專利名稱：：一種用于免疫調(diào)節(jié)的膠束溶液的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于免疫增強或免疫調(diào)節(jié)的膠束溶液，其中含有膠束化的枸杞多糖或是含有膠束化(micelles)的枸杞多糖提取物。該枸杞多糖膠束可以有效避免機體對單獨注射枸杞多糖產(chǎn)生的過敏反應，同時增加枸杞多糖在消化道中的吸收。該枸杞多糖膠束對機體產(chǎn)生免疫增強或免疫調(diào)節(jié)作用，尤其對需要增強或調(diào)節(jié)免疫功能而進行疾病起到治療、改善、預防作用。本發(fā)明還包括對腫瘤、感染、自身免疫性疾病、糖尿病、過敏性疾病、消化系統(tǒng)疾病(過敏性腸道綜合征(IBS)、炎癥性腸道疾病(IBD)、便秘、腹瀉等)的治療、改善和預防作用。
背景技術：
：枸杞屬植物新鮮或干燥果實的水溶性部分分離得到的枸杞多糖，一般是由雜多糖組成。其經(jīng)元素分析，還顯示含有氮元素。同時，枸杞多糖樣品由于來源不同、最終的應用目的不同，其中常含有多種氨基酸、小肽及多種微量元素。例如，枸杞多糖(LBP)是由六種己碳單糖ARA、GLC、GAL、MAN、XYL和RHA組成的多糖側(cè)鏈和十八種氨基酸組成的蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)成。經(jīng)過科研人員的大量試驗工作，目前普遍認為枸杞對骨髓造血干細胞、粒單系祖細胞增殖分化具有調(diào)節(jié)作用，能提高抗細菌感染力，對肝損傷有保護作用；枸杞多糖可以調(diào)節(jié)免疫功能低下、具有解毒、抗感染作用。其注射液能使免疫器官(胸腺和脾臟)重量增加，對體液免疫和細胞免疫有促進作用，是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染、促進造血功能等作用的基礎。其中的多糖肽有很好的抗脂質(zhì)過氧化活性。膠束是膠體分散系中的一種，屬于締合膠體。聚合物膠束的粒徑通常在200nm以下,屬于物質(zhì)由宏觀向微觀的過渡區(qū)域。這種特殊結(jié)構(gòu)可導致四種效應小尺寸效應、表面與界面效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應，并表現(xiàn)出傳統(tǒng)固體物質(zhì)所不具有的許多特殊性質(zhì)。因此，期待與以往的制品相比，能以醫(yī)藥產(chǎn)品、保健食品或功能食品的形式，充分、有效地利用枸杞多糖用于維持改善動物(特別是人)的健康。本發(fā)明的目的是制備出一定粒徑范圍內(nèi)的膠束(Micelle)溶液，以增加口服給用時其粘膜的吸收性，或是降低注射給用枸杞多糖時機體產(chǎn)生的致敏作用，從而有效地利用枸杞資源，特別是有效地利用具有明確活性的枸杞多糖制備用于免疫調(diào)節(jié)和免疫增強的飲食品(保健食品、功能性食品等)或醫(yī)藥產(chǎn)品(醫(yī)藥組合物)。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述課題，本發(fā)明者對己有產(chǎn)品中各種成分的利用進行了深入調(diào)査，發(fā)現(xiàn)進一步進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將枸杞多糖制備成膠束溶液(例如將枸杞多糖分散到水中制備10pm以下的膠束，更進一步優(yōu)選0.01lpm的膠束)狀態(tài)時，顯著改善粘膜的吸收，增加枸杞多糖分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，結(jié)果可以起到增強或調(diào)節(jié)免疫功能?