專利名稱：：人宮頸癌的一種治療性疫苗的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及人宮頸癌的一種治療性疫苗。技術背景人乳頭瘤病毒(humanpapilloma-virus，HPV)的持續(xù)感染常可引起生殖器疣、宮頸癌、陰莖癌、肛周癌及頭頸部癌等發(fā)生，其中尤以宮頸癌危害最為突出。目前全球宮頸癌患者己超過1400萬，主要集中在發(fā)展中國家，且每年新增病例47萬余，其中至少一半人死亡，宮頸癌在婦女腫瘤死亡率中高居第二位，已成為困擾社會的重大公共衛(wèi)生問題(ZurHausenH.Papillomavirusinhumancancers.ProAssocAmPhysicians,1999,111(6):581-587.KoutskyLA,GallowayDA，HolmesKK.Epidemiologyofgenitalhumanpapillomavirusinfection.Epidemiol.Rev.1988，10:122—163.MungerK,BaldwinA，EdwardsKM.MechanismsofHumanPapillomavirus-inducedOncogenesis.JVirol，2004，78(21):11451—11460.GarlandSM.Humanpapillomavirusupdatewithaparticularfocusoncervicaldisease.Pathology,2002,34(3):213-224.)。臨床上宮頸癌傳統治療方法療效不佳，主要表現為中晚期病人化療有效率一般小于20%，放療或手術后近4成復發(fā)，且預后極差。研究表明，利用最新分子生物學進展，研究生物工程疫苗以提高療效，是目前在宮頸癌防治上最有希望取得突破的方向之一(JansenKUandShawAR.Humanpapillomavirusvaccinesandpreventionofcervicalcancer.Annu.Rev.Med.2004,55:319—331.AmandaPsyrri*andDanielDiMaioHumanpapillomavirusincervicalandhead-and-neckcancer.NatureclinicalpracticeONCOLOGY2008，5(1):24-31.)。HPV是一種雙鏈DNA病毒，其衣殼蛋白LI與L2表達后能自我裝配或形成病毒樣顆粒(VLP)，可誘發(fā)機體產生特異性中和抗體和有效的周部免疫反應；HPV共有8個早期蛋白，其中E6和E7可分別使抑癌蛋白p53和Rbl失活，導致細胞周期失控、端粒酶激活與細胞永生化，其持續(xù)表達是腫瘤細胞轉化和維持惡性特征所必需的，以之為靶位可引發(fā)較強的特異性T細胞反應，E6和E7蛋白在正常人體內不存在，且抗原性、特異性均較強，屬較好的疫苗靶位(RodenRB,GrrenstoneHL,KimbauerR,etal.Invitrogenerationandtype-specificneutralizationofahumanpapillomavirustype16virionpseudotype.virology，1996,70(9):5875-5883.PorgadorA.Inductionofantitumorimmunityusingbonemarrow-generateddendriticcells.JI醒unol,1996,156(8):2918-1926.EvansM,BoryiewiczLK,EvansAS，etal.AntigenprocessingdefectsincervicalcarcinomaslimitthepresentationofaCTLepitopefromhumanpapillomavirus16E6.JI譲unol,2001，167(9):5420-5428.BerezutskayaE，BagchiS.ThehumanpapillomavirusE7oncoproteinfunctionallyinteractswiththeS4subunitofthe26Sproteasome.JBiolChem，1997,277(48):30135-30140.)。近10年來HPV疫苗研究非?；钴S，國際上已有數個HPV候選疫苗進入臨床II或III期試驗階段，不過包括2006年FDA正式批準上市的Gardasil(Merck公司)在內，多為預防性的VLP疫苗，治療性疫苗研究尚有待加強(Noauthorslisted.Newvacdnepreventscervicalcancer.FDAConsum.2006;40(5):37.)。此外尤其值得、注意的是，大宗流行病學調査顯示HPV是由多個型別組成的病毒，缺乏群抗原決定簇，而不同地區(qū)HPV感染型別構成比是存在差異的，因此開發(fā)多價疫苗才能真正起到防治效果。以宮頸癌為例，國外多以16和18型為主，58型罕見(<2%)，而我國58型感染則非常普遍(約10-30%)，宮頸癌病人中檢出率僅次于16型(50%左右)，在南方許多地區(qū)甚至與16型幾乎持平(ShiW,BuP,LiuJ,etal.Humanpapillomavirustype16E7DNAvaccine:mutationintheopenreadingframeofE7enhancesspecificcytotoxicT-lymphocyteinductionandantitumoractivity.JVirology.l999,73(9):7877-7881.林玉純，劉寶印，李潔等.人乳頭瘤病毒58型的發(fā)現及各型在中國宮頸疾患中的分子流行病學研究.醫(yī)學研究通訊，1996;25(11):21.DaiM,BaoYP,LiN,etal.HumanpapillomavirusinfectioninShanxiProvince,People'sRepublicofChina:apopulation-basedstudy.BrJCancer.2006，95(1):96隱101.ChanPK，LiWH,ChanMY,etal.Highprevalenceofhumanpapillomavirustype58inChinesewomenwithcervicalcancerandprecancerouslesions.JMedVirol,1999，59(2):232-238.)。多價疫苗開發(fā)受載體容量及生產成本等限制，而且不常見亞型的保護效果也很難證實，目前國外仍以一價或二價最常見病毒類型疫苗的研究為主，國內對58型感染亦未引起足夠重視，迄今國際上進入臨床試驗階段的HPV候選疫苗中沒有一個是針對58亞型的，這極可能導致相當長時間內進口疫苗在我國不適用，因此，自主開發(fā)針對我國國情的HPV疫苗迫在眉睫。