專利名稱：癩葡萄籽油甘油三酰酯在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途的制作方法
專利說明癩葡萄籽油甘油三酰酯在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癩葡萄籽提取物的用途，更具體地，本發(fā)明涉及癩葡萄籽油甘油三酰酯在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
癩葡萄(Momordica charantia L.Var.abbreviata Ser.，MCV)是苦瓜的一個(gè)變種，原產(chǎn)于印度東部，經(jīng)江蘇省優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)中心馴化改良，被無錫市富仁生物技術(shù)有限公司成功地予以大面積栽培、開發(fā)。癩葡萄果實(shí)整體呈紡錘狀，果面呈不規(guī)則尖刺狀，長約4～10cm，寬約3～6cm，果重25g-30g，未成熟果實(shí)呈淺綠色，成熟后為金黃色。癩葡萄與我國常見的苦瓜外形略有不同。
癩葡萄籽中含油量約30％，脂肪酸組成較為簡單，主要成分為十八個(gè)碳的脂肪酸，其含量達(dá)96.28％，其中十八碳不飽和脂肪酸含量達(dá)64.51％，在十八碳不飽和脂肪酸中共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid，記為CLn)為其主要成分，其含量是總脂肪酸的55.13％。
近年來人們對(duì)共軛三烯酸(conjugated trienoic acid)抗癌活性的研究比較活躍，研究對(duì)象主要是富含共軛亞麻酸的植物油(如栝樓籽油、苦瓜籽油、石榴籽油等)以及純CLn(如α-桐酸、栝樓酸、石榴酸等，它們均為十八碳共軛三烯酸，互為順反異構(gòu)體)，尤其對(duì)苦瓜籽油和α-桐酸的抗結(jié)腸腫瘤的活性及機(jī)理作了較多的研究，但對(duì)這些油的甘三酯(triacylglycerols，記為TG)組成及結(jié)構(gòu)與抗腫瘤功效之間的關(guān)系研究較少。主要原因是TG組成復(fù)雜，同分異構(gòu)現(xiàn)象普遍，難以分離得到單一的TG。TG是植物和動(dòng)物天然脂質(zhì)存在的主要形式，它們的分子結(jié)構(gòu)，包括脂肪酸在甘油骨架上不同空間位置的分布，對(duì)它們的消化和吸收等營養(yǎng)性質(zhì)，生物合成等生物化學(xué)性質(zhì)，晶體結(jié)構(gòu)、熔點(diǎn)等物理性質(zhì)都有重大的影響，這一觀點(diǎn)已經(jīng)得到了普遍認(rèn)同。13C-NMR法和胰脂酶定向水解TG法是研究TG組成與結(jié)構(gòu)的常用手段，可以從整體上了解油脂TG中的脂肪酸分布的信息，但仍不能說明具體TG的結(jié)構(gòu)；近年已有用APCI-MS法推斷具體TG結(jié)構(gòu)的報(bào)道。我們采用13C-NMR和APCI-MS兩種方法，其結(jié)果相互印證，以圖準(zhǔn)確判定癩葡萄籽油(The Seed oil ofMomordica charantia L.Var.abbreviata Ser.，MCO)TG的結(jié)構(gòu)。我們采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，考察、比較MCO混合TG、α-桐酸以及從MCO混合TG中分離得到的不同TG對(duì)消化系統(tǒng)系列腫瘤細(xì)胞增殖的影響，探討脂肪酸、甘三酯對(duì)于油脂的抗腫瘤功效是否存在結(jié)構(gòu)或組成決定功效的關(guān)系的問題，同時(shí)試圖發(fā)現(xiàn)該系列活性物質(zhì)的抑瘤規(guī)律，篩選對(duì)某一腫瘤細(xì)胞株抑制作用最強(qiáng)的物質(zhì)，并探求其作用濃度范圍，為癩葡萄籽油的深度開發(fā)及其在腫瘤防治上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術(shù)問題] 本發(fā)明的目的是提供一種癩葡萄籽油甘油三酰酯在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
[技術(shù)方案] 本發(fā)明涉及一種癩葡萄籽油甘油三酰酯在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯是采用下述方法制備的 (i)、癩葡萄籽陰干后去殼，25重量份癩葡萄籽用研缽磨成粉狀，再轉(zhuǎn)入具塞錐形瓶中，先加50重量份氯仿、100重量份甲醇，振搖2min，然后再加50重量份氯仿、50重量份水，振搖2min后進(jìn)行過濾，濾渣用10重量份氯仿、20重量份甲醇、20重量份氯仿/水混合物(1∶1，v/v)順序洗滌，合并洗液再轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，分離含氯仿液層，再用裝有無水硫酸鈉的漏斗進(jìn)行過濾，得到的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35℃水浴中在減壓下蒸去溶劑，然后用氮?dú)獯党龤堄嗳軇溆蜆映涞獨(dú)庵糜诒渲斜４鎮(zhèn)溆?；其中所述的癩葡萄籽是由江蘇無錫市富仁生物科技有限公司提供的。
