專利名稱：：稀土配合物、制備方法及其抗細菌的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種稀土配合物，特別涉及以萘酸、1,10-鄰菲啰啉為配體的稀土配合物，屬于微生物抑菌
技術領域：
。技術背景稀土，有著獨特的電子層和核結構，具有很好的抗菌、消炎、抗腫瘤等作用，我國儲備資源占世界80%左右。二十世紀以來,有關稀土在生命科學領域的研究不斷被報道，由于低毒特性，使稀土的抗菌特性在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生方面有著很好的應用前景，如硝酸鈰已經(jīng)作為殺菌消炎劑而應用到臨床，對燒傷有很好的治療作用。稀土通過抑制病原菌的生長和繁殖來提高作物的抗病性等。隨著高新技術的日益發(fā)展，配位化學的研究也邁向了一個新的臺階，其中，具有特殊物理、化學和生物化學功能的配位化合物不斷合成，為醫(yī)學界發(fā)現(xiàn)真正獨特而新穎的藥物提供了基礎?？紤]到稀土離子有很好的配位能力，所以，其配合物的合成及活性的研究受到人們的重視。大量實驗表明稀土有機配合物具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用，而且多數(shù)稀土配合物的抗菌活性高于配體及稀土離子，主要是由于稀土與配體發(fā)生了協(xié)同作用，并且比許多有機合成物或過渡金屬配合物的毒性低。蘭州大學曾合成出具有抗菌、消炎作用的氯滅酸、消炎痛、丙磺舒等稀土配合物，并制成不同劑型，且證明其毒性較小，對這些藥物的篩選和應用工作現(xiàn)在正在進行。目前的研究主要集中在合成簡單的稀土無機或者有機鹽類，雖然其抑菌性強，抑菌譜廣，但溶液的酸性較強，作為外用藥物不很理想。鑒于多數(shù)稀土配合物具有殺菌能力強，抑菌譜廣，溶液酸性接近生理pH等優(yōu)點，因此，研制殺菌性強，價格低廉，且能廣泛應用到農(nóng)業(yè)，醫(yī)療，環(huán)境等方面的稀土配合物抗菌劑具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種以萘酸、1,10-鄰菲啰啉為配體，抑菌效果優(yōu)于單純稀土離子的稀土配合物，其制備方法以及其在抑制細菌中的應用。本發(fā)明采取的技術方案是這樣的一、本發(fā)明提供的稀土配合物的結構式為REL3pheivnH20;其中RE是稀土元素Eu3+、Tb3+、Gd3+、La3+、y3+中的任何一種；L是a-Naphthoicacid、&Naphthoicacid、a曙Naphthlceticacid、^-Naphthlceticacid四禾中萘酸中的一禾中，四種萘酸的中文名稱分別為(x-萘甲酸、P-萘甲酸、(x-萘乙酸、P-萘乙酸，英文簡寫為a-NMA、p-NMA、a-NAA、P-NAA，化學式分別是，a-CuH702、p_CH702、a-C12H902、P-C12H902;Phen是UO-鄰菲啰啉(l,lO-phenanthroline)的縮寫，化學式為Ct2HgN2;n-O或l。二、本發(fā)明所說的稀土配合物的制備方法包括以下步驟(1)分別將Eu203、Tb407、Gd203、La203、丫203溶于濃鹽酸中，蒸發(fā)水分，濃縮結晶，制得相應的五種稀土氯化物EuCl3'6H20、TbCl3'6H20、GdCly6H20、LaCl3.6H20、YC13.6H20;(2)以L為第一配體，選擇a-萘酸，I，IO鄰菲啰啉為第二配體，上述五種稀土氯化物都按照REC1^6H20:L:phen-l:3:l的物質的量的比稱取，分別用95%的乙醇溶解，得到五種稀土氯化物的乙醇溶液、兩種配體a-萘酸和phen乙醇溶液；(3)將兩種配體溶液混合，調(diào)節(jié)pH值至67;將混合