專利名稱：一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微泡超聲造影劑的制備方法。
技術(shù)背景微泡超聲造影技術(shù)是通過將具有較大副作用的藥物(如抗癌藥)置于微泡 內(nèi)，在靶器官局部釋放可達(dá)到保護(hù)藥物、延緩藥物釋放、減少給藥次數(shù)、減小 劑量和增加療效的目的q目前臨床上應(yīng)用的天然高分子微泡超聲造影劑多來源 于蛋白類如白蛋白，不僅價(jià)格昂貴，而且粒徑分布不均一、體內(nèi)抗壓性差、聲衰減明顯、持續(xù)時(shí)間較短；聚酯類合成高分子微泡造影劑雖然顯影效果好，但囊壁較硬,需要較高的聲學(xué)輸出，以致在微囊破裂的同時(shí)可能產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)， 如體外實(shí)驗(yàn)可觀察到細(xì)胞溶解，體內(nèi)試驗(yàn)則引起微泡所在器官出血，進(jìn)入心室 內(nèi)的微泡可產(chǎn)生溶血，造成毛細(xì)血管破裂、局部滲出、出血或黏膜瘀血等。同 時(shí)，這些超聲造影劑本身并無靶向性，經(jīng)靜脈注射后，其在體內(nèi)是隨機(jī)分布的， 會有大量的造影劑不流經(jīng)超聲波輻照部位。靶向微泡超聲造影劑作為一種能攜 帶藥物穿過內(nèi)皮層進(jìn)入靶組織的非創(chuàng)性載體，可增加靶組織的藥物濃度。另外， 將藥物包裹入微泡內(nèi)部的方法還可以保持藥物原有的代謝性質(zhì)和分布，避免受 到外部劇烈環(huán)境的破壞，降低外源性藥物的免疫反應(yīng)。而且對作用的超聲波沒 有特定的要求， 一般采用低能量和低頻率的超聲波，超聲波本身不會給正常機(jī) 體造成任何不良影響，超聲微泡造影劑進(jìn)行的藥用的范圍沒有特定的限制。微泡超聲造影劑(包括天然高分子微泡超聲造影劑和耙向微泡超聲造影 劑)的一致性特征是其脆弱性，另外一個(gè)問題是微泡的衰退，包括氣體自然地 彌散和血液的溶解，以及超聲空化作用導(dǎo)致的破壞。目前微泡超聲造影劑(UCA)進(jìn)入體內(nèi)后的穩(wěn)定性直接影響造影成像的質(zhì)量及穩(wěn)定時(shí)間，也是影響 造影圖像量化分析的主要圍素之一。與膠狀體、乳劑及水溶液的UCA相比， 包膜微氣泡UCA的穩(wěn)定性是最難于控制的，其穩(wěn)定性主要取決于膜參數(shù)，另 外包膜后超聲聲場和氣泡的相互作用也可能會加快UCA氣泡的聲學(xué)特性消 失，所以微泡造影劑被修飾后聲學(xué)特性消失。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決目前微泡造影劑的不穩(wěn)定和微泡被修飾后聲學(xué)特性消失 的問題，而提供一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法。本發(fā)明的微膠囊包覆的微泡超聲造影劑按如下方法進(jìn)行制備將表面帶有負(fù)電荷的微泡加入到濃度為0.001~1000mg/mL、體積為微泡體積1~100倍、帶 正電荷的生物活性材料溶液吸附0.5 100min，靜置或離心，并將上層微泡用生 理鹽水或pH值為7.0~8.0的PBS緩沖溶液洗滌，然后加入到濃度為 0.001~1000mg/mL、體積為微泡體積1-100倍、帶負(fù)電荷的生物活性材料溶液 中吸附0.5 100min，靜置或離心，再將上層微泡用生理鹽水或pH值為7.0 8.0 的PBS緩沖溶液洗滌；即得到微膠囊包覆的微泡超聲造影劑。本發(fā)明利用靜電力對微泡進(jìn)行包覆，包覆后的微泡仍具有好的聲學(xué)特性和 造影效果，本發(fā)明還可以利用共價(jià)鍵、氫鍵等作用力對微泡超聲造影劑進(jìn)行包 覆。本發(fā)明制備的微膠囊包覆的微泡超聲造影劑性質(zhì)穩(wěn)定，可以修飾多層、多 種物質(zhì)，修飾后的微泡不易破損，仍然有很好的造影效果。本發(fā)明的方法具有以下的優(yōu)點(diǎn)-(1) 組裝方法簡單、靈活?？梢酝ㄟ^改變聚電解質(zhì)的組分以及組裝層數(shù) 等實(shí)現(xiàn)微泡超聲造影劑聲學(xué)特性的可設(shè)計(jì)化，根據(jù)不同的診斷或治療需要制備 適合的造影劑，在分子水平上控制包裹物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，不但提高了微泡穩(wěn) 定性還維持了微泡的聲學(xué)性能。