(ii)、25重量份硅膠用80重量份石油醚/無水乙醚(87∶13，v/v)與1重量份乙酸的混合液浸泡一夜，裝柱，再取2.5重量份所述油樣，用50重量份所述混合液溶解，油樣上柱，再用150重量份所述混合液作為洗脫液洗脫60-70min，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35℃水浴中在減壓下蒸去溶劑，得到所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物(癩葡萄籽油TG)。
(iii)、液相色譜法分離癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物 制備所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物溶液將所述癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物樣品溶于異丙醇/正己烷(5∶4，v/v)中，達(dá)到濃度200mg/mL； 液相色譜法分離條件WaterTM600(Waters公司)；色譜柱Lichrospher C18柱(10μm，250mm×10.0mm)(江蘇漢邦科技有限公司)；柱溫30℃；進(jìn)樣量50μL；流動(dòng)相乙腈∶異丙醇/正己烷(5/4，v/v)＝60∶40(v/v)；流速3mL/min；檢測波長270nm，所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物溶液上柱，分離，收集期望組分，得到所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯。
在本發(fā)明中，所述的腫瘤細(xì)胞選自肝、胃、食道、結(jié)腸或口腔癌。
下面詳細(xì)地描述(1)癩葡萄籽油TG組成和結(jié)構(gòu)分析、(2)細(xì)胞試驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理方法。
1、癩葡萄籽油TG的RP-HPLC/APCI-MS分析與制備 (i)色譜條件Waters 2695 Alliance HPLC Pump，SunFire C18 column(25cm×2.1mm，5μm particle size，Waters，USA)。將癩葡萄籽油TG樣品溶于異丙醇/正己烷(5∶4，v/v)中，其濃度1mg/mL，進(jìn)樣量3μL。柱溫35℃。流動(dòng)相A乙腈，流動(dòng)相B異丙醇/正己烷(5∶4，v/v)，梯度洗脫在0min100％A，50min內(nèi)變到50％A+50％B，然后在10min內(nèi)變?yōu)?00％B，流速0.3mL/min。
(ii)質(zhì)譜條件離子源為大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressurechemical ionization，APCI)，AP+模式，探針溫度400℃，錐孔電壓52v，掃描范圍300-1000amu，氮?dú)獗Ｗo(hù)。
二極管陣列紫外檢測器掃描范圍200-400nm。
(iii)NMR分析條件 儀器型號(hào)BRUKER AVANCE500(Bruker Biospin International AG)。
13C-NMR采樣脈沖寬度45°，掃描次數(shù)500-1000，測試溫度300K，弛豫時(shí)間4s，在125MHz下觀測，TMS為內(nèi)標(biāo)。
(iv)試驗(yàn)樣品配制 癩葡萄籽油TG、α-桐酸(桐籽采自湖南省吉首市郊，桐油提取方法與癩葡萄籽油提取方法相同，經(jīng)皂化得到桐油混合脂肪酸，再用一定比例的乙醇-水溶液溶解，低溫下重結(jié)晶兩次，得到白色針狀結(jié)晶為α-桐酸)、從癩葡萄籽油混合TG中用液相色譜法分離得到的癩葡萄籽油甘油三酰酯各峰組分，用N2吹干溶劑，準(zhǔn)確稱量，用無水乙醇或四氫呋喃配成20mmol/L的儲(chǔ)備液于-18℃冰箱中保存，2周內(nèi)使用。
