專利名稱：一種礁膜多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種礁膜多糖及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景研究發(fā)現(xiàn)，作為抗凝血藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用了70多年的肝素具有多種副作用，如誘發(fā)血 小板減少癥、出血作用。此外，制備肝素的主要原料中肝素的濃度低，與牛相關(guān)的"瘋牛 病"的發(fā)生，迫切需要尋找抗凝血藥物的替代物。近年來人們除繼續(xù)研究開發(fā)低分子量肝 素，如依諾肝素、那屈肝素鈣、達(dá)肝素鈉和亭扎肝素鈉外，還根據(jù)肝素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)一 些天然高分子化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，達(dá)到類似的目的。實(shí)驗(yàn)證明，這些肝素類物質(zhì)都具 有一定的抗凝血活性，但也都有一定的毒性。血栓類疾病嚴(yán)重危害人類的身體健康，是現(xiàn) 代社會(huì)主要的致死性疾病之一。目前，每年抗血栓藥物的全球市值約為120億美元，并且每 年以15%的速度遞增；抗凝血藥物的全球市值約為40億美元，并以13%的速度逐年遞增， 現(xiàn)有的抗凝血和抗血栓藥物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需要。海藻是抗凝血多糖的一個(gè) 天然豐富來源，目前海藻多糖的研發(fā)主要集中于紅藻多糖和褐藻多糖，而綠藻多糖的研發(fā) 很少，其中有關(guān)礁膜多糖的文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種礁膜多糖及其制備方法和應(yīng)用，它能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。一種礁膜多糖，其特征在于該礁膜多糖的糖鏈中含有鼠李糖基、木糖基、葡萄糖基、 半乳糖基、甘露糖基和葡萄糖醛酸基，是以a-l,2-糖苷鍵和a-l，3-糖苷鍵連接的線形長鏈分 子；鼠李糖基占單糖總摩爾百分含量的60~90%， a-l，2-糖苷鍵連接的L-鼠李糖基與"，3-糖苷鍵連接的L-鼠李糖基的摩爾比為1~8: 1;硫酸基位于a-l，2-L-鼠李糖基的C-3位和/ 或C-4位，和域位于a-l，3-L-鼠李糖基的C-2位和/或C-4位，礁膜多糖中硫酸基的重量百 分含量為10~40%;分子量為50000-800000道爾頓。上述礁膜多糖的制備方法，其特征在于將海藻藻體浸泡于水中勻漿，加熱提取，分離 出清液，將所得清液濃縮，脫鹽，將脫鹽后的溶液濃縮，脫蛋白，再將脫蛋白后的溶液濃 縮，醇沉，干燥，溶解，然后依次通過離子交換色譜柱分離、凝膠色譜柱分離，將收集的 溶液濃縮，脫鹽，再將脫鹽后的溶液濃縮，醇沉，洗漆，干燥，粉碎。上述礁膜多糖在制備抗凝血藥物或抗栓藥物中的應(yīng)用。制備本發(fā)明的產(chǎn)品所用原料天然海藻對(duì)人體無毒副作用，可長期使用。產(chǎn)品的抗凝血 活性和抗栓活性好，可以通過添加各種附劑制成片劑、散劑、顆粒劑、膠囊等作為預(yù)防和 治療血栓栓塞性疾病的抗凝血藥物或抗栓藥物，將具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。稱取干燥的海藻藻體，加入海藻重量1 80倍的水浸泡勻漿，在40 100。C水浴中攪拌 提取多糖0.1 6小時(shí)，離心棄去雜質(zhì)，取清液，將所得清液減壓濃縮，然后進(jìn)行透析或超 濾去除鹽，將除去鹽后的多糖溶液減壓濃縮，然后進(jìn)行酶法和/或Sevage法去除多糖中的蛋 白質(zhì)，再將去除蛋白質(zhì)后的多糖溶液減壓濃縮，加入4倍體積的濃度為95% (重量百分濃 度，下同)乙醇使多糖沉淀，將所得沉淀用無水乙醇洗滌1 3遍，在40 80。C烘箱中干燥 0.01-8小時(shí)，然后將所得多糖加入少量水溶解，通過離子交換色譜柱Q-Sepharose Fast Flow 分離，依次用蒸餾水、0.01 3.Omol/L氯化鈉水溶液洗脫，收集洗脫峰的洗脫液，將所得多 糖溶液減壓濃縮，然后進(jìn)行透析或超濾去除鹽，將除去鹽后的多糖溶液減壓濃縮，再通過 凝膠色譜柱Sephacryal S-400 HR進(jìn)一步分離，用0.01~0.5 mol/L醋酸鈉的水溶液洗脫，收 集洗脫峰的洗脫液，將所得多糖溶液減壓濃縮，然后進(jìn)行透析或超濾去除鹽，將除去鹽后 的多糖溶液減壓濃縮，加入4倍體積的95%乙醇使多糖沉淀，將所得沉淀用無水乙醇洗滌 1~3遍，在40 8(TC烘箱中干燥0.01 8小時(shí)，粉碎即得本發(fā)明的礁膜多糖。