(2) 本發(fā)明可以選擇具有生物相容性或者生物活性的材料對微泡進(jìn)行修 飾，材料選擇范圍廣泛，可以是天然或合成的聚電解質(zhì)、基因、生物活性因子、 抗體、藥物、蛋白質(zhì)和多糖等?？梢酝ㄟ^控制組裝層數(shù)，大大提高藥物的裝載 量而不改變其生物活性，改善了一般粘附法導(dǎo)致的藥物或基因與微泡結(jié)合不牢 固的缺點(diǎn)。(3) 由于微泡外殼聚電解質(zhì)的保護(hù)作用，有效地阻止和降低了腔內(nèi)氣體 的彌散，維持了超聲造影劑微泡良好的聲學(xué)性能。(4 )選擇具有活性官能團(tuán)的聚電解質(zhì)或者生物活性物質(zhì)對微泡進(jìn)行組裝， 可以在微泡外殼方便的連接上抗體等靶向物質(zhì)，制備成靶向性超聲造影劑。(5)可以在微泡的外殼包裹診斷和治療性藥物或基因，待微泡到達(dá)耙位后，在診斷超聲的作用下使微泡破裂，釋放其包裹的藥物或基因，達(dá)到診斷或 治療的目的。(6)本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，重現(xiàn)性好，環(huán)境友好(基于水相技術(shù)，無溶 劑毒性)，對微泡的體型結(jié)構(gòu)沒有特殊的要求，便于實(shí)施。
圖1為經(jīng)過包覆的微泡造影劑的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為是在ST68-PFC微泡 表面組裝上FITC標(biāo)記的聚賴氨酸后的激光共聚焦顯微鏡照片的FITC模式圖； 圖3為是在ST68-PFC微泡表面組裝上FITC標(biāo)記的聚賴氨酸后的激光共聚焦 顯微鏡照片的透射模式圖；圖4是在ST68-PFC微泡表面組裝上FITC標(biāo)記的 聚賴氨酸后的熒光發(fā)射光譜圖；圖5是微泡表面Zeta電位隨聚電解質(zhì)組裝層 數(shù)變化圖；圖6是本發(fā)明超聲造影劑肝臟造影計(jì)算機(jī)定量分析圖；圖7是在 SonoVue微泡表面上組裝上FITC標(biāo)記的聚賴氨酸后的熒光顯微鏡照片。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的微膠囊包覆的微泡超聲造影劑按如下方法 進(jìn)行制備將表面帶有負(fù)電荷的微泡加入到濃度為0.001~1000mg/mL、體積為 微泡體積1-100倍、帶正電荷的生物活性材料溶液吸附0.5 100min，靜置或 離心，并將上層微泡用生理鹽水或pH值為7.0~8.0的PBS緩沖溶液洗滌，然 后加入到濃度為0.001~1000mg/mL、體積為微泡體積1 100倍、帶負(fù)電荷的生 物活性材料溶液中吸附0.5 100min，靜置或離心，再將上層微泡用生理鹽水或 pH值為7.0-8.0的PBS緩沖溶液洗滌；即得到微膠囊包覆的微泡超聲造影劑。本實(shí)施方式的微膠囊包覆的微泡超聲造影劑表面可以重復(fù)吸附包覆帶正 電荷的生物活性材料和帶負(fù)電荷的生物活性材料，重復(fù)次數(shù)由需要包覆的層數(shù) 決定。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中的微泡是基于表面活性劑的造影劑微泡，或者是用蛋白、高分子材料、脂質(zhì)或糖 類包膜的造影劑微泡。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中的 帶正電荷的生物活性材料為聚電解質(zhì)、藥物、生物活性因子、DNA序列、耙向配體中的一種或幾種的組合。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式中帶正電荷的生物活性材料為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按 任意比混合。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是聚電解質(zhì)為 陰離子聚電解質(zhì)、陽離子聚電解質(zhì)、兩性聚電解質(zhì)中的一種或幾種。其它與具 體實(shí)施方式三相同。本實(shí)施方式中聚電解質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四的不同點(diǎn)是陰離子聚電 解質(zhì)為聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸、聚丙烯酸 鈉、聚谷氨酸、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸、葡聚糖、硫酸葡聚糖、磺化葡聚糖、硫 酸軟骨素、肝素、硫酸肝素、肝磷脂、尿激酶、鏈激酶、白蛋白中的一種或幾 種的混合物。其它與具體實(shí)施方式
