專利名稱：：從槐花中提取的一種降糖活性物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種從槐花中提取的一種降糖活性物質(zhì)。二、
背景技術(shù)：
槐花為豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的干燥花及花蕾。前者習(xí)稱為"槐花"，后者習(xí)稱為"槐米"。始載于《日華子本草》，性味苦、微寒，歸肝、大腸經(jīng)。2005版《中華人民共和國(guó)藥典》稱其涼血止血、清肝瀉火。通常用于便血，痔血，血痢，崩漏，吐血，衄血，肝熱目赤，頭痛眩暈等證。為中醫(yī)常用的止血藥。主要含有黃酮及其苷類、皂苷及其苷元、甾類等成分。其中黃酮-主要為蘆丁(Rutin),為槐花的主要成分?；被?含槐米，以下同)的現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究主要有抗炎作用槐花中所含蘆丁及其苷元槲皮素對(duì)大白鼠因組胺、蛋清、5—羥色胺、甲醛、多乙烯吡咯酮引起的腳爪浮腫，以及透明質(zhì)酸酶引起的足踝浮腫均有抑制作用。蘆丁能顯著抑制大白鼠創(chuàng)傷性浮腫，并能阻止結(jié)膜炎等炎癥及肺水腫的發(fā)展。大鼠腹腔注射戶丁對(duì)植入羊毛球的發(fā)炎過(guò)程有明顯的抑制作用?？共《尽⒖拐婢饔没被ㄓ锌共《?、抗真菌作用。戶丁在200wg/ml濃度時(shí)對(duì)水皰性口炎病毒有抑制作用?；被ㄋ?l:5)在試管內(nèi)對(duì)堇色毛癬菌、奧杜盎氏小芽胞癬菌、羊毛狀小芽胞癬菌、星形奴卡氏菌等皮膚真菌均有不同程度的抑制作用。槐花水提物對(duì)病毒引起的小鼠肺炎有明顯的抑制作用，槐花水提物具有體內(nèi)抗體流感病毒作用。抗腫瘤作用用體外細(xì)胞培氧3H—TDR參人法，蕓香甙對(duì)腹水型肝癌細(xì)胞的平均抑制率為23.8%。所含染料木素對(duì)人體鼻咽癌(KB)細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用。對(duì)心血管的作用槐花有降壓、擴(kuò)冠等作用。槐花液對(duì)麻醉狗有短暫但顯著的降壓作用，對(duì)離體蛙心肌有輕度興奮作用，對(duì)心傳導(dǎo)系統(tǒng)有阻滯作用。槐花煎液對(duì)心臟的作用主要是降低其收縮性能、減慢心率，而對(duì)其舒張功能影響較小。提示槐花煎液具有降低血壓、減慢心率、減弱心肌收縮力、降低心肌耗氧量的作用、保護(hù)心功能的作用?；被逡菏雇苄募蜗鄤?dòng)作電位MAP的各項(xiàng)電學(xué)指標(biāo)呈一致性減小(少)、心率減慢、心肌收縮力降低?；被▽?duì)家兔體外心房肌的作用表現(xiàn)在槐花對(duì)心肌具有負(fù)性肌力和負(fù)性頻率作用，其作用機(jī)制與其抑制Ca2+跨膜內(nèi)流有關(guān)。對(duì)毛細(xì)血管的影響其所含主要成分蘆丁有維生素P樣作用，能夠降低毛細(xì)血管的異常通透性、脆性，可用于高血壓、腦溢血、出血等癥的治療和預(yù)防，能維持血管抵抗力等;其所含的槲皮素有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量等作用。降血脂作用槐花的主要成分蘆丁對(duì)脂肪浸潤(rùn)的肝有祛脂作用，與谷胱甘肽合用祛脂效果更明顯，所含槲皮素也有降血脂作用。其所含染料木素對(duì)三硝基甲苯WR1339引起的大鼠高血脂有降低其血中膽固醇和三苷油酸脂的作用，對(duì)后者作用尤為顯著?？寡趸宰饔迷谕肦BC體外溫育自氧化試驗(yàn)中，3.2X10mol/L蕓香武可顯著抑制RBC自氧化，并可減少RBC自氧化過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量，說(shuō)明蕓香武對(duì)RBC自氧化溶血損傷有一定的保護(hù)作用.并可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)；說(shuō)明蕓香武不僅可顯著減少小鼠血漿中MDA含量.也可顯著提高大鼠血液中SOD活性.并有一定的量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示蕓香甙抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用可能與提高SOD活性有關(guān)。戸丁(0.02%)抗氧化性接近BHT，槲皮素的抗氧化性優(yōu)于蘆丁，槲皮素(0.08%)的抗氧化性更接近BHT，甚或超過(guò)它也有可能.可見(jiàn)用蘆丁代替BHT作抗氧化劑，既能滿足抗氧化性能的要求，又能避免BHT帶來(lái)的毒性。鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)蕓香甙(6.25100mg/kg,ip)可劑量依賴性抑制小鼠扭體反應(yīng)，蕓香甙(50100mg/kg.ip)明顯提高小鼠電嘶叫刺激閾值，顯著延長(zhǎng)小鼠熱板舔足反應(yīng)潛伏期。結(jié)果表明蕓香甙有鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛怍用比阿斯匹林強(qiáng)但弱于嗎啡。在小鼠扭體模型上。iv蕓香甙O.311.30rag/kg或ip蕓香甙6.2525.00mg/kg均呈劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用，中樞給藥所需劑量為外周用藥的1/20。