用的起始階段中外源性或內(nèi)源性的雙鏈RM被Dicer酶切割為19~21bp的小分子干擾RNA片段(smal1interferingRNAs，siRNAs);隨后siRNA與核酶復令物結合后形成RNA誘導沉默復合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC);RISC激活后通過石威基配對定位到同源mRNA轉錄本上并切割mRM，從而部分或完全抑制目的基因的表達。另一方面，細胞在RNA依賴性RNA聚合酶作用'下，可以siRNA為引物、以mRNA為模板，合成出mRNA的互補鏈，從而使mRNA也變成了dsRNA,然后在Dicer酶的作用下再次,皮裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過這個鏈式反應，細胞°內(nèi).的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從RNAi的作用機制中可見，這種基因表達調控方法屬于轉錄后的調節(jié)并具有明顯優(yōu)勢RNAi基因抑制效果確切，應用微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上、甚至可以達到基因敲除的效果；其次，RMi抑制具有嚴格的序列特異性，治療的針對性強，因而應用此項技術能夠同時抑制同一基因的多個靶點或多個不同基因而不致相互干擾；同時，RNAi的作用具有級聯(lián)式放大效應和高穿透性更適合惡性J中瘤的實-瞼研究；此外，RNAi序列識別的特異性即或對由野生型點突變形成的癌基因也能夠產(chǎn)生準確有效的封閉效果而對野生型基因沒有影響。在對多種腫瘤細胞系實驗中也證實腫瘤細胞中均存在著RNAi的機制，化學合成、質粒/病毒或其他方式介導的RNAi可以有效地抑制內(nèi)源性'RNA的表達。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明就是為了解決膠質瘤等腫瘤基因治療問題，以RNA干擾機制為基礎，通過人工合成或表達質粒序列轉錄形成的bFGF小雙鏈RM(siRNA)可以靶向作用于bFGF基因的mRNA,從而阻斷其翻譯過程，達到使bFGF基因表達降低的結果，而提供一種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA序列和表達載體及其應用。本發(fā)明以RNA干擾技術為基礎，從GenBank中獲得bFGFmRNA的全長序列，根據(jù)siRNA乾序列選擇的基本原則，針對bFGF基因設計了4條長度為19個核苷酸的siRNA(見表1)(由上海吉瑪公司合成)。通過一系列體外實驗證實(實施例l)，4條siRNA中bFGF-siRM-4的抑制效果最好。將bFGF-siRNA-4序列設計shRNA正義鏈和反義鏈，以loop環(huán)相連，稱為shRNA。合成每條shRM的DM模板的兩條單鏈，兩條單鏈DM退火即為DM雙鏈才莫板(shDNASense:'5'-CACCGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTTTTTTG-3'Antisense:5'-GATCCAAAAAACGAACTGGGCAGTATAAACTCTCTTGAAGTTTATACTGCCCAGTTCGC-3');再克隆至含U6啟動子的pGenesil-1質粒中，構建質粒表達載體pGPU6/GFP/Neo-shbFGF,并進行酶切鑒定和測序。酶切結果證明構建的>shRNA已插入載體，經(jīng)測序證明與設計的序列相同(實施例2)。然后采用脂質體介導的方法將pGPU6/GFP/Neo-shbFGF轉染入高表達bFGF的膠質瘤細胞系U251中。根據(jù)綠色焚光蛋白表達情況檢測轉染效率，同時應用'MTT法觀察轉染細胞的增殖活性的變化。應用RT-PCR法檢測轉染細胞mRNA表達的變化。用AnnexinV-FITC/PI雙色標記的流式細胞儀法檢測轉染細^^的凋亡狀態(tài)。因此，本發(fā)明提供一種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA序列，其具有特異性抑制腫瘤細胞的作用，其堿基序列及作用部位如下5'-CGAACUGGGCAGUAUAAACdtdt-3'5'-GUUUAUACUGCCCAGUUCGdtdt-3'作用于人bFGFmRNA的第857至868位。所述抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA序列，其是采用合成的方式形成3'端有2-4個dt修飾的siRNA。本發(fā)明提供了一種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA表達載體，其具有特異性抑制人bFGF基因表達，特異性抑制人腫瘤細胞的作用。