；谝陨细鞣N發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。本發(fā)明的制劑特征之一是即便經(jīng)胃腸道給用也顯現(xiàn)優(yōu)良效果，特別是安全性上顯現(xiàn)其優(yōu)點。尤其可以期待，在體內(nèi)通過粘膜(特別是小腸粘膜)吸收而刺激增強全身免疫的效果.因此,可以期待,該膠束溶液可作為具有免疫增強/免疫調(diào)節(jié)作用的醫(yī)藥組合物、飲食品(保健食品等)形式使用。枸杞多糖來自于茄科(5Wfl"ceae)枸杞屬";;c/w"L.)植物1種或幾種植物的果實的提取物，也可以經(jīng)發(fā)酵、組織培養(yǎng)等其它方式而得到。一般來說，這些豐直物包括枸豐己Z^c/wwC7z/weseMill、北方枸豐己Z^c/wwCTn'wewMill.尸otom'm7(Pojark.)A.M.lu、寧夏枸豐己Linn.、截萼枸豐己丄.fnwcafwmY.C.Wang、新i畫拘豐己Ldosy5fe附w附Projark.、會工枝拘豐己￡.t/osyWewwwProjark.var.rubricaulium、云南枸豐己丄.yw"wa"e"seKuangetA.M.Lu黑果枸豐己丄.rwr/zem'cwwMurr.豐主筒枸豐己丄.KuangetA.M.Lu、黃果枸豐己丄.Zar6arwwLinn.Fbr.awn2wricaApw附K.F.Ghing、土庫曼拘豐己丄.fwrco附am'cwwTurcz.、安《惠遜氏拘禾己_Law^fersow'And.、毛'森拘豐己Z.dasyWe附w附Pojark.、力口,H拘t己丄.ca/z》rm'cw附(CaliforniaAVolfberry)、歐洲枸杞Lewrap"eww(EuropeanWolfberry)以及其它茄科枸杞屬植物。將來自上述來源的枸杞多糖進行膠束化時，優(yōu)選該成分在水溶液中形成凝集體。將超微粒子分散到水中進行測定時，微粒的平均粒徑應在100pm以下，優(yōu)選50pm以下，更優(yōu)選10nm以下，更進一步優(yōu)選平均粒徑在0.01~l|im左右。應用力度分布儀可容易求出其平均粒徑。進行超微?；姆椒o特殊困難可以使用攪拌機和勻漿器，可以使用適當?shù)姆稚┻M行超微?；部梢酝ㄟ^高壓乳化機、超聲波等微粉化處理等方法得到合適的超微粒子。例如，應用高壓乳化機制備前述lpm以下的超微粒子，所采用的乳化壓，優(yōu)選300kgf/cr^以上，更優(yōu)選500kgf/cm2，進一步優(yōu)選800kgf/cii^以上，但隨處理次數(shù)的增加可適當降低乳化壓。本發(fā)明的膠束化溶液，可應用乳化劑達到膠束化狀態(tài)使用。關于分散劑的使用量，以含有的枸杞多糖的水溶液中所含全糖(糖總量為l)，按重量比計，優(yōu)選最多混合該分散劑100(100以下)份，更優(yōu)選10以下，更進一步優(yōu)選0.055左右。此時，為了更好得用于實際應用，保證產(chǎn)品的質(zhì)量可控、安全有效，也可以包含制劑學上允許的載體、增溶劑、抗氧化劑及其他輔料。通過測定抗腫瘤活性、NK(NaturalKiller)細胞活性、遲發(fā)超敏反應、細胞內(nèi)外細胞因子的測定、抗體的產(chǎn)生量等，可以很容易地驗證有無免疫增強作用。通過豚鼠試驗，可以檢測產(chǎn)品的過敏性行為。上述超微粒子可以通過動物，尤其是人的小腸粘膜吸收，可達到免疫增強效果或免疫調(diào)節(jié)效果。當其通過注射方式給用時，可以降低或消除枸杞多糖對機體產(chǎn)生的致敏作用。本發(fā)明的最終產(chǎn)品適用的對象是所有動物，特別是人。