目前，治療性HPV疫苗的研制主要有下列方法(ShreyaKanodia,DianeM.DaSilva,etaLRecentadvancesinstrategiesforimmunotherapyofhumanpapillomavirus-inducedlesionsInt.J.Cancer:2008;122:247-259.)。1、以病毒為載體的疫苗。主要是以痘苗病毒、腺病毒、腺相關病毒為載體，主要優(yōu)點能引起宿主產生強烈的細胞和體液免疫反應，但以前的感染可能對疫苗的效果產生負面影響。2、以細菌為載體的疫苗。該類疫苗能產生高滴度的抗體，但細胞免疫反應沒有以病毒為載體的疫苗效果好。如以李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌或大腸桿菌作為載體的疫苗。3、多肽疫苗。主要優(yōu)點合成方便，但細胞和體液免疫反應均較弱，并且該類疫苗受到HLA的限制。4、蛋白質疫苗。該類疫苗不受HLA的限制，能產生抗體，為了產生強烈的CTL反應，常需要與其它分子進行耦聯，如熱休克蛋白或添加佐劑。5、DNA疫苗。主要優(yōu)點是制備方便、穩(wěn)定性好，但其安全性值得注意。6、以樹突細胞為基礎的疫苗。其免疫原性強，但常需要在體外培養(yǎng)，再回輸到體內，在腫瘤的治療中開始被重視。7、腫瘤細胞疫苗或來源于腫瘤細胞成分或腫瘤相關性抗原，或對腫瘤細胞進行修飾。目前HPV疫苗研究存在的主要問題是①如何形成免疫記憶；②如何誘導有效的粘膜免疫；③如何控制生產成本。目前VLP疫苗預防效果好但成本過高，在發(fā)展中國家不可能被廣泛應用；合成多肽疫苗與DNA疫苗一樣，免疫功效較差，即使輔以各種佐劑，仍不能完全預防同型HPV感染或使已生成腫瘤消退，其應用還受MHC-l類分子限制，短期內難有大的進展。相形之下，具有長期、大規(guī)模人類接種史的病毒載體疫苗才是目前發(fā)展中國家可行性最強的HPV疫苗策略。其中腺病毒載體不但外源基因表達水平高，引起免疫反應強而持久，制備方法成熟，免疫途徑方便，還是已知的唯一能誘發(fā)有效粘膜免疫的病毒載體，已取代逆轉錄病毒成為當前應用最廣泛的載體。加之近年來復制缺陷腺病毒不斷重組改良，其使用安全性已大大增強，用以開發(fā)HPV疫苗的條件進一步成熟。治療性疫苗主要以E6和E7作為靶蛋白，其目的是誘導機體產生特異性細胞免疫反應、清除已感染的HPV、治療由感染引起的癌前病變和腫瘤。但高危型HPV的E6和E7蛋白是公認的致癌因子，在HPV相關的永生化和致瘤性中起著重要作用。E7蛋白能失活腫瘤抑制蛋白Rb，并有激活端粒酶、活化周期素E和A的作用(MichelN,OsenW，GissmannL，etal.EnhancedimmunogenicityofHPV16E7fiisionproteinshiDNAvaccination.Virology,2002，294:47259.)。E6可通過E6AP-泛素途徑降解P53蛋白，使P53蛋白控制的G,/S節(jié)點失去控制，導致細胞染色體不穩(wěn)定和基因突變增加，使外源DNA整合到染色體中的機率大大升高(ZhengZMand.BakerCC.papillomavirusgenomestructure,expression,andpost-transcriptionalregulation.FrontBiosci.2006,11:2286-2302.);同時還可作用于凋亡相關蛋白，抑制細胞凋亡、激活端粒酶、維持端粒長度使細胞永生化。所以，必須去除E6和E7的轉化活性才能用于疫苗的構建。研究表明，E6的N端主要與蛋白的穩(wěn)定性有關，N端發(fā)生缺失突變會顯著影響蛋白在體夕卜的半衰期(GrossmanSR,MoraR,LaiminsLA.IntracellularlocalizationandDNA~Ifindingpropertiesofhumanpapillomavirustype18E6proteinexpressedwithabaculovirusvectorl,JviroU989,63(l):366-374.)。E6的兩個鋅指區(qū)都是改變病毒轉化活性和引起蛋白反式激活所必需的，均與蛋白間的相互作用有關(KandaT,WatanabeS,ZanmaS,etal.Humanpapillomavirustype16E6proteinswithglycinesubstitutionforcysteineinthemetal-bindingmotif.ViroIog，1991,185(2):536-543.)。許多資料證實，E6的C端含有大多數的抗原表位。Nakagawa等詳細研究了HPV18型E6蛋白各位點與HEK293細胞轉化和p53失活的關系，發(fā)現除鋅指結構外，L-52突變對其影響也非常顯著(NakagawaS，WatanabeS,YoshikawaH，etal.Mutationalanalysisofhumanpapillomavirustype16E6protein:transformingfonctionforhumancellsanddegradationofp53invitro.Virolog,1995,212(2):535-542.)。E7蛋白為全長105個氨基酸殘基的酸性蛋白，是HPV18的主要轉化蛋白。E7蛋白分為3個功能區(qū)1區(qū)和2區(qū)與腺病毒E1A的第1、2保守區(qū)高度同源；3區(qū)為鋅指區(qū)。2區(qū)中的"L-X-E-X-C"被認為是結合Rb的關鍵位點。研究表明，該位點突變可明顯降低E7蛋白對猴CA-l細胞系的轉化活性，但并不影響人角化細胞的永生化，而鋅指區(qū)的突變則可完全破壞E7蛋白的轉化和永生化能力。E7蛋白可能是以二聚體的形式存在，此二聚體以"Cys-X-X-Cys"基序與Zine結合，l個鋅指突變會減弱其與Zine的結合能力、縮短半衰期、降低穩(wěn)定性、喪失其轉化性；而2個鋅指突變則徹底失去其與Zine結合的能力、引起半衰期的嚴重縮短、完全喪失其轉化性，并有可能喪失抗原性。此外，有研究報導對HPV16型E7蛋白進行T20V突變，可以提高其所誘導的CTL反應，但不影響E6和E7蛋白的功能活性(SchreursMWJ,KueterEWM，ScholtenKBJ,etal.AsingleaminoacidsubstitutionimprovestheinvivoimmunogenicityoftheHPV16oncoproteinE7(l1—20)cytotoxicTlymphocyteepitope.Vaccine，2005,23:4005.)。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種轉錄融合三基因片段。