專利名稱：：一種核糖核酸降解片斷復合物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種核酸降解片斷復合物，特別是一種核糖核酸(RNA)降解片斷復合物及其應用。
背景技術(shù)：
：多基因疾病是由多種基因病變引起的疾病，常見的有腫瘤、高血壓、糖尿病、艾滋病及衰老等等，這些疾病往往沒有特效藥，不易治愈。自2002年以來，小分子RNA對于各種疾病的抑制作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)并重視。已經(jīng)有研究證明了小分子RNA對腫瘤、丙肝病毒等具有有效的抑制作用，為這些困擾人類的疾病的治療提供了全新的途徑。本發(fā)明在上述技術(shù)背景下，應用最新的分子生物學理論和技術(shù)，提出了一種對多種多基因疾病的治療有效的核糖核酸降解片斷復合物，以及該復合物在治療多基因疾病藥物的制備中的應用，以期獲得更好的治療效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種核糖核酸降解片斷復合物，使其對更多種類的多基因疾病具有有效的抑制作用，并且具有更好的效果。本發(fā)明的這一目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的提供一種核糖核酸降解片斷復合物，它是由豬內(nèi)臟中分離純化出的核糖核酸的人工降解片斷組成的。所述的豬優(yōu)選非成年豬，進一步優(yōu)選胎豬，再進一步優(yōu)選15~20公分長度的無體毛的胎豬。所述豬內(nèi)臟優(yōu)選豬的肝臟、腎臟和心臟。所述分離并純化的方法可以是常規(guī)的酚提取-沉淀法和聚乙二醇沉淀法。具體方法可以分別為A.酚提取-沉淀法1.在細胞裂解后離心分離出的含核酸的水相中加入等體積的提取液(pH6.0的0.01MTris平衡過的苯酚氯仿異戊醇的體積比為1:1:1/24的混合液)振蕩提取515分鐘，然后5'C下6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，收集上清液；2.在步驟1所得上清液中加入等體積的上述提取液，重復上述提取和離心過程，收集上清液；3.用等體積的氯仿對步驟2所得上清液進行提取，并在5'C下6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液再重復本步驟的提取和離心過程，收集上清液；4.在步驟3得到的上清液中加入2.5倍體積的95%的乙醇和1/10體積的3M乙酸鈉，沉淀過夜，并5'C下6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后收集沉淀，將沉淀溶于pH6.0的0.01M的Tris緩沖液中備用；B.聚乙二醇沉淀法在溶有含雜質(zhì)的RNA的緩沖液中加入等體積10%的聚乙二醇(PEG4000)沉淀30~60分鐘，5'C下6000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后收集沉淀。所述人工降解的方法可以是常規(guī)的堿降解法，也可以優(yōu)選如下方法在溶有RNA分子的緩沖液中加入等體積0.2NNaOH，于0"C放置2060分鐘后調(diào)節(jié)pH至6.0，再在5'C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，收集沉淀。其中調(diào)節(jié)pH可用36%的乙酸溶液。上述分離純化和人工降解的過程可以是先用酚提取-沉淀法提取純化RNA大分子后，將其人工降解，再用聚乙二醇沉淀法進一步純化；也可以是將RNA大分子先用酚提取-沉淀法和聚乙二醇沉淀法充分分離純化后再人工降解。經(jīng)過上述分離、純化和人工降解后，用70%的乙醇洗該沉淀，再用相同方法離心后收集沉淀，將得到的沉淀在-2(TC下保存?zhèn)溆?。?jīng)過上述分離、純化和人工降解后得到的本發(fā)明的核糖核酸降解片斷為一系列大小不等的RNA分子，它們的核苷酸數(shù)量范圍在10~300之間，分子量在2><102~6><104之間，它們的復合物為白色或淺黃色粉末，經(jīng)過電泳結(jié)合分光光度法測得其純度大于98%，易溶于水、生理鹽水，比較穩(wěn)定，需要低溫保存。