四相同。本實(shí)施方式中陰離子聚電解質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四的不同點(diǎn)是陽離子聚電 解質(zhì)為聚乙烯亞胺、殼聚糖、多聚賴氨酸、季胺烷基醚化陽離子聚乙烯醇、聚 二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙基氯化銨、質(zhì)子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基亞 胺鹽酸鹽、聚2-羥基-3-甲基丙烯酸酯基三甲基氯化銨、聚丙烯酰胺、聚烯丙 基胺鹽酸鹽、聚乙烯亞胺、聚丙烯基氨、多熔素、明膠、膠原、魚精蛋白中的 一種或幾種的混合物。其它與具體實(shí)施方式
四相同。本實(shí)施方式中陽離子聚電解質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四的不同點(diǎn)是兩性聚電解 質(zhì)是指具有兩性電荷的性質(zhì)的各種蛋白、生長因子和分化誘導(dǎo)因子。其它與具 體實(shí)施方式四相同。這些蛋白、生長因子和分化誘導(dǎo)因子可以通過調(diào)節(jié)pH值來得到不同的帶 電性質(zhì)等電點(diǎn)下帶正電，等電點(diǎn)上帶負(fù)電。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是藥物為抗凝 血的藥物(白蛋白、肝素、磺化葡聚糖、尿激酶、聚苯乙烯磺酸鈉或華法林鈉)、 抗血小板粘附的藥物(阿司匹林和/或前列腺素)、抗感染的藥物(氨節(jié)青霉素、頭孢霉素、磺胺嘧啶或硫酸鏈霉素)、抗內(nèi)膜增長的藥物(地塞米松磷酸鈉)、抗腫瘤的藥物(柔紅霉素、阿霉素、卡鉑或喜樹堿)、抗血栓藥物和溶栓劑(r-tPA、 鏈激酶、尿激酶)中的一種或幾種的混合物。其它與具體實(shí)施方式
三相同。 本實(shí)施方式中藥物為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是生物活性因 子為細(xì)胞粘附因子、細(xì)胞生長因子或細(xì)胞分化因子。其它與具體實(shí)施方式
三相 同。本實(shí)施方式中生物活性因子為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是靶向配體為 用于聯(lián)合心肌、膜、結(jié)締、腫瘤和血塊的蛋白質(zhì)、肽、糖、維生素、類固醇、 激素遺傳物質(zhì)中的一種或幾種的組合。其它與具體實(shí)施方式
三相同。本實(shí)施方式中心肌、膜、結(jié)締、腫瘤和血塊作為靶向受體；蛋白質(zhì)、肽、 糖、維生素、類固醇、激素和遺傳物質(zhì)作為靶向配體。本實(shí)施方式中耙向配體為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十的不同點(diǎn)是蛋白質(zhì)為 抗體、抗體片斷、受體分子、受體連接分子、糖蛋白、外源凝集素中的一種或 幾種的組合。其它與具體實(shí)施方式
十相同。本實(shí)施方式中蛋白質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
十二:本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十的不同點(diǎn)是:肽為寡肽、 多肽或擬肽。其它與具體實(shí)施方式
十相同。
具體實(shí)施方式
十三纟本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十的不同點(diǎn)是遺傳物質(zhì) 為核苷、核苷酸或多核苷酸。其它與具體實(shí)施方式
十相同。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中 的帶負(fù)電荷的生物活性材料為聚電解質(zhì)、藥物、生物活性因子、DNA序列、 靶向配體中的一種或幾種的組合。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式中帶負(fù)電荷的生物活性材料為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按 任意比混合。