icyeach或乙二胺四乙酸能拮抗或增強(qiáng)ip蕓香甙的鎮(zhèn)痛作用。將小劑量蕓香甙敷于復(fù)發(fā)性口瘡病人的潰瘍面上不產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛效果。表明蕓香甙鎮(zhèn)痛部位主要是中樞而不是外周.其中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與鈣拮抗有關(guān)。致突變作用槐花水提物(5.Omg/ml)的應(yīng)用劑量和人血淋巴細(xì)胞姐妹染色單體互換(SCE)頻率之間存在明顯的量效關(guān)系，說(shuō)明該藥對(duì)人血淋巴細(xì)胞具有致突變作用，而且能抑制人淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂增殖?？笻IV—1活性:采用MTT比色法檢測(cè)化合物對(duì)各種細(xì)胞的毒性。用合胞體形成計(jì)數(shù)法，p24抗原捕獲ELISA法及RT—PCR等多種方法研究化合物體外抗HIV—1活性。結(jié)論槐花提取化合物K3體外有較好的抗HIV—1活性，能夠抑制病毒實(shí)驗(yàn)株(HIV—IIIIB，耐藥株(HIV—174V)和臨床分離株(HIV-IKM018)等多種病毒株的復(fù)制，且其作用機(jī)制是多靶點(diǎn)的，不僅可以抑制病毒的進(jìn)入，還可以抑制HIV—1逆轉(zhuǎn)錄酶活性。槐樹(shù)在我國(guó)分布廣泛，槐花(又稱槐花米)的資源極為豐富，河南是農(nóng)業(yè)大省，也是槐花的主產(chǎn)區(qū)之一。如果將其開(kāi)發(fā)出新的降糖新藥或保健食品，不僅可以充分利用資源，減少糖尿病病人痛苦，還可以創(chuàng)造出較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。三、
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況，本發(fā)明之目的就是提供一種從槐花中提取的一種降糖活性物質(zhì)，可有效用于制備降糖藥物，解決血糖高的治療問(wèn)題，其解決的技術(shù)方案是，槐花降糖活性物質(zhì)(總黃酮)的提取:取槐花(米)加8倍槐花重量體積的質(zhì)量濃度為80%的乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，濃縮成浸膏，加質(zhì)量濃度為5%的NaOH溶液溶解，過(guò)濾，濾液加HCl調(diào)至PH2-3，過(guò)濾，沉淀水洗至中性即得槐花降糖活性物質(zhì)(槐花總黃酮)，得率為0.6-0.9%,純度約為60%。所說(shuō)的重量體積是指固體物質(zhì)(槐花)用g，液體(乙醇)用ml，如槐花8倍體積重量的乙醇，即lg槐花加8ml乙醇，以下類同，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，純度高，穩(wěn)定性好，開(kāi)辟了槐花制備藥物的新領(lǐng)域，是中醫(yī)藥學(xué)上的一大創(chuàng)新，造福于為類。四具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)際情況，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。在實(shí)施中，本發(fā)明以河南省武陟縣藥材公司供應(yīng)的槐花(米)為例，首先取干燥的槐花(含有槐米)lkg，加質(zhì)量濃度為80%的乙醇8kml，加熱至60-8(TC，回流提取2次，每次1.5小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，濃縮成浸膏，再用質(zhì)量濃度為5W的NaOH溶液溶解，過(guò)濾后加HC1調(diào)PH為2.5，過(guò)濾后用水洗至中性即得7g±0.5g，槐花總黃酮含量約為60%的降糖活性物質(zhì)。采用80%乙醇提取，并用堿溶酸沉的方法得到槐花總黃酮。建立了HPLC法測(cè)定槐花總黃酮中蘆丁含量的方法，該方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，精密度好，線性范圍寬、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，樣品含量穩(wěn)定，開(kāi)辟了槐花(米)制備降糖藥物的新領(lǐng)域，造福于人類，其降糖之功效，為實(shí)驗(yàn)所證明。一、槐花總黃酮對(duì)小鼠高血糖及糖尿病模型的影響1、試驗(yàn)藥物本發(fā)明制得的槐花活性物質(zhì)(由河南省中藥發(fā)展工程技術(shù)研究中心提供)；鹽酸二甲雙胍，上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，批號(hào)060310;鹽酸腎上腺素注射液，上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)5A09011;四氧嘧啶，sigma公司生產(chǎn)；鏈脲佐菌素，sigma公司生產(chǎn)；生理鹽水，鄭州永和制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)060810012;濃硫酸，洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)051102;檸檬酸(分析純)，湖北省醫(yī)藥公司化玻站，批號(hào)050203;檸檬酸鈉(分析純)，天津市化學(xué)試劑批發(fā)部，批號(hào)050304;血糖試劑盒，浙江東甌生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2006060350;肝糖元試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20060907;糖化血清蛋白(GSP)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所第一分所生產(chǎn)，批號(hào)20061007。