本發(fā)明的礁膜多糖通過與淀粉和/或糖粉充分混合后，用75%的乙醇水溶液制軟材，然 后過12目不銹鋼篩進(jìn)行制粒、于50 6(TC下干燥后，通過14目的不銹鋼篩整粒。再加入 礁膜多糖1%重量的硬脂酸鎂和/或滑石粉，充分混合均勻后，按一般壓制片芯要求進(jìn)行壓 片，使得片芯具有適宜的硬度。將壓制得到的素片用糖漿和滑石粉進(jìn)行交替包粉衣層15-18 層，包糖衣層10-15層，最后打光即得具有抗凝血作用或抗血栓作用的片劑。本實(shí)施例中所述的海藻藻體可為寬礁膜、礁膜、袋礁膜、北極礁膜、破礁膜、囊礁膜、 厚礁膜、尖種礁膜、皺礁膜或褐色礁膜；所述的乙醇還可改用甲醇、丙酮或異丙醇；所述 的離子交換色譜柱DEAE Sepharose Fast Flow還可改用Q-Sepharose Fast Flow、 DEAE Cellulose、 DEAE Sephadex、 Q-Sepharose XL 、 Q Sepharose 、 Q Sepharose 4 Fast Flow 、 QAE Sephadex或Dowex;所述的用蒸餾水和0.01~3.0 mol/L氯化鈉水溶液洗脫也可改用蒸餾水 和0.01~3.0 mol/L氯化鉀水溶液洗脫；所述的凝膠色譜柱Sephacryal S-400 HR還可改用 Toyopearl HW-65、 Sephacryal S-300 HR、 Sephacryal S-200 HR、 S印hacryal S-100 HR、 Sephacryal S-500 HR、 Sephacryal S-1000 SF、Superdex 200、Superose 6、Superose 12、 Sepharose 6FastFlow、 Sepharose 4 Fast Flow 、 Sepharose 2B、 Sepharose 4B、 Sepharose 6B、 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B;所述的用0.01~0.5 mol/L醋酸鈉水溶液洗脫 也可改用蒸餾水溶液、0.01~0.5 mol/L氯化鈉水溶液、0.01~0.5 mol/L氯化鉀水溶液或 0.01~0.5 mol/L碳酸氫銨水溶液洗脫；所述的片劑還可改為散劑、顆粒劑或膠囊。本發(fā)明的礁膜多糖為類白色或白色無定形粉末，用氣相色譜測(cè)定6次制得的礁膜多糖 的單糖組成，用薄層層析和毛細(xì)管電泳測(cè)定糖醛酸組成，用硫酸鋇-明膠比濁法測(cè)定硫酸基含量，用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定分子量，用高碘酸氧化、Smith(史密斯)降解、甲基化分 析、紅外光譜、核磁共振波譜和質(zhì)譜測(cè)定糖鏈結(jié)構(gòu)，并通過分析確定，得到的礁膜多糖的 糖鏈中含有鼠李糖基、木糖基、葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基和葡萄糖醛酸基，是以a-1,2-糖苷鍵和a-l,3-糖苷鍵連接的線形長鏈分子；鼠李糖基占單糖總摩爾百分含量的60~90%， a-l,2-糖苷鍵連接的L-鼠李糖基與a-l,3-糖苷鍵連接的L-鼠李糖基的摩爾比為1~8: 1;硫 酸基位于a-l,2-L-鼠李糖基的C-3位和/或C-4位，和/或位于a-l,3-L-鼠李糖基的C-2位和/ 或C-4位，礁膜多糖中硫酸基的重量百分含量為10~40%;分子量為50000~800000道爾頓。 本發(fā)明的礁膜多糖的抗凝血作用是通過對(duì)健康人靜脈血活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血 酶時(shí)間的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)的，抗栓作用是通過對(duì)大鼠體內(nèi)、體外試驗(yàn)性血栓形成的影響進(jìn)行 評(píng)價(jià)的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明的產(chǎn)品具有明顯抗凝血活性和抗血栓作用。具體的實(shí)驗(yàn)方 法和結(jié)果如下1. 