最終產(chǎn)品的特征之一是即便經(jīng)口服給用時也能顯現(xiàn)出優(yōu)良效果，對給用方式無特殊限制?？刹捎媒?jīng)口給用、非經(jīng)口給用(皮下、肌肉、靜脈、經(jīng)鼻、氣霧或噴霧給用等)各種實施方案，可簡便地適用于廣大需求免疫增強或免疫調(diào)節(jié)作用的患者，大大增加了產(chǎn)品的安全性。本發(fā)明最終產(chǎn)品給用量要根據(jù)疾病的種類、嚴重程度、制劑的形式等作適當?shù)倪x擇。例如經(jīng)口服給用時，以總糖換算，優(yōu)選每天給患者給用lmg50g左右，可以在餐前、中間或餐后給用，但優(yōu)選餐前給用。另外，靜脈給用時，應適當減少給用量。做為預防用，無論健康的人，還是各種疾病的患者，均可給用本發(fā)明的最終產(chǎn)品已到達到全身的免疫增強或調(diào)節(jié)作用，并不特別限于伴隨免疫功能異常的疾病患者。對于人以外的動物而言，可以飼料、醫(yī)藥產(chǎn)品和醫(yī)藥組合物的形式使用。圖l是膠束化枸杞多糖粒徑范圍圖具體實施例方式下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明，但這些實施例不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實施例1將來源于寧夏枸杞6fl^anwjLinn.的粗多糖樣品經(jīng)過反復不同濃度的藥用乙醇處理，同時輔以離心和膜分離及凝膠色譜技術，精制后得到的總多糖樣品。將總多糖樣品溶于蒸餾水中得到枸杞多糖溶液，同時將卵磷脂(SLP-PC700,濃度0.8mg/ml)加入到蒸餾水中制備4倍枸杞多糖濃度的卵磷脂溶液。接著在真空攪拌的情況下(真空度-0.1MPa,均勻攪拌機轉(zhuǎn)速15，000rpm),將枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制備預膠束化溶液。將預膠束化溶液經(jīng)高壓乳化處理(乳化壓1500kgf/cm2)，制備出lOOnm左右的膠束溶液。應用激光衍射/散射式粒度分布測定法進行中位徑的測定(見圖l)。實施例2將來源于枸杞丄K&wCW"ewMill、寧夏枸杞丄.6ar6an/wLinn.、新疆枸杞丄.^w"^m/;nProjark.的枸杞多糖混合樣(硫酸苯酚法顯色，紫外分光光度法標定多糖的含量45%)品溶液加入到等濃度的卵磷脂溶液中，邊充入氮氣邊攪拌(錨式攪拌機轉(zhuǎn)速50rpm)，制備預膠束化溶液。將預膠束化溶液經(jīng)高壓乳化處理(乳化壓1500kgf/cm2)，制備出100nm左右的膠束融液。應用激光衍射/散射式粒度分布測定法進行中位徑的測定(圖略)。實施例3將來源于寧夏枸杞^c/ww6wk/n/加Linn.的粗多糖樣品經(jīng)過精制后得到總多糖樣品，進一步應用膜分離技術得到分子量在8，00030，000之間的多糖樣品。將此多糖樣品溶于蒸餾水中得到枸杞多糖溶液，同時將大豆卵磷脂加入到蒸餾水中制備4倍枸杞多糖濃度的卵磷脂溶液。接著在真空攪拌的情況下(真空度-0.1MPa,均勻攪拌機轉(zhuǎn)速15,000rpm)，將枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制備預膠束化溶液。將預膠束化溶液經(jīng)高壓乳化處理(乳化壓1500kgf/cm2)，制備出90nm左右的膠束溶液液。應用激光衍射/散射式粒度分布測定法進行中位徑的測定(圖略)。實施例4將經(jīng)過脫色素處理后黑果枸杞Ayc/wmn^zem'cwmMurr.的成熟果實，用低濃度的藥用乙醇提取得到總的粗多糖。