具體實(shí)施方式
十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十四的不同點(diǎn)是聚電解 質(zhì)為陰離子聚電解質(zhì)、陽離子聚電解質(zhì)、兩性聚電解質(zhì)中的一種或幾種的組合。其它與具體實(shí)施方式
十四相同。本實(shí)施方式中聚電解質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十五的不同點(diǎn)是陰離子 聚電解質(zhì)為聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸、聚丙 烯酸鈉、聚谷氨酸、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸、葡聚糖、硫酸葡聚糖、磺化葡聚糖、 硫酸軟骨素、肝素、硫酸肝素、肝磷脂、尿激酶、鏈激酶、白蛋白中的一種或 幾種的混合物。其它與具體實(shí)施方式
十五相同。本實(shí)施方式中陰離子聚電解質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十五的不同點(diǎn)是陽離子 聚電解質(zhì)為聚乙烯亞胺、殼聚糖、多聚賴氨酸、季胺烷基醚化陽離子聚乙烯醇、 聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙基氯化銨、質(zhì)子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基 亞胺鹽酸鹽、聚2-羥基-3-甲基丙烯酸酯棊三甲基氯化銨、聚丙烯酰胺、聚烯 丙基胺鹽酸鹽、聚乙烯亞胺、聚丙烯基氨、多熔素、明膠、膠原、魚精蛋白中 的一種或幾種的混合物。其它與具體實(shí)施方式
十五相同。本實(shí)施方式中陽離子聚電解質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合o具體實(shí)施方式
十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十五的不同點(diǎn)是兩性聚 電解質(zhì)是指具有兩性電荷的性質(zhì)的各種蛋白、生長因子和分化誘導(dǎo)因子。其它 與具體實(shí)施方式
十五相同。這些蛋白、生長因子和分化誘導(dǎo)因子可以通過調(diào)節(jié)pH值來得到不同的帶 電性質(zhì)等電點(diǎn)下帶正電，等電點(diǎn)上帶負(fù)電。
具體實(shí)施方式
十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十四的不同點(diǎn)是藥物為 抗凝血的藥物(白蛋白、肝素、磺化葡聚糖、尿激酶、聚苯乙烯磺酸鈉或華法 林鈉)、抗血小板粘附的藥物(阿司匹林和/或前列腺素)、抗感染的藥物(氨 芐青霉素、頭孢霉素、磺胺嘧啶或硫酸鏈霉素)、抗內(nèi)膜增長的藥物(地塞米 松磷酸鈉)、抗腫瘤的藥物(柔紅霉素、阿霉素、卡鉑或喜樹堿)、抗血栓藥物 和溶栓劑(r-tPA、鏈激酶、尿激酶)中的一種或幾種的混合物。其它與具體實(shí) 施方式十四相同。本實(shí)施方式中藥物為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
二十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十四的不同點(diǎn)是生物活性因子為細(xì)胞粘附因子、細(xì)胞生長因子或細(xì)胞分化因子。其它與具體實(shí)施方式
十四相同。本實(shí)施方式中生物活性因子為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
二十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
十四的不同點(diǎn)是靶向 配體為用于聯(lián)合心肌、膜、結(jié)締、腫瘤和血塊的蛋白質(zhì)、肽、糖、維生素、類 固醇、激素遺傳物質(zhì)中的一種或幾種的組合。其它與具體實(shí)施方式
十四相同。本實(shí)施方式中心肌、膜、結(jié)締、腫瘤和血塊作為靶向受體；蛋白質(zhì)、肽、 糖、維生素、類固醇、激素和遺傳物質(zhì)作為靶向配體。本實(shí)施方式中耙向配體為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