(v)癩葡萄籽油TG組成與結(jié)構(gòu)分析 采用RP-HPLC/APCI-MS進(jìn)行初步確定 采用RP-HPLC/APCI-MS方法從已純化癩葡萄籽油甘三酯混合物中分離癩葡萄籽油甘三酯，并初步確定其結(jié)構(gòu)。本法所需樣品量少，分析時(shí)間短，可以分析癩葡萄籽油甘三酯混合物中的單個(gè)癩葡萄籽油甘三酯，其他方法較難做到這點(diǎn)。APCI-MS除了可以提供癩葡萄籽油甘三酯分子量的信息外([M+H]+)，還可以提供癩葡萄籽油甘三酯斷裂為不同甘二酯(diacylglycerols，DG)的信息([M-RCOO]+)，從而提供脂肪酸在甘油骨架上的空間分布的信息(sn2位上的脂肪酸殘基不易丟失)通過比較癩葡萄籽油甘三酯中的AAB/ABA對(duì)的AA+/AB+的豐度，可以確定該癩葡萄籽油甘三酯的結(jié)構(gòu)是AAB型還是ABA型。雖然多不飽和脂肪酸在sn2位上的丟失比飽和脂肪酸更容易，會(huì)使得判斷失誤，但特定數(shù)值的AAB/ABA對(duì)的AA+/AB+的豐度比還是能使我們得出正確的判斷。分子離子峰的質(zhì)量數(shù)可以從[M+H]+離子峰、與堿金屬離子的加和離子[M+Na]+和[M+K]+的峰來判別；甘二酯碎片離子的質(zhì)量數(shù)是由具有不同雙鍵數(shù)和不同質(zhì)量數(shù)的脂肪酸的丟失而得的，其值具有特征性，APCI-MS可選擇每一個(gè)癩葡萄籽油甘二酯或甘三酯的特征離子，從總離子流圖中重建選擇離子色譜，從而辨別這些癩葡萄籽油甘二酯或甘三酯，或解析重疊峰，并確定共流出癩葡萄籽油甘三酯的準(zhǔn)確保留時(shí)間。
圖1為癩葡萄籽油的RP-HPLC/APCI-MS的總離子流圖和m/z為601.6、595.5、879.8的選擇離子色譜。癩葡萄籽油總離子流色譜圖中RT36.586min處的組分的[M+H]+的m/z為879.8，得到的兩種DG+的m/z分別為601.6和595.5，說明這個(gè)物質(zhì)是由兩個(gè)共軛亞麻酸和一個(gè)硬脂酸組成的TG。
圖2是RT為36.586min、m/z＝878.8的癩葡萄籽油組分的質(zhì)譜圖及局部放大圖。該圖顯示CLnCLn+(m/z＝595.4)的豐度遠(yuǎn)高于SCLn+(m/z＝601.4)的豐度，可以推測這一TG的結(jié)構(gòu)可能為1(3)，2-di-conjugated linolenoyl-3(1)-stearoyl-sn-glycerol(CLnCLnS，下文出現(xiàn)的癩葡萄籽油甘三酯的縮寫形式同此格式，既表明組成，又體現(xiàn)結(jié)構(gòu))，即S較少處于Sn2的位置。CLnCLnS是癩葡萄籽油中含量較大的組分。
在癩葡萄籽油的總離子流圖中，在33.561min附近有一個(gè)峰，實(shí)際上它是三種當(dāng)量碳數(shù)(equivalent carbon number，ECN)同為40、在RP-HPLC上不能分開的TG的共流出物，它們的保留時(shí)間和結(jié)構(gòu)依靠辨別不同的特征DG+離子及比較其豐度來判定RT32.227-32.831min處組分的[M+H]+的m/z為877.7，LCLn+(m/z＝597.6)和LL+(m/z＝599.6)為特征DG+離子，二者的豐度比約為2，推斷TG主要為LCLnL，即共軛亞麻酸主要處于Sn2的位置；RT32.831-33.317min處組分的[M+H]+的m/z也為877.7，但得到的兩種DG+的m/z分別為599.5(CLnO+)和595.5(CLnCLn+)，說明這個(gè)物質(zhì)是由兩個(gè)共軛亞麻酸和一個(gè)油酸組成的TG，由于兩種DG+的豐度很接近，則判斷CLnCLnO和CLnOCLn都存在；RT33.439-34.286min處組分的[M+H]+的m/z為851.8，特征DG+離子CLnCLn+(m/z＝595.6)和PCLn+(m/z＝573.5)的豐度比約為15，推斷TG為CLnCLnP，即P較少處于Sn2的位置。
癩葡萄籽油中RT46.140min處的組分的[M+H]+的m/z為885.9，得到的兩種DG+的m/z為601.6和607.4，說明這個(gè)物質(zhì)是由一個(gè)共軛亞麻酸和兩個(gè)硬脂酸組成的TG，SCLn+(m/z＝601.6)的豐度與SS+(m/z＝607.4)的豐度比約為2，推斷TG主要為SCLnS，即共軛亞麻酸主要處于Sn2的位置。
兩種含硬脂酸的TG的存在與癩葡萄籽油的物理性狀吻合，它在10℃左右時(shí)即會(huì)像豬油一樣凝固。
癩葡萄籽油甘三酯的RP-HPLC/APCI-MS分析結(jié)果見表1。
表1癩葡萄籽油甘三酯的RP-HPLC/APCI-MS分析結(jié)果 注相對(duì)含量按峰面積歸一化計(jì)算，當(dāng)量碳數(shù)(ECN)相同的TG的峰面積一起計(jì)算，由軟件自動(dòng)給出。
天然植物油中的癩葡萄籽油甘三酯的組成復(fù)雜，很多組分相同、結(jié)構(gòu)不同的癩葡萄籽油甘三酯或者組分也有差異的癩葡萄籽油甘三酯在HPLC上的保留性質(zhì)相近，難以將其分離，用HPLC-MS法分析癩葡萄籽油甘三酯組成與結(jié)構(gòu)難度較大。RP-HPLC不能分離ECN相同的癩葡萄籽油甘三酯，重疊峰的解析依靠APCI-MS。ECN相同、FA不同的癩葡萄籽油甘三酯，其甘二酯碎片離子的質(zhì)量數(shù)由具有不同雙鍵數(shù)和不同質(zhì)量數(shù)的脂肪酸的丟失而得，其值具有特征性，APCI-MS可選擇特定癩葡萄籽油甘三酯和甘三酯的特征離子，從總離子流圖中重建選擇離子色譜，從而解析重疊峰，辨別這些癩葡萄籽油甘三酯，并確定共流出癩葡萄籽油甘三酯的準(zhǔn)確保留時(shí)間，初步判定其結(jié)構(gòu)；但不能解析由雙鍵位置異構(gòu)和順反異構(gòu)的FA組成的不同的癩葡萄籽油甘三酯。表1即未能區(qū)分由CLn的順反異構(gòu)體構(gòu)成的不同癩葡萄籽油甘三酯，也不能區(qū)分由Ln與CLn構(gòu)成的不同癩葡萄籽油甘三酯，但后一情形的紫外吸收強(qiáng)度會(huì)有顯著差別。分析中同時(shí)采用的二極管陣列紫外檢測在271nm(α-桐酸的特征吸收波長)掃描得到的色譜圖與TIC沒有顯著差異。
