專利名稱：絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非病毒基因載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新型的非病毒基因藥物載體，具體是涉及一類絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非 病毒基因藥物載體。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，攻克腫瘤一直是世界矚目的研究熱點(diǎn)。1995 年世界衛(wèi)生組織對世界上近100種抗腫瘤藥物進(jìn)行了評價(jià)，順鉑抗腫瘤藥物的療效、市場等 綜合評價(jià)位居第2位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國抗腫瘤化療治療方案中，以順鉑為主或有順鉑參加配 伍的抗腫瘤藥物方案占所有化療方案的70%-80%。由此可見，鉑類抗腫瘤藥物的療效已經(jīng) 為大家所公認(rèn)，目前，已經(jīng)有了三代的臨床用藥，其中第一代順鉑；第二代卡鈾；第三 代奧沙利鉑、奈達(dá)鉑。還有很多正在研制階段的鉑類抗腫瘤新藥，如環(huán)鉑、樂鉑、硫鉑等。
基因藥物治療是近二十年來興起的新型治療方法，其基本策略是將外源基因通過各類載 體導(dǎo)入目的細(xì)胞并得到有效表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。在基因藥物釋放體系中，載體 的研究始終是研究的熱點(diǎn)。目前普遍應(yīng)用的病毒載體介導(dǎo)系統(tǒng)，雖然其有很高的基因轉(zhuǎn)染效 率，但高的細(xì)胞毒性、較低的靶向性、DNA攜帶能力的限制性、生產(chǎn)包裝及高價(jià)格等問題 限制了病毒載體的應(yīng)用范圍，尤其是1999年，美國基因治療臨床實(shí)驗(yàn)因使用腺病毒載體導(dǎo) 致"Jesse Gelsinger"死亡事件，使研究者在病毒類載體的臨床使用上更為謹(jǐn)慎。相反，非 病毒性轉(zhuǎn)基因載體具有免疫反應(yīng)低，安全性能高，易于人工合成等特點(diǎn)，在基因藥物的研究 中日益受到重視。隨著人類基因組框架圖的解析成功，更多的基因藥物從實(shí)驗(yàn)室研究所階段 進(jìn)入臨床實(shí)用階段。
非病毒型基因載體存在著毒性、生物相容性、降解性等問題，目前有一種合成的材料聚 乙烯亞胺，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分子量22000—25000的聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染效率非常高，但是存在毒性和 降解性的問題，小分子量(600， 1200， 2000)的聚乙烯亞胺毒性小，易于在生物體內(nèi)代謝， 但是幾乎沒有轉(zhuǎn)染效率。
用聚乙二醇修飾聚乙烯亞胺(聚乙烯亞胺的PEG化)具有延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間， 降低藥物免疫原性、毒性，增加其水溶性及穩(wěn)定性等優(yōu)良特性。Kim課題組報(bào)導(dǎo)了 (Sagam，K; Kim, SW. A new synthesis of galactose-poly(ethylene glycol)-polyethylenimine for gene delivery to hepatocytes. Journal of Controlled Release, Volume 79, Issues 1-3, 19 February 2002, Pages 271-281 )用聚乙二醇修飾聚 乙烯亞胺提高了聚乙烯亞胺的轉(zhuǎn)染效率，降低了聚乙烯亞胺的毒性。Petersen H等報(bào)導(dǎo)了(Petersen, H; Fechner， PM; Martin, AL, et al. Polyethylenimine-graft-poly(ethylene glycol) copolymers: influence of copolymer clock structure on DNA complexation and biological activities as gene delivery system. Bioconjugate Chem， Volumel3, 2002, Pages845-854)用聚乙二醇修飾聚乙烯亞胺可以提高其作為非 病毒基因藥物載體的基因表達(dá)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一類新型的絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物，并用聚乙二醇修飾聚乙烯亞胺的非 病毒基因藥物載體。