所述抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA表達載體，其DNA序列中真核質粒載體是pGenesil-l，或pcDNA3.0,或pcDNA3.1，或pRK5，或pLuescriptSK所述抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA表達載體，該表達載體是腺病毒，或腺相關病毒。本發(fā)明提供了一種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA序列在制備抑制腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明提供了一種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA表達載體在制備抑制腫瘤藥物中的應用。結果表明pGPU6/GFP/Neo-shbFGF可通過脂質體介導作用成功轉染入膠質瘤細胞內(nèi)。轉染pGPU6/GFP/Neo-shbFGF后的細胞代謝受抑制，細胞生長減慢。MTT吸收值在轉染后48小時和72小時下降，與正常對照組和陰性對照組相比都具有統(tǒng)計學意義。RT-PCR結果顯示轉染了不同濃度pGPU6/GFP/Neo-shbFGF的細胞mRNA表達均受抑制。流式細胞分析實驗表明bFGF-siRNA組在24小時和48小時早期凋亡與晚期凋亡都較正常對照組和陰性對照組明顯增多。這樣，本發(fā)明設計出針對bFGF的siRNA和其質粒表達載體，能夠有效抑制bFGF的基因表達，能有效抑制腫瘤細胞的增殖活性，還可誘導細胞凋亡。本發(fā)明提供的bFGF-siRM及其質粒表達載體可以特異性、高效地抑制人bFGF基因表達，從而達到抑制腫瘤發(fā)生和生長的目的。該siRNA及其質粒表達栽體可用于制備高效、快速、特異性強的抗腫瘤藥物。'圖1A是bFGF-siRM轉染U251細胞后48小時PCR擴增bFGF基因電泳圖1B是bFGF-siRM轉染U251細胞后48小時PCR擴增p-actin基因電泳圖2A是bFGF-siRM轉麵U251細胞后72小時PCR擴增bFGF基因電泳圖；圖2B是bFGF-siRNA轉染U251細胞后72小時PCR擴增P-actin基因電泳圖3A是正常對照組轉染U251細胞48小時后bFGF的表達(x200);圖3B是si,-4組轉染U251細胞48小時后bFGF的表達(x200);圖4是質粒重組栽體的酶切鑒定；圖5A是siRM-4轉染U251細胞后24小時綠色熒光蛋白表達情況；圖5B是siRM-4轉染U251細胞后48小時綠色焚光蛋白表達情況；圖6是bFGF-siRNA轉染后各時間點MTT吸收值；圖7A是48小時實驗組Annexin-V/PI雙染bFGF-siRNA轉染后流式測定細J!包凋亡情況；圖7B是48小時陰性對照組Annexin-V/PI雙染bFGF-siRNA轉染后流式測定細胞凋亡情況；圖8是pGPU6/GFP/;Veo質粒載體圖i普；圖9是bFGF-siRNA堿基序列圖。，圖中圖1AM:Marker;lanel:正常對照組；lane2:陰性對照組；lane3:siRNA-ljlane4:siRM-2jlane5:siRNA-lane6:siRNA-4j圖1B顯示M:Marker;lanel:正常對照組；lane2:陰性對照組；lane3:siRNA-:^lane4:siRM-lane5:siRNA-35lane6:si濕-4j圖2A顯示M:Marker;lanel:正常對照組；lane2:陰性對照組；lane3:siRNA-ljlane4:siRNA-2jlane5:siRNA-3jlane6:siRNA-圖2B顯示M:Marker;lanel:正常對照組；lane2:陰性對照組；lane3:siRNA-l;lane4:siRNA-2;lane5:siRM-3;lane6:siRNA-4.'圖4中顯示M:Lamda/Eco130I;1-6:EcoRI酶切；8-13:BamHI酶切。具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例一千擾人bFGF基因表達的siRM序列設計和篩選1.siRNA序列設計利用NCBIGenbank檢索bFGFmRM的全長序列，參照siRM設計原則，并運用RMstructure軟件模擬耙mRM的二級結構，盡量避免自身結合的莖區(qū)，選擇配對區(qū)域較少的序列，如線區(qū)和環(huán)區(qū)。篩選出4個19個核苷酸的序列，并將它們帶入BLAST基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，排除了和其他編碼序列/EST同源。