專利名稱：：富含原花色素的提取物和相關制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及包含高含量原花色素的提取物和使用富含原花色素的壓
背景技術：
：原花色素，即縮合的鞣酸是廣泛存在的，并且是最豐富的自然酚衍生物之一。原花色素是包含通過C4-C8或C4-C6鍵相連的黃烷-3-醇的重復單元的寡聚物和聚合物的混合物。黃烷-3-醇單元可能還通過C2-07(A型)間另外的雙鍵雙連接。原花色素的大小通過聚合程度(DP)來確定。原花色素中最常見的黃烷-3-醇是阿夫兒茶素(Afzalechin)、表阿夫兒茶素(印iafzalechin)、兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素。完全由兒茶素和表兒茶素構成的原花色素稱為原花青定(procyanidin),其中天竺葵定(propelargonidin)和原翠雀定(prodelphinidin)。原花青定在自然中是最豐富的。在文獻中報道的原花色素的生物活性包括抗癌，抗炎癥，抗衰老，抗氧化，抗過敏，抗菌特別是泌尿道的，促進頭發(fā)生長等(BartSchwitters/JackMasquelier"21stcenturyBiophylaxissubstanceOPC"，F(xiàn)ragranceJournal,50-135(1997),;TomoyaTakajashietal.，Journalofinverstigativedermatology112(310.316(1999)))。已有很多方法用來從植物或不同來源的水果如酸果蔓(&cc/"/wwwacrac^7o")、葡萄籽、茶葉、花生、松樹皮制備富含原花色素的提取物。這些方法中一些包括利用無機酸存在下以含水醇性溶劑進行的提取步驟，比如CN1454896中方法，或者它們包括如在CN174923中公開的超臨界的溶劑如C02的使用，或者它們需要使用超濾膜或包括在JP63267774方法中公開的反向滲透過濾。其它方法需要多步提取步驟的結合，使用要么單獨要么彼此結合的幾種有機溶劑，與至少一步結合，在其中包含提取物的溶液#:吸附到大網(wǎng)絡的多聚樹脂上，吸附的液體隨后如在US6608102、US6,440,471中描述的方法來洗脫、濃縮并霧化。根據(jù)其它的方法，可能獲得含有很高含量原花色素的提取物。如利用CA2539724中公開的方法可能獲得從80%到90%的總原花色素含量和其中寡聚物原花色素(OPC)含量從23%到45%的提取物，其中CA2539724包括利用至少兩種的吸附樹脂處理像松樹皮或提取物或其汁液的植物，其中兩種樹脂在至少一個下列特點方面不同，即材料種類、孔徑、特定的表面面積和分子質量分布范圍，或利用在EP1602653中公開的方法可能獲得具有乂人67%到85%的總原花色素含量和從12.5%到51%的OPC含量的4是耳又物，所述EP1602653包括使一種4是取物或壓榨出的4直物汁液與一種鹽或生物堿處理和合成吸附樹脂處理相結合。盡管能獲得具有高滴度的原花色素的現(xiàn)有技術方法有很多，商業(yè)可獲得的提取物具有不超過7%的原花色素滴度。所以這意味制備具有高滴度的原花色素提取物的現(xiàn)有技術方法并不容易在工業(yè)化規(guī)模上實現(xiàn)，因為很多原因，如毒性提取物的使用，溶劑或長時間(大約24h)的極端提取溫度(大約100°C)，在加壓儀器下如超臨界的液體下的使用，或超濾膜的使用。因此需要有一種不受現(xiàn)有技術方法缺點影響的高原花色素滴度的提取物的制備方法，而且因此可以容易的在工業(yè)化規(guī)模上可實現(xiàn)。
發(fā)明內容本申請創(chuàng)立了一種在工業(yè)化規(guī)^莫上可容易實現(xiàn)的方法，能夠獲得具有高滴度的原花色素的提取物。這個方法能夠獲得富含原花色素的提取物，起始于已經(jīng)預純化的富含原花色素的提取物或水果或植物，并包括以下的步驟a)在室溫以乙醇含量為以體積計50%到80%的含水乙醇提取包含高含量原花色素的壓碎的水果或植物或已經(jīng)預純化的富含原花色素的提取物，b)過濾來自步驟(a)的混合物，c)在真空下濃縮過濾的來自步驟(b)的溶液，d)在從5到24小時的時間范圍內，任選的存貯來自步驟(c)的濃縮的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物預先任選的用去離子水稀釋，e)用去離子水稀釋來自步驟(c)的濃縮存貯產(chǎn)物，如果用水稀釋在步驟(d)中沒有進行，則用去離子水稀釋來自步驟(d)的濃縮存貯產(chǎn)物，f)過濾來自步驟(e)中的混合物，g)將溶液上樣在大網(wǎng)絡的脂肪族交聯(lián)聚合樹脂上，h)用水沖洗所述樹脂，i)用具有乙醇含量為以體積計50%到80%的含水乙醇洗脫來自步驟(h)的大網(wǎng)絡的脂肪族交聯(lián)聚合樹脂，j)在真空下濃縮來自前一步驟的洗脫溶液，k)真空干燥或噴霧干燥來自步驟(j)的濃縮產(chǎn)物。