13C-NMR對(duì)癩葡萄籽油甘三酯結(jié)構(gòu)的判定 為了驗(yàn)證APCI-MS法對(duì)癩葡萄籽油甘三酯結(jié)構(gòu)的判定結(jié)果，我們做了癩葡萄籽油的13C-NMR實(shí)驗(yàn)。
由于文獻(xiàn)中未見AAA型的三α-桐酸甘油酯的13C-NMR數(shù)據(jù)，我們用RP-HPLC從桐油中分離制備得一組分，經(jīng)APCI-MS及271nm二極管陣列紫外檢測(見圖3)，認(rèn)為該組分是AAA型的三α-桐酸甘油酯。
其1H-NMR數(shù)據(jù)如下 δH＝0.895(H-18)，1.331(H-3，4，5，6，7)，1.588(H-16，17)，2.092(H-8，cis)，2.168(H-15，trans)，2.309(H-2)，4.218(甘油骨架αH)，5.262(甘油骨架βH)，5.384(H-9)，5.676(H-14)，5.987(H-10)，6.117(H-12，13)，6.370(H-11) 在δH＝2.73-2.70處沒有信號(hào)，表明該組分不含非共軛的亞麻酸，H-15是反式，進(jìn)一步認(rèn)定該組分為三α-桐酸甘油酯。
13C-NMR數(shù)據(jù)及其歸屬如表2所示。
表2桐油中三α-桐酸甘油酯的13C-NMR化學(xué)位移值 aα位脂肪酸殘基C的化學(xué)位移。
bβ位脂肪酸殘基C的化學(xué)位移。
依據(jù)AAA型三α-桐酸甘油酯的13C-NMR數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，將癩葡萄籽油的13C-NMR數(shù)據(jù)及其歸屬列于表3。 表3癩葡萄籽油的碳原子的化學(xué)位移值 aSat＝飽和脂肪酸，O＝油酸，L＝亞油酸，αE＝α-桐酸 由于α-桐酸等共軛亞麻酸在癩葡萄籽油中占的份額很大(超過50％)，Sat、O、L這些脂肪酸的信號(hào)較弱，在13C-NMR上的化學(xué)位移不能分開。但在C-1上明顯顯示Sat、L只分布在甘油骨架的α位上，而α-桐酸等共軛亞麻酸則在α和β位上都有分布。C-2上的位移值進(jìn)一步證實(shí)了這一現(xiàn)象。
表4列出了癩葡萄籽油RT29.68min組分的碳原子13C-NMR的化學(xué)位移值。
表4癩葡萄籽油RT29.68min的碳原子的化學(xué)位移值 aSat＝飽和脂肪酸，O＝油酸，L＝亞油酸，αE＝α-桐酸 癩葡萄籽油RT29.68min組分對(duì)應(yīng)表1中的CLnCLnL和CLnLCLn，其碳原子13C-NMR的化學(xué)位移值顯示在甘油骨架的α位和β位都有L，可以說APCI-MS法將該組分的結(jié)構(gòu)定為1(3)，2-di-conjugatedlinolenoyl-3(1)-linoleoyl-sn-glycerol(CLnCLnL)和1，3-di-conjugatedlinolenoyl-2-linoleoyl-sn-glycerol(CLnLCLn)是可靠的。
RP-HPLC分離收集的癩葡萄籽油TG各峰對(duì)應(yīng)組分 表5 RP-HPLC分離收集的癩葡萄籽油甘三酯各峰對(duì)應(yīng)組分 2、細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝細(xì)胞株L02、人食管癌細(xì)胞株ECA-109、人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174-T及人口腔上皮癌細(xì)胞株KB均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，在江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所常規(guī)體外細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
五株消化系統(tǒng)癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞均用含10％小牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)液(含100u/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素)于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。
