專利名稱：口腔鱗狀細(xì)胞癌的檢測(cè)方法及抑制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以通過觀察口腔鱗狀細(xì)胞癌的基因型對(duì)口腔鱗 狀細(xì)胞癌進(jìn)行初期診斷為目的、通過檢測(cè)特定染色體區(qū)域中存在的基 因的變化來檢測(cè)癌癥的方法。
背景技術(shù)：
口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous-cell carcinoma (OSCC))分類
屬于頭頸癌，是主要發(fā)生于口腔粘膜上皮等部位的腫瘤。在頭頸癌中 口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生率高達(dá)35%左右，在全世界每年對(duì)27萬人造 成影卩向(Parkin， DM.， et al., CA Cancer J Clin. 55, 74-108, 2002)。
口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病部位以舌部最多，其次以牙齦(牙床)為多。 此外，在頰粘膜、顎、口底等其它的口腔粘膜、以及顎骨、唾液腺上 也有發(fā)生。
近年來，盡管用于口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療的方法一直在 發(fā)展，但是其預(yù)后沒有得到改善。為此，期望找到口腔鱗狀細(xì)胞癌的 致病基因并闡明其功能，從而建立起一種用于有效的治療方法和進(jìn)行 化學(xué)預(yù)防的新型戰(zhàn)略性見解。 Parkin, DM., et al., CA Cancer J Clin. 55, 74-108,
200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題
如果能夠闡明來源于口腔、主要是來源于口腔上皮的細(xì)胞發(fā)生 癌化時(shí)在基因水平上的機(jī)制，就能夠在基因水平上發(fā)現(xiàn)來源于口腔的 細(xì)胞發(fā)生癌化、對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的惡性程度進(jìn)行診斷以及對(duì)口腔鱗 狀細(xì)胞癌的發(fā)展進(jìn)行控制，進(jìn)一步，就應(yīng)該能夠根據(jù)該機(jī)制來篩選、開發(fā)藥物或確立治療的方法。具體來說，可以認(rèn)為，通過鑒定出在口 腔鱗狀細(xì)胞癌中顯示特征性行為的基因，并以該基因?yàn)橹行倪M(jìn)行技術(shù) 上的研究，從而可以解決上述課題。即，本發(fā)明要解決的問題是鑒 定出在口腔鱗狀細(xì)胞癌等癌癥中顯示特征性行為的基因，從而提供一 種癌癥的檢測(cè)方法及細(xì)胞增殖抑制劑。 解決問題的手段
比較基因組雜交技術(shù) (Comparative Genomic Hybridization (CGH))是一種可用于解析伴隨基因組中多個(gè)基因的擴(kuò)增或缺失、或 者基因失活所致的基因異常的簡(jiǎn)便、迅速、最佳方法。因此，為了解 析與癌化和癌癥惡化等有關(guān)的基因組上的基因異常，本發(fā)明人對(duì)在 CGH陣列上載有的800種或4500禾中BAC/PAC DNA進(jìn)行CGH陣列 分析(MCG Cancer Array-800、 MCG Whole Genome-4500; Takada H., et al., Cancer Sci. 96, 100-105, 2005; Inazawa J.， et al., Cancer Sci. 95, 559-563,2004)，成功地鑒定出了與促進(jìn)源自口腔的細(xì)胞癌化有關(guān)的 癌基因，即，成功地鑒定了含有1的磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域 (Phosphoribosyl transferase domain containing 1 (PRTFDCl))基因。 然后，又成功地發(fā)現(xiàn)，PRTFDC1基因的缺失或者失活，g卩PRTFDCl 蛋白質(zhì)的減少會(huì)顯著地促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖，而且，如果使 PRTFDC1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或蛋白質(zhì)增加，口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖會(huì) 顯著地降低，由此完成了本發(fā)明。
艮P，根據(jù)本發(fā)明，提供一種癌癥的檢測(cè)方法，該方法通過檢測(cè) 存在于樣本的染色體區(qū)域lq21、2q24.1-q24.2、3pl3、7p11.2、 10pl2.1、 llpl5.4、 llpl5.2、 llpl3.3、 llq22、 llq23.3、 12pl3、 12q24.31、 13q33.3-q34、 12q24.1、 19ql3、或22ql2.1中的基因發(fā)生的至少一種 變化，來檢測(cè)樣本的癌化，包括其惡性程度。
優(yōu)選的是，所述基因?yàn)锽CL9、 MITF、 EGFR、 PTH、 BCLl、 FGF4、 CCND1、 FGF3、 PGR、 YAP1、 CIAP1、 MMP7、 MMP1、 CCND2、 FGF6、BCL7A、DPl、GAS6、SUPT5H、PRTFDCl、c10或f63、THNSLl、 GPR158、 MY03A、或GAF2中的至少一個(gè)。
優(yōu)選的是，所述基因的變化為基因擴(kuò)增、缺失和失活中的至少一種。
優(yōu)選的是，所述基因的變化是由CpG島的甲基化而引起的失活。
本發(fā)明的方法是一種癌癥檢測(cè)方法，其通過檢測(cè)BCL9、 MITF、 EGFR、 PTH、 BCL1、 FGF4、 CCND1、 FGF3、 PGR、 YAP1、 CIAP1、 MMP7、 MMP1、 CCND2、 FGF6、 BCL7A、 DP1、 GAS6、或SUPT5H 基因的擴(kuò)增、或者PRTFDCl、c10或f63、THNSLl、GPR158、MY03A、
或GAF2基因的缺失來檢測(cè)樣本的癌化，包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。
優(yōu)選的是，通過檢測(cè)PRTFDC1基因的缺失或失活來檢測(cè)樣本的 癌化，包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。
優(yōu)選的是，所述樣本為源自口腔的組織。 優(yōu)選的是，所述癌癥為口腔鱗狀細(xì)胞癌。
優(yōu)選的是，采用DNA芯片法、Southern印跡法、Northern印 跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、FISH法、CGH法、或陣列CGH法、亞硫 酸氫鹽測(cè)序法、COBRA法對(duì)所述基因的變化進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將 PRTFDCl、 clO或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基 因、或者將作為該基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，在體外導(dǎo)入到細(xì)胞中。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種細(xì)胞增殖抑制劑，其含有PRTFDC1、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因、或者作為 該基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種激活細(xì)胞增殖的方法，其包括將 PRTFDCl、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基 因的siRNA、 shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到 腫瘤細(xì)胞中。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種細(xì)胞增殖激活劑，其含有PRTFDC1、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的siRNA、 shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種物質(zhì)的篩選方法，其為針對(duì)由于其 中的PRTFDCl 、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2
7基因的CpG島發(fā)生甲基化而導(dǎo)致基因表達(dá)被抑制的口腔鱗狀細(xì)胞 癌，使該口腔鱗狀細(xì)胞癌與待測(cè)物質(zhì)接觸以檢測(cè)所述基因的表達(dá)，當(dāng) 與未接觸待測(cè)物質(zhì)的體系相比較，發(fā)現(xiàn)所述基因的表達(dá)增加時(shí)，可將
該待測(cè)物質(zhì)篩選為可以通過將所述基因的CpG島脫甲基化而使該基
因活化的抗腫瘤物質(zhì)。 發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，可以切實(shí)地把握來源于口腔的細(xì)胞樣本是否發(fā)生 癌化及其惡性程度。而且，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，通過導(dǎo)入基因表達(dá)
失活的PRTFDC1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而可以抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的 增殖。而且，可以對(duì)作為由于PRTFDC1基因表達(dá)失活而引發(fā)的口腔 鱗狀細(xì)胞癌的治療劑進(jìn)行篩選。


在圖1中，(a)表示18種口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株經(jīng)MCG Cancer Array-800確定的拷貝數(shù)的擴(kuò)增與缺失在全部基因組中的頻率?？寺?基于UCSC作圖位置(http:〃genome.ucsc.edu/ [version May, 2004]) 按照1-22、 X、 Y染色體的順序進(jìn)行排列。星號(hào)表示確認(rèn)有高水平擴(kuò) 增(log2比值")、或有純合缺失(log2比值《2)的區(qū)域。圖1中的(b) 表示HSC-6細(xì)胞株在CGH陣列中的代表性結(jié)果。另外，在10pl2染 色體中的RP11-165A20、 80K21、 66P13 (箭頭)顯示出明顯的拷貝 數(shù)降低(log2比值<-2)。圖1中的(c)表示HSC-6細(xì)胞株中10號(hào)染 色體的拷貝數(shù)情況的結(jié)果。箭頭表示10pl2染色體區(qū)域的候選克隆。