本方法允許包含超過10%的原花色素的提取物，優(yōu)選的超過15%,更優(yōu)選的超過20%,通過利用通過含水乙醇的溫和的^是取條件和同時在解吸附步驟使用像含水乙醇的非毒性溶劑的僅一種利用大網(wǎng)絡的聚合樹脂吸附法。圖1記錄了HPLC層析，圖2用每個峰的mg/ml表示的保留時間、面積、相應的濃度，和最后在實施例1中描述制備的分析樣品的終濃度。具體實施例方式本發(fā)明的富含原花色素的水果或植物，我們指如酸杲蔓、蘋果、黑莓、葡萄、李子、石榴、覆盆子、草莓、蠶豆、扁豆、茶。^f尤選的才艮才居本發(fā)明的方法，酉臾果蔓(vacc/"/w柳柳(3crac^po")用^乍起始材料。在步驟(a)中提取溶劑優(yōu)選具有以體積計從60%到75%的乙醇濃度，更優(yōu)選的70%。提取時間優(yōu)選的在10分鐘到2小時間，更優(yōu)選的30分鐘。當在步驟(a)中壓碎的水果或植物用作起始材料，根據(jù)本發(fā)明的方法包括進一步的步驟，其中來自提取步驟(a)所述的壓碎的水果或植物在進行步驟(b)利用含水乙醇的過濾前被壓榨。步驟(d)是任選的步驟，不管怎樣，當進行此步驟時，存貯時間優(yōu)選地為8小時至20小時，更優(yōu)選地15小時。利用去離子水沖洗包括吸附的溶液的樹脂，即進行本發(fā)明方法的步驟(h)是為了去除糖和酚酸。如果水果也富含花色素，本方法在利用水沖洗的步驟后可能包括進一步的沖洗步驟，以具有乙醇含量為60%(體積/體積)的含水乙醇來去除樹脂中的花色素。在步驟(i)洗脫溶劑的濃度，即含水乙醇具有以體積計從60到75%的乙醇濃度，更優(yōu)選的以體積計70%。在所述步驟中使用的大網(wǎng)絡的脂肪族的交聯(lián)樹脂可選自已知的和商業(yè)可獲得的。步驟(j)優(yōu)選地在真空下包括35到45。C間，更優(yōu)選地在40。C的溫度下實行。本申請也優(yōu)化了在最終提取物中利用HPLC確定原花色素的滴度的分析方法。本方法包括兩步單獨的步驟1.待分析的提取物的純化2.分析。步驟l:待分析的提取物的純化葡聚糖凝膠LH20柱的制備10g的葡聚糖凝膠LH20用去離子水(約50ml)在至少3小時后膨脹，然后導入PharmaciaBiotech出售的C16玻璃柱。樹脂用約130ml的去離子水沖洗。待上樣到葡聚糖凝膠LH20樹脂的溶液的制備為了獲得上樣到柱上的在X=280nm處吸收的化合物的主旨(tenor)通常大約相同，進行分光光度計測量。4是耳又物或溶液在20%的曱醇中稀釋來獲得在X=280nm從32到48的吸收值(或在1/50ABS^.8土20。/。處稀釋之后)。在葡聚糖凝膠LH20上的純化用20%的甲醇稀釋吸收值包括在前述范圍內的溶液，在4000rpm下離心15min。20ml慢慢倒出的這種溶液被上樣到上述的樹脂并且進行后面三步洗脫洗脫1，80ml20。/o的曱醇，洗脫2，160ml60。/o的曱醇，洗脫3,240ml100%的曱醇，這些洗脫溶液在約2ml/min的流速下操:作。來自洗脫1和洗脫2的洗脫溶液被舍棄。來自洗脫3的第一個20到30ml溶液被舍棄，然后收集剩余的洗脫溶液。溶劑通過從洗脫溶液的蒸發(fā)來去除，并且干燥獲得的殘留物。干燥的掮j又物為了通過HPLC來分析在具有以體積計79:29.5:0.5的丙酮/水/醋酸混合物中被稀釋，為了獲得包括在1到1.7ml間的終濃度，該體積用V,表示。2.HPLC分析校正表用于原花色素分析的標準品是原花青定B2(表兒茶素鄰—8)。下列溶液如在下表中記錄地制備<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>原花青定B2濃度的校正CB2=(mx訓0)/V其中CB2是單位為mg/1的原花青定B2濃度m是單位為mg的原花青定重量V是單位為ml的丙酮/水/醋酸的體積HPLC條件柱Lunasilica5pm(250x4.6mm)Phenomenex探測套筒(？