小牛血清由中國科學(xué)院上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司提供。
培養(yǎng)箱是Thermo Forma公司以商品名二氧化碳培養(yǎng)箱3110銷售的產(chǎn)品。
青霉素是碧云天公司以商品名青霉素ST488-1銷售的產(chǎn)品。
鏈霉素是碧云天公司以商品名鏈霉素ST488-2銷售的產(chǎn)品。
3、腫瘤細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Skehan的SRB方法(見文獻(xiàn)P.Skehan，R.Storeng，D.Scudiero，A.Monks，J.McMahon，D.Vistica，J.T.Warren，H.Bokesch，S.Kenney，M.R.Boyd，New colorimetric cytotoxicity assay for anti-cancer-drug screening.JNatl Cancer Inst.1990，82，1107-1112.)，取生長良好的培養(yǎng)細(xì)胞，以0.6-1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組6個(gè)平行孔。培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組中加入100μL/孔不同終濃度(25、50、100、200和400μmol/L或31.25、62.5、125、250和500μmol/L，由20mmol/L的儲(chǔ)備液用培養(yǎng)液稀釋而得)的待試驗(yàn)藥物，并用培養(yǎng)液補(bǔ)足200μL/孔。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組不加所述藥物。培養(yǎng)72h后，取出培養(yǎng)板，小心棄去培養(yǎng)液，按200μL/孔慢慢加入經(jīng)4℃預(yù)冷的10％三氯醋酸(Trichloroacetic Acid，TCA)，室溫靜置5min，移至4℃放置1h。固定結(jié)束，棄去固定液，用蒸餾水洗滌三遍以去除TCA。經(jīng)空氣干燥后，按100μL/孔加0.4％SRB(磺酰羅丹明B，Sulforhodamine B，為Sigma公司以商品名磺酰羅丹明B銷售的產(chǎn)品)染色液，于37℃染色30min，棄去染色液，用1％醋酸洗滌三遍以充分去除未結(jié)合的SRB，空氣干燥后，加150μL/孔10mmol/L Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羥甲基氨基甲烷，三博遠(yuǎn)志公司以商品名三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽銷售的產(chǎn)品)液溶解，微量振蕩器振蕩30s，所述的微量振蕩器是酶標(biāo)儀測量光吸收值A(chǔ)531。按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率 細(xì)胞存活率(％)＝實(shí)驗(yàn)組A531/對(duì)照組A531×100％。
所述的微量振蕩器是江蘇金壇市億通電子有限公司以商品名ZW-A微量振蕩器銷售的產(chǎn)品，其操作條件是低速30秒。
所述的酶標(biāo)儀是所述的酶標(biāo)儀是美國伯樂公司以商品名Bio-RadModel 3550銷售的產(chǎn)品，其測量條件是OD531。
4、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用

表示，使用學(xué)生氏-t檢驗(yàn)(兩位)計(jì)算顯著性。P值小于0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。
[有益效果] 除了對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的毒性不如α-桐酸外，癩葡萄籽油中含共軛亞麻酸的甘油三酰酯對(duì)4個(gè)人體腫瘤細(xì)胞系都具有極強(qiáng)的毒性；而對(duì)正常肝細(xì)胞雖有毒性，但強(qiáng)度不高。例如甘三酯SCLnS在高濃度(125μmol/L以上)時(shí)對(duì)5種人腫瘤細(xì)胞株、1種人正常細(xì)胞株都有毒性；在62.5μmol/L時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人口腔癌細(xì)胞KB、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174-T有顯著毒性；在31.25μmol/L時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人口腔癌細(xì)胞KB和人肝癌細(xì)胞株Bel-7402毒性顯著。綜合來看，癩葡萄籽油中甘三酯SCLnS的抗人胃癌腫瘤細(xì)胞SGC-7901的活性最佳。因此，癩葡萄籽油甘油三酰酯具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞的前景。