將粗多糖樣品經(jīng)過反復不同濃度的藥用乙醇處-理，同時輔以離心和膜分離技術，精制后得到的總多糖樣品溶于蒸餾水中得到枸杞多糖溶液，同時將卵磷脂(SLP-PC700)加入到蒸餾水中制備與枸杞多糖相同濃度的卵磷脂溶液。接著在真空攪拌的情況下(真空度-0.1MPa，均勻攪拌機轉(zhuǎn)速15000rpm)，將枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制備預膠束化溶液。將預膠束化溶液經(jīng)高壓乳化處理(乳化壓1200kgf/cm2)，制備出100nm左右的膠束化液。應用激光衍射一散射式粒度分布測定法進行中位徑的測定(圖略)。實施例54每主產(chǎn)于甘肅張掖土庫曼枸杞ft^co附am'cw附Turcz.或西北枸杞丄./70tom'm7Pojark.(甘枸杞)的果實脫色素后，用低濃度的藥用乙醇提取得到總的粗多糖。將粗多糖樣品經(jīng)過反復不同濃度的藥用乙醇處理，同時輔以離心和膜分離技術，精制后得到的總多糖樣品溶于蒸餾水中得到枸杞多糖溶液，同時將大豆卵磷脂加入到蒸餾水中制備與枸杞多糖相同濃度的卵磷脂溶液。接著在真空攪拌的情況下(真空度-0.1MPa，均勻攪拌機轉(zhuǎn)速13，000卬m)，將枸杞多糖溶液加入到卵磷脂溶液中制備預膠束化溶液。將預膠束化經(jīng)高壓乳化處理(乳化壓1500kgf/cm2)，制備出100nm左右的膠束化液。應用激光衍射散射式粒度分布測定法進行中位徑的測定(圖略)。實施例6應用S180皮下移植模型的實施例，試驗方法以腹水的形式采取Sarcoma180腫瘤細胞，該細胞在ICR小鼠(雌性，4周齡)腹腔內(nèi)移植傳代，用生理鹽水調(diào)成3xl0、ell/ml。將該細胞稀釋液移植到ICR小鼠(雌性，4周齡)的右腰背皮下，0.1ml/只。次日，根據(jù)體重進行分組(7只/組)，進行個體標記后，開始施用枸杞多糖及相應的枸杞多糖膠束溶液。1日l次經(jīng)口服給用，5天后休息2天，共進行10次。每次的給用量按總糖換算成44mg/Kg。表1和表2中表示給用組的情況，枸杞多糖浸膏和膠束化的枸杞多糖后面擴弧內(nèi)的數(shù)字是按總多糖量換算的使用量，單位是mg/kg。每周測定一次腫瘤直徑和體重。根據(jù)腫瘤直徑，用以下公式計算腫瘤的重量。腫瘤重量(mg)=腫瘤短徑(mm)2><腫瘤長徑(mm)+2根據(jù)腫瘤重量可以計算出腫瘤增殖抑制率腫瘤增殖抑制率(％)=(l-給用組的腫瘤重量+無處置組的腫瘤重量)x100下面僅通過腫瘤移植后第16天的各組腫瘤增殖抑制率和腫瘤生長情況，評價在該模型中藥效。表l腫瘤重量(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>t-檢驗Student'st-檢驗，分別將各組相對于無處置組進行t-檢驗。M-檢驗Mannwhi加ey-U檢驗，分別將各組相對于無處置組進行順位和檢驗。N.S.:無顯著性差異；p<0.01有顯著性差異。枸杞多糖膠束溶液的給用組中，在給用期間，與對照組相比，逐漸抑制腫瘤增殖，p<0.01，顯著抑制腫瘤增值。表2腫瘤增殖抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上結(jié)果表明，與以前的產(chǎn)品相比，本發(fā)明產(chǎn)品的膠束溶液可達到期望的藥效。實施例7:豚鼠過敏試驗將實驗動物分為枸杞多糖組l(分子量8,000~30,000)、枸杞多糖組2(分子量30，000~100,000)、枸杞多糖組3(分子量100,000~300,000)、枸杞多糖膠束組(多糖分子量8,000~1，000，000)、2%卵白蛋白陽性對照組、0.9%氯化鈉注射液陰性對照組。各組動物以無菌操作隔日分另Uip注射0.5ml/只，共三次致敏，然后將各組動物分為2批，每批3只，分別于首次注射后第14、21天靜脈注射lml/只攻擊。