本發(fā)明所提供的轉錄融合三基因片段，包括HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67以及連接三者的短核苷酸片段；所述HPV16mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列6;所述HPV18mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列7;所述HPV58mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列8;所述連接HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的短核苷酸片段為核糖體內部進入位點(internalribosomeentrysite,IRES)。所述HPV16mE67的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列1;所述HPV18mE67的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列2;所述HPV58mE67的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列3，所述核糖體內部進入位點的脫氧核糖核苷酸序列是序列表中序列4。上述轉錄融合三基因片段的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列5，其中HPV16raE67、HPV18mE67和HPV58mE67均具有起始密碼子和終止密碼子。含有上述轉錄融合三基因片段的重組表達載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體為復制缺陷型重組腺病毒表達載體。上述復制缺陷型重組腺病毒表達載體可用于制備預防和/或治療人宮頸癌的疫苗。含有上述轉錄融合三基因片段的復制缺陷型重組腺病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述復制缺陷型重組腺病毒是用Adeno-X表達系統制備的。本發(fā)明的另一個目的是提供人宮頸癌的一種治療性疫苗，它的活性成分是上述復制缺陷型重組腺病毒。根據我國HPV感染型別的分布特點，選擇HPV16、18和58這三個最常見的亞型(涵蓋國內80y。以上的宮頸癌HPV感染病例，東南部比例更高)，對影響其轉化活性和提高CTL反應的位點進行突變，對E6基因，選擇突變其P53結合位點及其中一個鋅旨結構；對E7基因，選擇突變其Rb結合位點和其中一個鋅指，在不影響蛋白穩(wěn)定性和免疫原性的前提下，徹底去除其轉化活性。構建了各亞型HPV的E6和E7蛋白的融合基因，并將其轉入腺病毒載體，檢測E6和E7蛋白轉化活性的去除情況。動物試驗結果表明，該疫苗能在細胞中表達，用純化的腺病毒顆粒直接免疫動物，對已形成的腫瘤有明顯的治療效果，其作用機制主要由于該疫苗能在動物體內產生強烈的CTL反應。圖1為HPV16、18和58型E6和E7基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果圖2為融合基因HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖3為重組質粒pShuttle2-16mE67-IRES2-18fflE67-工RES2-58mE67被NheI和NotI雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳結果圖4為轉入重組腺病毒載體Adeno-X-HPV16，18，58raE67的大腸桿菌PCR鑒定結果圖5為重組質粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67轉染HEK293細胞8天后細胞的形態(tài)圖6為重組腺病毒的滴度測定結果圖7為重組質粒pAdeno-X-HPV16,18mE67-EGFP轉染HEK293細胞48h后，轉基因細胞的熒光顯微鏡觀察結果圖8為重組腺病毒轉染HEK293細胞后的WesternBlot檢測結果圖9為小鼠的成瘤情況圖10為小鼠腫瘤體積的測量結果圖ll為小鼠存活率的測量結果圖12為CTL檢測結果具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.,Russell,DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物及DNA序列如無特別說明均由上海生工合成。實施例1、HPVE6和E7基因的來源及其突變HPV基因組DNA來自深圳市中醫(yī)院門診病人(年輕女性)的宮頸刮片標本，PCR擴增，測序后證實為HPV的基因組咖A。以該HPV基因組DNA為模板，分別設計HPV16、18和58型E6和E7基因的特異性引物，擴增HPV16型E6基因的特異性引物為Pl和P2，擴增HPV16型E7基因的特異性引物為P3和P4，擴增HPV18型E6基因的特異性引物為P5和P6，擴增HPV18型E7基因的特異性引物為P7和P8，擴增HPV58型E6基因的特異性引物為P9和PIO，擴增HPV58型E7基因的特異性引物為Pll和P12(具體的引物序列如表l所示)，用DNA聚合酶分別擴增HPV16、18和58型E6和E7基因，并在引物上添加相應的酶切位點，PCR反應體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反應條件先95。C預變性5min;然后95°Clmin，56°Clmin，72°Clmin，共32個循環(huán)，最后72"C延伸lOmin。對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，具體檢測結果如圖l所示。其中，M為DL2000Marker,泳道1-3分別為HPV16、18和58型E6基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠檢測結果；泳道4-6分別為HPV16、18和58型E7基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠檢測結果。結果表明，獲得大小為500bp的HPV16、18和58型E6基因和大小為300bp的HPV16、18和58型E7基因。PCR擴增產物經純化后分別與pMD18Tsimple(購自Takara公司)相連并進行測序，測序結果表明，擴增得到的HPV16、18和58型E6基因的脫氧核糖核苷酸序列與GenBankAccenssionNumberEF029179、EF202153和D90400的序列一致，擴增得到的HPV16、18和58型E7基因的脫氧核糖核苷酸序列與GenBankAccenssionNumberEU430687、EF202153和D90400的序列一致。