本發(fā)明提供的絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非病毒基因藥物載體:是Pt-PEI-PEG或PEG-PEI-Pt 復(fù)合物，以聚乙烯亞胺(PEI)為骨架，連接聚乙二醇(PEG),絡(luò)合鉑(Pt)類抗腫瘤藥物 構(gòu)成；所述復(fù)合物的鉑類化合物PEI物質(zhì)的量摩爾比為1 5 : 1; PEG摩爾用量為PEI物 質(zhì)的量的1 5%;組分所占摩爾百分比分別為Pt: 48.8 83.2 %， PEI: 16.5 49.8 %， PEG:
0. 17、2.44%。
本發(fā)明提供的絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非病毒基因藥物載體的制備方法是聚乙烯亞胺
(PEI)先與鉑類化合物進(jìn)行配位反應(yīng)生成Pt-PEI配合物，再與聚乙二醇(PEG)發(fā)生反應(yīng)， 生成Pt-PEI-PEG復(fù)合物；或PEI先與聚乙二醇PEG發(fā)生反應(yīng)，生成PEG-PEI復(fù)合物，再與 鈾類化合物配位反應(yīng)，生成PEG-PEI-Pt復(fù)合物。
制備步驟如下
1、 Pt-PEI-PEG復(fù)合物的合成方法一
1) Pt-PEI配合物的合成將PEI和鉑類化合物分別用10 50倍(摩爾/體積)量的無水乙 醇溶解，按鉑類化合物PEI物質(zhì)的量摩爾比為1 5 : 1;在攪拌的條件下，將鉑類化合 物的乙醇溶液緩慢滴入PEI乙醇溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 4小時(shí)，得到Pt-PEI配合物的 懸濁液；過濾，乙醇揮發(fā)干后，制得Pt-PEI配合物；
2) Pt-PEI配合物的PEG化將Pt-PEI配合物用50 200倍(摩爾/體積)量的二氯甲垸溶 解；PEG用50 200倍(摩爾/體積)量的二氯甲烷溶解；PEG摩爾用量為PEI物質(zhì)的量 的1 5%;在攪拌的條件下，將PEG的二氯甲烷溶液緩慢加入Pt-PEI的二氯甲垸溶液中， 繼續(xù)攪拌反應(yīng)l 4h，靜置，二氯甲烷揮發(fā)干后，得到Pt-PEI-PEG復(fù)合物。
2、 PEG-PEI-Pt復(fù)合物的合成方法二
1) PEG-PEI復(fù)合物的合成將PEI用10 50倍(摩爾/體積)量的二氯甲烷溶解；PEG用 50 200倍(摩爾/體積)量二氯甲烷溶解；PEG摩爾用量為PEI物質(zhì)的量的1 5%;在 攪拌的條件下，將PEG的二氯甲烷溶液緩慢滴入PEI的二氯甲烷溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 4h，得到PEG-PEI復(fù)合物溶液。 2) PEG-PEI復(fù)合物與鉬類化合物配位反應(yīng)將鉬類化合物用10 50倍(摩爾/體積)量乙 醇溶解，按鉑類化合物PEI物質(zhì)的量摩爾比為1 5 : 1，在攪拌的條件下，將鉑類化合 物緩慢滴入上述PEG-PEI復(fù)合物溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 4小時(shí)，靜置，二氯甲烷和 乙醇揮發(fā)干后得到PEG-PEI-Pt復(fù)合物。
本發(fā)明所述的聚乙烯亞胺為432Da (直鏈型)、600Da、 1200Da、 2000Da、 25kDa等分 子量的聚乙烯亞胺中任一種。
本發(fā)明所述的鉑類化合物為四氯化鉑、二氯化鉑、三氯化鉑、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、 奈達(dá)鉑等鉑類化合物中任一種。
本發(fā)明所述聚乙二醇為2000Da、 3400Da、 5000Da、 10000Da、 12000Da、 20000Da等分 子量的聚乙二醇中任一種。