對(duì)健康人靜脈血活化部分凝血活酶時(shí)間的影響取健康人靜脈血，置于含有1/10(血液與 抗凝劑體積比為9: 1)重量百分濃度為3.3%的枸櫞酸鈉抗凝液的塑料管中，輕輕顛倒混勻， 以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集上層血漿，備用。取9份待測(cè)血漿，每份90pL，分別加入 濃度為IO、 25、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600ng/mL的礁膜多糖水溶液10pL， 37°C 下孵育lmin，加入活化部分凝血活酶時(shí)間試劑100pL， 37。C孵育2分鐘，加入37'C預(yù)熱濃 度為0.025 mol/L的CaCl2水溶液100 pL，記錄凝固時(shí)間，即為活化部分凝血活酶時(shí)間值。對(duì) 照組加入生理鹽水10nL，按上述方法測(cè)定活化部分凝血活酶時(shí)間值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，礁膜 多糖可明顯延長活化部分凝血活酶活化時(shí)間，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P〈0.001)，表明 本礁膜多糖具有顯著抗凝血作用，能抑制內(nèi)源性凝血途徑或共有凝血途徑。不同濃度的礁 膜多糖對(duì)活化部分凝血活酶時(shí)間的影響表現(xiàn)為濃度愈大，凝固時(shí)間愈長，表明礁膜多糖的 抗凝血作用與濃度呈線性關(guān)系。2. 對(duì)健康人靜脈血凝血酶時(shí)間的影響血漿的分離如上所述。取9份待測(cè)血漿，每份90pL， 分別加入濃度為IO、 25、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600昭/mL的礁膜多糖水溶液10pL， 37'C下孵育1分鐘，加入37'C預(yù)熱凝凝血酶時(shí)間試劑200pL，記錄凝固時(shí)間，即為凝血酶時(shí) 間值。對(duì)照組加入生理鹽水10pL，按上述方法測(cè)定凝血酶時(shí)間值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，礁膜多 糖可明顯延長血漿凝血酶時(shí)間，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P〈0.001)，表明本礁膜多糖具 有顯著抗凝血作用，能抑制凝血酶活性或抑制纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。不同濃度的礁 膜多糖對(duì)凝血酶時(shí)間的影響表現(xiàn)為濃度愈大，凝固時(shí)間愈長，表明礁膜多糖的抗凝血作用 與濃度呈線性關(guān)系。3. 對(duì)大鼠體內(nèi)試驗(yàn)性血栓形成的影響取體重200 250克的健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分 為生理鹽水組、24.0mg/Kg礁膜多糖組、12.0mg/Kg礁膜多糖組、6.0 mg/Kg礁膜多糖組和6.0mg/Kg肝素組，每日分早晚2次灌胃，每次各灌胃0.4mL，生理鹽水組灌以生理鹽水0.4 mL。于第11天按每日總量灌胃后20分鐘，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(40.0mg/Kg)， 剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈15mm長，用體內(nèi)血栓形成儀的刺激電極將動(dòng)脈近心端輕輕挑起，用測(cè) 溫探頭挑起動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。藥后30分鐘用1.6mA直流電流持續(xù)刺激7分鐘。當(dāng)動(dòng)脈內(nèi)因血栓形 成阻塞血流時(shí)，血管表面溫度突降。從刺激開始到溫度突降所需時(shí)間稱阻塞時(shí)間(Ocelusion time,簡(jiǎn)稱OT)，以O(shè)T長短作為藥效指標(biāo)。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)處理，組間差異的顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本礁膜多糖有明顯的抗動(dòng)脈血栓 作用，劑量增加則作用增強(qiáng)，而且礁膜多糖比肝素有明顯抗動(dòng)脈血栓作用(PO.OOl)。 4.