專利名稱：法舒地爾誘導(dǎo)成年腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及法舒地爾用于誘導(dǎo)成年腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生的用途，特別地，涉及法舒 地爾用于保護(hù)神經(jīng)損傷和治療與神經(jīng)元損傷和死亡相關(guān)的疾病的用途。
背景技術(shù)：
法舒地爾為異喹啉磺胺衍生物，化學(xué)名稱為六氫-l-(5-異喹啉磺酰基)-lH-l,4-二氮雜卓或 l-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪，英文名稱為Fasudil，分子式為C,4HnN302S。其常用鹽有鹽酸鹽、 硝酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽，法舒地爾鹽酸鹽是最通常使用的一種鹽。2002年，法舒地爾在 中國上市，適應(yīng)癥為蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣等引起的缺血性腦血管疾病癥狀的改善。 腦內(nèi)的血管破裂出血后血液流入蛛網(wǎng)膜下腔，稱為蛛網(wǎng)膜下腔出血，其為出血性腦血管病的 一個(gè)類型，分原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。頭痛、嘔吐和頸項(xiàng)強(qiáng)直是蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要癥狀。 腦血管痙攣是指動(dòng)脈在一段時(shí)間內(nèi)的異常收縮狀態(tài)，常見于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的蛛網(wǎng)膜下腔出 血病人。腦血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血的致殘與死亡的主要原因。已經(jīng)表明法舒地爾為一種 新型、高效的血管擴(kuò)張藥(其為一種蛋白激酶抑制劑，即細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑)，能有效緩解 腦血管痙攣，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后引起的腦血管痙攣。目前已有許多臨床報(bào)告證實(shí)鹽酸法 舒地爾治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后引起的腦血管痙攣的有效性和安全性。
已有體內(nèi)試驗(yàn)研究了鹽酸法舒地爾藥代動(dòng)力學(xué)和代謝活性產(chǎn)物。鹽酸法舒地爾進(jìn)入體內(nèi) 很快轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗤钚缘拇x產(chǎn)物一羥基法舒地爾(hydroxyfasudil)，其濃度可達(dá)母藥的86 %，并具有較長的半衰期(鹽酸法舒地爾半衰期0.78小時(shí)，而羥基法舒地爾半衰期4.66小時(shí))。 羥基法舒地爾的12小時(shí)峰谷值為0.077 nM，并且具有與鹽酸法舒地爾相同的生物活性，可 在有效濃度范圍內(nèi)(0.025 —1.6 pM)抑制Rho激酶。
腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、帕金森病、視網(wǎng)膜疾病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病在其發(fā)生和發(fā) 展過程中會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡。對(duì)于這組疾病，人們一直都在積極地尋求有效的治療 藥物。過去20年來，人們研究和觀察了大量的神經(jīng)保護(hù)劑，試圖可以預(yù)防和治療這些神經(jīng)系 統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括鈣通道拮抗劑、自由基清除劑、谷氨酸拮抗劑、細(xì)胞膜穩(wěn)定劑和 神經(jīng)營養(yǎng)因子等，但由于腦損傷后多種因素同時(shí)或先后參與了神經(jīng)元的損傷與死亡，單純作 用于單個(gè)耙點(diǎn)的藥物難以取得令人滿意的療效，上述神經(jīng)保護(hù)劑的臨床治療效果并不理想。神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生修復(fù)問題一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。隨著神經(jīng)干細(xì)胞研究 不斷深入，人們嘗試?yán)蒙窠?jīng)干細(xì)胞修復(fù)受損神經(jīng)元成為近年來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之 一。祌經(jīng)干細(xì)胞在修復(fù)受損神經(jīng)組織中發(fā)揮重要作用，是修復(fù)和代替受損組織的有效方法， 能夠重建部分環(huán)路和功能。目前，研究較廣泛的移植物主要還是胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。 但因來源有限、倫理障礙及免疫排斥等問題，這些細(xì)胞的實(shí)用性受到極大限制。近來研究表 明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。但是，骨髓源細(xì)胞如骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞有較高的病毒感染危險(xiǎn)，且隨著其來源個(gè)體的年齡增長其細(xì)胞數(shù)量和增殖、分 化能力也顯著下降，較難滿足臨床的需求。