本發(fā)明中鉑類化合物pei物質(zhì)的量摩爾比為1 5 : l，表示鉑類化合物的摩爾用量是
PEI物質(zhì)的量的同等倍數(shù)到5倍之間的任一倍數(shù)。
本發(fā)明中PEG用量為PEI物質(zhì)的量的1 5%，表示PEG的摩爾用量是PEI物質(zhì)的量的 1%到5%之間的任一百分比。
本發(fā)明的技術(shù)效果
本發(fā)明得到的Pt-PEI-PEG復(fù)合物中有很多類似鉑類抗腫瘤藥物的結(jié)構(gòu)。因?yàn)镻EI的結(jié) 構(gòu)呈樹枝狀，其結(jié)構(gòu)的主體為…N-C-C-N-C-C…這樣的重復(fù)結(jié)構(gòu)，有豐富的氨基和亞氨基存 在，因而便于與Pt的配位反應(yīng)且生成配合物的局部結(jié)構(gòu)與鉑類抗腫瘤藥物非常相似，因此 能有鉑類抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用。
本發(fā)明采用的聚乙烯亞胺PEI，具有3種不同的氨基形式，形成了不同的緩沖體系，氨 基的存在基本作用是結(jié)合DNA，擴(kuò)展的功能是在攜帶DNA進(jìn)入細(xì)胞時(shí)不同的氨基組合成不 同的緩沖對，能保護(hù)DNA免遭細(xì)胞質(zhì)中的溶酶體降解。
本發(fā)明采用聚乙二醇修飾聚乙烯亞胺的技術(shù)得到的Pt-PEI-PEG復(fù)合物有較好的水溶性 和穩(wěn)定性，該復(fù)合物還很具有藥物進(jìn)行聚乙二醇修飾后一般具有的其他優(yōu)良特性，如延長藥 物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，降低藥物免疫原性、毒性等等。
由于鉑類化合物被有機(jī)大分子載體包被，從而使鉑類藥物的控制釋放成為可能。又由于 鉑類化合物與PEI配位以后，PEI上還有很多閑置的氨基和亞氨基，即使進(jìn)行聚乙二醇修飾 后，PEI上還是有很多氨基或亞氨基剩余，這些基團(tuán)的存在，使Pt-PEI-PEG復(fù)合物與基因藥 物的復(fù)合成為可能，因而有望成為同時(shí)運(yùn)載小分子抗腫瘤藥物與基因藥物的多功能載體，若再接上葉酸或其他配體，則可進(jìn)一歩成為具有革巴向腫瘤作用的多功能復(fù)合物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)①連接了鉑類藥物，有鉑類抗腫瘤藥物的功效；②進(jìn)行了聚乙二醇修飾， 有聚乙二醇修飾產(chǎn)物的優(yōu)良特性，如穩(wěn)定性高、水溶性好、體內(nèi)循環(huán)周期長以及毒性降低等 等；(D由于鉑類藥物被大分子有機(jī)物所包被，使鉑類藥物可以緩慢釋放，達(dá)到藥物控釋的目 的；④還可進(jìn)一步與基因藥物復(fù)合，成為同時(shí)運(yùn)載小分子藥物與基因藥物的多功能載體。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但不限于實(shí)施例所公開的內(nèi)容。 實(shí)施例l: PtCl4-PEI600-PEG3400復(fù)合物的合成(600、 3400等數(shù)字表示相應(yīng)原料的分子量， 下同)。
1) PtCl4-PEI600配合物的合成
將0.2mmolPtCl4和0.2mmolPEI600分別用5mL無水乙醇溶解，在攪拌的條件下，將PtCl4 乙醇溶液緩慢滴入PEI600乙醇溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)lh，得到PtCl4-PEI600配合物的懸濁 液。過濾，固體自然揮干后收集備用。
2) PtCl4-PEI600配合物的PEG化
將上述制得的PtCl4-PEI600配合物固體全部溶解在30mL 二氯甲烷中，可略微加熱，增 大其溶解度。再在攪拌的條件下，將PEG3400 (用量O.Olmmol)的二氯甲烷溶液(二氯甲烷 用量為lmL)緩慢加入其中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，靜置，待二氯甲垸揮干后得到固體產(chǎn)物，即 PtCl4-PEI600-PEG3400復(fù)合物。 實(shí)施例2: PEG3400-PEI1200-PtCU復(fù)合物的合成。