并將其分別命名為bFGF-siRNA-l、bFGF-siRNA-2、bFGF-siRM-3、bFGF-si謹一4(見表1)(由上海吉瑪公司合成)。參見圖9。_表1干擾人bFGF基因表達的siRNA序列_ii^序列Sense:5'-CAUCAAGCUACAACUUCAATT-3'Antisense:5'-UUGAAGUUGUAGCUUGAUGUTT-3'Sense:5'-AACCGUUACCUGGCUAUGATT-3'Antisense:5'-UCAUAGCCAGGUAACGGUUATT-3'Sense:5'-AUGUGUUACGGAUGAGUGUTT陽3'Antisense:5'-ACACUCAUCCGUAACACAUTT-3'Sense:5'陽CGAACUGGGCAGUAUAAACTT-3'Antisense:5'-GUUUAUACUGCCCAGUUCGTT-3'Sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'Antisense:5'-ACGUGACAAGUUCGGAGAATT-3'2.篩選出抑制效果最好的siRNA序列2.1材料與方法2.1.1轉染根據(jù)LipofectaminTM2000說明書的實驗步驟，利用月旨質體將siRNA轉染于U251細胞中。實驗分為六組，分別為siRM-l、s認A-2、siRNA-3和siRNA-4、陰性對照siRNA和正常對照組。siRNA轉染的終濃度為4(ig/L。2.1.2采用RT-PCR方法檢測bFGFmRNA表達水平采用TRIZOL試劑提取細胞總RNA，-7(TC保存，備用。細胞轉染后48小時和72小時，提取總RNA并定量，各實驗組取同等量的RNA反轉錄為cDNA，然后PCR擴增bFGF基因及p-actin基因，bFGF引物為上游序列為5'-CACCATGGCAGCCGGCAGCATCA-3'，下游序列為5"-TCAGCTCTTAGCAGACATTGG-3'，擴增的產(chǎn)物大小為485bp。p-actin引物為上游序列為5'-CCTCGCCTTTGCCGATC-3、下游序列為5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3'，擴增產(chǎn)物長度為626bp(引物由北京賽百盛合成)。PCR反應體系為20ml，包括CDM5jli1,10xBuffer2u1，25mmol/LMgC121.2/a1，2.5mmol/LdNTP2ni1，TaqDNA聚合酶O.2上下游引物(5ymol/L)各lpi,三蒸水加至20ml混均。擴增反應由DNAthermalcycler(GeneamPCRSystem2400)完成，bFGF的擴增條件為94。C預變性5min;94。C變性45s、6(TC退火60s、72。C延伸60s，循環(huán)32次；終延伸72。C10min。P-actin的擴增條件為94。C預變性5min;94。C變性30s、57。C退火30s、72。C延伸90s,循環(huán)25次;終延伸72。C10min。bFGF-siRNA-lbFGF-siRNA-2bFGF-siRNA-3bFGF-siRNA-4陰性對照組siRNA7PCR產(chǎn)物用1xTBE電泳緩沖液的2"/。(w/v)瓊脂糖凝膠(含O.5/ag/ml的溴化乙錠)電泳。運用Gel-proAnalyzerversion4.5軟件分析電泳結果，各基西條帶的含量以IOD值來表示，IOD(峰面積卜OD(光密度值)xpix(面積)，根據(jù)bFGF基因與actin基因PCR擴增產(chǎn)物IOD的比值估算目的基因的相對含量。2.1.3免疫組化檢測bFGF的蛋白表達將對數(shù)生長期U251細胞以2.Ox105/mL的密度接種于載玻片上，接種24h后，轉染siRNA。轉染后48小時按照免疫組化染色ABC法按說明書操作步驟進行，進行免疫組化染色。染色強度與陽性細胞百分比的乘積即為免疫組化的結果。2.1.4MTT法測定細胞增殖活性選用對數(shù)生長期的U251細胞，以5xl04/ml的細胞密度接種于96孔板中，實驗組、脂質體組和正常對照組在接種24h后，轉染并繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48、72小時后，進行MTT檢測，，酶標4義測定550nm波長下的OD值。2.1.5AnnexinV-FITC法檢測細胞凋亡將對數(shù)生長期U251細胞按4xl05/ml的量接種于6孔平底細胞培養(yǎng)板，24h后，進行轉染，siRM每種處理重復三次。轉染48h和72h后，收集細胞，并按常規(guī)處理細胞。加入5u1AnnexinV-FITC和/或5u1PI,混勻，4。C避光孵育15分鐘，1小時內(nèi)用流式細胞儀(BD公司)測定。3.結果3.1RT-PCR檢測siRNA對bFGFmRNA表達的抑制由電泳圖可看出48小時和72小時正常對照組、R^性對照組以及siRNA各組的bFGFmRNA表達量不同，見圖1和圖2。