圖2中(a)顯示HSC-6細(xì)胞株的10pl2染色體純合缺失區(qū)域的 圖譜。點(diǎn)樣于陣列中的BAC用水平線表示。白線為10§2比值<-2的 BAC、黑線為log2比值>-2的BAC。 HSC-6細(xì)胞株中純合缺失的最小 范圍由基因組PCR確定，用白色雙箭頭表示。用白或黑線表示經(jīng)基 因組PCR確定的HSC-6細(xì)胞株中位于純合缺失區(qū)域周圍的8個(gè)基因、 純合缺失(6個(gè)基因)或殘留基因(2個(gè)基因)。圖2中的(b)表示 的是18種口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中位于10pl2染色體純合缺失區(qū)域 周圍的8個(gè)基因與GAPDH基因(對(duì)照)的基因組PCR結(jié)果。在圖2中，(c)表示的是通過RT-PCR確定口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株、正常 口腔上皮細(xì)胞株RT7與正?？谇簧掀ぴ?xì)胞中的PRTFDC1、 c10 或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、 GAF2基因的表達(dá)。DW表示 蒸餾水，箭頭表示圖2b所示的純合缺失細(xì)胞株(HSC-6)。在18種 細(xì)胞株中，無PRTFDC1基因純合缺失的8種細(xì)胞株(OM-l、 OM-2、 NA、 ZA、 Ca9-22、 HSC-2、 HSC-3、 KON)顯示完全的基因沉默，1 種細(xì)胞株(HOC-313)同正常的對(duì)照相比顯示出表達(dá)降低。在圖2中， (d)表示的是用5-aza-dCyd (5fiM或10fiM)處理5天和/或用TSA (100ng/ml)處理24小時(shí)(經(jīng)處理的為+ 、未經(jīng)處理的為-)后的口 腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(NA、HSC-2、ZA)中PRTFDC1基因的RT-PCR 的分析結(jié)果。
圖3中(a)表示的是PRTFDC1基因外顯子1周圍的801-bp的 CpG島(從-373至+418)的圖。CpG部位用豎線表示。外顯子1用 空白窗口表示，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)標(biāo)記為+ 1。啟動(dòng)子分析中所使用的片段
(片段1、 2、 3)用粗黑線表示。COBRA和亞硫酸氫鹽測(cè)序(區(qū)域 l和區(qū)域2)所確定的區(qū)域用空白條(open bar)表示。用于COBRA 法的限制酶部位MluI和T叫I用黑色或灰色箭頭表示。圖3中的(b) 表示的是PRTFDCl基因的CpG島的啟動(dòng)子活性。構(gòu)建了 pGL3空載 體(mock)和包含CpG島區(qū)域1-3不同序列的報(bào)告基因質(zhì)粒。將這 些構(gòu)建體與內(nèi)部對(duì)照載體(pRL-hTK)同時(shí)轉(zhuǎn)化到NA禾B HSC-2細(xì) 胞中。相對(duì)于對(duì)照物，將熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示的是3個(gè)獨(dú) 立試驗(yàn)的平均值士SD。圖3中的(c)表示的是將口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì) 胞株中的PRTFDC1區(qū)域1與區(qū)域2用Mlul和Taql分別消化以后的 COBRA的代表性結(jié)果。箭頭表示在甲基化的CpG識(shí)別位點(diǎn)處切斷的 片段。箭頭表示未被切斷(非甲基化)的片段。切斷的DNA片段為 陽性的8種細(xì)胞用星號(hào)表示。圖3中(d)表示的是表達(dá)PRTFDCl 的細(xì)胞和未表達(dá)PRTFDCl的細(xì)胞(-)中所確認(rèn)的PRTFDCl區(qū)域1
(62CpG位點(diǎn))和區(qū)域2 ( (33CpG位點(diǎn))的亞硫酸氫鹽測(cè)序的代表 性結(jié)果。各白色和黑色的方塊分別表示非甲基化和甲基化的CpG部 位。每列來自一種克隆。NT表示未做測(cè)試。圖4 (a)表示的是47例口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床樣本中的12例、 陽性對(duì)照(HSC-2)、陰性對(duì)照(H0-1-N1)細(xì)胞株中PRTFDC1基 因區(qū)域1和區(qū)域2的COBRA的代表性結(jié)果。確定有切斷的DNA片 段(箭頭)的原發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌用星號(hào)表示。圖4中(b)表示的 是亞硫酸氫鹽測(cè)序確定的口腔鱗狀細(xì)胞癌的4種原代細(xì)胞中的 PRTFDC1基因區(qū)域1和區(qū)域2的甲基化狀態(tài)。
圖5表示的是口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖中的PRTFDC1基因表達(dá)的效 果。將pCMV-3Tag4-PRTFDCl 或pCMV-3Tag4-mock轉(zhuǎn)化到 PRTFDC1基因缺失的細(xì)胞株(NA和OM-2)中。圖5中的(a)表 示的是用從轉(zhuǎn)化后48小時(shí)的細(xì)胞中所提取的蛋白質(zhì)5pg，采用抗Myc 抗體進(jìn)行Western印跡分析。圖5中的(b)表示的是對(duì)不表達(dá) PRTFDC1基因的細(xì)胞株(NA和OM-2)進(jìn)行菌落形成分析。向這些 細(xì)胞中瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化包含PRTFDC1基因的Myc標(biāo)簽載體 (pCMV-3Tag4-PRTFDCl)或者空載體(pCMV-3Tag4-mock)。在 G418的存在下進(jìn)行藥物篩選3周。圖5(b)中左側(cè)表示的是轉(zhuǎn)化3 周后形成耐藥性菌落的結(jié)果。轉(zhuǎn)化有PRTFDC1基因的細(xì)胞所形成的 菌落比轉(zhuǎn)化有空載體的細(xì)胞要少；右側(cè)表示的是對(duì)菌落形成的定量分 析，計(jì)數(shù)"mm的菌落個(gè)數(shù)，其結(jié)果用三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值土SD來 表示。
具體實(shí)施例方式
下面進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。 (1)癌癥的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的癌癥檢測(cè)方法的特征在于，通過存在于檢測(cè)樣本的染 色體區(qū)域lq21、 2q24.1-q24.2、 3pl3、 7pll.2、 10pl2.1、 11pl5.4、 llpl5.2、 llpl3.3、 llq22、 llq23,3、 12pl3、 12q24.31、 13q33.3-q34、 12q24.1、 19ql3、 22ql2.1中的基因發(fā)生的至少一種變化，來檢測(cè)樣 本的包括惡性程度的癌化。更具體來說，通過檢測(cè)樣本中的BCL9、 MITF、 EGFR、 PTH、 BCL1、 FGF4、 CCND1、 FGF3、 PGR、 YAP1、 CIAP1、 MMP7、 MMP1、 CCND2、 FGF6、 BCL7A、 DP1、 GAS6、或SUPT5H基因的擴(kuò)增、或者PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的缺失來檢測(cè)樣本的癌化，包括檢 測(cè)樣本的癌化的惡性程度。特別優(yōu)選的是，通過檢測(cè)來源于口腔的細(xì) 胞中的PRTFDC1基因的缺失或失活，可以檢測(cè)出來源于口腔的細(xì)胞 的包括惡性程度在內(nèi)的癌化。
根據(jù)人基因組計(jì)劃的成果，PRTFDC1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是己知 的，該基因?yàn)榇嬖谟?0pl2染色體區(qū)域中的一個(gè)基因。雖然已知 PRTFDCl基因的編碼蛋白為一種具有磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的蛋 白質(zhì)，但其詳細(xì)的功能尚不明。還未發(fā)現(xiàn)該P(yáng)RTFDCl基因是一種重 要的與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病或惡性程度相關(guān)的癌相關(guān)基因。
如上所述，本檢測(cè)方法的特征在于，對(duì)來源于口腔的細(xì)胞或口 腔鱗狀細(xì)胞癌中的PRTFDCl基因的缺失或失活進(jìn)行檢測(cè)。
作為檢測(cè)PRTFDCl基因的缺失或失活的對(duì)象的來源于口腔的 細(xì)胞或口腔鱗狀細(xì)胞癌，最好是樣本提供者的活檢組織細(xì)胞。
該樣本組織細(xì)胞無論是來源于健康人口腔的細(xì)胞還是口腔鱗狀 細(xì)胞癌患者的癌組織，實(shí)際上，主要的受檢對(duì)象都是這樣的組織根 據(jù)檢查等的結(jié)果發(fā)現(xiàn)口腔粘膜或舌、牙齦等中存在有疑似癌化的病變 部位時(shí)的病變組織；或者為已經(jīng)確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌，但需要判定 其惡性程度和進(jìn)展程度的口腔鱗狀細(xì)胞癌的組織等。
根據(jù)本檢測(cè)方法，在"根據(jù)檢查等的結(jié)果發(fā)現(xiàn)口腔中存在有疑 似癌化的病變部位時(shí)的病變組織"中確認(rèn)PRTFDC1存在基因缺失或 失活的情況下，如果判定該病變組織正在進(jìn)行癌化，或者已經(jīng)處于癌 化狀態(tài)、并且惡性程度在持續(xù)增加，提示需要及早地進(jìn)行正式治療(通 過手術(shù)等切除病變部位、正式的化學(xué)療法等)。另外，在"己經(jīng)確診 為口腔鱗狀細(xì)胞癌，但需要判定其惡性程度和進(jìn)展程度的口腔鱗狀細(xì) 胞癌的組織"中確認(rèn)存在PRTFDC1基因的缺失或失活的情況下，如 果判定癌組織的惡性程度在持續(xù)增加，也提示需要及早地進(jìn)行正式治 療(通過手術(shù)等切除病變部位、正式的化學(xué)療法等)。作為樣本而采 集的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織經(jīng)過必要的處理(例如，由所采集的細(xì)胞來 制備DNA或RNA)后可以用作進(jìn)行本檢測(cè)方法的對(duì)象。(2) PRTFDCl基因缺失的檢測(cè)