1) PEG3400-PEI1200復(fù)合物的合成
將0.2mmolPEI1200用10mL 二氯甲烷溶解，0.002mmolPEG3400用0.4mL 二氯甲烷溶 解，在攪拌的條件下，將PEG3400 二氯甲烷溶液緩慢滴入PEI1200 二氯甲垸溶液中，繼續(xù) 攪拌反應(yīng)lh，得到PEG3400-PEI1200復(fù)合物溶液。
2) PEG3400-PEI1200-PtCl4復(fù)合物的合成
將0.4mmolPtCU用10mL無水乙醇溶解，在攪拌的條件下，將PtCl4乙醇溶液緩慢滴入 上述PEG3400-PEI1200復(fù)合物溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，靜置，待二氯甲垸和乙醇揮干后 得到略帶粘性的固體產(chǎn)物，即PEG3400-PEI1200-PtCU復(fù)合物。 實(shí)施例3: PtCl2(NH3)2-PEI1200-PEG5000復(fù)合物的合成。 1) PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物的合成
將0.6mmol順鈾PtCl2(NH3)2用20mL無水乙醇溶解，0.2mmolPEI1200用5mL無水乙醇溶解，在攪拌的條件下，將PtCl2(NH3)2乙醇溶液緩慢滴入PEI1200乙醇溶液中，繼續(xù)攪 拌反應(yīng)3h，得到PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物的懸濁液。過濾，固體自然揮干后收集備用。 2) PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物的PEG化
將上述制得的PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物固體全部溶解在30mL 二氯甲垸中，可略微加 熱，增大其溶解度。再在攪拌的條件下，將PEG5000 (用量0.005mmol)的二氯甲垸溶液(二 氯甲烷用量lmL)緩慢加入其中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，靜置，待二氯甲烷揮干后得到固體產(chǎn) 物，即PtCl2(NH3)2-PEI1200-PEG5000復(fù)合物。 實(shí)施例4: PEG5000-PEI600- PtCl2(NH3)2復(fù)合物的合成。
1) PEG5000-PEI600復(fù)合物的合成
將0.2mmolPEI600用10mL 二氯甲烷溶解，0.008mmolPEG5000分別用lmL 二氯甲烷溶 解，在攪拌的條件下，將PEG5000 二氯甲垸溶液緩慢滴入PEI600 二氯甲垸溶液中，繼續(xù)攪 拌反應(yīng)2h，得到PEG5000-PEI600復(fù)合物溶液。
2) PEG5000-PEI600- PtCl2(NH3)2復(fù)合物的合成
將1.0mmol順鉑PtCl2(NH3)2用30mL無水乙醇溶解，在攪拌的條件下，將PtCl2(NH3)2 乙醇溶液緩慢滴入上述PEG5000-PEI600復(fù)合物溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h，靜置，待二氯甲 烷和乙醇揮干后得到略帶粘性的固體產(chǎn)物，即PEG5000-PEI600-PtCl2(NH3)2復(fù)合物。
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權(quán)利要求
1、一種絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非病毒基因藥物載體，是Pt-PEI-PEG或PEG-PEI-Pt復(fù)合物，其特征是以聚乙烯亞胺為骨架，連接聚乙二醇，絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物構(gòu)成；所述復(fù)合物的鉑類化合物∶PEI物質(zhì)的量摩爾比為1～5∶1；PEG摩爾用量為PEI物質(zhì)的量的1～5％；各組分所占摩爾百分比分別為Pt48.8～83.2％，PEI16.5～49.8％，PEG0.17～2.44％。