圖像掃描分析結果，見表2。表2bFGFRT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖像掃描分析結果組別例數(shù)IOD,/10Dh"in平均值正常對照組30.9725陰性對照組30.9522轉染后24小bFGF-siRNA-l30.8653時bFGF-siRNA-230.7788bFGF-siRNA-330.6902bFGF-s濯A-430.5770正常對照組30.9478陰性對照組30.8850轉染后48小bFGF-si腿-130.8127時bFGF-si腿-230.7972bFGF-siRNA-330.7723bFGF-siRNA-430.52923.2免疫組織化學檢測siRNA對bFGF蛋白表達的抑制情況檢測轉染后48小時bFGF在U251細胞中的蛋白表達情況，見圖3。從圖3A中可見bFGF蛋白表達陽性胞漿呈棕色，bFGF-siRNA-4組(圖3B)蛋白表達陰性胞漿呈無色。免疫組化評分為正常對照組和陰性對照組均為強陽性(+++)，bFGF-siRNA-1、bFGF-siRNA-2、bFGF-siRM-3和bFGF-siRM-4分別為弱陽性(+)、強陽性(+++)、陰性(-)和陰性(-)。3.3不同實驗組對膠質瘤細胞增殖的影響轉染48及72小時后，進行MTT測定。三個不同時段的MTT吸收值見表2。經(jīng)統(tǒng)計處理，在48及72小時，實^^組MTT吸收值與正常對照組和陰性對照組相比，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表3轉染48和72小時后MTT吸收值組別例數(shù)轉染后48小時轉染后72小時正常對照組101.192±0.1260.947±0.075陰性對照組100.520±0.0450.810±0.102bFGF-siRNA-4組100.404±0.073*0.568±0.069*注*與正常對照組、陰性對照組相比，P〈0.05。3.4bFGF-siRNA轉染后對細胞凋亡的影響bFGFsiRNA-4轉染膠質瘤細胞U25148小時后，采用流式細胞儀測定細胞的凋亡狀況。正常對照組、脂質體組及賣驗組(bFGF-siRNA-4)的早期凋亡細胞占總細胞比例平均為0.78%、6.83%、14.85%,晚期凋亡所占總細胞比例平均為0.11%、1.39%、8.12%。上述實驗結果表明bFGF-siRNA-4是理想的bFGF小分子干擾RNA序列，將其導入腫瘤細胞能夠抑制該基因的mRNA和蛋白的表達并能抑制腫瘤細胞的增殖活性。實施例二bFGFsiRNA質粒表達載體的構建l.寡核苷酸的合成將實施例1篩選出的bFGF-siRNA-4序列設計shRNA正義鏈和反義鏈，shRNA模板中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的5，.端添加了CACC，與Bbsl酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5，端添加了GATC,與BamHI酶切后形成的粘端互補；如果siRNA的第一個堿基不是G，則在CACC后補加一個G。ShDNAsequence:Ssnss:TRANSCRIPTSGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTT2.shRNA模板的退火將DMoligo分別用TE(pH8.0)溶解，濃度為100uM。糾目應的正義鏈和反義鏈oligo溶液，按照如下配比配置退火反應體系。ReagentVolume(ul)10XshDNAAnnealing~Buffersensestrand(100uM)antisensestrand(100uM)_ddH20_Total50在PCR儀上按照如下程序進行退火處理95C5min;(95-n)C20sec，n為當前循環(huán)數(shù)，共70個循環(huán)。退火處理后得到濃度為10的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋500倍，終濃度為20nM,用于連接反應。3.pGPU6/GFP/Neo載體的線性化:取2ugpGPU6/GFP/Neo載體(圖8)，按照如下體系進行酶切處理ReagentVolume(ul)10XBufferG5版I22pGPU6/GFP/Neo2ugddH20To50ulTotal5037C酶切1小時，瓊脂糖電泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0(TaKaRa)回收，電泳檢測估算濃度，稀釋濃度至50ng/ul。