分別對上述擴增得到的HPV16、18和58型E6和E7基因的與轉化活性相關的位點以及能增強細胞免疫功能的部位進行突變，突變后的序列經測序分析證實突變成功，具體的突變方法如下以上述HPV16型E6基因的PCR擴增產物為模板，以PM1和PM2為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pMD18T-16E6ml;再以pMD18丁-16E6ml為模板，以PM3和PM4為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的PCR產物命名為HPV16mE6。以上述HPV16型E7基因的PCR擴增產物為模板，以PM5和PM6為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pMD18T-16E7ml;再以pMD18T-16E7ml為模板，以PM7和PM8為弓I物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的PCR產物命名為HPV16mE7。以上述HPV18型E6基因的PCR擴增產物為模板，以PM9和PM10為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pMD18T-l犯6ml;再以pMD18T-18E6ml為模板，以PM11和PM12為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的PCR產物命名為HPV18mE6。以上述HPV18型E7基因的PCR擴增產物為模板，以PM13和PM14為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pMD18T-18E7ml;再以pMD18T-18E7ml為模板，以PM15和PM16為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的PCR產物命名為HPV18mE7。以上述HPV58型E6基因的PCR擴增產物為模板，以PM17和PM18為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pMD18T-58E6ml;再以pMD18T-58E6ml為模板，以PM19和PM20為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的PCR產物命名為HPV58mE6。以上述HPV58型E7基因的PCR擴增產物為模板，以PM21和PM22為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pMD18T-58E7ml;再以pMD18T-58E7ml為模板，以PM23和PM24為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連并進行測序，將測序結果正確的PCR產物命名為HPV58mE7。其中，HPV16mE6是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第57位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)，第110位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G);HPV16mE7是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第22位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)，第91位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G);HPV18mE6是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第第52位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)，第68位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)，HPV18mE7是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第第27〗立的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)，第98位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G);HPV58mE6是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第第50位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)，第66位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G);HPV58mE7是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第第26位的谷氨酰胺(E)突變?yōu)楦拾彼?G)，第92位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)。表l引物設計擴增引物引物序列突變引物引物序列基因編號(5,-3，)位點編號(5，-3，)l犯6PlGGG7T腦ATGGACCAMAGAGA16E6L57GPM1TTTTCGGGATCGTTGCATAGTATATAGP2TCT藩6"7TCAGCTGGGTT丁CTCPM2GCAAAGTCATATACCTCACGTCGC16E7P3GGC腐C7TCATGGAGATACA16E6C110GPM3TAATTAGG§GTATTAACTGTCAAAAGCCp4GG脇7CrTTATGGTTTCTGApm4ACAAATCACACAACGGTTTGTTGTA16E7L22GPM5ACTGATQ5CTACTGTTATGAGCpm6TGTCTCTGGTTGCAAATCTAAC18E6P5TAC^7TCATGGCGCGCTTTGA16E7C91GPM7AGGAATTGTG蹄CCCATCTGTTCP6CGGGCCTO^CTTCTACTTGTGPM8AGTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCAAAG18E7P7Tff腦CCATGGACCTAAGGl咖L52GPM9CATTTAAAGAT55ATTTGTGGTGTATAGAP8TTT(Tra必TTACTGCTGGGAPM10CAAATTCAAATACCTCTGTAAGTTCCAiV18E6