溶液逐滴加入到REC13，6H20稀土氯化物溶液中，期間有白色沉淀生成，攪拌反應35h;REC13-6H20代表EuCl3.6H20、TbCl3.6H20、GdCl3.6H20、LaCl3.6H20、YC13.6H20中的一種；(4)混合液靜置12h,抽濾，用95%的乙醇洗滌3次，在紅外干燥箱中烘干，即為合成的配合物，分別得到以a-萘甲酸和1，10-鄰菲啰啉為配體的五種配合物；以另外三種萘酸為第一配體的配合物的制備方法與a-萘甲酸、1，10-鄰菲啰啉稀土配合物的制備方法相同，將第一配體(x-萘甲酸分別用(3-萘甲酸、(x-萘乙酸、P-萘乙酸替換即可。按以上方法所制備的物質的化學式為Eu(a-CH702)3C12H8N2.H20、Tb(a-CH702)3C12H8N2H20、Gd(a-CuH7。2)A2H8N2.H20、LaCa-C^O^C^HsNhY(a-CuHAhCuHgN^Eu((3-CH702)3C12H8N2、Tb(|3-CH702)3C12H8N2、GdCP-CuH^C^N"Y((3-CH702)3CI2H8N2、Eu(a-C12H902)3C12H8N2、Tb(a-C12H902)3C12H8N2、Gd(a-C12H902)3C12H8N2、La(a-C12H902)3C12H8N2、Y(a-C12H902)3C12H8N2、Eu(p-C12H902)3C12H8N2、Tb(p-C12H902)3C12H8N2、Gd((3-C12H902)3C12H8N2.H20、La((3-C12H902)3C12H8N2、Y(p-C12H902)3C12H8N2。共19種。三、抑菌試驗(1)濾紙條法觀察藥品的廣普抑菌性。選擇埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等十二中菌，取無菌濾紙條，用鑷子將其分別在0.012mol/L待測藥品中潤濕。在培養(yǎng)基上劃線接種實驗菌，再將濾紙條垂直于接種區(qū)放置。根據(jù)抑菌帶的長短判斷其抑菌性；(2)采用濾紙片法測定配合物對細菌抑制的濃度效應，并對配合物、配體、稀土離子的抑菌效果進行了比較。選擇了埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌等幾種典型的革蘭氏陽性菌、陰性菌、芽胞菌為實驗菌。取Mueller-HintonAgar(MHA)培養(yǎng)基融化后冷卻至48~50°C，每20ml加入500|il菌液迅速搖勻，倒板，貼濾紙片在平板上，每個濾紙片加2(Hd待測溶液。置于37°。恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，觀察結果，并記錄。(3)利用掃描電鏡對抑菌機理進行初探，采用鋨酸-戊二醛雙固定法處理菌體，真空干燥后，觀察配合物對菌體細胞壁有明顯的破壞作用。本發(fā)明取得的有益效果是測定的結果表明合成的十九種新型稀土配合物對多種實驗菌體有顯著的抑制作用，抑菌性能高于單獨的離子、配體、并且抑菌程度呈劑量關系。實驗證明該藥品具有抗菌性能好，抗菌范圍廣等特點。圖1給出的是埃希氏大腸桿菌的掃描電鏡照片。圖2給出的是埃希氏大腸桿菌用Eu(a-NMA)3pherrH20處理0.5h以后的掃描電鏡照片。圖3是埃希氏大腸桿菌用Eu(a-NMA)3pheirH20處理lh后掃描電鏡照片。圖4是埃希氏大腸桿菌用Eu(a-NMA)3phen*H20處理2h后掃描電鏡照片。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明。