專利名稱：海鞘抗菌肽、其前體肽、編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種海鞘抗菌肽、其前體肽、編碼基因以及海鞘抗菌肽的應(yīng)用。
技術(shù)背景抗菌肽(antimicrobial p印tides)是一類具有抗菌活性的天然 小分子蛋白。自1975年瑞典科學(xué)家Boman等從蠶蛹身上分離得到第一 個抗菌肽天蠶素(Cecropin)以來，人們又在昆蟲、兩棲類、水產(chǎn)動物， 以及包括人在內(nèi)的哺乳動物甚至植物及細(xì)菌等廣泛的生物譜中發(fā)現(xiàn) 了至少900余種抗菌肽。這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)而合成，在機(jī)體 抵抗病原入侵方面起著重要的作用，是機(jī)體非特異性免疫的重要組成 部分?？咕牡目剐宰V十分廣泛。大多數(shù)對細(xì)菌尤其對耐藥性細(xì)菌有較 強(qiáng)的殺滅作用，有些則對某些真菌、原生動物也有殺滅作用。近年研 究還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽還能選擇殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制HBV、 HIV的復(fù)制， 從而引起了人們更大的關(guān)注。抗菌肽的作用機(jī)理特殊，目前流行的觀 點是首先，帶正電荷的抗菌肽分子與帶負(fù)電荷的靶細(xì)胞膜相接觸, 隨后通過靶細(xì)胞膜所產(chǎn)生的電動勢將形成疏水面的抗菌肽二聚體注 入細(xì)胞膜，最后多個二聚體或多聚體在一起形成跨膜的離子通道，從而擾亂細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞能量狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細(xì)胞ATP含量嚴(yán)重下降，最終使靶細(xì)胞死亡。抗菌肽的抗病毒作用則是通過與病毒外殼蛋白結(jié)合而導(dǎo)致病毒失去生物活性。 這一特殊作用機(jī)理使微生物不易對其產(chǎn)生抗性。海鞘是一種海洋無脊椎動物，屬于脊索動物門，作為古老的原索 動物又處于無脊椎動物和脊椎動物之間。海鞘類是研究脊椎動物先天 性免疫進(jìn)化的極好的材料，由于海鞘類缺乏在更高級的脊椎動物中存在的免疫球蛋白和T細(xì)胞受體而依賴于先天性免疫系統(tǒng)，因此它們的 血細(xì)胞在宿主防御中有著重要的作用。近年來，從海鞘的血細(xì)胞中提 取了許多的抗菌肽。目前，人們已經(jīng)從海鞘中發(fā)現(xiàn)了多種抗菌肽。根據(jù)海鞘抗菌肽一 級結(jié)構(gòu)的不同可分為三大類型。(l)線形螺旋結(jié)構(gòu)的兩性抗菌肽分子， 包括Clavanins， styelins， clavaspirin; (2)含有DOPA殘基的抗菌 肽分子，包括plicatamide， haloxyamine; (3)含有二硫鍵的抗菌肽 分子，包括halocidin禾卩dycynthaurin等。Lee等從柄海鞘CS"^eZ3chra)的血細(xì)胞中分離出一組由4個a -螺旋抗菌肽組成的家族Clavanins A， B， C，和D。此后又從柄海鞘 咽組織構(gòu)建的c DNA文庫中篩選出 一 種新的C1 avan i n s家族成員 Clavanin E。通過研究表明Clavanins A-E是富含組氨酸，包含23個殘 基，C末端酰胺化的抗菌肽。對Clavanins的抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)它們和其他抗菌肽一樣在非常 低的濃度下表現(xiàn)出快速的殺菌效率。在5分鐘的孵化后，1.6ug/ml的Clavanin A使E. coli ML-35P的數(shù)量減少了一半；同時發(fā)現(xiàn)Clavanin C/D的殺菌能力比Clavanin A/B大致要高3 5倍。之后研究表明它們 對其他幾種革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌均有顯著的抗菌作用，并對幾種真 菌如Ca^j'c朋s有抑制效果。在低pH(p^5.5)和高鹽(300mmol/L NaCl)條件下對其中的幾種微生物仍保持相當(dāng)?shù)幕钚浴?發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的在于提供一種海鞘抗菌肽及其前體肽。 本發(fā)明的第二個目的在于提供本發(fā)明海鞘抗菌肽的編碼基因。 本發(fā)明的第三個目的在于將本發(fā)明的海鞘抗菌肽應(yīng)用于制備抗 病菌類產(chǎn)品。