1992年，Reynolds等首先從成年鼠紋狀體中分離出神經(jīng)干細(xì)胞，從而突破了成年組織不 可再生的觀點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)充分證明成年神經(jīng)千細(xì)胞產(chǎn)生的新生祌經(jīng)元不僅在形態(tài)上與成熟神經(jīng) 元相同，而且對(duì)突觸刺激有動(dòng)作電位反應(yīng)，并且可以有效地整合到神經(jīng)環(huán)路中，從而為臨床 應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)，為我們利用成年神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行腦修復(fù)治療指明了一個(gè)方向。 但是，到目前為止，該研究領(lǐng)域仍然沒有找到一種能夠有效地在體內(nèi)作用于成年神經(jīng)干細(xì)胞， 誘導(dǎo)其再生，從而修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞以達(dá)到治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。因此，尋找一種能夠 自由通過血腦屏障的、相對(duì)穩(wěn)定的、可以誘導(dǎo)內(nèi)源性成年腦神經(jīng)干細(xì)胞再生的物質(zhì)一直是人 們努力尋找的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過長期認(rèn)真地研究，出人意料地發(fā)現(xiàn)法舒地爾還具有神經(jīng)保護(hù)功能和具有促 進(jìn)成年腦神經(jīng)干細(xì)胞分化、誘導(dǎo)成年腦神經(jīng)干細(xì)胞再生的功能，從而完成了本發(fā)明。 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供法舒地爾保護(hù)神經(jīng)功能的用途。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供法舒地爾誘導(dǎo)成年腦神經(jīng)干細(xì)胞再生的用途，即誘導(dǎo)成年腦內(nèi) 源性神經(jīng)干細(xì)胞的用途。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供法舒地爾治療與神經(jīng)元損傷和死亡相關(guān)的疾病的用途，即治 療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的用途。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供法舒地爾在制備用于誘導(dǎo)成年腦神經(jīng)干細(xì)胞再生的藥物中的用 途。特別地，本發(fā)明提供法舒地爾在制備用作神經(jīng)保護(hù)劑的藥物中的用途。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供法舒地爾在制備用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
在還一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的 法舒地爾或鹽酸法舒地爾。本發(fā)明所述的法舒地爾，包括其鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、甲磺酸 鹽、檸檬酸鹽等藥學(xué)上可接受的鹽形式，其可以為任意形式，包括結(jié)晶形式(包括帶有結(jié)晶水 的和不帶有結(jié)晶水的)、水合物形式等藥學(xué)上可接受的形式，優(yōu)選法舒地爾鹽酸鹽。這些鹽及 不同的形式可以按照本領(lǐng)域熟知的方法制備。
本發(fā)明所述的有效量為法舒地爾在用于神經(jīng)保護(hù)或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中所可能產(chǎn)生醫(yī)學(xué) 上認(rèn)可的功效的量。本發(fā)明人經(jīng)多次研究發(fā)現(xiàn)，適于誘導(dǎo)成年腦神經(jīng)干細(xì)胞再生，即適于可 能治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的法舒地爾的有效量為0.5-8mg/kg，優(yōu)選l-6mg/kg,更優(yōu)選3-5mg/kg， 最優(yōu)選5mg/kg。對(duì)于上述法舒地爾的各種鹽及包含法舒地爾的藥物組合物的用量，以相當(dāng)于 能提供上述法舒地爾有效量的相應(yīng)法舒地爾鹽的量即為相應(yīng)鹽的有效量。