作為可直接進(jìn)行PRTFDCl基因缺失檢測(cè)的代表性方法，可以列 舉CGH (比較基因組雜交，comparative Genomic Hybridization) 去、 FISH (熒光原位雜交，F(xiàn)luorescence In Situ Hybridization)法。該實(shí) 施方案中的本檢測(cè)方法為這樣的方法對(duì)具有PRTFDCl基因的BAC (細(xì)菌人工染色體，Bacterial Artificial Chromosome) DNA、 YAC (酵 母人工染色體，Yeast Artificial Chromosome) DNA、 PAC (PI衍生 的人工染色體，PI-derived Artificial Chromosome) DNA (下面也稱 為BACDNA等)進(jìn)行標(biāo)記后，進(jìn)行FISH檢測(cè)，即可以檢測(cè)出是否 存在PRTFDCl基因(即，PRTFDCl基因是否缺失)。具體來說， 作為含有PRTFDCl基因的BAC DNA，可以列舉RP11-165A20等。
采用固定有基因組DNA的基質(zhì)來進(jìn)行上述實(shí)施方案中的方法 是合適的，而且在現(xiàn)實(shí)中也是這樣進(jìn)行的。
通過制造多個(gè)基因組DNA的固定基質(zhì)來實(shí)用化時(shí)，由于通常所 得到的BAC DNA的量很少，所以就需要將該DNA作為基因擴(kuò)增產(chǎn) 物而獲得(該基因擴(kuò)增過程也稱為"無窮化")。在該無窮化過程中， 首先將BAC DNA等用識(shí)別4堿基的酶(例如Rsal、 Dpnl、 HaeIII) 等消化以后，加入連接物進(jìn)行連接。連接物為由10-30個(gè)堿基、合適 的是由15-25個(gè)堿基組成的寡核苷酸，具有2條互補(bǔ)序列的鏈，退火 以后，形成平滑末端一側(cè)的3'末端的寡核苷酸需要磷酸化。接下來， 采用與連接物一方的寡核苷酸具有相同序列的引物，通過PCR (聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction)法進(jìn)行擴(kuò)增，即可以實(shí) 現(xiàn)無窮化。另一方面，可以將各BAC DNA等中的特征性的50-70個(gè) 堿基的氨基化寡核苷酸作為檢測(cè)用探針。
這樣，通過將無窮化的BACDNA等固定于基質(zhì)上、特別合適 的是固定于固體基質(zhì)上，即可以制備出所希望的DNA固定化基質(zhì)。 所述固體基質(zhì)優(yōu)選為玻璃板。玻璃等固體基質(zhì)更優(yōu)選通過聚-L-賴氨 酸、氨基硅垸、金'鋁等的沉積將該基質(zhì)進(jìn)行包被。
點(diǎn)接于基質(zhì)上的上述無窮化的DNA的濃度優(yōu)選為10pg l 5pg/|il，更優(yōu)選為lng/|il 200 ng/pl。點(diǎn)接量?jī)?yōu)選為lnl lpl，更優(yōu)選為10nl 100nl。另外，對(duì)固定于基質(zhì)上的各個(gè)點(diǎn)的大小和形狀不 特別限定，例如，大小可以為直徑0.01mm lmm，從上面看的形狀 可以為圓形至橢圓形。對(duì)干燥點(diǎn)的厚度也不特別限定，為l)im至 lOO)iim。進(jìn)一步，點(diǎn)的個(gè)數(shù)不特別限定，每個(gè)使用的基質(zhì)上為10個(gè) 50,000個(gè)點(diǎn)，更優(yōu)選為100個(gè) 5,000個(gè)點(diǎn)。雖然各個(gè)DNA的點(diǎn)接 次數(shù)在一次至四次的范圍內(nèi)，但優(yōu)選兩次重復(fù)或三次重復(fù)點(diǎn)接。
干燥點(diǎn)的制備(例如)可以通過采用點(diǎn)樣儀將無窮化的BAC DNA等滴接于基質(zhì)上，形成多個(gè)點(diǎn)以后，將點(diǎn)干燥而制得。點(diǎn)樣儀 可以使用噴墨式打印機(jī)、針式陣列打印機(jī)、雙噴射式(注冊(cè)商標(biāo))打 印機(jī)，優(yōu)選使用噴墨式打印機(jī)。例如，可以使用GENESHOT (曰本 名古屋市的力' < )株式會(huì)社生產(chǎn))等。
這樣，通過將無窮化的BAC DNA等固定于基質(zhì)上，特別合適 的是固定于固體基質(zhì)上，即可以制備出所希望的DNA固定化基質(zhì)。
另外，作為直接檢測(cè)該P(yáng)RTFDC1基因缺失的手段之一，可以列 舉Southern印跡法。Southern印跡法是將從樣本得到的基因組DNA 分離并固定，通過檢測(cè)該基因組DNA與PRTFDC1基因的雜交來檢 測(cè)樣本中該基因存在的方法。
而且，也可以通過Northern印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR法進(jìn)行 PRTFDC1基因的缺失檢測(cè)。Northern印跡是一種將由樣本中獲得的 mRNA分離、固定，通過檢測(cè)該mRNA與PRTFDC1基因的雜交、 從而檢測(cè)該樣本中該基因的mRNA存在的一種方法。實(shí)時(shí)RT-PCR 法是通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增、并實(shí)時(shí)進(jìn) 行測(cè)定的一種方法，根據(jù)擴(kuò)增倍率即可以對(duì)作為模板的mRNA進(jìn)行 定量。該定量可以采用熒光色素來進(jìn)行，有兩種方法。即采用在雙 鏈DNA中特異性插入(intercalate)發(fā)出熒光的色素(例如，SYBR 綠)的方法，以及采用使熒光色素結(jié)合在擴(kuò)增的DNA序列中的特異 性寡核苷酸上的探針的方法。
(3) PRTFDC1基因失活的檢測(cè)
己有報(bào)道，當(dāng)富含CpG的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域發(fā)生密集甲基化 時(shí)就會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄失活(Bird A.P.， et al., Cell, 99, 451-454, 1999)。在癌細(xì)胞中，與其它區(qū)域相比，CpG島存在高頻率的且密集的甲基 化，啟動(dòng)子區(qū)域的超甲基化(hypermethylation)與癌癥中的癌抑制 基因的失活緊密相關(guān)(Ehrlich M., et al., Oncogene, 21, 6694-6702， 2002)。
如后所述，實(shí)際上，PRTFDC1基因的外顯子中存在的CpG島 具有啟動(dòng)子活性，而且，該CpG島甲基化的程度與一部分口腔鱗狀 細(xì)胞癌中的PRTFDC1基因的表達(dá)抑制強(qiáng)烈相關(guān)。
而且，通過在作為脫甲基化試劑的5-氮脫氧胞嘧啶(5-aza-dCyd) 的存在下培養(yǎng)口腔鱗狀細(xì)胞癌，可以使CpG島脫甲基化，其結(jié)果是， 可以使PRTFDC1基因的表達(dá)恢復(fù)。根據(jù)這些結(jié)果可以判斷，CpG島 的高頻率甲基化(hypermethylation)是高頻率地引發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞 癌中的癌抑制基因表達(dá)抑制的原因之一。
通過上述檢測(cè)方法，對(duì)于被判斷為PRTFDC1基因表達(dá)量減少的 樣本細(xì)胞(來源于癌組織的原發(fā)癌細(xì)胞)，使該細(xì)胞與脫甲基化試劑 (5-氮脫氧胞嘧啶)發(fā)生作用，從而使基因的表達(dá)量恢復(fù)。即，在使 脫甲基化試劑與樣本細(xì)胞發(fā)生作用、從而使基因的表達(dá)量恢復(fù)的情況 中，樣本細(xì)胞中的基因受到抑制的主要原因?yàn)镃pG島的甲基化，所 以通過對(duì)樣本提供者給予具有脫甲基化作用的藥物，預(yù)期可獲得相應(yīng) 的抗腫瘤效果。
(4)細(xì)胞增殖的抑制方法以及細(xì)胞增殖抑制劑
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將 PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基 因、或?qū)⒆鳛樵摶虻谋磉_(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)在體外導(dǎo)入細(xì)胞中。并且， 本發(fā)明還提供一種含有上述基因或蛋白質(zhì)的細(xì)胞增殖抑制劑。
在處理PRTFDC1、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、 或GAF2基因時(shí)，其可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員采用公知的技術(shù)從培養(yǎng)細(xì) 胞等中獲得的cDNA，也可以是采用PCR法等通過酶學(xué)方法而合成 的DNA。在采用PCR法獲得DNA時(shí)，使用人染色體DNA或cDNA 庫作為模板，使用經(jīng)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以使得目標(biāo)堿基序 列可以得到擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增得到的DNA片段可以被克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，其中該載體在大腸桿菌等宿主中能夠增殖。
PRTFDC1、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2
基因的檢測(cè)探針或引物的制備、以及目標(biāo)基因的克隆等操作對(duì)于本領(lǐng)
域技術(shù)人員來說均是已知的，例如，可以參照1989年冷泉港實(shí)驗(yàn)室 (冷泉港，紐約)編著的"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版)"，或John Wiley & Sons (1987 1997)年出版的"Current
Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 38"等記載的方法進(jìn)行制備。
PRTFDC1、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2
基因可以重組入載體中以重組載體的形式使用。載體為病毒載體或動(dòng) 物細(xì)胞表達(dá)用載體，優(yōu)選使用病毒載體。作為病毒載體，可以列舉逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、桿狀病毒載體、牛痘
病毒載體、慢病毒載體等。其中，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在感染細(xì)胞以 后病毒基因組整合進(jìn)入宿主染色體內(nèi)，從而可以使整合進(jìn)入載體內(nèi)的
外源基因能夠穩(wěn)定、長(zhǎng)期地表達(dá)，所以特別優(yōu)選使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用載體例如可以采用pCXN2 (Gene, 1991年第108 巻第193-200頁)、PAGE207 (日本特開平6-46841號(hào)公報(bào))或其變體等。