本發(fā)明所選擇的海鞘屬于中國南海食蟲性柄海鞘(S0^/a ， 采自中國南海西沙群島。本發(fā)明用構(gòu)建cDNA文庫的方法，從中國南海柄海鞘咽組織中克 隆得到抗菌肽Clavanin家族成員。中國南海海鞘咽組織cDNA文庫的構(gòu)建首先分離海鞘咽組織， 提取總RNA。取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈產(chǎn)物。再取 cDNA用于連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液分別涂板，其余用于搖總庫菌液，從平 板上挑取單克隆保種。本發(fā)明通過對以上重組克隆大規(guī)模序列測定，得到8條EST序列 編碼中國南海柄海鞘抗菌肽Clavanin家族成員，申請人將之命名為海 鞘抗菌肽Clavanin H，海鞘抗菌肽Clavanin H為成熟肽，由23個氨 基酸組成，分子量為2.71千道爾頓，海鞘抗菌肽Clavanin H具有典型的抗菌肽一級結(jié)構(gòu)的特征，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，具體如下Val Phe Arg Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe 15 10 15Val His Gly Phe Ser His Val Phe 20該成熟肽可以通過分離純化得到，HPLC鑒定其純度達(dá)到96.5%， MALDI-TOF鑒定其分子量正確。本發(fā)明的海鞘抗菌肽，為如下(a)或(b)或(c)或(d)所述 的多肽(a) 具有序列表中SEQ ID NO: 3所述的氨基酸序列，即海鞘抗 菌肽Clavanin H;(b) (a)所述氨基酸序列的保守性變異多肽；(c) (a)所述氨基酸序列的活性衍生物；(d) 將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的由(a)衍生的多肽。上述(c)所述海鞘抗菌肽，優(yōu)選海鞘抗菌肽Clavanin H的C末端酰胺化修飾物。本發(fā)明的海鞘抗菌肽可以是通過化學(xué)合成、基因重組表達(dá)獲得的 產(chǎn)物。本發(fā)明的海鞘抗菌肽Clavanin H的前體肽，其氨基酸序列如序列 表中SEQ ID NO: 2所示，具體如下Met Lys Thr Thr lie Leu lie Leu Leu lie Leu Gly Leu Gly lie 15 10 15Asn Ala Lys Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ser Glu Glu Glu Lys Val 20 25 30Phe Arg Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe Val35 40 45His Gly Phe Ser His Val Phe Gly Asp Asp Gin Gin Asp Asn Gly50 55 60Lys Phe Tyr Gly His Tyr Ala Glu Asp Asn Gly Lys His Trp Tyr65 70 75Asp Thr Gly Asp Gin80編碼海鞘抗菌肽Clavanin H的前體肽的多核苷酸序列如序列表 中SEQ ID N0:1所示，具體如下atgaaaacaa caattttgat tcttctcata ctgggacttg gcatcaatgc aaaatctctg 60 gaggaaag朋aatcggagga agagaaagta ttccgctacc ttggcaaaat tattcatcat 120 gttggcaatt ttgtacatgg ttttagccac gtgttcggcg acgaccaaca agataatgga 180 aagttttatg gccactacgc agaagacaat ggcaagcatt ggtatgatac cggggatcaa 240 taa 243本發(fā)明的多核苷酸，為如下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a) 編碼海鞘抗菌肽Clavanin H的前體肽的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選具有序列表中SEQ ID NO'.l所述的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明獲得的中國南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H具有生物活性，具有抗菌作用。分離純化的Clavanin H在50nM時即能抑制部分致病細(xì)菌和真菌。因此，本發(fā)明的海鞘抗菌肽可應(yīng)用于制備抗病菌類產(chǎn)品，抗病菌類產(chǎn)品包括詞料添加劑、獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品如抗菌藥物等。