圖1是癩葡萄籽油的RP-HPLC總離子流色譜圖和m/z＝878.8組分的m/z＝601.6、595.5選擇離子色譜； 圖2是保留時(shí)間為36.586min、m/z＝878.8的癩葡萄籽油組分的質(zhì)譜圖及局部放大圖； 圖3是RP-HPLC分離得到的桐油組分的271nm紫外檢測色譜圖和總離子流色譜圖及其質(zhì)譜圖； 具體實(shí)施方式
下面描述的實(shí)施例詳細(xì)說明。
實(shí)施例1試驗(yàn)樣品對(duì)人肝正常細(xì)胞L02存活率的影響 前面表5列出的6個(gè)峰樣品與混合TG樣品共7個(gè)待試驗(yàn)樣品以及α-桐酸樣品，分別用培養(yǎng)基配制成濃度為25、50、100、200和400μmol/L的樣品液，加培養(yǎng)基不加藥物者作為對(duì)照，每個(gè)待試驗(yàn)樣品都有對(duì)照，處理肝正常細(xì)胞L02。培養(yǎng)72h后用SRB法檢測細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。表6不同濃度癩葡萄籽油TG及分離物 對(duì)肝正常細(xì)胞L02存活率的影響 在最高濃度下(400μmol/L)，除MCO混合TG外，7個(gè)待試驗(yàn)樣品對(duì)肝正常細(xì)胞L02增殖都有一定的抑制作用。MCO混合TG對(duì)肝正常細(xì)胞L02增殖幾乎沒有任何影響；在100μmol/L及以下濃度，除峰6外(41.3％)，肝正常細(xì)胞L02存活率在85％以上。
峰6組分在所有濃度下顯示的毒性都比其他組分大。從總體上看，6個(gè)分離組分對(duì)肝正常細(xì)胞L02增殖抑制作用由大到小依次為峰6、峰3、峰2、峰5、峰1、峰4。
在100μmol/L以上濃度，隨著檢測樣濃度的增加，肝正常細(xì)胞L02的存活率明顯下降，說明待試驗(yàn)樣品對(duì)肝正常細(xì)胞L02增殖抑制作用也存在明顯的量效關(guān)系；在100μmol/L及以下濃度，待試驗(yàn)樣品對(duì)肝正常細(xì)胞L02增殖抑制作用不明顯。
實(shí)施例2試驗(yàn)樣品對(duì)人食道癌細(xì)胞ECA-109存活率的影響 前面表5列出的5個(gè)峰樣品與混合TG樣品共6個(gè)待試驗(yàn)樣品以及α-桐酸樣品，分別用培養(yǎng)基配制成濃度為31.25、62.5、125、250和500μmol/L的樣品液，只加培養(yǎng)基不加藥物者作為對(duì)照，每個(gè)待試驗(yàn)樣品都有對(duì)照，處理食道癌細(xì)胞ECA-109。培養(yǎng)72h后用SRB法檢測細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。
表7不同濃度癩葡萄籽油TG及分離物 對(duì)食道癌細(xì)胞ECA-109存活率的影響 雖然在一定濃度下7個(gè)待試驗(yàn)樣品對(duì)食道癌細(xì)胞ECA-109增殖有一定的抑制作用，但7個(gè)待試驗(yàn)樣品在125μmol/L以下的濃度幾乎都沒有毒性。從總體上看，MCO混合TG的毒性最小，即使是高濃度的，毒性也較小；峰1、峰5和峰6毒性也很小；在125-250μmol/L濃度下，α-桐酸毒性很大，此時(shí)峰3組分顯示更大毒性；峰2只在最高濃度時(shí)顯示很大毒性。
從表7中可以看出隨著待試驗(yàn)樣品濃度的增加，食道癌細(xì)胞ECA-109細(xì)胞的存活率明顯下降，說明待試驗(yàn)樣品對(duì)食道癌細(xì)胞ECA-109增殖抑制作用具有明顯的量效關(guān)系。
MCO混合TG、α-桐酸以及從MCO混合TG中分離得到的不同TG對(duì)食道癌細(xì)胞ECA-109增殖的抑制作用都不強(qiáng)，且只有峰3組分在125-250μmol/L濃度下顯示比α-桐酸毒性大。
實(shí)施例3試驗(yàn)樣品對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901存活率的影響 前面表5列出的6個(gè)峰樣品與混合TG樣品共7個(gè)待試驗(yàn)樣品以及α-桐酸樣品，分別用培養(yǎng)基配制成濃度為31.25、62.5、125、250和500μmol/L的樣品液，只加培養(yǎng)基不加藥物者作為對(duì)照，每個(gè)待試驗(yàn)樣品都有對(duì)照，處理胃癌細(xì)胞SGC-7901。培養(yǎng)72h后用SRB法檢測細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。