Cartouchedegarde)3mm洗脫溶劑溶劑(A):曱醇溶劑(B):二氯曱烷溶劑(C):醋酸/水(l:1)(V/V)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1以體積計洗脫流速1ml/min柱溫度37°C光i普范圍200-700nm波長X=280nm注入體積=5(xl標準;容液分析前述的標準溶液利用HPLC分析。在分析后，校正表被插入HPLC軟件(作為原花青定B2濃度函數(shù)的面積)樣品分析在丙酮/水/醋酸(79:29.5:0.5)中稀釋的樣品利用HPLC分析。層析分析在純化和HPLC分析后獲得的酸果蔓法鑒定，原花色素為具有從13.5到50分鐘的保留時間的峰。整合方法來自于'TractionofpolymericfromlowbushblueberryandquantificationofprocyanidinsinselectedfoodswithoptimizednormalphaseHPLCMSfluorescentdetectionmethod，，(利用優(yōu)化的正常相HPLC.MS熒光探測方法對來自灌木南方越橘的多聚物分餾和在選定的食物中原花青定的定量)，(GuL.KelmetalJ.Agr，F(xiàn)oodChem.2002,50,4852-4860)。從試驗的開始到終點，它存在于水平的基線。從相鄰的寡聚物的峰間的谷底的最低點畫一條垂直的線到水平基線。曲線包圍的面積在兩個相鄰的垂直線達到峰值，與水平基線結合在一起。這個面積必須包括在上述的校正表內。獲得數(shù)據(jù)的分析HPLC軟件允許計算分析溶液的原花色素濃度(mg/1)。原花青定B2的校正表允許具有相應于每一個峰面積的原花色素濃度。每一個峰的原花色素的濃度被加和，結果對應分析溶液的原花色素的;農(nóng)度(mg/1為單4立的Clue。即，上樣到葡聚糖凝膠上溶液的原花色素C(mg/1)的濃度，以原花青定B2的當量表示，應用下述方程可以獲得C=(Clue,)/20其中Vr.分析溶液的體積(1-1.7ml)我們這里以下記錄用于說明但不是局限目的制備的實施例，其從壓碎的酸果蔓(實施例1)開始和從已預純化的提取物(實施例2)開始。實施例1-來自壓碎的酸果蔓的富含原花色素的提取物50kg的壓石年的酉交果蔓(vac"'m'wmmacrac^pw)、1001的含7j^乙醇70%(V/V)攪拌30min,此后壓榨壓碎的水果并且全混合物在25的篩下過濾，從而獲得重約120kg的清澈乙醇提取物。在真空下40。C的溫度濃縮乙醇提取物，從而獲得重約10kg的殘留物。然后其用101的去離子水稀釋從而獲得重約20kg的稀釋的提取物，其存貝i于室溫15小時。稀釋的提取物然后在10)im的篩下過濾。25l商業(yè)化的大網(wǎng)絡的脂肪族交聯(lián)聚合樹脂利用75l的去離子水沖洗，然后它們被上樣到玻璃柱并且添加20kg前述的過濾的含水溶液。具有吸收提取物的樹脂用IOOI的去離子水沖洗，然后用1001的以體積計70%的乙醇洗脫。洗脫的溶液然后在真空下在40°C濃縮，獲得大約20kg的濃縮拔::取物，其最后被霧化來獲得粉末。4是:取物用上面記錄的分析方法分析，圖1和2記錄HPLC層析，每一個峰的保留時間、面積和以每個峰的以mg/ml表示的相應的濃度，和最后的為6824.24mg/1的原花色素或CujE的總濃度。V尸1.7ml(通過HPLC總共分析的溶液)。因而如果我們應用上述方程C=(CluexV,)/20C=6824.24x1.7/20=580.06mg/1含水乙醇(MeOH20%)溶液利用201.5mg的最終提取物來制備，其體積V2等于72ml。580.06x0.072=41.76mg的原花色素(41.76/201.5)x100=20.73%實施例2-從已經(jīng)預純化的提取物中制備的提取物在本試驗中使用的酸果蔓提取物是EXOCYANCRAN10,由Tournaytechnologies批次NoL7015生產(chǎn)，用上述公開的方法分析。原花色素含量7%607.7mg的酸果蔓提取物利用100ml的70%(V/V)處理30分鐘。過濾溶液，然后在真空下利用實施例1的方式濃縮，并貯存過夜。濃縮的溶液用10ml的去離子水稀釋然后過濾。溶液被上樣到商業(yè)大網(wǎng)絡的脂肪族交聯(lián)樹脂，然后用水(200ml)沖洗并用70%的乙醇溶液洗脫，獲得溶液在真空下濃縮。