圖1是中國南海海鞘咽組織cDNA文庫的EST序列長度分布統(tǒng)計圖。圖2是本發(fā)明的中國南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H的分子篩分 離圖譜；圖3為中國南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H分子篩分離后陰離子 交換分離圖；圖4為中國南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H陰離子分離后HPLC分 離圖；圖5為中國南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H純化后MALDI-T0F鑒 定圖。圖6為中國南海柄海鞘抗菌肽Clavanin H抑制奶牛乳房炎致病 菌生長實驗的實驗結(jié)果。
具體實施方式
實施例一中國南海海鞘咽組織cDNA文庫的構(gòu)建及EST序列分析總RNA的提取和cDNA合成分離中國南海海鞘咽組織，參照GibcoBRL公司的TRIZOL LS試劑說明書進(jìn)行毒管總RNA提取。文庫構(gòu)建采 用Clontech公司Smart cDNA Library Construction Kit試齊!j盒，并利用試劑盒本身附帶的引物、載體、限制性內(nèi)切酶等進(jìn)行實驗。取 1 ii g海鞘咽組織總RNA以SMART III寡聚核苷酸片斷 (5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3，)和CDSIII/3， PCR引物(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)加N—iN-3，)進(jìn)行逆 轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，得到10tU cDNA第一鏈產(chǎn)物。海鞘咽組織cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定取cDNA 1. 5^1用于連接反 應(yīng)，反應(yīng)體系5pl，轉(zhuǎn)化其中1^1，取5ul轉(zhuǎn)化液分別涂板，取300ul 轉(zhuǎn)化液用于搖總庫菌落。隔日記數(shù)平板的單菌落數(shù)分別為805， 695 和1052個。因此雙鏈cDNA7ul可獲得的cDNA文庫克隆數(shù)為 (805+695+1052) *1050*7*5/3*5*1. 5=4. 170*106 (個)。隨機(jī)挑取46 個單克隆，利用載體多克隆位點兩端的T7和SP6引物PCR擴(kuò)增，結(jié) 果顯示，重組率超過98% (45/46)，大部分的插入片段大于500bp (41/46)，平均插入片段長度為700bp。從平板上隨機(jī)挑取六板單克隆 搖菌、保種、提取質(zhì)粒、T7引物單向測序，手工使用BLASTN和BLASTX 在線同源比對，SEQT00L、 ClustalX 1.83程序分析測序結(jié)果。測序 結(jié)果顯示柄海鞘平均插入片段長度為544bp。以上結(jié)果顯示本申請人構(gòu)建的海鞘咽組織cDNA文庫在文庫重組 子數(shù)、重組率和插入片段大小等方面均符合良好文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。從 圖1中可見在500-600bp， 700-800bp和800_900bp處存在高豐度的 EST序列，而本發(fā)明所克隆的南海柄海鞘抗菌基因Clavanin H的EST 序列長度正位于500-600bp之間。實施例二海鞘抗菌基因Clavanin H序列的測定和分析南海柄海鞘抗菌基因Clavanin H的序列來自實施例一中國南海海鞘咽組織cDNA文庫中所克隆到的8條高度同源的EST序列，海鞘 抗菌基因Clavanin H屬于高表達(dá)基因，約占所有EST序列的4%，以 5號板D12號克隆為例對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示其cDNA用工具軟件SEQTOOL對其堿基序列進(jìn)行分析， 并獲得其最大開放讀碼框，長度240bp (不包含終止密碼子)，編碼 80個氨基酸殘基的前體肽，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1 所述，80個氨基酸殘基的前體肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所述。