表8不同濃度癩葡萄籽油TG及分離物 對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901存活率的影響 在一定濃度下8個(gè)待試驗(yàn)樣品對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖都有一定的抑制作用。從表8中可以看出隨著待試驗(yàn)樣品濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞的存活率明顯下降，說明待試驗(yàn)樣品對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用具有明顯的量效關(guān)系。
從總體上看，MCO混合TG的毒性仍然最小，即使是高濃度，毒性也較??；峰1毒性明顯弱于其他幾個(gè)峰組分，但在濃度為125-250μmol/L處毒性強(qiáng)過α-桐酸；在250μmol/L及以下濃度，峰2、3、4、5、6組分都比α-桐酸毒性強(qiáng)，它們?cè)诘蜐舛?31.25μmol/L)時(shí)毒性也很大，使得細(xì)胞存活率低于54.1％，尤其是峰3和峰6組分，在此濃度時(shí)細(xì)胞存活率分別只有41.9％和34.6％。
6個(gè)分離組分對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用由大到小依次為峰3、峰6、峰5、峰2、峰4、峰1。除峰1外的5個(gè)峰組分各濃度對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖都有顯著的抑制作用。
實(shí)施例4試驗(yàn)樣品對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402存活率的影響 前面表5列出的6個(gè)峰樣品與混合TG樣品共7個(gè)待試驗(yàn)樣品以及α-桐酸樣品，分別用培養(yǎng)基配制成濃度為25、50、100、200和400μmol/L的樣品液，只加培養(yǎng)基不加藥物者作為對(duì)照，處理肝癌細(xì)胞Bel-7402。培養(yǎng)72h后用SRB法檢測細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。
表9不同濃度癩葡萄籽油TG及分離物 對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402存活率的影響 6號(hào)峰從50μmol/L起就對(duì)Bel-7402細(xì)胞有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。峰3和峰4從100μmol/L起對(duì)該細(xì)胞有極強(qiáng)毒性。而α-桐酸、混合TG、峰1、5、2的效果不顯著。
實(shí)施例5試驗(yàn)樣品對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LS-174T存活率的影響 前面表5列出的6個(gè)峰樣品與混合TG樣品共7個(gè)待試驗(yàn)樣品以及α-桐酸樣品，分別用培養(yǎng)基配制成濃度為31.25、62.5、125、250和500μmol/L的樣品液，只加培養(yǎng)基不加藥物者作為對(duì)照，處理肝癌細(xì)胞Bel-7402。培養(yǎng)72h后用SRB法檢測細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。 表10不同濃度癩葡萄籽油TG及分離物 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LS-174T存活率的影響 α-桐酸對(duì)該細(xì)胞的毒性作用在所有5個(gè)濃度下都比癩葡萄籽油TG要強(qiáng)，這是5個(gè)人體腫瘤細(xì)胞中唯一的例外。與文獻(xiàn)中的報(bào)道也吻合，目前國際上報(bào)道最多的就是α-桐酸對(duì)結(jié)腸腫瘤的抑制作用。癩葡萄籽油中的峰6在濃度高于125μmol/L時(shí)才對(duì)該細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性。
實(shí)施例6試驗(yàn)樣品對(duì)人口腔上皮癌細(xì)胞株KB存活率的影響 前面表5列出的6個(gè)峰樣品與混合TG樣品共7個(gè)待試驗(yàn)樣品以及α-桐酸樣品，分別用培養(yǎng)基配制成濃度為31.25、62.5、125、250和500μmol/L的樣品液，只加培養(yǎng)基不加藥物者作為對(duì)照，處理人口腔上皮癌細(xì)胞株KB。培養(yǎng)72h后用SRB法檢測細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表11。表11不同濃度癩葡萄籽油TG及分離物 對(duì)人口腔上皮癌細(xì)胞株KB存活率的影響 對(duì)口腔癌細(xì)胞，癩葡萄籽油TG的峰1和峰6在較低濃度下即有較強(qiáng)的毒性。但峰3和峰4在125μmol/L以上毒性更強(qiáng)。