實施例1稀土配合物的制備一、本發(fā)明提供的稀土配合物的結構式為REL3pheivnH20;其中RE:可以是稀土元素中Eu3+、Tb3+、Gd3+、La3+、￥3+的任何一種；n=0或1;L為第一配體可用L是a-Naphthoicacid、々-Naphthoicacid、a-Naphthlceticacid、々-Naphthlceticacid四種萘酸中的一種，四種萘酸的中文名稱分別為a-萘甲酸、p-萘甲酸、(X-萘乙酸、P-萘乙酸；Phen為第二配體Phen是l，lO-鄰菲啰啉(l，lO-phenanthroline)的縮寫，化學式為C12H8N2;—共是19種配合物，稀土配合物的組成和化學式由下表列出表一合成的稀土配合物的組成和化學式列表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、稀土配合物的制備步驟如下(1)稀土氯化物的制備準備五個燒杯做好標記，依次加入EU203、Tb407、Gd203、La203、Y203。稀土氧化物的純度均為99.99%。然后都加入濃鹽酸；蒸發(fā)水分，濃縮結晶；分別制得氯化稀土EuCl3'6H20、TbCl3'6H20、GdCl3'6H20、LaCl3'6H20、YC13'6H20，備用；(2)以a-萘甲酸為第一配體，1,10-鄰菲啰啉為第二配體，稀土氯化物按照RECV6H20:a-萘甲酸:phen-l:3:l的物質的量的比分別稱??；取五個燒杯標號1，2，3，4，5,將稱取的稀土氯化物EuCl3.6H20、TbCl3.6H20、GdCl3.6H20、LaCl3'6H20、YC13'6H20，依次放入五個燒杯中。再取兩個燒杯標號6，7分別稱取a-萘甲酸、l，lO-鄰菲啰啉；7個燒杯的藥品都分別用適量95%的乙醇溶解；(3)將兩種配體溶液混合，在電磁攪拌情況下用lmol丄"NaOH溶液調(diào)節(jié)配體混合溶液pH值至67;然后將配體溶液分別逐滴加入到以上五個燒杯的稀土氯化物溶液中，期間有白色沉淀生成，攪拌反應35h。(4)將混合物靜置12h,抽濾，用95%的乙醇洗滌3次，在紅外干燥箱中烘干，得到以a-萘甲酸和1，10-鄰菲啰啉為配體的五種配合物；1號燒杯得到Eu(a-NMA)3pherrH20;2號燒杯得到Gd(a-NMA)3pheivH20;3號燒杯得到Tb(a-NMA)3pheivH20;4號燒杯得到La(a-NMA)3phen;5號燒杯得到Y(a-NMA)3phen;(5)以另外三種萘酸配合物為配體的配合物的合成方法與a-萘甲酸、1，10-鄰菲啰啉稀土配合物的制備方法相同。第二配體不變，第一配體a-萘甲酸分別用p-萘甲酸、a-萘乙酸、P-萘乙酸替換即可。實施例2抑菌試驗1、定性抑菌實驗以DMF(N,N-二甲基甲酰胺)為溶劑，配制0.012mol/L的5種稀土離子Eucl3、Tbcl3、Gdcl3、LaCl3、YC13.6H2。、5種配體a-NAA、j3-NAA、a-NMA、P-NMA、phen、以及Eu(a-NMA)3phen'H20、Tb(a-NMA)3phen'H20、Gd(a-NMA)3phen.H20、La(a-NMA)3phen、Y(a-NMA)3phen、Eu(P_NMA)3phen、丁bC(3國NMA)3phen、GdCp-NMA;bphen、Y(p-NMA)3phen、EuCa-NAA^pheiKTb(a-NAA)3phen、Gd(a-NAA)3phen、La(a畫NAA)3phen、Y(a-NAA)3phen、Eu(卩陽NAA)3phen、Tb(|3-NAA)3phen、Gd(p-NAA)3phen.H20、La(P-NAA)3phen、Y(卩-NAA)3phen溶液。配制Mueller-HintonAgar(MHA)培養(yǎng)基，每38g用1L水溶解，121°C，20min滅菌，倒板。在平板上劃線接種試驗菌金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌、表皮葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、奇異變形桿菌、粘質沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、嗜麥芽糖桿菌、新型隱球菌。