進(jìn)一步分析顯示，該前體肽的第l-29位氨基酸殘基為其 信號肽區(qū)域，其第29位殘基為賴氨酸，可認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)水解信 號，將前體肽的前導(dǎo)肽和成熟肽部分分開，故確定Clavanin H成熟 肽的氨基酸序列為VFRYLGKIIHHVGNFVHGFSHVF，即序列表中SEQ ID N0:3所述的氨基酸序列。由于Clavanin H前體肽中信號肽區(qū)和成熟 肽區(qū)與所有已經(jīng)報道的抗菌肽Clavanin家族有明顯的相似性，故海 鞘抗菌肽Clavanin H為新的Clavanin家族成員。實施例三海鞘抗菌肽Clavanin H的分離純化取海鞘咽組織，剪碎后用50mmol/L Tris-Cl， pH8. 6+100mmol/L NaCl萃取，用G25Fine (i. d2. 6*100cm)分離，以萃取緩沖液洗脫， 280nm檢測，可見四個紫外吸收峰如圖2所示；收集第2峰上Q S印harose fast flow分離，NaCl梯度洗脫，獲得5個洗脫峰如圖3 所示。收集第1峰上C18反相柱分離，乙腈梯度洗脫，收集保留時間 為45. 7min的峰如圖4所示。分離純化的海鞘抗菌Clavanin H，經(jīng) 飛行時間質(zhì)譜分析，分子量為2. 71千道爾頓如圖5所示。這與根據(jù) 所克隆的基因推測的表達(dá)序列VFRYLGKIIHHVGNFVHGFSHVF的理論分 子量2. 71千道爾頓一致。實施例四海鞘抗菌肽基因Clavanin H的重組表達(dá)本實驗釆用組氨酸缺陷型畢赤酵母GS115作為宿主菌，采用分泌性表達(dá)載體pPICZaA構(gòu)建重組表達(dá)系統(tǒng)。選擇SacI內(nèi)切酶線性化重組 載體pPICZctA，然后將帶有相應(yīng)酶切位點的抗菌肽Clavanin H基因通 過T4 DNA連接酶與線性化載體連接，再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中， 利用Zeocin抗性的低鹽LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑單菌落接種培養(yǎng)， 抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證和測序。制備畢赤酵母菌株GS115的感受態(tài)細(xì)胞。取80ml感受態(tài)細(xì)胞與10 ugSacI單酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)?；靹?，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化.30'C溫 育l h后，將菌液涂在含有100ug/ml Zeocin抗生素的YPD固體培養(yǎng)基 平板上.30°C恒溫培養(yǎng)2 4天，篩選出陽性菌落。同時，將Sacl線性 化的pPICZaA空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GS115菌株作為空白對照。將鑒定得到的陽性重組酵母菌分別加入到10ml YPDA培養(yǎng)基中， 在3(TC恒溫培養(yǎng)，進(jìn)而利用甲醇作為誘導(dǎo)物，對重組目的蛋白 Clavanin H進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)超濾和陽離子交換層析純化。實施例五海鞘抗菌肽Clavanin H的抑菌活性實驗海鞘抗菌肽Clavanin H抑制奶牛乳房炎致病菌實驗。試驗中選擇乳室發(fā)炎腫大、皮膚發(fā)紅、溫?zé)帷⑷橹懦霾粫?、稀薄帶黃色并混 有絮狀物和凝乳塊等表現(xiàn)明顯奶牛乳房炎癥狀的奶牛乳汁。實驗組為 5ml上述奶牛乳汁與濃度為0. 5mg/ml的海鞘抗菌肽Clavanin H等體積震蕩混合30分鐘，對照組為5ml上述奶牛乳汁與滅菌生理鹽水等 體積震蕩混合30分鐘。將上述混合溶液分別涂布到LB固體培養(yǎng)基上， 觀察奶牛乳房炎致病菌生長情況。從圖6中可以看出，加入有抗菌肽 的奶牛乳汁中，乳房炎致病菌沒有生長(左側(cè)平板)，而對照組(右 側(cè)平板)則有大量乳房炎致病菌生長。說明抗菌肽有殺滅乳房炎致病 菌的作用。本發(fā)明的海鞘抗菌肽Clavanin H能抑制部分致病細(xì)菌和真菌。 因此，本發(fā)明的海鞘抗菌肽可應(yīng)用于制備抗病菌類產(chǎn)品，如飼料添 加劑、獸藥、防腐劑、抗菌藥物等。