將上述重組載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗髦羞M(jìn)行轉(zhuǎn)化，對(duì)得到的轉(zhuǎn)化 體進(jìn)行培養(yǎng)即可以進(jìn)行生產(chǎn)。當(dāng)重組載體為病毒載體時(shí)，導(dǎo)入該載體 的宿主可以采用具有產(chǎn)生病毒能力的細(xì)胞，例如，COS-7細(xì)胞、CHO 細(xì)胞、BALB/3T3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的宿主可以 使用YCRE、甲CRIP、 MLV等；腺病毒載體及腺相關(guān)病毒載體的宿 主可以是來源于人胎兒腎臟的293細(xì)胞等。可以采用磷酸鈣法等將病 毒載體導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。而重組載體為動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用載體時(shí)，導(dǎo) 入該載體的宿主可以使用大腸桿菌K12菌株、HB101菌株、DH5a 菌株等，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
所得到的轉(zhuǎn)化體分別在合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。例如， 大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以使用含有生長(zhǎng)發(fā)育所必需的碳源、氮源、 無機(jī)物以及其它物質(zhì)的pH5 8左右的液體培養(yǎng)基來進(jìn)行培養(yǎng)。通常在15 43'C下培養(yǎng)約8 24小時(shí)左右。此時(shí)，在培養(yǎng)結(jié)束以后，目 的重組載體可以通過通常的DNA分離純化方法制得。
此外，動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)例如可以使用含有約5 20%胎牛 血清的199培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng) 基的pH優(yōu)選為約6~8。通常在30 4(TC下培養(yǎng)約18 60小時(shí)。此時(shí)， 由于含有該載體的病毒粒子釋放于培養(yǎng)上清中，所以可以通過氯化銫 離心法、聚乙二醇沉淀法、過濾濃縮法等對(duì)病毒粒子進(jìn)行濃縮和純化 而獲得目的重組載體。
本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑可以通過將作為有效成分的上述基因 與基因治療劑中通常使用的基劑一起配合而制得。而且，當(dāng)將上述基 因重組整合進(jìn)入病毒載體中時(shí)，制備含有重組載體的病毒粒子，將其 與基因治療劑中通常使用的基劑一起配合。
為了配制作為有效成分的上述基因或蛋白質(zhì)，所使用的基劑可 以使用通常注射液中使用的基劑，例如，蒸餾水、氯化鈉或氯化鈉與 無機(jī)鹽的混合物等的鹽溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶 液、甘氨酸、精氨酸等氨基酸溶液、有機(jī)酸溶液或鹽溶液與葡萄糖溶 液的混合溶液等?；蛘撸鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常用方法，也可 以在這些基劑中使用滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、植物油、表面活性 劑等佐劑，以溶液、懸濁液、分散液的形式配制為注射劑。這些注射 劑可以通過粉末化、凍干等操作制備為用時(shí)溶解的制劑。
本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑的給藥形式可以是通常的靜脈內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)等的全身給藥方式，或者也可以是局部注射或經(jīng)口給藥等局部給 藥方式。此外，當(dāng)細(xì)胞增殖抑制劑在給藥時(shí)，也可以采用與插管技術(shù)、 基因?qū)爰夹g(shù)、或者外科手術(shù)等的組合給藥形式。
本發(fā)明的細(xì)胞增殖抑制劑的給藥量因患者年齡、性別、癥狀、 給藥途徑、給藥次數(shù)、劑型等而異，但一般來說，成年人每日攝入的 重組基因的重量在l嗎/kg體重至1000mg/kg體重左右的范圍內(nèi)，優(yōu) 選為從10嗎/kg體重至100mg/kg體重左右的范圍內(nèi)。給藥次數(shù)不作 特別限定。
(5)細(xì)胞增殖的激活方法及細(xì)胞增殖激活劑根據(jù)本發(fā)明，提供一種激活細(xì)胞增殖的方法，其包括將
PRTFDC1、 clO或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基 因的siRNA、 shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到 腫瘤細(xì)胞中。而且提供一種含有上述siRNA、 shRNA、反義寡核苷酸 或功能缺失型基因的細(xì)胞增殖激活劑。
siRNA為約20個(gè)堿基(例如為約21 23個(gè)堿基)或者不足20 個(gè)堿基長(zhǎng)度的雙鏈RNA。通過在細(xì)胞中表達(dá)這種siRNA，即可以抑 制作為該siRNA的靶標(biāo)的基因(在本發(fā)明中為PRTFDCl、c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2)的表達(dá)。
只要能夠引發(fā)RNAi，本發(fā)明中所使用的siRNA可以是任何形 式。這里，所謂"siRNA"是"短干擾RNA (short interfering RNA)" 的簡(jiǎn)稱，或者是人工化學(xué)合成的，或者是生物化學(xué)方法合成的，或者 是在生物體內(nèi)合成的，或者是約40個(gè)堿基以上的雙鏈RNA在體內(nèi) 分解為10個(gè)堿基對(duì)以上的短雙鏈RNA。通常，其具有5'-磷酸、3'-OH 的結(jié)構(gòu)，3'末端有約2個(gè)突出的堿基。該siRNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合， 形成RISC ( RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，RNA-induced-silencing-complex)。該復(fù)合物能夠識(shí)別與該siRNA具有相同序列的mRNA 并與之結(jié)合，通過RNaseIII樣的酶活性，在siRNA的中部將mRNA 切斷。
優(yōu)選的是，siRNA的序列與作為切斷靶標(biāo)的mRNA的序列100% 一致，但是，在siRNA的中部以外的堿基不一致的情形下，多數(shù)情 況下RNAi的切斷活性還會(huì)部分殘留，所以也可不必100%—致。
優(yōu)選的是，siRNA的堿基序列與表達(dá)應(yīng)該被抑制的PRTFDC1、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的堿基序列
之間具有同源性的區(qū)域不包含該基因的翻譯起始區(qū)。原因在于由于
預(yù)想到在翻譯起始區(qū)中siRNA會(huì)與各種轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子結(jié)合， 從而在效果上就會(huì)不能與mRNA結(jié)合，可以預(yù)測(cè)其效果會(huì)降低。因 此，具有同源性的序列，優(yōu)選為距離該基因翻譯起始區(qū)20個(gè)堿基， 更優(yōu)選為距離該基因翻譯起始區(qū)70個(gè)堿基。具有同源性的序列例如 可以是該基因3'末端附近的序列。根據(jù)本發(fā)明的另外一種實(shí)施形式，作為通過RNAi抑制目標(biāo)基
因表達(dá)的因子，其還可以使用3'末端具有突出部的短的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)的 shRNA (short hairpin RNA)。所謂"shRNA"是指通過在單鏈RNA中 包含部分回文結(jié)構(gòu)的堿基序列、從而在分子內(nèi)形成雙鏈結(jié)構(gòu)、形成類 似于發(fā)卡一樣的結(jié)構(gòu)的約20個(gè)堿基對(duì)以上的分子。這樣的shRNA被 導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)以后，在細(xì)胞內(nèi)被分解為約20個(gè)堿基(代表性地為例如 21個(gè)堿基、22個(gè)堿基、23個(gè)堿基)的長(zhǎng)度，與siRNA—樣可以引發(fā) RNAi。如上所述，shRNA由于可以與siRNA—樣引發(fā)RNAi，在本 發(fā)明中也可以有效地加以應(yīng)用。
shRNA優(yōu)選具有3'突出末端。雖然雙鏈部分的長(zhǎng)度并不做特別 限定，但優(yōu)選為約IO個(gè)核苷酸以上，更優(yōu)選為約20個(gè)核苷酸以上。 這里，3'突出末端優(yōu)選為DNA，更優(yōu)選為至少2個(gè)核苷酸以上的DNA， 進(jìn)一步更優(yōu)選為2 4個(gè)核苷酸的DNA。
如上所述，在本發(fā)明中，作為可以通過RNAi來抑制PRTFDC1、 cl0或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的表達(dá)的因 子，可以使用siRNA或者shRNA。 siRNA的優(yōu)點(diǎn)在于(1)即便是 導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部，RNA本身也不會(huì)重組入正常細(xì)胞的染色體中，所 以其不是一種能夠引起遺傳給后代的變異的治療方法，安全性高；以
及，(2)短雙鏈RNA的化學(xué)合成比較容易，形成雙鏈形式更穩(wěn)定， 等等。而shRNA的優(yōu)點(diǎn)是通過長(zhǎng)期抑制基因表達(dá)進(jìn)行治療時(shí)，可 以制作在細(xì)胞內(nèi)能夠形成轉(zhuǎn)錄shRNA的載體，然后將其導(dǎo)入到細(xì)胞 內(nèi)部。
通過本發(fā)明中所使用的RNAi來抑制PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、GPR158、MY03A、或GAF2基因表達(dá)的siRNA或者shRNA 可以是人工化學(xué)合成，也可以將由正義鏈和反義鏈的DNA序列反向 連接形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA通過T7 RNA聚合酶在體外合成RNA 而制備。體外合成時(shí)，使用T7 RNA聚合酶和T7啟動(dòng)子，由模板 DNA可以合成反義和正義的RNA。將它們?cè)隗w外退火以后導(dǎo)入細(xì)胞 內(nèi)，即可以引發(fā)RNAi，抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。這里，可以采用例如 磷酸鈣法、或者各種轉(zhuǎn)染試劑(例如oligofectamine、 lipofectamine和lipofection)將那些RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。