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠昆明種，II級(jí)，雄性，由河北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)611040，608155。3、實(shí)驗(yàn)儀器5UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn)；恒溫水浴鍋，北京市光明儀器廠生產(chǎn)；離心機(jī)，北京醫(yī)療儀器修理廠生產(chǎn)；FA(N)/JA(N)系列電子天平，上海民橋精密儀器有限公司生產(chǎn)；可調(diào)式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司生產(chǎn)。4、實(shí)驗(yàn)方法對(duì)腎上腺素致小鼠高血糖模型的影響取雄性小鼠60只，體重2022g，隨機(jī)均勻分為6組，分別灌服大、中、小劑量的本發(fā)明物質(zhì)(600mg/kg、300mg/kg、150mg/kg，配成濃度為30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml，灌胃體積為0.2ml/10g)溶液，二甲雙胍混懸液(0.208g/kg，0.104mg/ml，0.2ml/10g)，模型組和空白組灌服同體積的生理鹽水液。每天給藥1次，連續(xù)給藥9天。于禁食后12h灌藥后90min，除空白組外每鼠迅速腹腔注射腎上腺素240ug/kg,空白對(duì)照組注射同體積生理鹽水，于給腎上腺素后30min、60min立即眼眶取血，分離血清，供測(cè)血糖用。然后處死小鼠后，稱取肝臟，制勻漿，供測(cè)肝糖元用。對(duì)四氧嘧啶致小鼠高血糖模型的影響取雄性小鼠60只，體重200.776oz，隨機(jī)均勻分為6組，分別灌服大、中、小劑量的槐花總黃酮(600mg/kg、300mg/kg、150mg/kg，配成濃度為30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml，灌胃體積為0.2ml/10g)溶液，二甲雙胍混懸液(0.208g/kg，0.104mg/ml，0.2ml/10g)，模型組和空白組灌服同體積的生理鹽水液。每天給藥1次，連續(xù)給藥10天。于第7天禁食后12h灌藥后90min，除空白組外每鼠尾靜脈注射8(kg/kg(0.05ml/10g)新配制的四氧嘧啶生理鹽水液，注射后72h，小鼠眼眶取血，分離血清，供測(cè)血糖用。然后處死小鼠后，稱取肝臟，制勻漿，供測(cè)肝糖元用。對(duì)鏈尿佐菌素致小鼠糖尿病模型的影響取雄性小鼠，正常飼養(yǎng)3天，禁食12h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌素80(mg/kg，0.02ml/10g)，于注射第11天禁食12h后，尾部采血測(cè)空腹血糖值，選取血糖值〉11.lmmol/L并具有明顯多飲、多食、多尿癥狀的小鼠50只，按血糖值隨機(jī)均分為5組，即大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組，陽(yáng)性對(duì)照組和模型組，分別灌服大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)(600mg/kg、300mg/kg、200mg/kg，0.2ml/10g)，二甲雙胍(O.5g/kg,25mg/ml，0.2ml/10g)及同體積生理鹽水，另取10只小鼠作為空白對(duì)照組，灌服同體積生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)給藥30天。于給藥第IO、20、30天尾部取血測(cè)血糖值。第30天在禁食12h末次給藥lh后，小鼠眼眶取血，分離血清，供測(cè)血糖用。然后處死小鼠后，稱取肝臟，制勻漿，供測(cè)肝糖元用；取胰腺，10%福爾馬林液固定，作病理切片，供光鏡觀察胰臟組織情況。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1本發(fā)明物質(zhì)對(duì)腎上腺素致小鼠高血糖模型血糖水平及肝糖原含量的影響(X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*與模型組比尸<0.05，**與模型組比/^<0.01從上表可看出，與空白對(duì)照組比，模型組在30分鐘和60分鐘血糖水平顯著升高(戶<0.01)，肝糖元水平顯著降低(尸<0.01)，說(shuō)明造腎上腺素高血糖模型成功。與模型組比，大、中、小劑量槐花總黃酮組和二甲雙胍組可顯著降低30分鐘血糖水平(尸<0.01)、可顯著升高肝糖元水平(,<0.01)，二甲雙胍組可顯著性降低60分鐘血糖水平(尸<0.01)，大劑量槐花總黃酮組可明顯降低60分鐘血糖水平(尸<0.05)。