干燥獲得的濃度然后分析最終獲得的提取物(158.2mg)。利用上述方法評價其原花色素含量為18.0%。因而在最終提取物中的原花色素含量比在起始提取物中高2.6倍。權利要求1.一種從富含原花色素的植物、水果或已經(jīng)預純化的提取物獲得富含原花色素的提取物的方法，該方法包括以下步驟:a)用具有以體積計50％到80％乙醇濃度的含水乙醇處理富含原花色素的壓碎的水果或植物或已經(jīng)預純化的提取物，b)過濾來自步驟(a)的混合物，c)在真空下濃縮來自步驟(b)的過濾溶液，d)任選地在從5到24小時時間范圍內存貯來自步驟(c)的濃縮產(chǎn)物，所述產(chǎn)物預先任選地用去離子水稀釋，e)用去離子水稀釋來自步驟(c)的存貯產(chǎn)物，或者在步驟(d)中沒有進行用水稀釋的情況下，則用去離子水稀釋來自(d)的濃縮的存貯產(chǎn)物，f)過濾來自步驟(e)的混合物，g)將溶液上樣到大網(wǎng)絡的脂肪族交聯(lián)聚合樹脂上，h)用去離子水沖洗所述樹脂，i)用具有以體積計從50％到80％乙醇含量的含水乙醇洗脫來自步驟(h)的大網(wǎng)絡的脂肪族交聯(lián)聚合樹脂，j)在真空下濃縮來自前一步驟的洗脫溶液，k)真空干燥或噴霧干燥來自步驟(j)的濃縮產(chǎn)物。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的在步驟(a)中使用的富含原花色素的水果或植物選自酸果蔓、蘋果、黑莓、葡萄、李子、石榴、覆盆子、草莓、蠶豆、扁豆和茶。3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述的富含原花色素的水果是酸果蔓(v"cc/m'謂附acracarpow)。4.根據(jù)權利要求1到3任一項所述的方法，其中在步驟(a)中使用的所述含水乙醇具有以體積計/人60%到75%的乙醇含量。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述的含水乙醇具有以體積計70%的乙醇含量。6.#4居權利要求1到5任一項所述的方法，其中所述的步驟(a)進行的時間在10分鐘到2小時的范圍內。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述的時間是30分鐘。8.根據(jù)權利要求1到7任一項所述的方法，其中當在步驟(a)中使用壓碎的富含原花色素的水果時，經(jīng)乙醇處理的壓碎的水果在進行步驟(b)前纟皮壓榨。9.根據(jù)權利要求1到8任一項所述的方法，其中所述步驟(d)的存貯時間包括8小時到20小時之間。10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述的存貯時間是15小時。11.根據(jù)權利要求l到IO任一項所述的方法，其中在步驟(i)中使用乙醇含量為以體積計乂人60%到75%的含水乙醇。12.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述的含水乙醇具有以體積計70%的乙醇含量。13.—種具有原花色素滴度高于10%的提取物，其中所述提取物用權利要求1到12任一項所述的方法制備。14.根據(jù)權利要求13所述的提取物，其中所述原花色素的滴度高于重量比的15%。15.根據(jù)權利要求14所述的提取物，其中所述原花色素的含量高于20%。全文摘要本發(fā)明涉及一種從富含原花色素的水果或植物或已經(jīng)預純化的提取物獲得包含高含量原花色素的提取物的方法，以及用該方法制備的提取物。所述方法包括以下步驟用含水乙醇處理富含原花色素的壓碎的水果或植物或已經(jīng)預純化的提取物；過濾所得的混合物；真空濃縮所述過濾溶液；用去離子水稀釋濃縮的產(chǎn)物；過濾稀釋的產(chǎn)物；將過濾溶液上樣到大網(wǎng)絡的脂肪族交聯(lián)聚合樹脂上；用去離子水沖洗所述樹脂；用含水乙醇洗脫所述樹脂；濃縮洗脫溶液并干燥濃縮的產(chǎn)物。本發(fā)明所述的方法可以容易地在工業(yè)化規(guī)模上實現(xiàn)。文檔編號A61K36/185GK101380338SQ20081013512公開日2009年3月11日申請日期2008年7月30日優(yōu)先權日2007年8月1日發(fā)明者克里斯戴勒·索萊爾,吉爾斯·拉普萊格,娜塔莎·埃爾考菲申請人:法魯克斯控股股份有限公司