本發(fā)明所述的與神經(jīng)元損傷和死亡相關(guān)的疾病，即所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括，但不限于腦 缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、視網(wǎng)膜疾病等。
可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，將木發(fā)明所述的法舒地爾或包含有效量的法舒地爾的 藥物組合物制成適于給藥的任何劑型，包括但不限于腸道給藥制劑或非腸道給藥制劑，例如 片劑、膠囊、口服液、注射劑、粉針劑等，優(yōu)選注射劑，更優(yōu)選靜脈注射劑。
本發(fā)明所述制劑的給藥途徑可以是本領(lǐng)域已知的任何給藥途徑，優(yōu)選腹腔注射。
本發(fā)明所述制劑可以每天給藥3次，每次給藥量為法舒地爾可以治療所述疾病的有效量， 即上述給出的有效量。
應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本發(fā)明中提及但沒有詳細(xì)說明的方法、步驟、裝置、儀器、材料等，普 通技術(shù)人員可以采用本領(lǐng)域熟知的相應(yīng)方法、步驟、裝置、儀器、材料等，或者按照本領(lǐng)域 的常規(guī)知識(shí)和技術(shù)獲得。


圖1為顯示體外原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元MAP — 2和HOCHEST雙染色圖。紅色為MAP-2神經(jīng) 元，而藍(lán)色為HOCHEST核染色，用以檢驗(yàn)本研究所用祌經(jīng)元的形態(tài)和純度。
圖2為顯示小鼠在正常氧和腦缺氧(8%氧)6小時(shí)后，復(fù)氧72小時(shí)后海馬不同部位神經(jīng) 元染色圖。CA1、 CA2和CA3分別為海馬CA1、 CA2和CA3區(qū)。
圖3為顯示小鼠在腦缺氧(8%氧)不同時(shí)間腦組織勻漿后免疫印染法測(cè)定Rho激酶的亞型 RockII蛋白的表達(dá)的圖。
圖4為顯示小鼠在腦缺氧不同的時(shí)間腦組織切片免疫組化染色Rho激酶的亞型ROCK II 的表達(dá)的圖，紅黃箭頭均為綠色熒光的ROCK II表達(dá)。圖5為顯示小鼠腦缺氧(8%) 6小時(shí)后注射生理鹽水和法舒地爾(mg/kg) ， 24小時(shí)后側(cè)腦 室下區(qū)(SVZ)后角(A和B)，前角(C和D)和海馬DG區(qū)(E和F) Brdu陽性細(xì)胞數(shù)的圖。
圖6為顯示小鼠腦缺氧(8%)6小時(shí)后注射法舒地爾，24小時(shí)后側(cè)腦室下區(qū)(SVZ)后角 DCX和Brdu雙陽性細(xì)胞數(shù)的圖。A)紅色為Brdu陽性，細(xì)胞，B)綠色為DCX染色，C)二種 顏色的重疊。重疊復(fù)染細(xì)胞為增生的神經(jīng)千細(xì)胞。
圖7為顯示生理鹽水組和法舒地爾組的小鼠腦組織勻漿上清液G-CSF和VEGF的濃度水 平圖。采用進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒測(cè)定。
圖8為顯示體外原代神經(jīng)元培養(yǎng)后和PBS對(duì)照的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)的圖。
圖9為顯示法舒地爾抑制缺氧后祌經(jīng)元死亡而導(dǎo)致培養(yǎng)上清液LDH釋放減少和PI陽性 細(xì)胞數(shù)減少的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將結(jié)合下述試驗(yàn)例或?qū)嵤├鲞M(jìn)一歩詳細(xì)闡述，但應(yīng)當(dāng)理解，下述實(shí)施例僅僅用 于闡述和解釋本發(fā)明，而并不限制本發(fā)明的范圍。
試驗(yàn)例l:法舒地爾體外促進(jìn)腦神經(jīng)干細(xì)胞增生試驗(yàn)
1. 試驗(yàn)細(xì)胞及其制備
將孕17—18天KM孕鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。脫頸法處死孕鼠， 75%酒精消毒皮膚。在無菌條件下剝出胎鼠，置于冰預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液中。仔細(xì)分離胎鼠 腦組織，剝除腦膜及血管，去除小腦、腦干和基底節(jié)，取出海馬組織，置于冰預(yù)冷的DMEM 中輕輕吹打，使其形成單細(xì)胞懸浮液。收集細(xì)胞懸液，在4oC下，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分 鐘。棄去上清液，用新鮮配制的神經(jīng)元培養(yǎng)液重新懸浮。計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞懸液中細(xì)胞的 密度。以2><105/0112種植在多聚賴氨酸包被的玻片上，在37。C下、5%(:02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，7 天后更換l/2培養(yǎng)液。14天后進(jìn)行神經(jīng)元特異性標(biāo)記微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)染色鑒定，同 時(shí)用熒光染色劑HOCHEST33342標(biāo)記細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀測(cè)結(jié)果(見圖1)。 MAP—2陽 性細(xì)胞為紅色，提示為神經(jīng)元，藍(lán)色為細(xì)胞核。鑒定后的神經(jīng)元細(xì)胞供建立缺糖缺氧損傷 (oxygen-glucose deprivation, OGD)模型。