4.pGPU6/GFP/Neo-shbFGF質粒表達載體的構建555354.1按照如下體系進行載體的連接反應<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>22Clhr,transformtoJM109competentcells.4.2挑取單菌落，接種到含50ug/mlKanamycin的LB培養(yǎng)集中。4.3使用堿裂解法抽提質粒，所得質粒用勘/hHI，fcdlI分別酶切鑒定(圖4)。陽性重組載體應該可以被勘感I切開，而不能被&dlI切開。酶切結果表明，所有質粒表達載體均為陽性重組載體，選擇克隆sribFGF-a，進行測序鑒定。測序結果如下shbFGF-a序列正確。GGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTTTTTTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATCCGGTGGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgtgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgtgccgtcctccttgagtcgatgcccttcagctcgatgcgtcacagggtgtcgccctcgactcactcggcgcggtctgtagtgcgtcgtct6gagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgcatggcggacctgagagtcctgctgctcatgtggtcggtagccgcctgaagacat實施例三bFGF-siRNA質粒表達載體抑制膠質瘤的體外實驗研究將實施例2構建的bFGF-siRNA質粒表達載體pGPU6/GFP/Neo-shbFGF轉染膠質瘤的U251細胞后進行如下實驗(轉染、RT-PCR、免疫組化、MTTAnnexinV-FITC等實驗方法同實施例1略)1.bFGFsiRNA質粒表達載體轉染效率的測定轉染后24小時及48小時，觀察細胞熒光蛋白表達情況，結果實驗組中脂質體用量為10"1，質粒用量為4ug時，轉染效率最高。(見圖5)2.bFGFsiRM質粒表達載體轉染后細胞增殖活性的測定轉染24小時、48小時、72小時、96小時的MTT吸收值，結果(見表4，圖6):表4pGPU6/GFP/Neo-shRNA轉染后各時間點MTT吸收值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注陰性對照組脂質體/陰性質粒為10lil/4ug;;siRNA組脂質體/bFGF質粒為10ul/4ug;'4.bFGFsiRNA質粒表達栽體轉染后細胞凋亡的測定轉染24小時和48小時后，用流式細胞儀測定細胞凋亡，Annexin-V/PI雙染法。結果顯示，轉染后24小時，正常對照組、陰性對照組、實一驗組的早期凋亡比例分別為O.31、0.26、0.23，晚期凋亡比例分別為6.96、3.01、3.03，表明質粒轉染后24小時對細胞凋亡的影響不大；轉染后48小時，正常對照組、陰性對照組、實驗組的早期凋亡比例分別為0.70、4.32、8.17(見圖7),晚期凋亡比例分別為4.64、4.05、6.54,表明實驗組質粒轉染后48小時可誘導細胞凋亡，其中誘導早期凋亡效果較顯著，對晚期凋亡也有一定的誘導作用。SEQUENCELISTING<110>天津市第一中心醫(yī)院<120>抑制人bFGF基因表達增殖的siRNA序列及其表達載體和應用<130>1<160>1<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211>38<212>RNA<213>2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum<220><221>RNA<222>(1)..(38)<223><400>1cgaacugggcaguauaaacguuuauacugcccaguucg38<210>2<211〉1128<212>DNA<213>2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum<220><221>2<222〉(1)..