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述核糖核酸降解片斷復合物在治療多基因疾病藥物的制備中的應用。本發(fā)明的這一目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的將上述核糖核酸降解片斷復合物按照常規(guī)方法制備成注射劑。所述注射劑優(yōu)選為水性注射液或注射用無菌粉末。所述制備注射劑的常規(guī)方法可以是將降解得到的本發(fā)明核糖核酸降解片斷復合物溶解于50倍體積的生理鹽水中，制成水性注射液；或者再將所述水性注射液冷凍干燥制成注射用無菌粉末。所述的多基因疾病為肝癌或肉瘤等疾病。本發(fā)明應用方法制備的注射劑的使用方法是用于人體注射前，按照4mg/kg體重的劑量標準，用生理鹽水將上述制備好的注射劑進行適當溶解或稀釋，然后將溶解或稀釋好的注射劑進行靜脈注射；用于動物體靜脈注射時，劑量標準是用于人體時的10倍。目前，學術(shù)界認為小分子的核酸片斷對多基因疾病的治療機制主要有以下兩方面小分子的核糖核酸片斷可以對病變蛋白質(zhì)的合成進行干擾，即小分子核酸干擾；小分子的核糖核酸片斷可以阻止癌細胞擴散。本發(fā)明人認為，除上述治療機制外，小分子的核酸片斷對多基因疾病的治療機制還在于外源正常核酸片斷可以從分子水平矯正、修復病區(qū)核酸分子或基團的畸變。本發(fā)明的RNA降解片斷復合物是RNA大分子經(jīng)人工降解后形成的一系列大小不等的RNA片斷組成的復合物。經(jīng)過所述人工降解方法，使原來隱藏在核酸大分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部的不同大小的結(jié)構(gòu)片斷暴露出來?；谏鲜鋈N治療機制，由這一系列核酸片斷組成的復合物，能夠?qū)Χ喾N多基因疾病實現(xiàn)更廣泛的治療。目前現(xiàn)有技術(shù)中用于治療多基因疾病的核糖核酸基本上都是大分子物質(zhì)，而本發(fā)明的核糖核酸降解片斷復合物是核糖核酸大分子經(jīng)過人工降解后得到的大量小分子片斷組成的；本發(fā)明的核糖核酸片斷提取自天然的動物組織而非化學合成，因此是單鏈RNA。通過上述技術(shù)方案獲得的本發(fā)明核糖核酸降解片斷在抑制肝癌、肉瘤等疾病的發(fā)展方面具有顯著效果，有以下動物實驗為證實驗1.本發(fā)明核糖核酸降解片斷復合物對小鼠移植性肝癌H22生長的影響材料與方法實驗樣品本發(fā)明實施例1制備的核糖核酸降解片斷復合物實驗動物健康ICR小鼠，雌性，體重20-22g，II級清潔級，由昆明醫(yī)學院省天然藥物藥理重點實驗室動物室提供。實驗瘤種小鼠移植性肝癌H22，引自中國科學院上海藥物研究所實驗方法將接種7天后生長良好的腫瘤細胞用生理鹽水調(diào)成6.5xl06/mL濃度的細胞懸液，接種于實驗動物右側(cè)腋部皮下，0.2mL/只。接種24小時后隨機分為5組，分別為陰性對照組(A)、陽性對照組(B)、未降解核酸大分子對照組(C)、低劑量實驗組(D)和高劑量實驗組(E)，每組8只，分別通過尾靜脈注射給藥，其中A組注射0.1mL/10g體重的生理鹽水，B組注射順鉑(DDP，云南省個舊市生物制藥廠，批號20010501)lmg/kg體重，C組注射未降解的核糖核酸20mg/kg體重，D組和E組注射上述實驗樣品，劑量分別為20mg/kg體重和40mg/kg。按上述給藥方案連續(xù)給藥10天，停藥1天后處死動物，分別稱體重和瘤重，計算各組的平均瘤重并按以下公式計算腫瘤生長的抑制率(抑瘤率)對照組平均瘤重_給藥組平均瘤重抑瘤率(％)=-xlOO%對照組平均瘤重實驗結(jié)果見表l表l.本發(fā)明核糖核酸降解片斷復合物對小鼠移植性肝癌H22生長的抑制作用(X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上述實驗結(jié)果可見，本發(fā)明的核糖核酸降解片斷復合物對小鼠移植性肝癌H22生長的抑制作用與陰性對照組相比在統(tǒng)計學上具有高度顯著性，且量效結(jié)果明顯；而且可以看到，經(jīng)過人工降解后的核糖核酸降解片斷復合物要比未降解的核糖核酸大分子對肝癌的抑制作用顯著增強。實驗2.本發(fā)明核糖核酸降解片斷復合物對小鼠移植性肉瘤S^生長的影響實驗樣品、實驗動物、實驗方法均與實驗1相同，只是實驗不設未降解核酸大分子對照組，實驗動物共分4組陰性對照組(A)、陽性對照組(B)、低劑量實驗組(C)和高劑量實驗組(D)，而且所使用的瘤種是小鼠移植性肉瘤實驗結(jié)果見表2。