序列表<110〉深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司〈120〉海鞘抗菌肽、其前體肽、編碼基因及應(yīng)用〈160〉 3〈170〉 Patentln version 3.1<210> 1 <211〉 243 〈212〉 DNA〈213>中國南海柄海鞘 〈400> 1atgaaaacaa caattttgat gaggaaagaa aatcggagga gttggcaatt ttgtacatgg aagttttatg gccactacgc taa(Styela clava)tcttctcata ctgggacttg agagaaagta ttccgctacc ttttagccac gtgttcggcg agaagacaat ggcaagcattgcatcaatgc aaaatctctg 60 ttggcaaaat tattcatcat 120 acgaccaaca agataatgga 180 ggtatgatac cggggatcaa 240243〈210> 2〈211〉 80〈212〉 PRT〈213〉 中國南海柄海鞘(Styela clava)<400〉 2Met Lys Thr Thr lie Leu lie Leu Leu lie Leu Gly Leu Gly lie Asn1015Ala Lys Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ser Glu Glu Glu Lys Val Phe Arg202530Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe Val His Gly Phe354045Ser His Val Phe Gly Asp Asp Gin Gin Asp Asn Gly Lys Phe Tyr Gly505560His Tyr Ala Glu Asp Asn Gly Lys His Trp Tyr Asp Thr Gly Asp Gin65707580〈210> 3 <211> 23 <212> PRT<213> 中國南海柄海鞘(Styela clava) 〈400> 3Val Phe Arg Tyr Leu Gly Lys lie lie His His Val Gly Asn Phe Val 15 10 15His Gly Phe Ser His Val Phe 20
權(quán)利要求
1.一種海鞘抗菌肽，為如下(a)或(b)或(c)或(d)所述的多肽(a)具有序列表中SEQ ID NO3所述的氨基酸序列；(b)(a)所述氨基酸序列的保守性變異多肽；(c)(a)所述氨基酸序列的活性衍生物；(d)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的由(a)衍生的多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海鞘抗菌肽，其特征在于為(a) 所述多肽的c末端酰胺化修飾物。
3. —種海鞘抗菌肽的前體肽，具有序列表中seq id n0:2所述 的氨基酸序列；
4. 一種多核苷酸，為如下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a) 編碼權(quán)利要求3所述多肽的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于具有序列表 中seq id n0:1所述的核苷酸序列。
6. 權(quán)利要求1或2所述的海鞘抗菌肽在制備抗病菌類產(chǎn)品上的 應(yīng)用，所述抗病菌類產(chǎn)品包括飼料添加劑、獸藥、防腐劑和醫(yī)藥產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明為一種海鞘抗菌肽、其前體肽、編碼基因及應(yīng)用。本發(fā)明的海鞘抗菌肽為海鞘抗菌肽Clavanin H，或其保守性變異多肽，或其活性衍生物，或經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的海鞘抗菌肽Clavanin H衍生的多肽。本發(fā)明的海鞘抗菌肽的前體肽具有序列表中SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。本發(fā)明的海鞘抗菌肽應(yīng)用于制備抗病菌類產(chǎn)品，如飼料添加劑、獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品如抗菌藥物等。
文檔編號A61K38/17GK101250222SQ20081006576
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者李永新, 皮燦輝, 蘇向東, 黃毓茂 申請人:深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司