2. 缺糖缺氧細(xì)胞損傷模型
'無糖型DMEM培養(yǎng)液，用前通入5%<:02、 10%H2、 85%>42混合氣體飽和15min，去處
培養(yǎng)液中的氧氣，制備缺糖缺氧神經(jīng)元培養(yǎng)液。取培養(yǎng)10天左右，生長良好的神經(jīng)元，棄去培養(yǎng)液，用PBS液沖洗3次，加入無糖型DMEM培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，向 箱內(nèi)通入5%<:02、 10%H2、 85XN2混合氣體，將培養(yǎng)箱密封保持37°C，并使箱內(nèi)氧濃度低 于1%。在一定缺氧時(shí)間(例如6小曰寸)后將培養(yǎng)板取出，吸除無糖培養(yǎng)液，分別加入原神經(jīng) 元培養(yǎng)液，放置于37'C、 5%C02和95%空氣的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
3. 給藥
隨后，給藥缺糖缺氧神經(jīng)元法舒地爾注射液(母藥濃度為30mg/2ml=15mg/ml)。實(shí)驗(yàn)濃 度設(shè)定為高，中和低三個(gè)濃度，分別為l ^tg/ml， 10 pg/ml和100 ng/ml。分別在當(dāng)天、第 2天和第3天分三次加入。第5天收集細(xì)胞和上清液做進(jìn)一步檢測(cè)用。
4. 對(duì)照試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛_定后，采用加入相同體積的PBS代替法舒地爾注射液，在完全相同的實(shí)驗(yàn) 條件下作為法舒地爾的對(duì)照。正常氧狀態(tài)下培養(yǎng)的細(xì)胞作為缺氧細(xì)胞的基線。
5. 神經(jīng)元BrdU檢測(cè)
加入法舒地爾第3天后，分別在第3和第4天加Brdu (1 ug/ml)。第5天收集細(xì)胞PBS 漂洗細(xì)胞10minX2次，4%多聚甲醛室溫固定20min， 1 XPBS漂洗細(xì)胞10minX2次，3%羊 血清室溫封閉15min。 BrdU—抗(l: 200)稀釋于含1 %羊血清PBS中，4°C，過夜。羊抗小鼠 CY3標(biāo)記二抗(l: IOO)稀釋于PBS中，室溫避光1小時(shí)。1XPBS漂洗細(xì)胞5minX3次，50 %甘油封片，熒光顯微鏡下觀測(cè)結(jié)果。
6. 結(jié)果和分析
圖8顯示比較PBS組，加入法舒地爾組神經(jīng)元形成較為明顯的神經(jīng)球。Brdu陽性的增生 神經(jīng)元細(xì)胞明顯多于PBS對(duì)照組。結(jié)果清楚地表明法舒地爾可在體外促進(jìn)腦神經(jīng)干細(xì)胞增生。 多次試驗(yàn)得到相同的結(jié)果。
試驗(yàn)例2:法舒地爾體內(nèi)促進(jìn)腦神經(jīng)干細(xì)胞增生試驗(yàn)
1. 試驗(yàn)動(dòng)物
KM小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。動(dòng)物到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后給與清潔級(jí) 飼養(yǎng)，自由飲食和飲7]C，靜養(yǎng)5 — 7天。
2. 小鼠缺氧模型
將32只小鼠分成4組，每組8只，在缺氧系統(tǒng)中給予8%氧氣+92%氮?dú)饣旌蠚怏w中分 別缺氧2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)。在缺氧箱中放置缺氧儀，動(dòng)態(tài)檢測(cè)缺氧箱中氧濃度保證小鼠缺氧程度的可控性。箱體可容納30 — 40只小鼠，將32只小鼠一次放入可以保證缺 氧條件的可比性。復(fù)氧72小時(shí)后生理鹽水灌注，取腦液氮速凍后一8(TC保存，待免疫印染和 免疫組化時(shí)腦組織切片后，海馬神經(jīng)元和ROCK II染色。
3. 給藥
法舒地爾注射液，母藥濃度為30mg/2ml = 15mg/ml。依據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，體內(nèi)試驗(yàn)濃 度設(shè)定為小鼠在缺氧系統(tǒng)中缺氧6小時(shí)后腹腔注射鹽酸法舒地爾(5 mg/kg)和Brdu(50 mg/kg)， 24小時(shí)后再重復(fù)注射一次；對(duì)照組注射相同體積生理鹽水和Brdu。法舒地爾組8只 鼠，而生理鹽水對(duì)照組7只鼠。復(fù)氧24小時(shí)后生理鹽水灌注，取腦液氮速凍后一80'C保存， 待免疫印染和免疫組化時(shí)腦組織切片后，進(jìn)行Brdu和DCX染色。
4. 對(duì)照試驗(yàn)
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷耐瑫r(shí)，采用注射相同體積的生理鹽水代替法舒地爾注射液，在完全相同 的實(shí)驗(yàn)條件下作為法舒地爾的對(duì)照。另外設(shè)定正常氧動(dòng)物8只在完全相同的條件下進(jìn)行作為 對(duì)照。