表2.本發(fā)明核糖核酸降解片斷復合物對小鼠移植性肉瘤s咖生長的抑制作用(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上述實驗結(jié)果可見，本發(fā)明的核糖核酸降解片斷復合物對小鼠移植性肉瘤Sw生長的抑制作用與陰性對照組相比在統(tǒng)計學上具有高度顯著性，且量效結(jié)果明顯。另經(jīng)急性毒性實驗得到，本發(fā)明核糖核酸降解片斷復合物MID〉266.0mg/kg，可見本發(fā)明的核糖核酸降解片斷復合物具有高效低毒的優(yōu)點。具體實施方式實施例1.1.將15公分左右體長的胎豬洗凈，取其肝臟、腎臟和心臟，洗去血液后切碎，再用切割機粉碎，加入其10倍體積的0.2M的蔗糖，再加入NaCl至其終濃度為0.14M，用膠體磨處理，然后在5"C以5000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，取所得上清液溶于其10倍體積的0.01MTris溶液，保持pH在6.0,在其中加入等體積的提取液，該提取液為pH6.0的O.OlMTris溶液平衡過的苯酚:氯仿:異戊醇按1:1:1/24體積比混合的混合溶液，然后振蕩提取10分鐘后在5°C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘取上清液；2.用上述步驟1的提取液提取步驟1所得的上清液，并在5t:以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，取上清液；3.將步驟2得到的上清液用等體積氯仿提取，并在5°C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，取上清液后再用等體積氯仿提取并同條件離心，取上清液；4.在步驟3得到的上清液中加入2.5倍體積95%的乙醇和1/10體積的3M乙酸鈉，沉淀過夜，然后在5。C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，收集沉淀并溶于pH6.0的O.OlMTris溶液中；5.在步驟4得到的溶液中加入等體積的10n/。的PEG4000沉淀40分鐘，然后5°C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，收集沉淀，溶于pH6.0的O.OIMTris溶液中；6.在步驟5得到的溶液中加入等體積0.2NNaOH，在0'C放置反應60分鐘后用36。/。的乙酸調(diào)節(jié)pH至6.0，然后5。C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，收集沉淀，用70%的乙醇洗，再用相同方法離心收集沉淀，即得到本發(fā)明所述的RNA降解片斷復合物。對上述RNA降解片斷復合物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗后，可以證實其中的RNA片段在2><102~6><104分子量之間的區(qū)域內(nèi)均有顯色。上述所得RNA降解片斷復合物為白色或淺黃色粉末，經(jīng)電泳結(jié)合分光光度法檢測，其純度大于98%，易溶于水和生理鹽水，比較穩(wěn)定，需-2(TC保存?zhèn)溆?。實施?.1.將20公分左右體長的胎豬洗凈，取其肝臟、腎臟和心臟，洗去血液后切碎，再用切割機粉碎，加入其10倍體積的0.2M的蔗糖，再加入NaCl至其終濃度為0.14M,用膠體磨處理，然后在5。C以5000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，取所得上清液溶于其10倍體積的O.OIMTris溶液，保持pH在6.0，在其中加入等體積的提取液，該提取液為pH6.0的O.OlMTris溶液平衡過的苯酚:氯仿:異戊醇按1丄1/24體積比混合的混合溶液，然后振蕩提取15分鐘后在5'C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘取上清液；2.用上述步驟1的提取液提取步驟1所得的上清液，并在5-C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，取上清液；3.