表2本發(fā)明物質(zhì)對(duì)四氧嘧I^C小鼠高血糖,血糖水平MF糖元含量的影響(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*與模型組比尸<0.05,**與模型組比/<0.01從上表可看出，與空白對(duì)照組比，模型組血糖水平顯著升高(,<0.01)，肝糖元水平顯著降低(戶<0.01)，說(shuō)明造小鼠四氧嘧啶高血糖模型成功。與模型組比，大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組可顯著降低小鼠四氧嘧啶高血糖模型糖水平(,<o.01)，大、中劑量本發(fā)明物質(zhì)組可顯著升高肝糖元水平(/^0.01)，小劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組可明顯升高肝糖元水平(尸<0.05)。3.3對(duì)鏈尿佐菌素致小鼠糖尿病模型血糖及胰臟組織形態(tài)的影響表3本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素致小鼠糖尿病模型血糖水平的影響(x士s,mmo1/1)組別動(dòng)物劑量(只)(mg/kg)開(kāi)始血糖10天血糖肝糖原(呢/g)空白對(duì)照組104.771±0.686**4.929土0.847**4.758±0.703**4.760±0.637**28.754±5.251林模型組二甲雙胍組101020815.696±2.15.424±2.31427320.496±2.88718.724±2.51120.740±4.03820.869±3.98111.477±1.98215.035土3.008林12.582±2.499**17.089±2.275**大劑量組1060015.506±2.37718.580±2.39016.237±2.252林14.665±2.353**19.257±3.409林中劑量組1030015,574±2.53518.666±2.48616.947±2.696*15.573±2.629林18.187±2.946林子路g1015015.478±2.38919.152±3.42018.045±3.39617.063±3.400*15.531±2.754***與模型組比/^0.05,**與模型組比尸<0.01從表3可看出，與空白對(duì)照組比，從開(kāi)始給藥到給藥第30天，模型組血糖水平均顯著升高(尸<0.01)，肝糖元水平顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明造小鼠鏈尿佐菌素糖尿病模型成功。各給藥組開(kāi)始血糖之間無(wú)明顯差異，說(shuō)明分組均勻；給藥第10天，各給藥組比模型組均降低，但無(wú)明顯差異；給藥第20天，與模型組比，二甲雙胍組和大劑量本發(fā)明物質(zhì)組小鼠血糖水平均顯著降低(尸<0.01)，中劑量本發(fā)明物質(zhì)組明顯降低(尸<0.05);給藥第30天，與模型組比，大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組均可顯著降低模型小鼠血糖水平(尸<0.01)，小劑量本發(fā)明物質(zhì)組明顯降低血糖水平(P<0.05);大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組均可顯著升高模型小鼠肝糖元水平(尸<0.01)。表4本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素致小鼠糖尿病模型胰臟組織的影響組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量(mg/kg)一++++++空白對(duì)照組1010000模型組100019二甲雙胍組102080280大劑量組106000910中劑量組103000820小劑量組101500730"一"胰島細(xì)胞胞漿豐富，未出現(xiàn)萎縮，水腫和空泡變性，均正常；"+"胰島細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，而無(wú)水腫和空泡變性；"++"胰島細(xì)胞大部分出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞少數(shù)出現(xiàn)水腫而無(wú)空泡變性；"+++"胰島細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，同時(shí)出現(xiàn)水腫和空泡變性明顯者。從上表可看出，經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，與空白對(duì)照組比，模型組胰臟病理變化顯著(,<0.01)，說(shuō)明造小鼠糖尿病模型成功。