上述siRNA或者shRNA可以作為細(xì)胞增殖激活劑使用。本發(fā)明 的細(xì)胞增殖激活劑的給藥方法可以是經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥(例如靜 脈給藥、肌肉給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、粘膜給藥、直腸給藥、陰 道給藥、患病部位的局部給藥、皮膚給藥等等)、患部直接給藥等。 本發(fā)明的制劑作為藥物組合物使用時(shí)，必要時(shí)可以添加藥學(xué)上許可的 添加劑。藥學(xué)上許可的添加劑的具體例子可以列舉抗氧化劑、保存劑、 著色劑、調(diào)味劑、以及稀釋劑、乳化劑、懸濁劑、溶劑、填料、增量 劑、緩沖劑、傳輸介質(zhì)、稀釋劑、載體、賦形劑和/或藥學(xué)佐劑等。 但并不僅限于這些。
本發(fā)明的藥劑的制劑形式不作特別限定。例如可以列舉口服液 劑、注射劑、緩釋劑等等。將本發(fā)明的藥劑作為上述制劑而用于處方 時(shí)的溶劑可以是水性溶劑也可以是非水性溶劑。
進(jìn)一步，本發(fā)明的細(xì)胞增殖激活劑的有效成分siRNA或者 shRNA可以以非病毒載體或病毒載體的形式給藥。當(dāng)為非病毒載體 的形式時(shí)，可以使用脂質(zhì)體導(dǎo)入核酸分子的方法(脂質(zhì)體法、HVJ-脂質(zhì)體法、陽離子脂質(zhì)體法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、Lipofectamine法等)、 顯微注射法、用基因槍(Gene Gun)與載體(金屬顆粒)一起將核酸分 子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的方法等。而當(dāng)將siRNA或者shRNA以病毒載體形式 給藥于生物體時(shí)，可以使用重組腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體。在 無毒化的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、 痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbis vims)、仙臺(tái)病 毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒中導(dǎo)入能夠表達(dá)siRNA或者 shRNA的DNA，使細(xì)胞或組織被該重組病毒感染，即可以將基因?qū)?入細(xì)胞或組織中。
根據(jù)使用目的、疾病的嚴(yán)重程度、患者年齡、體重、性別、既 往史、或者作為有效成分的siRNA或者shRNA的種類，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以決定本發(fā)明的細(xì)胞增殖激活劑的給藥量。雖然siRNA或者 shRNA的給藥量不作特別限定，例如可為約0.1ng/kg/日 約 100mg/kg/日，優(yōu)選為約lng/kg/日 約10mg/kg/日。一般是給藥后l 3日可見RNAi的效果。因此，優(yōu)選以1日 3日一次的頻率給藥。 使用表達(dá)載體時(shí)，可以按一周左右給藥一次。
本發(fā)明中，也可以將反義寡核苷酸作為細(xì)胞增殖激活劑使用。 本發(fā)明中所使用的反義寡核苷酸為與PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、GPR158、MY03A、或GAF2基因的DNA序列中的連續(xù)5 100個(gè)堿基序列互補(bǔ)的、或雜交的核苷酸，也可以是DNA或RNA任 意一個(gè)，或者，只要在功能上沒有損害，也可以是它們的修飾物。在 本說明書中，所謂"反義寡核苷酸"，不僅指與構(gòu)成DNA或mRNA的 預(yù)定區(qū)域的核苷酸相對(duì)應(yīng)的核苷酸完全互補(bǔ)的核苷酸，只要DNA或 mRNA與寡核苷酸能夠穩(wěn)定雜交，也可以存在一些錯(cuò)配。
另外，反義寡核苷酸也可以進(jìn)行修飾。通過適當(dāng)?shù)男揎?，該?義寡核苷酸在生物體內(nèi)很難分解，更加穩(wěn)定，從而可以阻礙ITIIa。 這種修飾后的寡核苷酸可以列舉為S-oligo型(硫代磷酸酯型)、C-5 噻唑型、D-oligo型(磷酸二酯型)、M-oligo型(甲基磷酸酯型)、 肽核酸型、磷酸二酯鍵型、C-5丙烯基嘧啶型、2-0-丙基核糖、2'-甲 氧基乙氧基核糖型等修飾型的反義寡核苷酸。而且，反義寡核苷酸也 可以是通過將構(gòu)成磷酸基團(tuán)的氧原子的至少一部分為硫原子取代而 被修飾。這種反義寡核苷酸的核酸酶耐受性、水溶性、對(duì)RNA的親 和性特別優(yōu)異。將構(gòu)成磷酸基團(tuán)的氧原子的至少一部分為硫原子取代 而被修飾的反義寡核苷酸例如可以是S-01igo型等的寡核苷酸。
反義寡核苷酸的堿基數(shù)優(yōu)選為小于或等于50個(gè)，更優(yōu)選為小于 或等于25個(gè)。堿基數(shù)過多會(huì)導(dǎo)致寡核苷酸的合成的工夫與成本大大 增加，收率也會(huì)降低。而反義寡核苷酸的堿基數(shù)為大于等于5個(gè)，優(yōu) 選為大于等于9個(gè)。堿基數(shù)小于等于4個(gè)時(shí)，對(duì)目標(biāo)基因的特異性降 低，所以是不優(yōu)選的。
反義寡核苷酸(或其衍生物)可以通過通常的方法合成，例如， 通過市售的DNA合成裝置(例如Applied Biosystems公司制造的等 等)即可以很容易地合成。作為合成法，采用Phosphoroamidite的固 相合成法、采用氫膦酸酯的固相合成法等等均可以獲得。
在本發(fā)明中，當(dāng)反義寡核苷酸用作細(xì)胞增殖激活劑時(shí)， 一般是以包含反義寡核苷酸和制劑用添加物(載體、賦形劑等)的藥物組合 物的形式提供的?？梢詫?duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物以藥物形式給予反義 寡核苷酸。對(duì)反義寡核苷酸的給藥途徑不作特別限定，經(jīng)口給藥或非 經(jīng)口給藥(例如肌肉給藥、靜脈給藥、皮下給藥、腹腔給藥、鼻腔等 粘膜給藥、或者吸入給藥等)中的任意一種均可。
對(duì)反義寡核苷酸的制劑形式不作特別限定。經(jīng)口給藥的制劑例 如可以列舉片劑、膠囊劑、細(xì)粒劑、粉末劑、顆粒劑、口服液劑、糖 漿劑等；非經(jīng)口給藥的制劑例如可以列舉注射劑、滴劑、栓劑、吸入 劑、黏膜吸收劑、皮膚吸收劑、滴鼻劑、滴耳劑等等。包含反義寡核 苷酸的藥劑的形式、可使用的制劑用添加物、制劑的制造方法等本領(lǐng) 域技術(shù)人員均可適當(dāng)?shù)剡x擇。
反義寡核苷酸的給藥量可以綜合考慮患者的性別、年齡、體重、 疾病的嚴(yán)重程度、給藥目的為預(yù)防還是治療、或者其它合并癥狀的有 無等等而適當(dāng)?shù)剡x擇，但一般給藥量為約0.1pg/kg體重/日 100mg/kg體重/日，優(yōu)選為約0.1pg/kg體重/日 10mg/kg體重/日。
本發(fā)明中，也可以將PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的功能缺陷型基因作為細(xì)胞增殖激活劑使用。 所謂"功能缺陷型基因"是指在該基因中導(dǎo)入變異以使其功能缺失的 基因。具體來說，與此相對(duì)應(yīng)的基因?yàn)榉g一般被稱為突變蛋白質(zhì)的 基因，突變蛋白質(zhì)是指由該基因形成的氨基酸序列中至少一個(gè)組成氨 基酸缺失、至少一個(gè)組成氨基酸被別的氨基酸取代、至少一個(gè)氨基酸 被附加等原本的功能缺失的蛋白質(zhì)。
當(dāng)功能缺失型基因作為細(xì)胞增殖激活劑使用時(shí)，可以通過將作 為有效成分的上述基因與基因治療劑中通常使用的基劑共同配合而 制備。而且，當(dāng)將上述基因重組入病毒載體時(shí)，制備含有該重組載體 的病毒粒子，將其與基因治療劑中通常使用的基劑共同配合。
上述基劑可以使用通常注射液中使用的基劑，例如，蒸餾水、 氯化鈉或氯化鈉與無機(jī)鹽的混合物等的鹽溶液、甘露醇、乳糖、葡聚 糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液、有機(jī)酸溶液 或鹽溶液與葡萄糖溶液的混合溶液等?；蛘?，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常用方法，也可以在這些基劑中使用滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、 植物油、表面活性劑等佐劑，以溶液、懸濁液、分散液的形式配制成 注射劑。這些注射劑可以通過粉末化、凍干等操作制備成用時(shí)溶解的 制劑。
功能缺失型基因的給藥形式可以是通常的靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)等全 身給藥，或者也可以是局部注射或經(jīng)口給藥等局部給藥方式。給藥時(shí)， 也可以采用與插管技術(shù)、基因?qū)爰夹g(shù)、或者外科手術(shù)等的組合給藥 形式。
功能缺失型基因的給藥量因患者年齡、性別、癥狀、給藥途徑、 給藥次數(shù)、劑型等等而異，但一般成年人每日攝入的重組基因的重量
在1(ig/kg體重至1000mg/kg體重左右的范圍內(nèi)。優(yōu)選為從10叫/kg 體重至100mg/kg體重左右的范圍內(nèi)。給藥次數(shù)不作特別限定。
另外，上述本發(fā)明的各種基因治療劑也可以在按常法制備的脂 質(zhì)體懸濁液中添加基因、通過冷凍后融解而制得。調(diào)制脂質(zhì)體的方法 有薄膜震蕩法、超聲波法、逆相蒸發(fā)法、表面活性劑去除法等。優(yōu)選 的是，在超聲波處理脂質(zhì)體懸浮液以后，添加基因可以提高基因的包 封率。包封有基因的脂質(zhì)體可以直接或與水、生理鹽水等混懸后靜脈 給藥。
(6)抗腫瘤物質(zhì)的篩選方法
如上所述，對(duì)于口腔鱗狀細(xì)胞癌，PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的失活是主要的原因， 因此，可以認(rèn)為，使這些基因的作用正常化的藥物可用作口腔鱗狀細(xì) 胞癌的抗腫瘤制劑。特別是，在該失活的主要原因是由于PRTFDC1 基因的CpG島發(fā)生甲基化的情況中，使這些主要原因得以解除、緩 和的藥劑即可以用作抗腫瘤制劑。
作為進(jìn)行這種篩選方法的前提，需要確保在樣本中存在 PRTFDC1基因的表達(dá)量被抑制的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞。即，本發(fā)明 的篩選方法中，需要的是"由于PRTFDC1基因的CpG島發(fā)生甲基 化而引起的PRTFDC1基因表達(dá)被抑制的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞"。在 基于如上所述見解的基礎(chǔ)上，采用常法就可以建立這些細(xì)胞株。例如，從至少己經(jīng)被確認(rèn)為PRTFDCl基因失活的細(xì)胞中，選擇使該細(xì)胞與 已知的脫甲基化試劑(如5-氮脫氧胞嘧啶)進(jìn)行作用后PRTFDCl基 因水平得以恢復(fù)的細(xì)胞，將該細(xì)胞繼代培養(yǎng)，即可以建立"由于 PRTFDCl基因的CpG島發(fā)生甲基化而引起的PRTFDCl基因表達(dá)被 抑制的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞"(以下也稱為甲基化癌細(xì)胞株)。