C68GPM11GCATGCCATAAAgGTATAGATTpm12AGCATGGGGTATACTGTCTCTA5犯6P9TTAC腦(JATGTTCCAGGACG18E7C27GPM13GTTGACCTTCTAgGTCACGAGCAP10GGC^477TCACTTGTGTTTGTCPM14CGGAATTTCATTTTGGGGC58E7PUTCtf/W77TAGAGGAAACAACCC麗C98GPM15CTGTCCTTTGTG§GTCCGTGGTGTp12TGCtfara:tgtttattgctgpm16GGTGTTaGAAACAGCTGCTGGAATGP12'TTCmCOK"TGTTTATTGCTG58E6L50GPM17TTGCAGATGGCAGAATAGTGTATAGAGPM18ATACMAGTCATATACCTCAGATCGCTGIRESP13TT6WCCTTACCTCTCCCTC58E6C66GPM19AGTATGTAAAGTGgGCTTACGATTGCP14GCG,77rGGTGGCCATAPM20GCAAATGGATTTCCATCTCTATACACP14'TAC腦tfTGTGGCCATATTATC58E7E26GPM21ATTCTGCTACG^CAM7ATGTGACPM22AGGTCAGTTGCTTCAGGATGTAAATC58E7C92GPM23CATTGTG5GCCCTAGCTPM24GTACATGTGCCCATAAGCA注表中斜體字部分為酶切位點，帶下劃線部分為突變位點。實施例2、融合基因的獲得及mE67基因轉化活性去除情況檢測一、融合基因的獲得用T-Vector載體(購自Takara公司)分別將上述實施例1獲得的野生型HPV16的E6和E7基因、HPV18的E6和E7基因、HPV58的E6和E7基因以及突變后的HPV16的raE6和mE7基因、HPV18的mE6和mE7基因、HPV58的mE6和mE7基因相連接，產生融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58raE67，具體的連接方法如下將HPV16E6、HPV16mE6用引物P1、P2進行PCR擴增，HPV16E7、HPV16mE7用引物P3、P4進行PCR擴增，電泳產物分別用進行酶切，回收酶切產物，將HPV16E6與HPV16E7，HPV16mE6與HPV16mE7經歷'/wHI酶切后的產物用T4連接酶進行連接，然后以連接產物為模板，以P1和P4為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連，將得到的含有融合基因的載體分別命名為T-HPV16E67和T-HPV16mE67;同樣的方法，將HPV1犯6、HPV18mE6用引物P5、P6進行PCR擴增，HPV18E7、HPV18mE7用引物P7、P8進行PCR擴增，電泳產物分別用進行酶切，回收酶切產物，將HPV18E6與HPV18E7，HPV18mE6與HPV18mE7經&n酶切后的產物用T4連接酶進行連接，然后以連接產物為模板，以引物P5和P8為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連，將得到的含有融合基因的載體分別命名為T-HPV18E67和T-HPV18mE67;將HPV58E6、HPV58mE6用引物P9、P10進行PCR擴增，HPV16E7、HPV16mE7用引物Pll、P12進行PCR擴增，電泳產物分別用&0旦進行酶切，回收酶切產物，將HPV58E6與HPV58E7，HPV58mE6與HPV58mE7經fcaI酶切后的產物用T4連接酶進行連接，然后以連接產物為模板，以引物P9和P12為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物與pMD18Tsimple相連，將得到的含有融合基因的載體分別命名為T-HPV58E67和T-HPV58mE67。對上述得到的含有融合基因的載體T-HPV16raE67、T-HPV18mE67和T-HPV58mE67分別進行PCR、電泳檢測，結果如圖2所示。其中，1為1^].611￡67PCR產物的電泳檢測結果，2為HPV18mE67PCR產物的電泳檢測結果，3為HPV58mE67PCR產物的電泳檢測結果。對T-HPV16mE67、T-HPV18mE67和T-HPV58mE67質粒進行測序，結果表明HPV16mE67的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列6所示；HPV18mE67的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列7所示；HPV58mE67的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列8所示。二、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67基因轉化活性去除情況檢測1、轉基因細胞的獲得將上述步驟一獲得的融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67用順el和fe/dil酶切后，分別連入真核表達質粒pIRES2-EGFP(購自BD公司)的Mel和"s/zHI酶切位點間，得到含有融合基因HPV16E67的重組表達載體pIRES2-HPV16E67,含有融合基因HPV18E67的重組表達載體pIRES2-HPV18E67，含有融合基因HPV58E67的重組表達載體pIRES2-HPV58E67，含有融合基因HPV16mE67的重組表達載體pIRES2-HPV16mE67,含有融合基因HPV18mE67的重組表達載體pIRES2-HPV18mE67和含有融合基因HPV58mE67的重會且表達載體pIRES2-HPV58mE67。將上述構建的重組表達載體用脂質體法(詳見Lipofectamin2000試劑盒說明)分別轉染Balb/c3T3細胞，經G418篩選，得到含有相應基因的細胞克隆。同時以未轉入任何真核表達質粒的Balb/c3T3細胞f乍為對照，用以觀察去轉化活性情況。2、常規(guī)體外細胞培養(yǎng)，觀察其接觸抑制情況將質粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67、pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67和pIRES2-HPV58mE67分別轉染Balb/c3T3細胞，經G418篩選，得到含有相應基因的細胞克隆。培養(yǎng)上述轉基因細胞3天后，進行光鏡觀察，結果發(fā)現，轉入質粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67的細胞呈融合狀并重疊生長，提示失去生長接觸抑制，而轉入質粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的細胞始終存在接觸抑制現象。