5. 免疫印染測(cè)定
經(jīng)10% SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上15-30 min，轉(zhuǎn)移后的硝酸 纖維膜置于麗春紅染色液中顯色，標(biāo)記蛋白質(zhì)Marker及譜帶位置后，轉(zhuǎn)移緩沖液洗至脫色。 封閉硝酸纖維膜置于膜封閉液中，搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉lh?？筊OCKII抗體用5。/o的 小牛血清稀釋(l: 500)4。C過夜。采用二抗1: 1000稀釋，室溫孵育lh。用化學(xué)發(fā)光法顯色， X光片顯影。免疫印跡的圖譜由數(shù)碼相機(jī)拍照,經(jīng)Image-pro Plus 5.0圖像處理軟件，以(3-actin 為內(nèi)參。
6. 免疫組化測(cè)定
小鼠斷頭后沿中線切開頭皮并沿矢狀縫剪開顱骨，取出大腦，浸入20。/。庶糖中4。C脫水， 沉底后再置于30Q/。蔗糖中4。C脫水至組織下沉。用濾紙吸干腦組織表面的蔗糖溶液，用OCT 在液氮中包埋，以8pm的厚度作冠狀位冰凍連續(xù)切片，按照先后順序存放備用。免疫熒光染 色用5%羊血清室溫下封閉10min， 一抗4'C孵育24小時(shí)后，熒光燃料488標(biāo)記的二抗室溫 避光作用l小時(shí)，lxPBS洗滌5minx3次后，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
7. 結(jié)果和分析
結(jié)果顯示我們建立的缺氧模型可以引起海馬不同區(qū)域，特別是CA1和CA2區(qū)內(nèi)神經(jīng)元的 丟失(參見圖2)。用免疫印染和免疫組化的方法證明腦缺氧6小時(shí)后R0CK n的表達(dá)增加，為使用Rho激酶抑制劑提供了依據(jù)(圖3和圖4)。結(jié)果表明缺氧后注射法舒地爾可以明顯增 加腦SVZ區(qū)前角和后角位置Brdu陽性的細(xì)胞再生(圖5)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這些Brdu陽性 的增生細(xì)胞同時(shí)表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志DCX(圖6)，說明法舒地爾誘導(dǎo)的SVZ區(qū)增生細(xì)胞是神經(jīng) 干細(xì)胞。
試驗(yàn)例3:法舒地爾對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用
1. 試驗(yàn)細(xì)胞
同試驗(yàn)例1的1.試驗(yàn)細(xì)胞及其制備中所述的方法制備試驗(yàn)細(xì)胞。
2. 缺糖缺氧損傷模型
同試驗(yàn)例1的2.缺糖缺氧損傷模型所述的方法制備缺糖缺氧損傷模型。
3. 給藥
根據(jù)試驗(yàn)例1中法舒地爾不同濃度比較預(yù)實(shí)驗(yàn)，在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了中間的濃度， 即10ng/ml。其余與試驗(yàn)例1中完全相同。
4. 對(duì)照試驗(yàn)
試驗(yàn)?zāi)Ｐ痛_定后，采用加入相同體積的PBS在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下作為法舒地爾的對(duì)照。
5. 細(xì)胞LDH釋放率測(cè)定
為確定給予神經(jīng)元不同時(shí)間處理后，在不同的復(fù)糖復(fù)氧的時(shí)間內(nèi)神經(jīng)元損傷的情況，通 過測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)細(xì)胞損傷的程度。神經(jīng)元受到損傷后細(xì)胞內(nèi)的LDH將釋放到細(xì) 胞培養(yǎng)液內(nèi)。因而檢測(cè)損傷后細(xì)胞上清液內(nèi)的LDH值，反應(yīng)了細(xì)胞受損情況。將正常細(xì)胞給 予反復(fù)凍溶，其上清液內(nèi)為全部細(xì)胞死亡后釋放的LDH量。將所檢測(cè)的細(xì)胞上清液LDH值 與細(xì)胞完全死亡總釋放的LDH值相比，得到細(xì)胞LDH釋放率。LDH測(cè)定依據(jù)試劑盒說明書 操作。在酶標(biāo)儀上波長490nm檢測(cè)每孔的OD值。細(xì)胞LDH釋放率以檢測(cè)組OD值/細(xì)胞 總釋放的OD值X100X來表示。
6. PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)
碘化丙啶(propidine iodide， PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中 晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI 陽性細(xì)胞代表死亡神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)。
7. 結(jié)果和分析