二十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十一的不同點(diǎn)是蛋 白質(zhì)為抗體、抗體片斷、受體分子、受體連接分子、糖蛋白、外源凝集素中的 一種或幾種的組合。其它與具體實(shí)施方式
二十一相同。本實(shí)施方式中蛋白質(zhì)為兩種或兩種以上物質(zhì)組成時(shí)按任意比混合。
具體實(shí)施方式
二十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十一的不同點(diǎn)是肽 為寡肽、多肽或擬肽。其它與具體實(shí)施方式
二十一相同。
具體實(shí)施方式
二十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十一的不同點(diǎn)是遺 傳物質(zhì)為核苷、核苷酸或多核苷酸。其它與具體實(shí)施方式
二十一相同。
具體實(shí)施方式
二十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是重復(fù)操 作直至達(dá)到需要的層數(shù)后，將制備好的微泡放入體積相等的PBS緩沖液中、 在4'C的條件下保存。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 沖的洗滌是將微泡放入pH值為7.0~8.0的PBS緩沖溶液中，輕微振搖后靜置，再取上層微泡。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中離心轉(zhuǎn)速為100~2000r/min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中離心轉(zhuǎn)速為1000r/min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中將表面帶有負(fù)電荷的微泡加入到濃度為0.01~100mg/mL、體積為微泡體積 1 50倍、帶正電荷的生物活性材料溶液吸附l~50min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中 將表面帶有負(fù)電荷的微泡加入到濃度為Q.l~10mg/mL、體積為微泡體積2~20 倍、帶正電荷的生物活性材料溶液吸附2 20min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中將表面帶有負(fù)電荷的微泡加入到濃度為0.5~5mg/mL、體積為微泡體積5~15 倍、帶正電荷的生物活性材料溶液吸附5 15min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中將表面帶有負(fù)電荷的微泡加入到濃度為lmg/mL、體積為微泡體積10倍、 帶正電荷的生物活性材料溶液吸附10min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中然后加入到濃度為0.01~100mg/mL、體積為微泡體積1~50倍、帶負(fù)電荷的 生物活性材料溶液吸附1 50min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中然后加入到濃度為0.1~10mg/mL、體積為微泡體積2~20倍、帶負(fù)電荷的生 物活性材料溶液吸附2 20min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中然后加入到濃度為0.5~5mg/mL、體積為微泡體積5~15倍、帶負(fù)電荷的生物 活性材料溶液吸附5 15min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中然后加入到濃度為lmg/mL、體積為銜泡體積10倍、帶負(fù)荷的生物活性材 料溶液吸附10min。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一 中將上層微泡用pH值為7.2~7.6的PBS緩沖溶液洗滌。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中將上層微泡用pH值為7.4的PBS緩沖溶液洗滌。其它與具體實(shí)施方式
一相 同。
具體實(shí)施方式