3、軟瓊脂培養(yǎng)在直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿上鋪一層0.35%的瓊脂，每個培養(yǎng)皿中分別接種5X104個對數生長期的上述步驟1獲得的轉基因的Balb/c3T3細胞和未轉入任何真核表達載體的Balb/c3T3細胞，每種處理5個重復，37°C5%〔02常規(guī)培養(yǎng)3周，倒置顯微鏡下觀察集落形成情況。結果表明，在軟瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周后，轉入質粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67的細胞呈集落性生長，而轉入質粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的細胞和未轉基因的Balb/c3T3細胞一樣，均未見50個細胞以上的集落形成。4、裸鼠體內致瘤實驗取Balb/c小鼠(購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心)，每只小鼠皮下接種5Xl06個上述步驟l的獲得的轉基因和未轉基因的Balb/c3T3細胞，每種細胞接種5只小鼠，觀察小鼠皮下成瘤情況。結果表明，接種40天后，用轉入質粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的Balb/c3T3細胞接種的小鼠和用未轉基因的Balb/c3T3細胞接種的小鼠無一成瘤，而用轉入質f立pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2「HPV58E67的Balb/c3T3細胞接種的小鼠有80%皮下成瘤，瘤的平均直徑為2.5mm。軟瓊脂培養(yǎng)和裸鼠體內致瘤實驗證明，突變后的三個亞型的mE67基因已經失去E6和E7基因的轉化活性，為疫苗的安全使用提供了保障。實施例3、重組腺病毒質粒的構建將上述實施例2構建的HPV16mE67基因經順el和酶切后與用同樣酶切的載體pCDNA3.1(+)相連，產生重組質粒pCDNA3.1(+)16mE67;以質粒pIRES2-EGFP(購自BD公司)為模板，用P13、P14為引物進行PCR擴增，產物分離純化后得到663bp的IRES2片段，對IRES2片段進行測序，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。將該IRES2片段用和fcoZ[雙酶切后連入質粒pCDNA3.1(+)16mE67的^Mil和fcoM酶切位點間，得到重組表達載體pCDNA3.1(+)16mE67-IRES2。將上述實施例2構建的HPV18mE67基因經fcoZI和酶切后與用同樣酶切的載體pCDNA3.1(+)相連，產生重組質粒pCDNA3.1(+)18mE67;以質粒pIRES2-EGFP(購自BD公司)為模版，用P13、P14，為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物用^棚ffl和Xhol雙酶切后連入質粒pCDNA3.1(+)18mE67的萬<3/^和Xhol酶切位點，得到重組表達載體pCDNA3.1(+)18mE67-IRES2。然后用fcoM和Z/wI雙酶切該pCDNA3.1(+)18mE67-IRES2質粒，回收1471bp的小片段，并將其連入上述pCDNA3.1(+)16mE67-IRES2的fcoM和J力o/位點間，將產生的重組表達載體命名為pCDNA3.1(+)—Kozak16mE67-IRES2-18mE67-IRES2。將上述實施例2構建的HPV58mE67基因用P9、P12'為引物進行PCR擴增，PCR擴增產物經/力o1和雙酶切后，與用同樣酶切的載體pCDNA3.1(-)(Invitrogen公司)相連，產生重組質粒pCDNA3.1(-)58mE67，然后用順el和J力。1雙酶切上述pCDNA3.1(+)-Kozak16mE67-IRES2-18mE67-IRES2質粒，回收2915bp的小片段，并將其連入上述pCDNA3.1(-)58raE67的Mel和J力ol位點間，將產生的重組表達載體命名為-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。用煱el和iV"I雙酶切重組表達載體pCDNA3.1(-)16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67，得到3.7kb的融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。對該融合基因進行測序，測序結果表明，16raE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示。融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67中均去除了HPV16mE6、HPV18mE6和HPV58mE6的E6終止密碼子和HPV16mE7、HPV18raE7和HPV58raE7的E7起始密碼子，而保留了E6起始密碼子和E7終止密碼子。以上操作均按常規(guī)分子生物學操作規(guī)程及TakaraMutanBESTKit(Takara公司)說明進行。將重組表達載體pCDNA3.1(-)16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67經」奶el和他rt雙酶切后插入穿梭質粒pShuttle2(購自BD公司)的順el和船tl酶切位點間，得到重組表達載體pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58fflE67。將重組表達載體pShuttle2-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67用PI-SceI和I-CeuI雙酶切(NewEnglandLab公司)，酶切體系如下試劑體積PI-Sce1(1un帥l)2^aI-CeuI(5units/|il)0，重組表達載體pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67(500ng/nl)2|il10xDoubleDigestBuffer3jxllOxBSA3|ildH205(il總體積30jli1將酶切體系混勻后置37'C水浴中精確酶切3h，回收并純化酶切產物。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖3所示。