二、本發(fā)明物質(zhì)對(duì)大鼠糖尿病模型的影響1、藥物試劑本發(fā)明物質(zhì)，即槐花總黃酮(由河南省中藥發(fā)展工程技術(shù)研究中心提供)；鏈脲佐菌素，sigma公司生產(chǎn)；鹽酸二甲雙胍，上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，批號(hào)060310;生理鹽水，鄭州永和制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)060810012;濃硫酸，洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)051102;檸檬酸(分析純)，湖北省醫(yī)藥公司化玻站，批號(hào)050203;檸檬酸鈉(分析純)，天津市化學(xué)試劑批發(fā)部，批號(hào)050304;血糖試劑盒，浙江東甌生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2006060350;肝糖元試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20060907;糖化血清蛋白(GSP)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所第一分所生產(chǎn)，批號(hào)20061007;SOD試劑盒(測(cè)總)，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20070131;丙二醛(MDA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20070206;低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒(LDL-C)，浙江東甌生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2006080265;高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒(HDL-C)，浙江東甌生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2006120002;甘油三脂測(cè)定試劑盒(TG)，浙江東甌生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2006110001;總膽固醇測(cè)定試劑盒(TCH)，浙江東甌生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2006090002;胰島素(INS)放射免疫分析藥盒，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20063082;消脂素(L印tin)放射免疫分析藥盒，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心生產(chǎn)，批號(hào)070126;C-肽(C-P)放射免疫分析藥盒(RIA),北京科美東雅生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20070125;胰島素抗體(INS-Ab)放射免疫分析藥盒，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20070125。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠Wistar,II級(jí)，雄性，體重180200g;由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格i正號(hào):701022。3、實(shí)驗(yàn)儀器UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn)；恒溫水浴鍋，北京市光明儀器廠生產(chǎn)；離心機(jī)，北京醫(yī)療儀器修理廠生產(chǎn)；FA(N)/JA(N)系列電子天平，上海民橋精密儀器有限公司生產(chǎn)；可調(diào)式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司生產(chǎn)。4、實(shí)驗(yàn)方法取大鼠100只，禁食12h后，其中90只尾靜脈注射鏈脲佐菌素60mg/kg(用pH為4.2的枸櫞酸緩沖液配制)，另10只設(shè)為完全空白對(duì)照組，尾靜脈注射等體積的枸櫞酸緩沖液。第10天尾部取血測(cè)血糖值，選取血糖值〉11.lmmol/L并具有明顯多飲、多食、多尿癥狀的大鼠50只，按血糖值隨機(jī)均分為5組，分別灌服大、中、小劑量的本發(fā)明物質(zhì)(600mg/kg、300mg/kg、150mg/kg，配成濃度為30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml，灌胃體積為2ml/100g)溶液，二甲雙胍片208mg/kg(20.8mg/ml，2ml/100g)，模型組與空白對(duì)照組給予同體積生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥30天，分別于給藥的第IO、20、30天測(cè)空腹血糖值，于最后1次測(cè)血糖前1天禁食12h;灌藥2h后，取血，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定各種指標(biāo)。取胰臟和腎臟，福爾馬林固定，切片，供光鏡和電鏡檢査。