本發(fā)明的篩選方法中，需要將上述甲基化癌細(xì)胞株與待測(cè)物質(zhì) 相接觸。對(duì)該接觸的方式不作特別限定，可以將待測(cè)物質(zhì)以適當(dāng)?shù)南?釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋后添加到甲基化細(xì)胞株的培養(yǎng)基中，接著進(jìn)行培養(yǎng)， 從而使它們接觸。然后，定量測(cè)定添加待測(cè)物質(zhì)前甲基化癌細(xì)胞株中 的PRTFDCl基因的表達(dá)量，以及適當(dāng)?shù)亻g隔一定的時(shí)間定量測(cè)定添 加待測(cè)物質(zhì)后的PRTFDCl基因的表達(dá)量，將添加待測(cè)物質(zhì)前、后所 測(cè)定的PRTFDCl基因的表達(dá)量之差，與不添加待測(cè)物質(zhì)而在相同條 件下進(jìn)行培養(yǎng)后的對(duì)照培養(yǎng)物進(jìn)行比較，當(dāng)與對(duì)照培養(yǎng)物相比，如果 添加待測(cè)物質(zhì)后的培養(yǎng)基中的PRTFDCl基因表達(dá)量增加時(shí)，則將該 待測(cè)物質(zhì)篩選作為在使用甲基化癌細(xì)胞株的試劑中的"通過使 PRTFDCl基因的CpG島脫甲基化而可以使PRTFDCl基因得以活化 的抗腫瘤物質(zhì)"。
另外，進(jìn)行本篩選方法時(shí)，也可以將篩選出來的有希望成為口 腔鱗狀細(xì)胞癌的抗腫瘤成分的物質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)篩選，例如，適宜 的是，以口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖抑制效果和裸鼠的生存率得以提髙為 指標(biāo)，在植入有上述甲基化癌細(xì)胞株的裸鼠體內(nèi)進(jìn)行篩選，將范圍縮 小至最終的候選物質(zhì)。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不因這 些實(shí)施例而受到特定限制。
實(shí)施例
實(shí)施例l: 口腔鱗狀細(xì)胞癌中基因的變化
為了檢測(cè)出口腔鱗狀細(xì)胞癌中的新型基因變化，采用由18種口 腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(OM-l、OM-2、TSU、ZA、NA、Ca9-22、HOC-313、 HOC-815、 HSC-2、 HSC-3、 HSC國(guó)4、 HSC-5、 HSC-6、 HSC-7、 KON、 SKN-3、 HO-l-N-l、 KOSC-2)制備的基因組DNA，采用MCG CancerArray隱800禾Q MGC Whole Genome Array-4500來進(jìn)行CGH陣列分析 (圖la)。以來源于正常的口腔上皮的細(xì)胞株(RT7)所提取的基因 組DNA為對(duì)照用Cy5進(jìn)行標(biāo)記；以由口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株所制備 的基因組DNA為被檢DNA采用Cy3進(jìn)行標(biāo)記。具體來說，將DpnII 消化的基因組DNA (0.5pg)、分別在0.6mM dATP、 0.6mM dTTP、 0.6mMdGTP、 0.3mM dCTP、 0.3mM Cy3-dCTP (口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì) 胞)或者0.3mM Cy5-dCTP (正常細(xì)胞)的存在下，用BioPrime Array CGH Genomic Labeling System (Invitrogen公司生產(chǎn))進(jìn)《亍豐示記。Cy3 和Cy5標(biāo)記的dCTP購(gòu)自GE Healthcare公司。在Cot-1 DNA (Invitrogen公司生產(chǎn))的存在下將兩種標(biāo)記的基因組DNA加入乙 醇中使其沉淀，然后溶解于1的雜交混合液(50%甲酰胺、10% 硫酸葡聚糖(Dextran sulfate) 、 2XSSC(1XSSC: 150mM NaCl/15mM 檸檬酸鈉)、4%十二垸基硫酸鈉、pH7.0)中，在37'C孵育30分鐘 以后，將所得物加入在雜交儀(Gene TAC;八一K一卜"/、M才廿^ 二 > 乂公司)上設(shè)置的CGH陣列上，孵育48 72小時(shí)。然后，將 CGH陣列在50。/。甲酰胺/2XSSC溶液(pH7.0)中在5(TC下清洗15 分鐘，接下來在2XSSC/0.1% SDS中于5(TC下清洗15分鐘。風(fēng)干以 后，將CGH陣列用GenePix 4000B掃描儀(美國(guó)加利福尼亞州Axon Instruments公司制造)監(jiān)測(cè)來源于Cy3和Cy5的熒光。得到的結(jié)果用 GenePix Pro 6.0成像軟件(美國(guó)加利福尼亞州Axon Instruments公司 制造)進(jìn)行分析。將來源于Cy3的熒光強(qiáng)度的平均值和來源于Cy5的 熒光強(qiáng)度的平均值調(diào)整為相同值，求得Cy3/Cy5的比值。當(dāng)在基因 組中沒有異常時(shí)，Cy3/Cy5的比值為l (1og2比值^0)，而該比值為 1.32以上(1og2比值為0.4以上)時(shí)判定為存在基因組擴(kuò)增，該比值 為4以上(1og2比值為2以上)時(shí)判定為顯著擴(kuò)增。當(dāng)比值為0.75 以下(log2比值為-0.4以下)時(shí)可判斷基因組有可能發(fā)生雜合子缺失， 當(dāng)比值為0.25以下(log2比值為-2以下)時(shí)可判定發(fā)生純合子缺失的可 能性極大。其結(jié)果如表1和表2所示。表1.<image>image see original document page 25</image>
表2
<image>image see original document page 25</image>
'根據(jù)UCSC Genome Browser (2M4年5月版) '位于BAC周圍的基因，該基因的純合缺失由基因組PCR確認(rèn)
在18種口腔鱗狀細(xì)胞癌中，發(fā)生高水平的基因擴(kuò)增的為10種
(55.6%)，可以確認(rèn)15個(gè)基因座。而在18種口腔鱗狀細(xì)胞癌中，發(fā) 生基因缺失的為2種，可以確認(rèn)2個(gè)基因座。實(shí)施例2: 口腔鱗狀細(xì)胞癌中10pl2染色體缺失區(qū)域中所含有的 基因的分離
為了確定在口腔鱗狀細(xì)胞癌(HSC-6)的10pl2染色體純合缺失 區(qū)域中所包含的基因，首先，使用來自HSC-6細(xì)胞的基因組PCR， 確定純合缺失區(qū)域的范圍?；蚪MPCR中所使用的引物序列如表3 所示。
表3
補(bǔ)充表2.本研究中所用的引物序列
方法
耙基因
上游引物
反向引物
基因組PCR
5f~CACCTTGGCTTCAACAAACAG RR7raCf 5'-GTGGCGAAGGATATTATGAAAG C柳鄰3 ^-TATACCAAAGAAGATCCGGAAG y柳，f 5'-ATGCATmCCTCCACTGGATG
5WATTGCTACAGAA(3CATATGAG MVO別 ？-TTTGCCGAGTGGTTCTGGAC G^D2 5、TCCAGTGATTAAAGGCAGAATG
^AAGGTGTCAGTGGTGGAOaTG
5'-GGTTGGGCATTCGCTGCAG 5，-CGTTCATTGA.GACAAATGGATC g-GTGTTGTAATAAATATAACGGTTAT ^GATTTTGGACAAGTTGTTCGAC 5:'-TGCTCTCGATG-CAAGCTGTG 51-TTTAGCTTTCATTAGCCTTAATAC 5，-TTGCCGCTGGGTTTGAGATG 5，-船GAGACGTTGCCTCTCTTC
COBRA和亞硫酸氫鹽測(cè)序 區(qū)域1 區(qū)域2
5WrreGTGAAGAGAACATCCAG
5r-TATACCAAAGAAGATCCGCAAG
■5r-ATTACCTCCCTTGACS3GCTG
-ATATTGCTAGAGAAGCATATGAG
5f-O^GAAGGATGTGGTTTGGCA
^"AGAGAGAATGAGTCOXTG丁
^-AA"TOG/VTTTTGGTGGTATTGG
3-TGGATTTGC3GAATTAGGGC5TT StAAATGTAAAT
Sf-TCAGATCTCTGAA.GTATTCATTG
^-AAAGTTGTGGTGTTGGTATCATG
5、GAAATCGCTGTGGATGTTTATC
5'-ATATTTCCAGTTGGGCATAGAG
5'-ATTGGCTTATGGTGCGAGAC
S'-TTGCCGCTGGGTTTGAGATG
5'-AeCCTTTCCCCTCTCGTAC;
3-ACCGCAAAATAAAAAATTTAGATTT rATTTTGGGGT 5'-GGCAAAAAAAAAAAAACCTGCAA
由CGH陣列的結(jié)果及人基因組數(shù)據(jù)庫(http:〃 genome.ucsc.edu/) 可以確認(rèn)，缺失區(qū)域?yàn)樽畲蠹s2.95Mb的缺失(圖lb、圖2a)。然 后，可以確認(rèn)在該區(qū)域中存在7個(gè)基因。
其中，僅在HSC-6細(xì)胞(1/18， 5.6%;圖2b)中，可以確認(rèn) PRTFDC1基因、clO或f63基因、THNSLl基因、GPR158基因、MY03A 基因、GAD2基因發(fā)生純合缺失，而ARHGAP21基因并沒有發(fā)生缺 失。
實(shí)施例3:關(guān)于口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中PRTFDC1 mRNA表達(dá)
的消失
為了了解上述6個(gè)基因(PRTFDC1基因、c10或f63基因、 THNSL1基因、GPR158基因、MY03A基因、GAD2基因)的表達(dá) 水平，對(duì)18種口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株、正?？谇簧掀ぜ?xì)胞進(jìn)行了反
26轉(zhuǎn)錄PCT (RT-PCR)。具體來說，從培養(yǎng)的細(xì)胞株中提取RNA，采 用Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen公司)，合成 單鏈cDNA，采用補(bǔ)充資料表1中所示的引物序列進(jìn)行PCR。另外， 采用3-磷酸甘油酸脫氫酶基因(GAPDH基因)作為對(duì)照物。其結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，與HSC-6細(xì)胞一樣，在10pl2染色體區(qū)不應(yīng)該發(fā)生純合缺失 的8個(gè)細(xì)胞株中，PRTFDC1 mRNA的表達(dá)也完全消失(圖2c)。而 且，同RT7細(xì)胞、來自正?？谇徽衬さ脑?xì)胞相比，HOC-313細(xì) 胞顯示出表達(dá)減少(1/18， 5.6%)。這樣的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中 的PRTFDC1 mRNA的表達(dá)消失可能是由于除基因組缺失以外的機(jī) 制(例如后生遺傳現(xiàn)象)所致。另一方面，c10或f63、 THNSL1、 GPR158基因表達(dá)的消失或降低的發(fā)生頻率低。
