專利名稱：一種應用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細胞接種方法
技術領域：
本發(fā)明屬于組織工程椎間盤髓核的構(gòu)建技術，具體涉及應用于組織工程椎 間盤髓核構(gòu)建的種子細胞接種方法。
背景技術：
在組織工程椎間盤髓核的構(gòu)建過程中，種子細胞的接種是一項關鍵技術， 接種方法的選擇直接影響著種子細胞在支架材料上分布、上架率及細胞的生物 學活性，進而決定所構(gòu)建組織的生物學功能。目前國內(nèi)外文獻報道的種子細胞 的接種方法很多，其中以靜置法最為常用，該方法簡單易行，但此法存在的最 大問題是細胞的上架率很低，并且所接種細胞在支架材料中的分布不均勻。于是研究者又嘗試使用動態(tài)接種法進行接種，其中包括perfusion seeding (灌注 接種法)，spinner flask seeding (旋轉(zhuǎn)接種法)，agitated seeding (攪動接 種法)等，但是這些方法的效率目前仍然存在爭論，并且需要借助特殊的設備。 此外，其他接種方法，例如oscillatingperfusion (振蕩接種法)，filtration seeding (過濾接種法)等操作比較復雜，且多受限于材料的形狀。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術存在的不足，提出一種應用于組織工程椎 間盤髓核構(gòu)建的種子細胞接種方法，其方法簡單，并能提高種子細胞的上架率和種子細胞在支架內(nèi)分布的均勻程度。本發(fā)明提出的應用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細胞接種方法，采用 的種子細胞接種載體為透明質(zhì)酸，該載體為正常椎間盤髓核的細胞外基質(zhì)成分， 在整個髓核組織空間結(jié)構(gòu)的維持，髓核組織細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定，髓核細胞生物 學功能的發(fā)揮等方面起著關鍵的作用。本發(fā)明方法的步驟如下一種應用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細胞接種方法，所述方法采用 的種子細胞接種載體為透明質(zhì)酸，其步驟如下(1) 首先將人或動物的椎間盤髓核細胞與用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液 配制的透明質(zhì)酸溶液進行混懸，保證細胞懸液中髓核細胞的終濃度為1 X105-1X 1(f個/ml，透明質(zhì)酸的終濃度為0. 001-0. 01mg/ml;(2) 將本身不含有透明質(zhì)酸成分的組織工程髓核支架材料用不含血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡后吸干水分，放入培養(yǎng)皿中待用；(3) 將歩驟(1)所制的細胞懸液緩慢滴加至支架材料，在37C°， 5%C02 的孵箱內(nèi)靜置；(4) 30分鐘后將細胞-支架復合體移入到培養(yǎng)瓶中，緩慢加入10%胎牛血 清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37C。， 5%0)2培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，每隔2-3日進行 換液，直到細胞在支架材料內(nèi)進行增殖并合成細胞外基質(zhì)，此時將細胞-支架復 合體移植入動物或人體內(nèi)進行研究或治療。應用上述種子細胞接種方法具有以下幾方面的優(yōu)點1.透明質(zhì)酸為正常髓核組織基質(zhì)成分，具有可降解性，無免疫原性，不激 活補體和促進種子細胞更好發(fā)揮生物學功能等特點，因而此接種方法更加的安全、仿生并且可以提高所構(gòu)建組織的生物學性能。
2. 此種方法操作簡單，無需借助特殊的設備，只需將種子細胞與一定濃度 的透明質(zhì)酸混懸后滴注到本身不含有透明質(zhì)酸成分的組織工程髓核支架材料上
靜置即可。
3. 以往研究證明透明質(zhì)酸是介導細胞與細胞外基質(zhì)黏附以及細胞在細胞外 基質(zhì)上伸展的重要分子，因而此基于透明質(zhì)酸作為接種載體的接種法可以提高 種子細胞的上架率和種子細胞在支架內(nèi)分布的均勻程度。
4. 透明質(zhì)酸為正常髓核基質(zhì)成分，具有良好的生物相容性，因而此接種方 法在組織工程髓核研制領域當中可以廣泛應用。
5. 所應用的透明質(zhì)酸價格便宜，因而此種方法經(jīng)濟實用，易于推廣使用。
具體實施方式
實施例1:
1. 首先將分離培養(yǎng)的三周齡新西蘭乳兔椎間盤髓核細胞與用DMEM/F12培養(yǎng) 液(無血清)配制的透明質(zhì)酸溶液進行混懸，保證細胞懸液中髓核細胞的終濃度 為1X 105-1 X 1()6個/ml，透明質(zhì)酸的終濃度為0. 001-0. 01mg/ml。