9圖9顯示用LDH試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)法舒地爾處理可以減少神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH濃 度(p〈0. 05)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)法舒地爾處理可以減少PI細(xì)胞數(shù)(P〈0. 01)。我們采用不 同的方法(LDH釋放和流式細(xì)胞儀檢測(cè))均證實(shí)法舒地爾可以保護(hù)缺氧后神經(jīng)元的損傷。
試驗(yàn)例4:法舒地爾誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的作用機(jī)理
1. 試驗(yàn)動(dòng)物
同試驗(yàn)例2的1.試驗(yàn)細(xì)胞及其制備中所述的方法制備試驗(yàn)細(xì)胞。
2. 小鼠缺氧模型
16只小鼠分別在缺氧系統(tǒng)中給予8%氧氣+ 92%氮?dú)饣旌蠚怏w中分別缺氧6小時(shí)。在缺 氧箱中放置缺氧儀，動(dòng)態(tài)檢測(cè)缺氧箱中氧濃度，保證小鼠缺氧程度的可控性。法舒地爾組和 生理鹽水組分別為8只。
3. 給藥
法舒地爾注射液(母藥濃度為3()〖iiK/2ml = 15iTig/ml)。依據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，體內(nèi)試驗(yàn)濃 度設(shè)定為小鼠在缺氧系統(tǒng)中缺氧6小時(shí)后腹腔注射鹽酸法舒地爾(5 mg/kg)和Brdu (50 mg/kg)， 24小時(shí)后再重復(fù)注射一次，對(duì)照組注射相同體積生理鹽水和Brdu。法舒地爾組8只 鼠，生理鹽水對(duì)照組8只鼠。復(fù)氧24小時(shí)后生理鹽水灌注，取腦液氮速凍后一80'C保存，進(jìn) 行腦組織勻漿上清液細(xì)胞因子測(cè)定。
4. 對(duì)照試驗(yàn)
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷耐瑫r(shí)，采用注射相同體積的生理鹽水在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下作為法舒 地爾的對(duì)照。
5. 細(xì)胞因子測(cè)定
為進(jìn)一步深入研究法舒地爾誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞分子機(jī)理，我們采用商售的試 劑盒檢測(cè)腦組織勻漿上清液中G-CSF和VEGF濃度。檢測(cè)步驟參照說明書。
6. 結(jié)果和分析
試驗(yàn)結(jié)果顯示缺氧后法舒地爾處理顯著地增加了腦組織中G-CSF的濃度(pO.Ol)，而減 少了 VEGF的水平(p0.05)(參見圖7)。大量實(shí)驗(yàn)己經(jīng)證明G-CSF可以誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì) 胞動(dòng)員，表明法舒地爾誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)T細(xì)胞可能與G-CSF增加和VEGF減少有關(guān)。
權(quán)利要求
1.法舒地爾在制備用于誘導(dǎo)成年腦神經(jīng)干細(xì)胞再生的藥物中的用途。
2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述成年腦神經(jīng)干細(xì)胞為腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞。
3. 法舒地爾在制備用于保護(hù)神經(jīng)功能的藥物即神經(jīng)保護(hù)劑中的用途。
4. 法舒地爾在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
5. 權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述法舒地爾選自法舒地爾鹽酸鹽、硝酸鹽、硫 酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、甲磺酸鹽或檸檬酸鹽。
6. 權(quán)利要求5的用途，其中所述法舒地爾為法舒地爾鹽酸鹽。
7. 權(quán)利要求4或6的用途，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、 帕金森病、癡呆或視網(wǎng)膜疾病。
8. 權(quán)利要求5的用途，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、帕 金森病、癡呆或視網(wǎng)膜疾病。
9. 權(quán)利要求7的用途，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自腦缺血或腦損傷。
全文摘要
本發(fā)明公開了法舒地爾及包含法舒地爾的藥物組合物用于誘導(dǎo)成年腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生的用途，特別地，本發(fā)明公開了法舒地爾用于保護(hù)神經(jīng)損傷和治療與神經(jīng)元損傷和死亡相關(guān)的疾病的用途。
文檔編號(hào)A61K31/551GK101612157SQ20081012635
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者晶 丁, 呂傳真, 姚小青, 孫長海, 肖保國 申請(qǐng)人:天津紅日藥業(yè)股份有限公司