對(duì)大鼠體外試驗(yàn)性血栓形成的影響藥物分組對(duì)照組(生理鹽水組)、12.0mg/Kg礁 膜多糖組、6.0mg/Kg礁膜多糖組、3.0mg/Kg礁膜多糖組和3.0mg/Kg肝素組。取健康雄性 Wistar大鼠，以戊巴比妥鈉靜脈麻醉大鼠(40.0mg/Kg)，分離頸總動(dòng)脈，以干燥的玻璃注射 器自頸總動(dòng)脈取血2mL，均分于兩個(gè)硅化聚乙烯管環(huán)內(nèi)，血液在37。C環(huán)境中以17轉(zhuǎn)/分鐘 轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘后停止，按拉丁方設(shè)計(jì)的給藥順序分別向每根管環(huán)的兩端各加藥O.lmL，轉(zhuǎn)動(dòng) 60分鐘，自聚乙烯管環(huán)內(nèi)傾出血栓，立即稱重，測(cè)量血栓長度，置6(TC恒溫干燥箱中烘干， 并稱其干重，按上述步驟再取血做其余四組，然后再取5只大鼠重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，按以下公式 計(jì)算各藥物組的溶栓率。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差 異的顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。對(duì)照組血栓濕重一給藥組血栓濕重溶栓率(％) = - x 100%對(duì)照組血栓濕重實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12.0 mg/Kg礁膜多糖、6.0 mg/Kg礁膜多糖組和3.0mg/Kg礁膜多糖組濕重、 干重及長度與生理鹽水組比較均明顯減小(PO.OOl)，表明本礁膜多糖具有體外溶栓作用， 而且12.0 mg/Kg礁膜多糖組和6.0 mg/Kg礁膜多糖組比3.0 mg/Kg肝素組有明顯溶栓作用 (PO.OOl)，肝素組與生理鹽水組比較，血栓濕重、干重及長度均無明顯差別。
權(quán)利要求
1.一種礁膜多糖，其特征在于該礁膜多糖的糖鏈中含有鼠李糖基、木糖基、葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基和葡萄糖醛酸基，是以α-1，2-糖苷鍵和α-1，3-糖苷鍵連接的線形長鏈分子；鼠李糖基占單糖總摩爾百分含量的60～90％，α-1，2-糖苷鍵連接的L-鼠李糖基與α-1，3-糖苷鍵連接的L-鼠李糖基的摩爾比為1～8∶1；硫酸基位于α-1，2-L-鼠李糖基的C-3位和/或C-4位，和/或位于α-1，3-L-鼠李糖基的C-2位和/或C-4位，礁膜多糖中硫酸基的重量百分含量為10～40％；分子量為50000～800000道爾頓。
2. 權(quán)利要求1所述的礁膜多糖的制備方法，其特征在于將海藻藻體浸泡于水中勻 漿，加熱提取，分離出清液，將所得清液濃縮，脫鹽，將脫鹽后的溶液濃縮，脫蛋 白，再將脫蛋白后的溶液濃縮，醇沉，干燥，溶解，然后依次通過離子交換色譜柱 分離、凝膠色譜柱分離，將收集的溶液濃縮，脫鹽，再將脫鹽后的溶液濃縮，醇沉， 洗滌，干燥，粉碎。
3. 權(quán)利要求1所述的礁膜多糖在制備抗凝血藥物或抗栓藥物中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求2所述的礁膜多糖的制備方法，其特征在于所述的海藻藻體為寬礁膜、 礁膜、袋礁膜、北極礁膜、破礁膜、囊礁膜、厚礁膜、尖種礁膜、皺礁膜或褐色礁膜。
全文摘要
一種礁膜多糖，其特征在于該礁膜多糖的糖鏈中含有鼠李糖基、木糖基、葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基和葡萄糖醛酸基，是以α-1，2-糖苷鍵和α-1，3-糖苷鍵連接的線形長鏈分子。制備時(shí)將海藻藻體浸泡于水中勻漿，加熱提取，分離出清液，將所得清液濃縮，脫鹽，將脫鹽后的溶液濃縮，脫蛋白，再將脫蛋白后的溶液濃縮，醇沉，干燥，溶解，然后依次通過離子交換色譜柱分離、凝膠色譜柱分離，將收集的溶液濃縮，脫鹽，再將脫鹽后的溶液濃縮，醇沉，洗滌，干燥，粉碎。本發(fā)明的礁膜多糖，可用于制備一種新型的抗凝血藥物或抗血栓藥物。
文檔編號(hào)A61P7/00GK101328227SQ20081013809
公開日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者張會(huì)娟, 芳 房, 李紅燕, 毛文君 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)