于攻擊后15min內(nèi)，觀察動物有無咳嗽、抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、休一克及死亡等情況。反應級數(shù)_反應癥狀_0無明顯反應1只有輕微抓鼻、顫抖或豎毛2有3次或以上咳嗽、有抓鼻、顫抖或豎毛3多次或連續(xù)咳嗽、伴有呼吸困難或痙攣、抽搐等4痙攣、抽搐、大小便失禁、休克死亡給藥組及陰性對照組動物經(jīng)兩次攻擊后，未見明顯異常癥狀，試驗結(jié)果均為陰性。而陽性對照組可見動物出現(xiàn)呼吸困難、痙攣、大小便失禁、休克死亡等。結(jié)果表明枸杞多糖的膠束溶液對豚鼠無致敏作用(見表3)。表3過敏試驗結(jié)果攻擊時間組別動物數(shù)評分平均分陰性對照組30000陽性對照組34444枸杞多糖32343第14天組l枸杞多糖組232332.7枸杞多糖組333142.7膠束組30000陰性對照組0000陽性對照組34444枸杞多糖32121.7第21天組l枸杞多糖組233212枸杞多糖組333222.3膠束組300008實施例8溶血試驗取兔血15ml，去除纖維蛋白，經(jīng)四次洗滌，將所得紅細胞用0.9%氯化鈉注射液稀釋成2n/。(v/v)的混懸液。然后取試管7支，15號管加入受試藥物0.10.5ml;第6管不加受試物，作陰性對照；第7管仍不加受試藥物，用蒸餾水代替O.9氯化鈉注射液，作陽性對照。將各管置于37'C水浴中保溫，開始每隔15分鐘觀察一次，l小時后每隔l小時觀察一次，連續(xù)觀察4小時。結(jié)果陽性對照管加入蒸餾水后即刻出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。陰性對照管及各試驗管連續(xù)觀察4小時，上清液無色透明，無溶血現(xiàn)象，經(jīng)振蕩搖勻后紅細胞均勻散開，也無紅細胞凝聚現(xiàn)象。結(jié)果表明，枸杞多糖膠束溶液對家兔紅細胞無明顯體外溶血及致凝集作用(見表4)。表4枸杞多糖膠束溶液溶血試驗結(jié)果組別管號0.250.5藥后時間(h)0.751234陰性管6—陽性管7+1—2—++++++枸杞多糖膠束3—溶液4—5—一無浴血十全浴血，陰性對照為生理鹽水(陽性對照為蒸餾水實施例9血管刺激試驗取內(nèi)毒素控制在1.0以下的枸杞多糖膠束樣品(Endosafe法，USP30)及0.9%氯化鈉注射液。將實驗動物分為膠束溶液組和0.9%氯化鈉注射液對照組，給用劑量為人臨床用量的等效劑量，每日給藥一次，連續(xù)7天，分別以無菌操作家兔耳緣靜脈推注給藥。推注后肉眼觀察局部靜脈血管及周圍組織有無紅腫，末次推注后將動物處死，于注射部分近心端1.5cra至3cm處剪取耳緣，用10%甲醛固定，常規(guī)組織切片，觀察有無血栓形成，內(nèi)皮損傷及其它病理變化。結(jié)果給藥期間及末次用藥24小時后，肉眼觀察各組動物耳緣靜脈及周圍組織無紅腫現(xiàn)象，組織切片檢查可見兔耳血管完整，未見內(nèi)皮損傷，周圍組織無水腫及炎性細胞浸潤，與對照組比較無明顯差異。結(jié)果表明，枸杞多糖膠束溶液對家兔血管無明顯刺激作用，亦未引起血管周圍組織明顯病變。權(quán)利要求1.一種用于免疫增強或免疫調(diào)節(jié)的膠束溶液，其中含有膠束化的枸杞多糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枸杞多糖膠束溶液，含有起乳化作用的分散劑卵磷脂，最終的產(chǎn)品為水溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠束溶液，當溶液中枸杞多糖的含量為1時，以重量比計，最多混合100份分散劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述膠束溶液，可以含有制劑學上允許的載體或增量劑以及矯味劑。