取形狀規(guī)則的30張無菌濾紙長條，(長10cm，寬0.8cm)用鑷子將其分別浸入以上配置的藥品中潤濕，并在容器內(nèi)壁瀝去多余溶液；再將濾紙條放在固體培養(yǎng)基中間，垂直與接種區(qū)；培養(yǎng)1618h后，根據(jù)抑菌帶的長短，即可判斷各物質對不同類型微生物生長的影響，初步判斷其抗菌譜。結果表明19種配合物均有顯著抑菌作用，且抑菌譜較廣；單獨5種離子抑菌性較弱。phen和萘酸配體具有不同抑菌效果。2、定量抑菌實驗采用濾紙片法(cN0.6cm)進行定量抑菌實驗配制濃度梯度(0.004mol/L、0.008mol/L、0.01mol/L、0.012mol/L)的各種配合物，稀土離子、配體。將有同種藥品不同濃度的濾紙片貼在同一平皿上觀察藥品濃度對細菌生長的影響。實驗菌金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌、枯草芽胞桿菌步驟以藥品Eu(a-NMA)3phen*H20和實驗菌金黃色葡萄球菌為例。選取保藏菌種(金黃色葡萄球菌)，活化34次，得到活性較好的菌；挑單菌落，液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，LB的配制方法胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化鈉(NaCl)5g/L。NaOH調(diào)節(jié)pH到7.4，搖培，37°C160rpm16h。測其OD6(X)=1.8，大約l。9/ml;取60ml融好的Mudler-HintonAgar(MHA)培養(yǎng)基倒入小錐形瓶中，取過夜培養(yǎng)的菌懸液1.5ml滴入瓶內(nèi)，輕輕混勻，分別倒入三個平皿，為三組平行；用鑷子將滅過菌的直徑為0.6cm的濾紙片放到平皿中，分別取4種不同濃度的Eu(a-NNA)3phervH20藥品20ul滴到不同的濾紙片上；待藥品干掉，置于37'C恒溫生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1618h，觀察。其他藥品同樣進行實驗。觀察結果，記錄數(shù)據(jù)，計算平均值，統(tǒng)計分析。表二、絡合物抑菌實驗數(shù)據(jù)如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果表明稀土配合物的抑菌性能明顯優(yōu)于單獨的配體和離子，且隨著稀土配合物濃度的增大，抑菌效果增強。實施例3掃描電鏡觀察本實驗采用傳統(tǒng)的鋨酸一戊二醛雙重固定法進行電鏡樣品的制備。藥品為0.01mol/L的Eu(a-NMA)3phen'H20，實驗菌為埃希氏大腸桿菌。(1)取事先培養(yǎng)好的新鮮菌懸液1000(il裝入1.5mlEP管，四管裝，其中一管做對照。(2)取上述其中三管菌液離心，棄上清，各組分別加0.01mol/L的Eu(a-NMA)3phen.H2O500ial進行處理，取時間梯度0.5h、lh、2h。(3)將處理好的菌株及其對照離心，棄上清，用事先制備好的磷酸緩沖液清洗3次(每清洗一次都離心，棄上清)。(4)加戊二醛400^1固定23h，再用磷酸緩沖液清洗3次(方法同3)。(5)換用鋨酸固定0.5lh，磷酸緩沖液清洗3次(同上)。(6)乙醇梯度脫水，取梯度30%，50%，70%,90%,100%(兩次)。(7)叔丁醇置換兩次，將叔丁醇處理好懸濁液適量均勻涂在事先裁好的蓋玻片上，一起固定在載物臺上。(8)抽真空干燥，徹底干燥的樣品經(jīng)離子濺射儀濺射4分鐘，噴金并進行電鏡觀察。