將步驟2得到的上清液用等體積氯仿提取，并在5°C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，取上清液后再用等體積氯仿提取并同條件離心，取上清液；4.在步驟3得到的提取液中加入2.5倍體積95%的乙醇和1/10體積的3M乙酸鈉，沉淀過夜，然后在5。C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，收集沉淀并溶于pH6.0的0.01MTris溶液中；5.在步驟4得到的溶液中加入等體積0.2NNaOH，在0"C放置反應30分鐘后用36%的乙酸調(diào)節(jié)pH至6.0;6.在步驟5得到的溶液中加入等體積的10%的PEG4000沉淀60分鐘，然后5'C以6000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，收集沉淀，然后用70%的乙醇洗，再用相同方法離心收集沉淀，即得到本發(fā)明所述的RNA降解片斷復合物。對上述RNA降解片斷復合物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗后，可以證實其中的RNA片段在2xl0^6xl(^分子量之間的區(qū)域內(nèi)均有顯色。所得RNA降解片斷復合物為白色或淺黃色粉末，經(jīng)電泳結(jié)合分光光度法檢測，其純度大于98%,易溶于水和生理鹽水，比較穩(wěn)定，需-2(TC保存?zhèn)溆?。實施?.應用實施例將lml的實施例1制備的核糖核酸降解片斷復合物溶解于50ml的生理鹽水中，即制備成本發(fā)明所述的核糖核酸降解片斷復合物注射液的儲備液，再用分光光度法測定該儲備液的濃度。人體使用時，根據(jù)4mg/kg的劑量標準將上述儲備液用生理鹽水進行適當稀釋后，通過靜脈注射給藥。實施例4.應用實施例將1.5ml的實施例2制備的核糖核酸降解片斷復合物溶解于生理鹽水中，使終濃度為4mg/ml然后用常規(guī)方法將制備好的溶液冷凍干燥，即得到本發(fā)明所述的核糖核酸降解片斷復合物的注射用無菌粉末。人體使用時，根據(jù)4mg/kg的劑量標準將上述無菌粉末用生理鹽水溶解后，通過靜脈注射給藥。權(quán)利要求1.一種核糖核酸降解片斷復合物，其特征在于它是由豬內(nèi)臟中分離純化出的核糖核酸的人工降解片斷組成的。2.權(quán)利要求1所述的核糖核酸降解片斷復合物，其特征在于所述的豬是非成年豬。3.權(quán)利要求2所述的核糖核酸降解片斷復合物，其特征在于所述非成年豬是胎豬。4.權(quán)利要求1所述的核糖核酸降解片斷復合物，其特征在于所述豬內(nèi)臟是豬的肝臟、腎臟和心臟。5.權(quán)利要求1所述的核糖核酸降解片斷復合物，其特征在于所述分離和純化的方法是酚提取-沉淀法和聚乙二醇沉淀法。6.權(quán)利要求1所述的核糖核酸降解片斷復合物，其特征在于所述人工降解的方法是堿降解法。7.權(quán)利要求6所述的核糖核酸降解片斷復合物，其特征在于所述堿降解法是在溶有核糖核酸的緩沖液中加入等體積0.2NNaOH，于0。C放置2060分鐘后調(diào)節(jié)pH至6.0;經(jīng)過所述人工降解，所述核糖核酸片斷的核苷酸數(shù)量范圍在10~300之間，分子量在2xl(^6xl(^之間。8.權(quán)利要求1所述的核糖核酸降解片斷復合物在治療多基因疾病藥物的制備中的應用，其特征在于將所述核糖核酸降解片斷復合物按照常規(guī)方法制備成注射劑。9.權(quán)利要求8所述的核糖核酸降解片斷復合物在治療多基因疾病藥物的制備中的應用，其特征在于所述注射劑為水性注射液或注射用無菌粉末。10.權(quán)利要求8所述的核糖核酸降解片斷復合物在治療多基因疾病藥物的制備中的應用，其特征在于所述的多基因疾病為肝癌或肉瘤。全文摘要本發(fā)明涉及一種核糖核酸降解片斷復合物，它是由豬內(nèi)臟中分離純化出的核糖核酸的人工降解片斷組成的；所述核糖核酸人工降解片斷的核苷酸數(shù)量范圍在10～300之間，分子量在2×10²～6×10⁴之間。本發(fā)明還涉及所述核糖核酸降解片斷復合物在治療肝癌等多基因疾病藥物制備中的應用。文檔編號A61K35/22GK101229183SQ20081005636公開日2008年7月30日申請日期2008年1月17日優(yōu)先權(quán)日2008年1月17日發(fā)明者周錫漳申請人:周錫漳