5.根據(jù)權(quán)利要求14任一項所述的膠束溶液，總糖在整個體系內(nèi)所占重量百分比為0.01~80%。6.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項所述的膠束溶液，其所含有的枸杞多糖膠束為分散劑與多糖溶液混合制備出0.01100pm的粒子。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的膠束溶液，其中優(yōu)選制備出平均粒徑為lpm以下的膠束溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求17任一項所述膠束溶液，枸杞多糖來自于茄科(So/a"ceae)枸杞屬(Ayc/"wL.)植物1種或幾種植物的果實的提取物，也可以經(jīng)發(fā)酵、組織培養(yǎng)等其它方式而得到，一般來說，這些植物包括枸杞Ayc/wmCW"ewMill、北方枸杞厶C7z/朋^Mill.戶o/aw/m7(Pojark.)A.M.Lu、寧夏枸杞丄.6flr6an/附Linn.、截萼枸杞丄Jnmcflrt/wY.C.Wang、lfi畺枸豐己丄.i/osyWewwnProjark.、會工枝拘豐己Z.(/oyj^fewwwProjark.vw.rubricaulium、云南拘豐己_L少wrawa"ewjeKuangetA.M.Lu黑果枸豐己丄.rwAem'cwwMurr.柱筒枸豐己丄.KuangetA.M.Lu、黃果拘禾己L6crr6wwwLinn.Far.awaw/icfir/pwAWK.F.Ching、土庫曼枸杞丄.fwco附aw/cw附Turcz.、安德遜氏枸杞丄.aw(3fersow'And.、毛森枸杞丄.c/asy5fewwmPojark.、力卩州枸杞丄.ca/z/om/cww(CaliforniaWol化erry)、歐洲枸杞ewopaeww(EuropeanWolfberry)以及其它茄科枸杞屬植物。9.根據(jù)權(quán)利要求1~8任一項所述膠束溶液，其中所含枸杞多糖的分子量為小于3,000,000。其中所含枸杞多糖的分子量優(yōu)選為8,0001,000,000。10.根據(jù)權(quán)利要求19任一項所述枸杞多糖膠束溶液，它可單獨在癌癥、細菌感染性疾病、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病，也可以用于其它制劑治療或預防時的輔助用藥，也可以作為某些制劑處方中的一部分應用。全文摘要一種用于免疫調(diào)節(jié)的膠束溶液，涉及免疫增強作用和/或免疫調(diào)節(jié)制品領域，其是將來自于茄科(Solanaceae)枸杞屬植物(LyciumL.)的枸杞多糖或含枸杞多糖的提取物制備成膠束溶液。優(yōu)選將枸杞多糖進行分散化處理，尤其是制備出一定粒徑范圍內(nèi)的膠束(Micelle)溶液，以增加口服給用時粘膜對枸杞多糖的吸收性，或是降低注射給用時機體對枸杞多糖產(chǎn)生的致敏作用，從而發(fā)揮免疫增強作用和/或免疫調(diào)節(jié)作用。文檔編號A61K9/00GK101559140SQ20081010419公開日2009年10月21日申請日期2008年4月16日優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日發(fā)明者仰振球,馮志媛,劉萬水,尹永祥,李軍林,譚皕營申請人:北京京衛(wèi)燕康藥物研究所有限公司