從癩葡萄籽油中經(jīng)HPLC分離得到的六組不同TG分別對(duì)5個(gè)人體腫瘤細(xì)胞系有大小不一的效果。除了對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的毒性不如α-桐酸外，癩葡萄籽油中含共軛亞麻酸的甘油三酰酯對(duì)4個(gè)人體腫瘤細(xì)胞系都具有極強(qiáng)的毒性；而對(duì)正常肝細(xì)胞雖有毒性，但強(qiáng)度不高。例如，甘三酯SCLnS在高濃度(125μmol/L以上)時(shí)對(duì)5種人腫瘤細(xì)胞株、1種人正常細(xì)胞株都有毒性；在62.5μmol/L時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人口腔癌細(xì)胞KB、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174-T有顯著毒性；在31.25μmol/L時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人口腔癌細(xì)胞KB和人肝癌細(xì)胞株Bel-7402毒性顯著。綜合來看，癩葡萄籽油中甘三酯SCLnS的抗人胃癌腫瘤細(xì)胞SGC-7901的活性最佳。
權(quán)利要求
1、一種癩葡萄籽油甘油三酰酯在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于癩葡萄籽油甘油三酰酯是采用下述方法制備的
(i)、癩葡萄籽陰干后去殼，25重量份癩葡萄籽用研缽磨成粉狀，再轉(zhuǎn)入具塞錐形瓶中，先加50重量份氯仿、100重量份甲醇，振搖2min，然后再加50重量份氯仿、50重量份水，振搖2min后進(jìn)行過濾，濾渣用10重量份氯仿、20重量份甲醇、20重量份氯仿/水混合物(1∶1，v/v)順序洗滌，合并洗液再轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，分離含氯仿液層，再用裝有無水硫酸鈉的漏斗進(jìn)行過濾，得到的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35℃水浴中在減壓下蒸去溶劑，然后用氮?dú)獯党龤堄嗳軇?，其油樣充氮?dú)庵糜诒渲斜４鎮(zhèn)溆茫?br> (ii)、25重量份硅膠用80重量份石油醚/無水乙醚(87∶13，v/v)與1重量份乙酸的混合液浸泡一夜，裝柱，再取2.5重量份所述油樣，用50重量份所述混合液溶解，油樣上柱，再用150重量份所述混合液作為洗脫液洗脫60-70min，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35℃水浴中在減壓下蒸去溶劑，得到癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物；
(iii)、液相色譜法分離所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物
制備所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物溶液將所述癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物樣品溶于異丙醇/正己烷(5∶4，v/v)中，達(dá)到濃度200mg/mL；
液相色譜法分離條件柱溫30℃；進(jìn)樣量50μL；流動(dòng)相乙腈∶異丙醇/正己烷(5/4，v/v)＝60∶40(v/v)；流速3mL/min；檢測波長270nm；所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯混合物溶液上柱，分離，收集期望組分，得到所述的癩葡萄籽油甘油三酰酯。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞選自肝、胃、食道、結(jié)腸或口腔腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及癩葡萄籽油甘油三酰酯在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。除了對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的毒性不如α-桐酸外，癩葡萄籽油中含共軛亞麻酸的甘油三酰酯對(duì)4個(gè)人體腫瘤細(xì)胞系都具有極強(qiáng)的毒性；而對(duì)正常肝細(xì)胞雖有毒性，但強(qiáng)度不高。因此，癩葡萄籽油甘油三酰酯具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞的前景。
文檔編號(hào)A61K36/42GK101239055SQ20081008497
公開日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2008年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日
發(fā)明者堅(jiān) 湯, 傅偉昌, 顧小紅, 徐春燕 申請(qǐng)人:江南大學(xué)