結果顯示對照組埃希氏大腸桿菌菌體形態(tài)正常，表面光滑，分布均勻。絡合物處理菌體不同時間后，配合物對細菌細胞形態(tài)有不同程度的破壞作用，且隨時間增長，作用越來越明顯。埃希氏大腸桿菌菌體明顯凝集，出現(xiàn)粘連，質壁分離現(xiàn)象，處理lh、2h的菌體明顯變形，隨時間增長菌體變形越明顯，對其破壞程度越大。有報道認為配合物的抗菌性是由于配合物脂溶性較好，易于和細胞壁上C=0、P=0結合，濃度較大時，細胞壁通透性被破環(huán)，不再是菌體完整的屏障。配合物進入細胞影響胞內(nèi)酶的活性，影響DNA的復制。權利要求1、一種稀土配合物，其特征在于結構式為REL3phen·nH2O；其中RE是稀土元素Eu3+、Tb3+、Gd3+、La3+、Y3+中的任何一種；L是L是α-Naphthoicacid，β-Naphthoicacid，α-Naphthlceticacid，β-Naphthlceticacid四種萘酸中的一種；Phen是1，10-鄰菲啰啉；n＝0或1。2、如權利要求1所說的稀土配合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(1)分別將Eu2(D3、Tb407、Gd203、La203、Y203稀土氧化物溶于濃鹽酸中，蒸發(fā)水分，濃縮結晶，制得相應的稀土氯化物EuCV6H20、TbCl3'6H20、GdCl3'6H20、LaCl3.6H20、YC13.6H20;(2)以L為第一配體選用a-萘酸，I，IO鄰菲啰啉為第二配體，五種稀土氯化物都按照REC13'6H20:L(a-萘酸):phen=l:3:l的物質的量的比稱取，分別用95%的乙醇溶解，得到五種稀土氯化物的乙醇溶液、兩種配體L((x-萘酸)和phen乙醇溶液；(3)將兩種配體溶液混合，調(diào)節(jié)pH值至67，將混合溶液逐滴加入到REC13-6H20稀土氯化物溶液中，攪拌反應3~5h;(4)混合液靜置12h，抽濾，用95%的乙醇洗滌3次，在紅外干燥箱中烘干，得到以a-萘甲酸和1,10-鄰菲啰啉為配體的五種配合物。3、根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中第一配體L分別用P-萘甲酸、(x-萘乙酸、(3-萘乙酸替換，制備的稀土氯化物為EuCl3*6H20、TbCl3.6H20、GdCl3.6H20、LaCl3.6H20、YC13.6H20。4、一種如權利要求l所述的稀土配合物的應用，其特征是稀土配合物在抑制細菌中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了萘酸、1，10-鄰菲啰啉稀土配合物及其抑制細菌的作用。結構式為REL₃phen·nH₂O；其中RE是稀土元素Eu³⁺、Tb³⁺、Gd³⁺、La³⁺、Y³⁺中的任何一種；L是α-Naphthoicacid，β-Naphthoicacid，α-Naphthlceticacid，β-Naphthlceticacid四種萘酸中的一種；n＝0或1。以L為第一配體，鄰菲啰啉為第二配體，按照RE³⁺∶L∶phen＝1∶3∶1的物質的量的比，加乙醇溶解，混合兩種配體，加入到稀土氯化物溶液中，攪拌反應合成稀土配合物。采用濾紙片法對新型稀土配合物進行了定性和定量抑菌實驗，結果表明稀土配合物對多種實驗細菌均有抑菌作用，優(yōu)于單獨的配體和離子，且隨著濃度的增加，抑菌效果增強；本發(fā)明為開發(fā)生物抑菌劑提供了有益嘗試。文檔編號A61K31/555GK101235047SQ200810054578公開日2008年8月6日申請日期2008年2月29日優(yōu)先權日2008年2月29日發(fā)明者凱楊,楠楊,王瑞芬,范瓊英,趙寶華,楠項申請人:河北師范大學