(1128)<223><400>1gggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagat60aattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaa120gtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatat180gcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacg240aaacaccgcgaactgggcagtataaacttcaagagagtttatactgcccagttcgttttt300tggatccactagttctagagcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttcccttt360agtgagggttaattgcgcgttaagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaat420gcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgetttatttgtaaccat480tataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttca540gggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctga600ttatgatcagttatctagatccggtggatctgagtccggacttgtacagctcgtccatgc660cgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgt720tggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacgg780ggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcct840cgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatga900tatagacgttgtggctgtgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgtgccgtcctcc960ttgagtcgatgcccttcagctcgatgcgtcacagggtgtcgccctcgactcactcggcgc1020ggtctgtagtgcgtcgtctggagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgcatggcg1080gacctgagagtcctgctgctcatgtggtcggtagccgcctgaagacat1128權利要求1.一種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA序列，其具有特異性抑制腫瘤細胞的作用，其堿基序列及作用部位如下5′-CGAACUGGGCAGUAUAAACdtdt-3′<p>5′-GUUUAUACUGCCCAGUUCGdtdt-3′<p>作用于人bFGFmRNA的第857至868位。2.如4又利要求1所述抑制人bFGF基因表達和增殖的siRM序列，其是采用合成的方式形成3'端有2-4個dt修飾的siRM。3.—種抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA表達載體，其具有特異性抑制人bFGF基因表達，特異性抑制人腫瘤細胞的作用。4.根據(jù)權利要求3所述抑制人bFGF基因表達和增瑋的siRNA表達載體，其特征在于DNA序列中真核質粒栽體是pGenesil-1，或pcDNA3.0，或pcDNA3.1,或pRK5，或pLuescriptSK。5.根據(jù)權利要求3所述抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA表達載體，其特征在于該表達載體是腺病毒，或腺相關病毒。6.權利要求1所述抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA序列在制備抑制腫瘤藥物中的應用。7.權利要求3所述抑制人bFGF基因表達和增殖的siRNA表達載體在制備抑制腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種抑制人bFGF基因表達的siRNA序列和表達載體及其應用，屬于生物工程技術。本發(fā)明是將bFGF-siRNA導入腫瘤細胞后，可以靶向作用于bFGF基因的mRNA，從而阻斷其翻譯過程，有效地沉默bFGF基因，能夠有效抑制bFGF的基因表達，能有效抑制腫瘤細胞的增殖活性，還可誘導細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長。本發(fā)明可用于制備高效、快速、特異性強的抗腫瘤藥物。文檔編號A61P35/00GK101575602SQ20081005300公開日2009年11月11日申請日期2008年5月6日優(yōu)先權日2008年5月6日發(fā)明者馮學泉,飚張,徐新女,王淑杰,王金環(huán)申請人:天津市第一中心醫(yī)院