其中，Ml為DL2000marker,泳道1為重組表達載體pShuttle2-16mE67-IRES2-18raE67-IRES2-58mE67酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，泳道4為空載體pShuttle2酶切后的瓊脂糖凝膠電泳結果，M2為DL15000marker。將回收的含有16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67的酶切產物用TakaraligationMixture連入Adeno-X表達系統(購自BD公司)中的Adeno-X病毒DNA中，置PCR儀中16。C連接過夜。將連接產物用Swal酶切消化(Swal酶切位點位于PI-SceI與I-CeuI之間)，以去除未能與Adeno-X病毒DNA連接的基因片段。再次回收酶切產物，將融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67與Adeno-X病毒DNA正確連接的重組腺病毒載體命名為Adeno-X-HPV16，18，58mE67。用重組腺病毒載體Adeno-X-HPV16,18,58mE67轉化大腸桿菌DH5ot，Amp抗性平板挑選陽性克隆，分別以表1中的P3和P4、P7和P8、PU和P12為引物進行PCR擴增，PCR檢測結果如圖4所示。其中，M為DL2000bp的DNA分子量標準，1為HPV16E7的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，2為HPV18E7的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，3為HPV58E7的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。提取重組腺病毒載體Adeno-X-HPV16，18，58mE67的DNA，將所得的重組質粒命名為pAdeno-X-HPV16，18,58mE67。對重組質粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67進行PCR擴增、酶切鑒定，將酶切鑒定正確的重組質粒送上海博亞測序。Pacl酶切pAdeno-X-HPV16，18，58mE67用于轉染HEK293細胞。實施例4、重組缺陷性腺病毒的制備與滴度的測定一、重組缺陷性腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67的制備用線性化后的重組質粒pAdeno-X-HPV16,18，58mE67轉染HEK293細胞，培養(yǎng)轉染后的細胞至細胞出現明顯的病態(tài)效應(cytopathiceffect,CPE)。轉染8天后，細胞的具體形態(tài)如圖5所示。其中，A為轉染重組質粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67的HEK293細胞的形態(tài)，B為正常HEK293細胞的形態(tài)。重組腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67的制備按照Adeno-XExpressionSystemUserManual進行，具體過程如下(1)用PBS洗滌上述出現明顯病態(tài)效應的HEK293細胞2次，直接將HEK293細胞吹打下來(不用胰酶)，1，500rpm室溫下離心5min;500^1PBS重懸細胞；(2)-20'C和37'C水浴反復凍融細胞3次，每次融化后短時間混勻細胞懸液；(3)12000rpm室溫離心10min，收集含病毒的上清，加入10%甘油，過濾除菌后作為重組病毒原液置-70'C凍存?zhèn)溆茫?4)培養(yǎng)服K293細胞，待細胞鋪滿瓶底50-70%時，加入步驟(3)制備的病毒原液250yl，繼續(xù)培養(yǎng)；(5)觀察細胞的病態(tài)效應，待50%以上的細胞從培養(yǎng)板底浮起時，重復上述(1)-(3)步驟制備重組腺病毒rAd-HPV16，18,58mE67，-2Q。C存放，以備測定病毒滴度或進一步制備高滴度病毒用。二、重組缺陷性腺病毒rAd-LacZ的制備將質粒pShuttle2-LacZ(購自BD公司)用PI-SceI和I-CeuI雙酶切，酶切產物與經同樣酶切的Adeno-X表達系統中的Adeno-X病毒DNA相連，將得到的重會且腺病毒載體命名為Adeno-X-LacZ。提取重組腺病毒載體Adeno-X-LacZ的DNA，將所得的重組質粒命名pAdeno-X-LacZ。用重組質粒pAdeno-X-LacZ轉染HEK293細胞，制備重組缺陷性腺病毒rAd-LacZ。重組缺陷性腺病毒rAd-LacZ制備的具體過禾呈同步驟一。三、重組腺病毒rAd-HPV16,18，58mE67的滴度測定因HEK293細胞能表達腺病毒活化的早期蛋白E1和E3，重組質粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67能夠在HEK293細胞中進行包裝并釋放到培養(yǎng)基中，用超高速離心機回收上述步驟一制備的重組腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67，然后用腺病毒滴定試劑盒測定重組腺病毒的滴度，滴度測定結果如圖6所示。其中，第1-10列為加入不同濃度重組腺病毒rAd-HPV16,18，58mE67的HEK293細胞，第11和12列為正常的HEK293細胞，灰色孔表示沒有產生CPE效應的細胞，CPE孔表示產生CPE效應的細胞。結果表明，病毒滴度為3.2Xl(^pfu/ml。四、熒光顯微鏡觀察重組質粒pAdeno-X-HPV16，18mE67-EGFP(其構建過程同pAdeno-X-HPV16，18，58mE67，用EGFP取代重組質粒pAdeno-X-HPV16，18,58mE67中的HPV58mE67基因)轉染HEK293細胞48h后開始，定時觀察HEK293細胞表達綠色熒光的情況，估算HPV58mE67的表達強度。400X顯微鏡下熒光檢測結果如圖7所示，結果表明HPV58mE67在HEK293細胞中能表達。五、Westernblot檢測用上述步驟三純化的感染復數(MOD為5:l的重組腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67感染COS-7細胞，一天后收集細胞，RIPA裂解細胞提取蛋白，分別以小鼠抗人HPV16，18E6單抗(購自Cheraicon公司)、HPV16E7單抗(購自Neomarker公司)、HPV18E7單抗(購自GeneTex公司)和HPV58單抗(購自SantaCruz公司)為一抗，Westernblot檢測HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的表達。