2、 權(quán)利要求1所述的絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非病毒基因藥物載體的制備方法，其特征是所 述Pt-PEI-PEG復(fù)合物載體的合成歩驟如下* Pt-PEI配合物的合成將PEI和鉑類化合物分別用摩爾/體積為10 50倍量的無水乙醇 溶解，按鉑類化合物PEI物質(zhì)的量摩爾比為1 5 : 1的用量；在攪拌的條件下，將鉑 類化合物的乙醇溶液緩慢滴入PEI乙醇溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 4小時(shí)，得到Pt-PEI 配合物的懸濁液；過濾，乙醇揮發(fā)干后，制得Pt-PEI配合物；* Pt-PEI配合物的PEG化將歩驟1制得Pt-PEI配合物和PEG分別用摩爾/體積為50 200 倍量的二氯甲烷溶解；按PEG摩爾用量為歩驟1中PEI物質(zhì)量的1 5M的用量；在攪拌 的條件下，將PEG的二氯甲垸溶液緩慢加入Pt-PEI的二氯甲垸溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)l 4小時(shí)，靜置，二氯甲垸揮發(fā)干后，得到Pt-PEI-PEG復(fù)合物。
3、 權(quán)利要求1所述的絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非病毒基因藥物載體的制備方法，其特征是所 述PEG-PEI-Pt復(fù)合物載體的合成歩驟如下* PEG-PEI復(fù)合物的合成將PEI用摩爾/體積為10 50倍量的二氯甲烷溶解；PEG用摩 爾/體積為50 200倍量二氯甲垸溶解；PEG摩爾用量為PEI物質(zhì)的量的1 5%的用量； 在攪拌的條件下，將PEG的二氯甲垸溶液緩慢滴入PEI的二氯甲烷溶液中，繼續(xù)攪拌反 應(yīng)1 4小時(shí)，得到PEG-PEI復(fù)合物溶液。* PEG-PEI復(fù)合物與鉑類化合物配位反應(yīng)將鉑類化合物用摩爾/體積為10 50倍量乙醇 溶解，按鉑類化合物PEI物質(zhì)的量摩爾比為1 5 : 1，在攪拌的條件下，將鉑類化合物 緩慢滴入上述PEG-PEI復(fù)合物溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 4小時(shí)，靜置，二氯甲烷和乙 醇揮發(fā)干后得到PEG-PEI-Pt復(fù)合物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述載體的制備方法，其特征是所述的PEI為直鏈型432Da、 600Da、 1200Da、 2000Da或25kDa的聚乙烯亞胺中任一種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述載體的制備方法，其特征是所述的鉑類化合物為四氯化鉑、 二氯化鉑、三氯化鉑、順鉑、卡鉑、奧沙利鉬或奈達(dá)鉑的鈾類化合物中任一種。
6、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述載體的制備方法，其特征是所述的PEG為2000Da、 3400Da、 5000Da、 10000Da、 12000Da、 20000Da的連接有功能基團(tuán)的聚乙二醇中任一種。
全文摘要
一種絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物的非病毒基因藥物載體，是Pt-PEI-PEG或PEG-PEI-Pt復(fù)合物載體，以聚乙烯亞胺為骨架，連接聚乙二醇，絡(luò)合鉑類抗腫瘤藥物構(gòu)成；所述復(fù)合物的各組分所占摩爾百分比分別為Pt48.8～83.2％，PEI16.5～49.8％，PEG0.17～2.44％。制備方法是由鉑類化合物與PEI進(jìn)行配位，再與PEG發(fā)生反應(yīng)，生成Pt-PEI-PEG復(fù)合物載體；或由鉑類化合物與PEG-PEI復(fù)合物配位反應(yīng)，生成PEG-PEI-Pt復(fù)合物載體。具有抗腫瘤藥物的功效，穩(wěn)定性高、水溶性好、體內(nèi)循環(huán)周期長以及毒性降低優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P35/00GK101293102SQ20081006258
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者峻 周, 湯谷平, 胡秀榮, 璐 趙 申請人:浙江大學(xué)