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表5本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素致大鼠糖尿病模型血糖水平的影響(x士s，mmol/L)動(dòng)物劑量開(kāi)始第io天第20天第30天組別(只)(mg/kg)血糖血糖血糖血糖空白對(duì)照組104.832±0.858**4.982±0.766**4.735±1.094**4.862±0.718**模型組1015.473±2.60017.755±2.49218.484±2.35519.766±2.754二甲雙胍組1020815,870±2.93615.663±2.09013.585±2.061**11.548±1.992**大劑量組1060015.97±2.98016.619±2.69214.852±3.186**13.130±2.937**中劑量組1030015.933±2.81317.477±2.64015.429±3.126*13.744±2.832**小劑量組1015016.057±2.68517.828±2.44217.549±1.97417.113±1.919**與模型組比尸<0.05，**與模型組比尸<0.01從上表可看出，與空白對(duì)照組比，模型組從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始至實(shí)驗(yàn)第30天血糖水平均顯著升高(,<0.01)，說(shuō)明造鏈尿佐菌素大鼠糖尿病模型成功。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，各給藥組血糖與模型組比無(wú)明顯差異，說(shuō)明分組均勻；在給藥第10天，與模型組比，給藥組有一定降血糖水平的趨勢(shì)；在給藥第20天，與模型組比，大劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組可顯著降低大鼠鏈尿佐菌素糖尿病模型血糖水平(尸<0.01)，中劑量本發(fā)明物質(zhì)組可明顯降低血糖水平(,<0.05);在給藥第30天，與模型組比，大、中劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組可顯著降低大鼠鏈尿佐菌素糖尿病模型血糖水平(尸<0.01)，小劑量本發(fā)明物質(zhì)組可明顯降低血糖水平(尸<0.05)。表6-1本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠糖尿病模型血脂及抗氧化能力的影響(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6-2本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠糖尿病模型血脂及抗氧化能力的影響(；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*與模型組比,<0.05,**與模型組比尸<0.01從表6-1、表6-2可看出，與空白對(duì)照組比，模型組血清總膽固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白水平和MDA水平菌顯著升高(尸<0.01)，血清高密度脂蛋白水平和紅細(xì)胞S0D活力顯著降低(尸<0.01)，說(shuō)明大鼠糖尿病模型出現(xiàn)顯著的血脂升高和抗氧化能力降低，造模型成功。與模型組比，大、中劑量槐花總黃酮組和二甲雙胍組可顯著降低血總膽固醇水平和甘油三酯水平(尸<0.01)，小劑量本發(fā)明物質(zhì)組可明顯降低血清總膽固醇水平(尸<0.05);大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組均可顯著降低血清低密度脂蛋白水平(尸〈0.01);大、中劑量本發(fā)明物質(zhì)組均可顯著降低血清MDA水平(尸<0.01)，小劑量本發(fā)明物質(zhì)組可明顯降低血清MDA水平(,<0.05);大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組均可顯著升高血清高密度脂蛋白水平和紅細(xì)胞S0D活力(尸<0.01)。表7本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠糖尿病模型胰島素、胰島素抗體、消脂素和C肽水平的影響(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與模型組比尸<0.05，**與模型組比尸<0.01表7可看出，與空白對(duì)照組比，模型組胰島素水平和(:一肽水平顯著降低(尸<0.01)，消脂素水平顯著升高(尸<0.01)，說(shuō)明出現(xiàn)明顯糖尿病病變。與模型組比，大劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組可顯著升高血清胰島素水平(/^0.01)，中劑量本發(fā)明物質(zhì)組可明顯升高血清胰島素水平(尸<0.05);大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組均可顯著降低血清消脂素水平(P<0.01);大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組均可顯著升高血清C—肽水平(尸〈0.01);二甲雙胍組均可明顯升高血清C一肽水平(尸<0.01)。大、中、小劑量本發(fā)明物質(zhì)組對(duì)胰島素抗體水平影響不明顯。表8本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠糖尿病模型胰臟組織的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>"一"胰島細(xì)胞胞漿豐富，未出現(xiàn)萎縮、水腫和空泡變性，均正常；"+"胰島細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，而無(wú)水腫和空泡變性；"++"胰島細(xì)胞大部分出現(xiàn)萎縮，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)變性水腫現(xiàn)象；"+++"胰島細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，出現(xiàn)顯著的水腫和空泡變性。