2. 將I型膠原海綿支架材料用DMEM/F12培養(yǎng)液(無血清)浸泡后盡量吸干 水分，放入培養(yǎng)皿中待用。
3. 將第1步所制的細胞懸液緩慢滴加至支架材料，在37C。， 5%0)2的孵箱內(nèi)
內(nèi)靜置。
4. 30分鐘后將細胞-支架復合體移入到培養(yǎng)瓶中，緩慢加入DMEM/F12培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清)，在37C° ， 5%0)2培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，每隔2-3日進行換液，直到細胞在支架材料內(nèi)進行增殖并合成細胞外基質(zhì)，此時將細胞-支架復合體移 植入兔椎間盤退變動物模型體內(nèi)進行研究。實施例21. 首先將分離培養(yǎng)的人椎間盤髓核細胞與用DMEM/F12培養(yǎng)液(無血清) 配制的透明質(zhì)酸溶液進行混懸，保證細胞懸液中髓核細胞的終濃度為1X105-1X 1(f個/ml，透明質(zhì)酸的終濃度為0. 001-0. 01mg/ml。2. 將聚磷酸鈣支架材料用DMEM/F12培養(yǎng)液(無血清)浸泡后盡量吸干水 分，放入培養(yǎng)皿中待用。3. 將第1步所制的細胞懸液緩慢滴加至支架材料，在37C°， 5%0)2的孵箱內(nèi)靜置。4. 30分鐘后將細胞-支架復合體移入到培養(yǎng)瓶中，緩慢加入DMEM/F12培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清)，在37C。， 5%0)2培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，每隔2-3日換液，直到細胞在支架材料內(nèi)進行增殖并合成細胞外基質(zhì)，此時將細胞-支架復合體移植 入病人已摘除髓核組織的退變節(jié)段椎間盤內(nèi)進行治療。 上述各例中使用的DMEM/F12培養(yǎng)液由Hyclone公司提供。
權利要求
1. 一種應用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細胞接種方法，所述方法采用的種子細胞接種載體為透明質(zhì)酸，其步驟如下(1)首先將人或動物的椎間盤髓核細胞與用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液配制的透明質(zhì)酸溶液進行混懸，保證細胞懸液中髓核細胞的終濃度為1×105-1×106個/ml，透明質(zhì)酸的終濃度為0.001-0.01mg/ml；(2)將本身不含有透明質(zhì)酸成分的組織工程髓核支架材料用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡后吸干水分，放入培養(yǎng)皿中待用；(3)將步驟(1)所制的細胞懸液緩慢滴加至支架材料，在37C°，5％CO2的孵箱內(nèi)靜置；(4)30分鐘后將細胞-支架復合體移入到培養(yǎng)瓶中，緩慢加入10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37C°，5％CO2培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，每隔2-3日進行換液，直到細胞在支架材料內(nèi)進行增殖并合成細胞外基質(zhì)，此時將細胞-支架復合體移植入動物或人體內(nèi)進行研究或治療。
2、根據(jù)權利要求1所述的應用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細胞 接種方法，其特征在于所述支架材料為本身不含有透明質(zhì)酸成分的組織 工程髓核支架材料，選自I型膠原海綿支架材料、聚磷酸鈣支架材料、藻 酸鹽支架材料、殼聚糖及其衍生物支架材料、聚羥基乙酸支架材料、聚乳酸支架材料。
全文摘要
本發(fā)明提出一種應用于組織工程椎間盤髓核構(gòu)建的種子細胞接種方法，采用的種子細胞接種載體為透明質(zhì)酸，接種步驟為首先將人或動物的椎間盤髓核細胞與透明質(zhì)酸溶液進行混懸，再將支架材料用培養(yǎng)液浸泡后吸干水分待用，然后用細胞懸液緩慢滴加至支架材料，靜置，最后將細胞-支架復合體移入到培養(yǎng)瓶中，緩慢加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，直到細胞在支架材料內(nèi)進行增殖并合成細胞外基質(zhì)，即可移植入動物或人體內(nèi)進行研究或治療。該方法簡單，具有更加的安全、仿生并且可以提高所構(gòu)建組織的生物學性能，提高種子細胞的上架率和種子細胞在支架內(nèi)分布的均勻程度等優(yōu)點。
文檔編號A61L27/38GK101285052SQ20081006960
公開日2008年10月15日 申請日期2008年4月29日 優(yōu)先權日2008年4月29日
發(fā)明者躍 周, 李長青, 博 黃 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院