Westernblot檢測結果如圖8所示。其中，泳道1、3、5和7表示未轉染腺病毒的C0S-7細胞的Westernblot檢測結果；泳道2、4、6和8分別表示轉染重組腺58mE67的C0S-7細胞用不同抗體檢測的Westernblot檢測結果。結果表明HPV16mE67和HPV18mE67有較高的表達，但HPV58mE67的表達量較HPV16mE67和HPV18mE67的表達量少，可能存在表達的極性問題。實施例6、動物試驗一、抑制腫瘤生長由于TC-1細胞(購自上?？蠌娚飪x器有限公司)能表達HPV16E6和HPV16E7蛋白，取小鼠在其后腿部上方皮下注射5W05個TC-1細胞，4天后形成腫瘤。小鼠的成瘤情況如圖9所示。其中，A為注射TC-1細胞的模型組小鼠，B為沒有注射TC-1細胞的對照組小鼠。將已成瘤的小鼠隨機分成PBS組、rAd-LacZ組和腺病毒治療組，每組10只小鼠，PBS組每只小鼠注射pH為7.4的PBS0.2ml，rAd-LacZ組每只小鼠注射l*106pfu的腺病毒rAd-LacZ0.2ml，腺病毒治療組每只小鼠注射l*106pfu實施例5制備的重組腺病毒rAd-HPV16,18，58mE670.2ml。每周免疫上述各組小鼠一次，連續(xù)兩周，每兩天用游標卡尺測量腫瘤的大小，按公式腫瘤的大小二長*寬*高*0.52計算腫瘤的大小。腫瘤體積的測量結果如圖IO所示所示。實驗設三次重復，圖IO中的數值為三次重復的平均值。結果表明，腺病毒治療組的小鼠腫瘤生長明顯被抑制。二、存活率實驗將按照上述步驟一制備的成瘤小鼠隨機分成PBS組、rAd-LacZ組和腺病毒治療組，每組10只小鼠，每周免疫一次，共免疫2次，各組的免疫原和免疫劑量均同步驟一。觀察各組小鼠的存活情況。各組小鼠存活率的測量結果如圖ll所示。實驗設三次重復，圖ll中的存活率為三次重復的平均值。結果表明，腺病毒治療組小鼠42天內的存活率為100%，而作為對照的PBS組和rAd-LacZ組小鼠存活的天數不超過32天。三、疫苗的作用機制研究將上述步驟一的成瘤小鼠隨機分成PBS組、rAd-LacZ組和腺病毒治療組，每組10只小鼠，每隔兩周免疫一次，共免疫3次，各組的免疫原和免疫劑量均同步驟一。六周后，處死小鼠取脾細胞作CTL反應。具體的實驗過程如下將各組小鼠脾的單細胞懸浮培養(yǎng)在RPMI1640(GIBCO/BRL)中，補充10%FCS、2mML-谷氨酰胺、lmM丙酮酸鈉(GIBCO/BRL)、50,2-巰基乙醇和504g/ral的硫酸慶大霉素(GIBCO/BRL)。用上述實施例1制備的1MMHPV16E7重新刺激脾細胞。一星期后分析各組細胞的裂解活性。以刺激的脾細胞作為效應細胞，以TC-l細胞作為靶細胞，將上述細胞以不同比例50:1、25:1和12.5:1混合，將混合細胞培養(yǎng)在96孔板中，37"條件下5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，然后用BeckmanG5-6R(BeckmanCoulterCanada,Mississauga,ON)以200xg離心5min。從每個孔收集100ul培養(yǎng)上清，用試劑盒檢測乳酸脫氫酶(LDH)的活性。乳酸脫氫酶活性的i十算公式為(LDHtest-LDHspont)/(LDHtotal-LDHspont)]x100。公式中LDHtest、LDHspont和LDHtotal分別代表試驗孔、自發(fā)釋放和最大釋放。實驗設三次重復，具體結果如圖12所示。結果表明，腺病毒治療組能產生強烈的CTL反應，腺病毒治療組的CTL反應比PBS組和rAd-LacZ組均高。序列表<歸8<210〉1<211〉777<212〉DNA<213〉人工序列<400>1atgcacc犯sagagaactgcaatgtttcaggacccacaggagcgacccagaaagttacc360catttatgcacagagctgcaaacaactatacatgatataatattagaatgtgtgtactgc120aagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgggatggttgcatagta180t3ta_ga_g3tgggaatccatatgcagtgtgtgataaatgtttaaeigttttattctaaaatt240agtgagtatagatattattgttatagtgtgtatggaacaacattagaacagc犯tacaac300aaaccgttgtgtgatttgttaattaggggtattaactgtcaaaagccactgtgtcctgaa360gaaaagcaaaga^cgitctggacaaaaagceiaagattccataa^t肪ggggtcggtggacc420ggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacccgtagagaaacccagCtgEL8LgCtt480atgcatgg3geLtacscctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaact540gatggctactgttatgagcaattaaa/tgacagctcagaggaggaagatgaaatagatggt600ccagctggacaagcag朋ccgg3C3gsgcccatta_caM￡ittgtaaccttttg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型重組腺病毒，其特征在于所述復制缺陷型重組腺病毒是用Adeno-X表達系統制備的。10、人宮頸癌的一種治療性疫苗，它的活性成分是權利8或9所述的復制缺陷型重組腺病毒。全文摘要本發(fā)明公開了人宮頸癌的一種治療性疫苗。該疫苗的活性成分是重組腺病毒；所述重組腺病毒按照如下方法制備將包括HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67以及連接三者的短核苷酸片段的轉錄融合三基因片段插入Adeno-X表達系統的病毒DNA中得到重組腺病毒載體，再將該重組腺病毒載體導入細胞中得到重組腺病毒。動物試驗結果表明，該疫苗能在細胞中表達，用純化的腺病毒顆粒直接免疫動物，對已形成的腫瘤有明顯的治療效果，其作用機制主要由于該疫苗能在動物體內產生強烈的CTL反應。本發(fā)明的疫苗可以用于治療由HPV感染所致的腫瘤。文檔編號A61K39/12GK101280316SQ20081011276公開日2008年10月8日申請日期2008年5月26日優(yōu)先權日2008年5月26日發(fā)明者駿萬,楊崢嶸,義鄭,馬原棟,黃來強申請人:清華大學深圳研究生院