從上表可看出，經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，與空白對(duì)照組比，模型組胰臟病理變化顯著(/^0.01),說(shuō)明造模大鼠出現(xiàn)胰臟損傷。與模型組比，大、中劑量本發(fā)明物質(zhì)組均可顯著減輕前胰臟的病理變化(尸<0.01)。各組大鼠胰臟組織光鏡觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組大鼠胰島細(xì)胞胞漿豐富、胞體較大，細(xì)胞核疏散分布；模型組大鼠胰島細(xì)胞部分出現(xiàn)明顯萎縮，胞衆(zhòng)明顯減少、胞體縮小、細(xì)胞核密集，部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫和空泡變；二甲雙胍組大鼠胰島細(xì)胞少部分細(xì)胞得到明顯恢復(fù)，細(xì)胞胞漿較豐富，胞體增大，大部分細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，胞漿減少胞體縮小，細(xì)胞較密集；大劑量本發(fā)明物質(zhì)組大鼠胰臟組織的大部分細(xì)胞已得到恢復(fù)，胞柴豐富，胞體增大，少部分細(xì)胞呈萎縮狀態(tài)，細(xì)胞核叫密集；中劑量本發(fā)明物質(zhì)組大鼠胰臟組織中部分細(xì)胞呈萎縮狀，部分已恢復(fù)，胞漿豐富，胞體增大；小劑量本發(fā)明物質(zhì)組大鼠胰臟組織中的胰島細(xì)胞出現(xiàn)明顯的萎縮狀態(tài)，細(xì)胞體積縮小，胞漿明顯減少，細(xì)胞核密集，個(gè)別細(xì)胞胞漿豐富。各組大鼠胰島細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組大鼠胰島細(xì)胞中的線粒體和線粒體嵴排列整齊密集，嵴間腔不擴(kuò)張；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊而密集，未出現(xiàn)擴(kuò)張、囊泡現(xiàn)象。模型組大鼠胰島細(xì)胞中的線粒體明顯減少而線粒體嵴明顯變短或消失，嵴間腔呈空泡狀；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張或呈囊泡狀。二甲雙胍組大鼠胰島細(xì)胞中的線粒體有所增多，線粒體嵴大部分排列較整齊，部分排列紊亂，嵴變短或呈空泡狀；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張或呈囊泡狀。本發(fā)明物質(zhì)大劑量組大鼠胰島細(xì)胞中的線粒體有所增多，線粒體嵴部分排列整齊，部分嵴變短，或呈空泡狀；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊密集，少部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有擴(kuò)張現(xiàn)象。本發(fā)明物質(zhì)中劑量組大鼠胰島細(xì)胞中的線粒體有所增多，線粒體少部分嵴排列紊亂，部分嵴變短，或呈空泡狀；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂、擴(kuò)張或呈囊泡狀。本發(fā)明物質(zhì)小劑量組大鼠胰島細(xì)胞中的線粒體有所增加，少部分線粒體嵴排列紊亂，嵴變短或消失、呈空泡狀；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂，大部分?jǐn)U張或呈囊泡狀。表9本發(fā)明物質(zhì)對(duì)鏈尿佐菌素所致大鼠糖尿病模型腎臟組織的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>"_"腎小球、腎小囊、腎小管上皮細(xì)胞均正常；"+"腎小球細(xì)胞稍有增生、腎小囊小部分?jǐn)U張、壁層細(xì)胞呈扁平，腎小管上皮小部分水腫；"++"腎小球細(xì)胞25%增生、腎小囊小部分?jǐn)U張、壁層細(xì)胞呈扁平，腎小管上皮部分水腫空泡變；"+++"腎小球細(xì)胞50%增生、腎小囊小75%擴(kuò)張、壁層細(xì)胞呈扁平，腎小管上皮大部分呈空泡變。從上表可看出，經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，與空白對(duì)照組比，模型組腎臟病理變化顯著(尸<0.01)，說(shuō)明造模大鼠出現(xiàn)腎臟損傷。與模型組比，大、中劑量本發(fā)明物質(zhì)組和二甲雙胍組均可顯著減輕腎臟的病理變化(尸<0.01)。