在RT7細(xì)胞和源自正?？谇徽衬さ脑?xì)胞中均沒有發(fā)現(xiàn) MY03A基因、GAD2基因的表達(dá)?？梢哉J(rèn)為這是由于根據(jù)表達(dá)數(shù) 據(jù)庫 (ncbi.nlm,nih.gov禾卩http:〃 www.lsbm.org/database/index.html) 的結(jié)果，這些基因由于顯示出組織特異性的表達(dá)模式，所以在源自口 腔的細(xì)胞中并不表達(dá)。
實(shí)施例4:脫甲基化對(duì)PRTFDC1基因表達(dá)的影響 為了研究PRTFDC1基因的表達(dá)抑制是否是由于DNA甲基化的 原因所致，采用PRTFDC1基因不表達(dá)的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株，分 別用lpM、 5pM的脫甲基化試劑5-aza-dCyd處理5天，禾卩/或用 100ng/ml的脫乙?；种苿㏕SA處理24小時(shí)。從這些細(xì)胞中提取 RNA，用RT-PCR檢測(cè)PRTFDC1基因的表達(dá)(圖2d)。其結(jié)果是， 5-aza-dCyd處理以后，PRTFDC1基因的基因表達(dá)得以恢復(fù)。由該結(jié) 果可以明顯地推定，PRTFDC1基因的表達(dá)抑制與DNA甲基化相關(guān)。 另外，TSA處理后，并未見到PRTFDC1基因的表達(dá)存在差異，由此 明顯可以看出，PRTFDC1基因的表達(dá)調(diào)節(jié)受組蛋白脫乙?；挠绊懶　?br> 實(shí)施例5:關(guān)于PRTFDC1基因CpG島的啟動(dòng)子活性CpG島的甲基化是抑制基因表達(dá)的機(jī)制之一。采用CpGPLOT 程序(http:〃 www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot)分析了 PRTFDC1基因
的CpG島，結(jié)果顯示，在PRTFDC1基因的外顯子1的周圍存在有 CpG島(圖3a)。為了研究該CpG島的啟動(dòng)子活性，將包含該CpG 島周圍的區(qū)域分為3個(gè)片段(片段1、片段2、片段3)，將這些片 段插入到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pGL3-Basic載體，Promega公司生產(chǎn)) 中，并轉(zhuǎn)化到口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(NA、 HSC-2)中(圖3a)。 采用雙熒光素酶報(bào)告基因陣列檢測(cè)系統(tǒng)(Promega公司)，按照其操 作指南測(cè)定熒光素酶的活性，測(cè)定含有各片段的pGL3載體所產(chǎn)生的 熒光素酶活性(圖3b)。其結(jié)果顯示，片段1和3的熒光素酶活性 較高(圖3b)
實(shí)施例6: 口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株和口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床樣本中 PRTFDC1基因CpG島的甲基化狀態(tài)
實(shí)際上，在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中，為了確認(rèn)PRTFDC1基因 的外顯子1的CpG島的甲基化狀態(tài)，對(duì)上述兩個(gè)區(qū)域(片段1、片 段2)采用結(jié)合亞硫酸氫鹽限制性分析(COBRA)法進(jìn)行分析(圖 3a)。
具體來說，使用EZ DNA甲基化試劑盒(美國(guó)加利福尼亞州的 Zymo RESEARCH生產(chǎn))，將源自口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株的基因組 DNA (2pg)在亞硫酸氫鈉中于5(TC下處理過夜，采用經(jīng)設(shè)計(jì)的引物 (補(bǔ)充資料表l)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域。將所得到的PCR產(chǎn)物 用Mlul限制性酶(New England BioLabs)或TaqI限制性酶(New England BioLabs)進(jìn)行消化。利用Mlul或TaqI不消化未被甲基化的 但被亞硫酸氫鈉修飾的序列，而可消化發(fā)生甲基化的但未被亞硫酸氫 鈉修飾的序列的性質(zhì)，檢測(cè)甲基化的程度。將PCR片段進(jìn)行電泳以 后，采用MultiGauge2.0 (富士7 < ^厶株式會(huì)社)根據(jù)密度測(cè)定法 來測(cè)定發(fā)生甲基化片段的帶和未被甲基化片段的帶的濃度比，發(fā)生甲 基化區(qū)域的甲基化程度用百分比表示。另外，將這些序列亞克隆入 TOPOTA克隆載體(Invitrogen公司)中，確定其堿基序列。
28其結(jié)果是，表達(dá)PRTFDC1基因的細(xì)胞株(TSU、 HOC-815、 HSC-4、 HSC-5、 HSC-7、 SKN-3、 HO-l-Nl、 KOSC-2)禾卩RT7纟田胞
在兩個(gè)區(qū)域中均顯示出明顯的低甲基化傾向(圖3c)。但是，在 PRTFDC1基因沒有表達(dá)或表達(dá)低的細(xì)胞株中，在兩個(gè)區(qū)域中均顯示 出顯著的髙頻率的甲基化(圖3c)。特別是，由于區(qū)域2高頻率地 發(fā)生甲基化，由上述啟動(dòng)子分析的結(jié)果可以看出，區(qū)域2發(fā)生的甲基 化對(duì)于PRTFDC1基因表達(dá)的抑制起重要的作用。
進(jìn)一步采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Toyota M., et al.， Cancer Res. 59, 2307,1999)進(jìn)行分析，確認(rèn)了 PRTFDC1基因的CpG島的甲基化程 度(圖3d)。其結(jié)果顯示，在PRTFDC1基因未發(fā)生純合缺失、但表 達(dá)消失的細(xì)胞株(表4) ZA、 HSC-2中，PRTFDC1基因的CpG部位 顯示出非常高的甲基化傾向。而在表達(dá)了 PRTFDC1基因的細(xì)胞株 RT7、 KOSC-2中，未發(fā)生甲基化。
表4
補(bǔ)充表1. PRTFDC1基因的基因組拷貝數(shù)、mRNA表達(dá)和CpG島超甲基化的狀態(tài)
細(xì)胞株
缺失mRNA表達(dá)CpG島超甲基化a
OM!-1
半合
TSU■，-++
NA半合一
ZA半A —I— 口'如
+
HOC-313融±咖
，+
HSC-2
HSC-3一
HSC4:謝
HSC"5，麗
HSC純合
HSC-7
KON'輔-麗.+
S,3半合+
HO-,-M1■> 。
KOSC-2'扁
a根據(jù)材料和方法中所述的COBRA來測(cè)定甲基化狀態(tài)
b NT,未檢測(cè)
接下來，為了確定口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床樣本中的PRTFDC1 基因CpG島的甲基化狀態(tài)，采用47例口腔鱗狀細(xì)胞癌，利用COBRA 法進(jìn)行分析(圖4a)。結(jié)果顯示，在47個(gè)病例中有8個(gè)病例(17.0%)的PRTFDCl基因CpG島出現(xiàn)甲基化等位基因。另外，在所有樣本 中都確認(rèn)有非甲基化等位基因，這可能是由于正常細(xì)胞受到污染所 致。在COBRA分析中，被判定為陽性的口腔鱗狀細(xì)胞癌(1、 68、 69、 75，圖4b)經(jīng)亞硫酸氫鹽測(cè)序確定為甲基化狀態(tài)。結(jié)果可以確 認(rèn)，在COBRA陽性的口腔鱗狀細(xì)胞癌中，存在甲基化等位基因。
對(duì)47例口腔鱗狀細(xì)胞癌的PRTFDCl基因Cp島甲基化與臨床 病理診斷的相關(guān)性的調(diào)查結(jié)果如表5所示。
表5
表3.臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)與PRTFDC1基因CpG島的超甲基化之間的關(guān)系
Jl PffWBC，超甲基化a Pi
a根據(jù)材料和方法中所述的甲基化特異性PCR來測(cè)定甲基化狀態(tài)
b P值得自X 或Fisher精確檢驗(yàn)法，并且當(dāng)p<0.05 (雙側(cè))時(shí)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著
'13個(gè)病例無此信息
d 16個(gè)病例無此信息
e 9個(gè)病例無此信息
實(shí)施例7:通過PRTFDCl基因的活化來抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的
根據(jù)前述結(jié)果，研究了 PRTFDCl基因表達(dá)活化是否可以抑制口 腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖。首先，構(gòu)建了能夠表達(dá)PRTFDCl基因的并具
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總
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范
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間A <l。煙吸
別男女齡中
性 年
者等
者酒中
jf. 酒飲e -
煙吸不酒飲不化好差糊期
培
分
1-
3
S 物s ，4 3:1 鄉(xiāng)7 錫M有Myc標(biāo)簽的質(zhì)粒(pCMV-3Tag4-PRTFDCl)。該質(zhì)?？梢杂糜跈z 測(cè)全長(zhǎng)的PRTFDC1基因的作用。該質(zhì)粒是這樣制備的將通過 RT-PCR擴(kuò)增得到的PRTFDC1基因的cDNA插入到pCMV-3Tag4載 體(Stratagene公司)中，使得Myc標(biāo)簽與翻譯框匹配連接。采用沒 有插入PRTFDC1基因的空載體(pCMV-3Tag4-mock)作為對(duì)照。將 這些表達(dá)質(zhì)粒與作為轉(zhuǎn)化試劑的FuGENE6 (Roch Diagnostics)混 合，轉(zhuǎn)至NA、 OM-2細(xì)胞中。48小時(shí)后回收細(xì)胞。采用抗Myc抗體 (Cell Signaling Technology公司)經(jīng)Western印跡確認(rèn)有 PRTFDCl蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖5a)。