三十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是重復(fù)吸 附包覆的操作3 5次。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四十本實(shí)施方式微膠囊包覆的微泡超聲造影劑按如下方法 進(jìn)行制備將表面帶有負(fù)電荷的ST68-PFC微泡(屬于基于表面活性劑的造影 劑微泡)，加入到濃度為lmg/mL、體積為微泡體積10倍、帶正電荷的FITC 標(biāo)記的聚賴氨酸溶液吸附8min，靜置使其分層，并將上層微泡用pH值為7.4 的PBS緩沖溶液洗滌，再加入到將濃度為lmg/mL、體積為微泡體積10倍、 帶負(fù)電荷的海藻酸鈉溶液加入到，吸附8min，靜置或離心使其分層，再將上 層微泡用pH值為7.4的PBS緩沖溶液洗漆；即得到微膠囊包覆的微泡超聲造 影劑。本實(shí)施方式制備的微泡超聲造影劑的激光共聚焦顯微鏡照片(圖2和圖3) 表明聚電解質(zhì)能有效地組裝到微泡的表面。從照片上可以看出，微泡呈球形， 具有較好的分散性，沒有觀察到明顯的聚集。較強(qiáng)的綠色熒光僅能從微泡的外 壁觀測到，表明FITC標(biāo)記的聚賴氨酸僅吸附在外殼上而沒有進(jìn)入微泡內(nèi)部。 同時(shí)，微泡外壁均勻的熒光光環(huán)表明制得的微泡造影劑表面組分均勻，均勻的 泡壁對微泡的穩(wěn)定有一定的作用。同時(shí)，包裹FITC標(biāo)記的聚賴氨酸的超聲造影劑微泡的熒光發(fā)射光譜也進(jìn) 一步說明聚電解質(zhì)組裝到了微泡表面。微泡在520nm處出現(xiàn)了明顯的譜峰(圖 4)，而且發(fā)射波長較溶液狀態(tài)下的FITC標(biāo)記的聚賴氨酸也沒有發(fā)生變化，說 明采用層層自組組裝的方法可以將聚電解質(zhì)等包裹在微泡造影劑的外殼上。聚 電解質(zhì)包裹到微泡上之后，可以增加其穩(wěn)定性。另外聚電解質(zhì)包裹微泡造影劑 具有很好的化學(xué)活性，很容易對其進(jìn)行化學(xué)改性，使其表面帶上各種功能性基 團(tuán)(如羥基、羧基、氨基、酰胺基和硫鍵等)，還可以根據(jù)特定的對象選擇合 適的生物分子進(jìn)行修飾。對本實(shí)施方式制得的微泡超聲造影劑進(jìn)行所需層數(shù)的聚電解質(zhì)組裝。Zeta 電位結(jié)果表明，未進(jìn)行包裹的ST68-PFC微泡表面帶有負(fù)電荷(^-40mV)， 當(dāng)在其表面吸附上帶有不同電荷的聚電解質(zhì)后，微泡表面電位也隨之發(fā)生交替變化。當(dāng)在微泡的表面上沉積吸附上第一層PLL后，微泡表面電位發(fā)生急劇 增大("60 mV)。吸附上第一層Alg之后，微泡表面又帶上負(fù)電荷("-40 mV)。 交替吸附上帶有不同電荷的聚電解質(zhì)，微泡表面的電位也發(fā)生交替的變化(圖 5)。將新西蘭大白兔常規(guī)麻醉后，經(jīng)兔耳緣靜脈勻速推注本實(shí)施方式制備的造 影劑(0.04mL/kg)，使用PHILIPS iu22超聲儀，以脈沖反向諧波模式，L9-3 探頭，MI0.07進(jìn)行回波成像。高頻探頭顯示大白兔肝臟、大血管等組織和臟 器，用超聲儀內(nèi)部工作站存儲動靜態(tài)造影資料，并經(jīng)計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)為數(shù)字信號，定 量分析造影前后血流及組織回聲情況。結(jié)果大白兔肝臟等實(shí)質(zhì)臟器及血流信 號明顯增多、增強(qiáng)(圖6)，而且安全性好，整個(gè)造影過程，大白兔生命征平 穩(wěn)。說明經(jīng)過層層自組裝修飾的造影劑在賦予更多功能的同時(shí)并沒有減弱其造 影效果。
具體實(shí)施方式
四十一本實(shí)施方式微膠囊包覆的微泡超聲造影劑按如下方 法進(jìn)行制備將表面帶有負(fù)電荷的SonoVue微泡加入到濃度為lmg/mL、體積 為微泡體積20倍、帶正電荷的FITC標(biāo)記的聚賴氨酸溶液吸附10min，靜置使 其分層，并將上層微泡用生理鹽水洗滌，再加入到將濃度為lmg/mL、體積為 微泡體積10倍、帶負(fù)電荷的海藻酸鈉溶難加入到，吸附8min，靜置或離心使 其分層，再將上層微泡用pH值為7.4的PBS緩沖溶液洗滌；即得到微膠囊包 覆的微泡超聲造影劑。本實(shí)施方式的SonoVue微泡為意大利博萊科公司的產(chǎn)品，屬于脂質(zhì)包膜 的造影劑微泡。SonoVue微泡表面帶有負(fù)電荷，通過靜電吸引作用將聚賴氨酸組裝到微泡 表面之后，Zeta電位測量顯示微泡帶有明顯的正電荷，熒光顯微鏡照片(圖7) 表明聚電解質(zhì)能有效地組裝微泡的表面，組裝海藻酸鈉后，Zeta電位測量顯示 微泡帶有明顯的負(fù)電荷。從照片上可以看出，組裝聚電解質(zhì)之后的微泡仍然具 有較好的分散性，僅能從微泡外壁觀測到較強(qiáng)的熒光，表明FITC標(biāo)記的聚賴 氨酸僅吸附在微泡外殼上而沒有進(jìn)入微泡內(nèi)部。