各組大鼠腎臟組織光鏡觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組大鼠腎臟中的腎小球、腎小囊和腎小管生皮細(xì)胞均為正常；模型組大鼠腎臟中的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜稍有增生，腎小囊腔擴(kuò)張，壁層細(xì)胞變扁平狀，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變；二甲雙胍組大鼠腎臟中的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞明顯減少，腎小囊腔大部分不擴(kuò)張，只有少部壁層細(xì)胞呈扁平狀，腎小管上皮細(xì)胞也得到一定恢復(fù)，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)空泡變；大劑量本發(fā)明物質(zhì)組大鼠腎臟中腎小球部分內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞得到抑制，腎小囊腔大部分不擴(kuò)張，少部分?jǐn)U張，壁層細(xì)胞呈扁平狀，腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫、少部分呈空泡變；中劑量本發(fā)明物質(zhì)組大鼠腎臟中的腎小球細(xì)胞部分增生，腎小囊腔部分?jǐn)U張，壁層細(xì)胞呈扁平狀，腎小管上皮細(xì)胞部分水腫，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)空泡變；小劑量本發(fā)明物質(zhì)組大鼠腎臟的腎小球細(xì)胞增生明顯，腎小囊腔擴(kuò)張，壁層細(xì)胞呈扁平狀，腎小管上皮細(xì)胞水腫，部分出現(xiàn)空泡變。四、總結(jié)本發(fā)明物質(zhì)具有明顯的降血糖作用，主要活性部位是槐花總黃酮，含量97%左右，純度高，效果好，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，槐花總黃酮能使腎上腺素、四氧嘧啶和鏈脲佐菌素所致高血糖動(dòng)物的血糖水平下降，對(duì)四氧嘧啶和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的高血糖小鼠和大鼠的高血糖均有明顯的降低作用，槐花總黃酮對(duì)胰島P細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，促進(jìn)了胰島e細(xì)胞釋放胰島素，這種作用與其抗氧化能力有關(guān)，其降脂和保護(hù)腎臟作用也與其抗氧化能力有關(guān)，本發(fā)明研制之前，尚未見(jiàn)有對(duì)槐花降血糖作用的系統(tǒng)研究報(bào)道，本試驗(yàn)表明槐花降血糖作用確切，為尋找降糖新藥開(kāi)辟了一條新的途徑，為槐花應(yīng)用于糖尿病及并發(fā)癥的治療提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用槐花資源打下基礎(chǔ)，是中醫(yī)藥上的一大創(chuàng)造。1權(quán)利要求1、一種從槐花中提取的一種降糖活性物質(zhì)，其特征在于，該物質(zhì)是由槐花加8倍槐花重量體積的質(zhì)量濃度為80％的乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，濃縮成浸膏，加質(zhì)量濃度為5％的NaOH溶液溶解，過(guò)濾，濾液加HCl調(diào)至PH2-3，過(guò)濾，沉淀水洗至中性所得槐花降糖活性物質(zhì)，得率為0.6-0.9％，純度為60％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從槐花中提取的一種降糖活性物質(zhì)，其特征在于，所說(shuō)的該物質(zhì)是首先取干燥的槐花lkg，加質(zhì)量濃度為8(^的乙醇8kml，加熱至60-80'C，回流提取2次，每次1.5小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，濃縮成浸膏，再用質(zhì)量濃度為5%的NaOH溶液溶解，過(guò)濾后加HC1調(diào)m為2.5,過(guò)濾后用水洗至中性即得7g±0.5g，槐花總黃酮含量為60%的降糖活性物質(zhì)。3、權(quán)利要求1或2所述的從槐花中提取的一種降糖活性物質(zhì)為在制備治療降糖藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種從槐花中提取的一種降糖活性物質(zhì)，可有效用于制備降糖藥物，解決血糖高的治療問(wèn)題，其解決的技術(shù)方案是，槐花降糖活性物質(zhì)的提取取槐花加8倍槐花重量體積的質(zhì)量濃度為80％的乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5小時(shí)，合并醇提液，過(guò)濾，濃縮成浸膏，加質(zhì)量濃度為5％的NaOH溶液溶解，過(guò)濾，濾液加HCl調(diào)至pH2-3，過(guò)濾，沉淀水洗至中性即得槐花降糖活性物質(zhì)，得率為0.6-0.9％，純度為60％，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，純度高，穩(wěn)定性好，開(kāi)辟了槐花制備藥物的新領(lǐng)域，是中醫(yī)藥學(xué)上的一大創(chuàng)新，造福于人類。文檔編號(hào)A61P3/10GK101297861SQ20081014040公開(kāi)日2008年11月5日申請(qǐng)日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者苗明三申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院