另外，在轉(zhuǎn)染3周后，在作為新霉素類藥物的G418的存在下使 細(xì)胞增殖，用70%乙醇將增殖后的細(xì)胞固定，用結(jié)晶紫進(jìn)行染色并 計(jì)數(shù)。其結(jié)果顯示，與用空載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞相比，用 pCMV-3Tag4-PRTFDCl轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的菌落數(shù)顯著減少(圖5b)。 該結(jié)果明確顯示，PRTFDC1基因的表達(dá)活化具有作為可抑制口腔鱗 狀細(xì)胞癌增殖的癌抑制劑的功能。序列表
<110>富士膠片株式會(huì)社
國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)
〈120> 口腔鱗狀細(xì)胞癌的檢測(cè)方法及抑制方法
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〈150> JP No. 2007-143110 <151〉 2007-05-30
<160> 36
<170> Patent In version 3.3
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caccttggct tcaaca3aca g 21
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ctggccaagg atattatga3 ag 22
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tataccaaag aagatccgca ag 22<formula>formula see original document page 33</formula><212〉 隱
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caagaggcaa gagaacccag 20
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gttggtgaag agaacatcca g 21
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33Cgtgtcag tggtgg3CCt g
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tataccaaag aagatccgca ag
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12 20 DNA
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attacctccc ttgacggctc 20
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aaatgtaaat tttttatttt ggggt 25
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ccttcattga gacaaatcga tc 22<210> 21
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gtgttctaat aaatataacg gttat 25
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ttgccgctgg gtttgagatg 20
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agtgggtgtc gctgttgaag 20
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aggacacgtt gcctctcttc
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tcagatctct gaagtattca ttg
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人工序列
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aaagttgtgc tgttggtatc atg 23
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gaaatcgctg tgcatgttta tc 22
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合成DNA<400> 33
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cccaaaaaaa aaa3aacctc C3a 2權(quán)利要求
1.一種癌癥的檢測(cè)方法，該方法通過檢測(cè)存在于樣本的染色體區(qū)域1q21、2q24.1-q24.2、3p13、7p11.2、10p12.1、11p15.4、11p15.2、11p13.3、11q22、11q23.3、12p 13、12q24.31、13q33.3-q34、12q24.1、19q13、或22q12.1中的基因發(fā)生的至少一種變化，來檢測(cè)樣本的癌化，包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。
2. 權(quán)利要求1所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所述基因?yàn)锽CL9、 MITF、 EGFR、 PTH、 BCL1、 FGF4、 CCND1、 FGF3、 PGR、 YAP1、 CIAP1、 MMP7、 MMP1、 CCND2、 FGF6、 BCL7A、 DP1、 GAS6、 SUPT5H、 PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或 GAF2中的至少一個(gè)。
3. 權(quán)利要求1或2所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所述基因變化 為擴(kuò)增、缺失和失活中的至少一種。
4. 權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所 述基因的變化是由CpG島的甲基化而引起的失活。
5. —種癌癥的檢測(cè)方法，該方法通過檢測(cè)BCL9、 MITF、 EGFR、 PTH、 BCL1、 FGF4、 CCND1、 FGF3、 PGR、 YAP1、 CIAP1、 MMP7、 MMP1、 CCND2、 FGF6、 BCL7A、 DP1、 GAS6、或SUPT5H基因的 擴(kuò)增、或者PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的缺失來檢測(cè)樣本的癌化，包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性 程度。
6. —種癌癥的檢測(cè)方法，該方法通過檢測(cè)PRTFDC1基因的缺 失或失活來檢測(cè)樣本的癌化，包括檢測(cè)樣本的癌化的惡性程度。
7. 權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所 述樣本為源自口腔的組織。
8. 權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中所 述癌癥為口腔鱗狀細(xì)胞癌。
9. 權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的癌癥的檢測(cè)方法，其中采 用DNA芯片法、Southern印跡法、Northern印跡法、實(shí)時(shí)RT-PCR 法、FISH法、CGH法、或者陣列CGH法、亞硫酸氫鹽測(cè)序法、COBRA 法對(duì)所述基因的變化進(jìn)行檢測(cè)。
10. —種抑制細(xì)胞增殖的方法，其包括將PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因、或?qū)⒆鳛樵摶虻谋?達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)在體外導(dǎo)入到細(xì)胞中。
11. 一種細(xì)胞增殖抑制劑，其含有PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因、或作為該基因的表達(dá) 產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。
12. —種激活細(xì)胞增殖的方法，其包括將PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的siRNA、 shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中。
13. —種細(xì)胞增殖激活劑，其含有PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的siRNA、 shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因。
14. 一種物質(zhì)的篩選方法，其為針對(duì)由于其中的PRTFDC1、 c10或f63、 THNSL1、 GPR158、 MY03A、或GAF2基因的CpG島發(fā)生甲基化而導(dǎo)致基因表達(dá)被抑制的口腔鱗狀細(xì)胞癌，使該口腔鱗狀細(xì)胞癌與待測(cè)物質(zhì)接觸以檢測(cè)所述基因的表達(dá)，當(dāng)與未接觸該待測(cè)物 質(zhì)的體系相比較，發(fā)現(xiàn)所述基因的表達(dá)增加時(shí)，可將該待測(cè)物質(zhì)篩選 為可以通過將所述基因的CpG島脫甲基化而使該基因活化的抗腫瘤 物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明通過以口腔鱗狀細(xì)胞癌中基因組結(jié)構(gòu)的變化為指標(biāo)來提供一種檢測(cè)包括惡性程度在內(nèi)的口腔鱗狀細(xì)胞癌的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以口腔鱗狀細(xì)胞癌的基因組結(jié)構(gòu)變化為指標(biāo)，可以檢測(cè)包括惡性程度在內(nèi)的口腔鱗狀細(xì)胞癌。另外本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，通過使失活的基因恢復(fù)，可以抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101314794SQ20081010866
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者井本逸勢(shì), 稻澤讓治, 鈴木江美奈 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社;國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)