權(quán)利要求
1、一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法，其特征在于微膠囊包覆的微泡超聲造影劑按如下方法進(jìn)行制備將表面帶有負(fù)電荷的微泡加入到濃度為0.001～1000mg/mL、體積為微泡體積1～100倍、帶正電荷的生物活性材料溶液吸附0.5～100min，靜置或離心，并將上層微泡用生理鹽水或pH值為7.0～8.0的PBS緩沖溶液洗滌，然后加入到濃度為0.001～1000mg/mL、體積為微泡體積1～100倍、帶負(fù)電荷的生物活性材料溶液中吸附0.5～100min，靜置或離心，再將上層微泡用生理鹽水或pH值為7.0～8.0的PBS緩沖溶液洗滌；即得到微膠囊包覆的微泡超聲造影劑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法， 其特征在于微泡是基于表面活性劑的造影劑微泡，或者是用蛋白、高分子材料、 脂質(zhì)或糖類包膜的造影劑微泡。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法， 其特征在于帶正電荷的生物活性材料為聚電解質(zhì)、藥物、生物活性因子、DNA 序列、靶向配體中的一種或幾種的組合。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法， 其特征在于藥物為抗凝血的藥物、抗血小板粘附的藥物、抗感染的藥物、抗內(nèi) 膜增長的藥物、抗腫瘤的藥物、抗血栓藥物、溶栓劑中的一種或幾種的組合。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法， 其特征在于生物活性因子為細(xì)胞粘附因子、細(xì)胞生長因子或細(xì)胞分化因子。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法， 其特征在于靶向配體為用于聯(lián)合心肌、膜、結(jié)締、腫瘤和血塊的蛋白質(zhì)、肽、 糖、維生素、類固醇、激素、遺傳物質(zhì)中的一種或幾種的組合。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法, 其特征在于聚電解質(zhì)為陰離子聚電解質(zhì)、陽離子聚電解質(zhì)高分子兩性聚電解質(zhì) 中的一種或幾種的組合。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法， 其特征在于的帶負(fù)電荷的生物活性材料為聚電解質(zhì)、藥物、生物活性因子、 DNA序列、靶向配體中的一種或幾種的組合。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法， 其特征在于再加入濃度為lmg/mL、體積為微泡體積10倍、帶負(fù)荷的生物活 性材料溶液吸附10min。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方 法，其特征在于在微膠囊包覆的微泡超聲造影劑表面重復(fù)吸附包覆帶正電荷的 生物活性材料和帶負(fù)電荷的生物活性材料。
全文摘要
一種微膠囊包覆的微泡超聲造影劑的制備方法，它涉及一種微泡超聲造影劑的制備方法。本發(fā)明解決了微泡造影劑的不穩(wěn)定和微泡被修飾后聲學(xué)特性消失的問題。本發(fā)明的微膠囊包覆的微泡超聲造影劑按如下方法進(jìn)行制備吸附，靜置或離心，洗滌，再吸附，靜置或離心，洗滌；即得到微膠囊包覆的微泡超聲造影劑。本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易操作，重現(xiàn)性好，適用范圍廣，環(huán)境友好，適用于多種超聲造影劑的表面修飾，便于實(shí)施。
文檔編號A61K49/22GK101219224SQ20081006391
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者劉吉斌, 劉紹琴, 戴志飛, 柯亨特, 王金銳, 邢占文 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)